JPH09298A - アセトアミノフェンを測定するための分析要素及び方法 - Google Patents

アセトアミノフェンを測定するための分析要素及び方法

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 アセトアミノフェンを精密に測定すること。 【解決手段】 支持体表面に少なくとも一つの試薬層を
含み、前記試薬層中に（ａ）アリールアシルアミダーゼ
酵素、（ｂ）パラアミノフェノールをカップリング剤に
対して酸化的カップリングさせて着色化合物を生成する
ことができるフェリシアン化物及び酵素から成る群より
選ばれた酸化剤、並びに（ｃ）明細書中で定義した特定
の水溶性の発色性カップリング剤を含有する、水性流体
中のアセトアミノフェンを測定するための分析要素。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、乾式分析要素を用
いて実施される、水性流体中のアセトアミノフェンを測
定するための分光光度法によるアッセイに関する。
【０００２】
【従来の技術】アセトアミノフェンは広く用いられてい
る鎮痛剤である。これは処方箋がなくても入手すること
ができるので、アスピリンが患者に問題を起こしうる場
合によく用いられる。治療的投与量では、その血清中濃
度は一般に５０ｍｇ／Ｌ未満である。この薬物を注入し
てから４時間後の血清中濃度が３００ｍｇ／Ｌよりも高
い場合には一般に毒性が観測される。過剰投与による作
用の一つが肝臓毒性である。従って、アセトアミノフェ
ンの血清中濃度を正確に測定する必要がある。アセトア
ミノフェンのようなアニリドを測定する公知の方法とし
て、アリールアシルアミダーゼ(E.C.3.5.1.13)及び酸化
剤を利用する方法がある。アリールアシルアミダーゼ
は、該アニリドのアミド結合を切断することによりアセ
テートとアニリン、例えばｐ−アミノフェノールを生成
する。次いで、このアニリンを過マンガン酸塩又はその
銅若しくは鉄の金属塩のような酸化剤の存在下でフェノ
ールのような発色性化合物と反応させて、６１５ｎｍで
検出することができるインドフェノールのような着色化
合物を生成させる。別の方法として過ヨウ素酸塩や過硫
酸塩のような酸化剤を使用する方法もある。米国特許第
４，９９９，２８８号及び同第４，４３０，４３３号明
細書が典型的である。
【０００３】これらの方法の欠点の一つとして、アリー
ルアシルアミダーゼを不活化してしまう条件であるアル
カリ性ｐＨでない限り、アニリンの酸化速度がほとんど
の金属塩では非常に遅くなることが挙げられる。米国特
許第４，６７５，２９０号明細書（１９８７年６月２３
日発行、松本）に、合成ジブロム化アミド（基質）をペ
プチダーゼを含有する試料で処理することによりジブロ
ム化アニリンを遊離させ、この遊離ジブロム化アニリン
を、酸素を消費し且つ定義された式のカプラーの存在下
で前記アニリンの酸化的縮合によって顔料を生成させる
オキシダーゼ（例、アスコルベートオキシダーゼ）によ
って酸化する工程を含む、ペプチダーゼの酵素活性を測
定する方法が記載されている。この反応は溶液中で起こ
る。
【０００４】松本の方法は酵素を利用するものであるた
め、従来技術の無機酸化剤にまつわる問題を解決するこ
とができる。しかしながら、松本の方法は合成ジブロム
化基質を使用しており、従って、アセトアミノフェンの
検査に直接適用することができない。当該技術分野で
は、発色にフェノールの酸化的カップリングを利用した
場合、その発色反応に特定のハロゲノフェノールを使用
すると発色量を増加させることができるという証拠があ
る。しかしながら、被検体である生物学的流体中に存在
するアセトアミノフェンはハロゲン化されていないた
め、松本の方法で用いられるジブロム化合成基質とは化
学的に区別できる。さらに、松本は溶液アッセイを開示
している。代わりとなるより便利なアッセイとして「乾
式」化学法がある。この用語は、各種の「指触乾燥状態
の」検査要素、例えば、「ディップ・アンド・リード」
検査用ストリップ、多層検査要素、等に含まれる化学試
薬を用いて実施される方法及び技術を意味する。「乾
式」法は、検査試料以外には再構成及び分析に液体をま
ったく必要としない。
【０００５】溶液アッセイ用の試薬は、乾式フォーマッ
トに適合させた場合に、十分に機能しないことがしばし
ばある。乾式要素では微量の試薬及び検査試料が用いら
れるので、アセトアミノフェンのアッセイ用乾式要素で
は、アニリンがカプラーに酸化的カップリングされて発
色するときにクリアで正確な色信号を与える試薬を使用
することが重要である。潜在的なカプラーとして選ぶこ
とができる化合物は広範囲にわたる。松本は、乾式分析
法で十分に機能するような発色性酸化的カプラーについ
ては提案も示唆も何らされていない。問題は、乾式要素
に適した酸化的カプラーの選定が本質的に経験に基づい
ていることである。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】組み合わされて乾式フ
ォーマットで塗布された際には活性を残存し且つ適当な
カプラーとの酸化的カップリング時には明確な信号を与
える酵素及びその他の試薬を含む、生物学的流体中のア
セトアミノフェンを測定するための乾式アッセイが望ま
れている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、乾式フォーマ
ットにおいて検出可能な色変化を提供してアセトアミノ
フェンを精密に測定するためのカップリング剤を選定す
るものである。水溶性のカップリング剤が必要であっ
て、水不溶性のカップリング剤は、たとえ適切に分散さ
れた場合でも、十分には機能しないことが発見された。
本発明の要素は、従来技術が教示している無機酸化剤は
使用せず、代わりに温和な酸化剤、例えば、酵素又はフ
ェリシアン化物を使用する。乾式分析要素では、Ｃｕ++
やほとんどのＦｅ+++ の塩は、ゼラチンを架橋、硬化さ
せることによりゼラチンマトリックスを攻撃することが
知られている。この問題は、酸化剤として酵素を使用す
ることにより解決される。好適な酸化性酵素としてアス
コルビン酸オキシダーゼ、ラクターゼ及びチロシナーゼ
が挙げられる。
【０００８】フェリシアン化物は、ほとんどのＦｅ+++
塩やその他の金属系酸化剤ほど強い酸化剤ではない（表
Ａを参照のこと）。それゆえ、フェリシアン化物が、そ
うでなければ乾式要素構造を損なう中性ｐＨにおいて迅
速な反応速度を提供できるということは意外である。好
適なフェリシアン化物として、アルカリ金属及びアルカ
リ土類金属のフェリシアン化物、例えば、フェリシアン
化カリウム、フェリシアン化ナトリウム及びフェリシア
ン化カルシウムが挙げられる。特に好適なフェリシアン
化物はアルカリ金属のフェリシアン化物である。本発明
によると、支持体表面に少なくとも一つの試薬層を含
み、前記試薬層中に下記（ａ）〜（ｃ）を含有する、水
性流体中のアセトアミノフェンを測定するための分析要
素が提供される。 （ａ）アリールアシルアミダーゼ酵素； （ｂ）パラアミノフェノールをカップリング剤に対して
酸化的カップリングさせて着色化合物を生成することが
できるフェリシアン化物又は酸化性酵素；及び （ｃ）下記一般式で示される水溶性の発色性カップリン
グ剤：
【０００９】
【化４】
【００１０】上式中、Ｒは−（ＣＨ2 ）n Ｘから成る群
より選ばれた水可溶化基であるが、ここでｎは１〜５で
あり、そしてＸは−ＳＯ3 Ｍ〔但し、Ｍは水素、アルカ
リ金属、アルカリ土類金属若しくはアンモニウム（ＮＨ
4 + ）カチオンである〕又は−Ｎ（Ｒ7 ）3 + Ｚ- 〔但
し、各Ｒ7 は各々独立に炭素原子数１〜４個のアルキ
ル、例えばメチル、エチル、プロピル及びブチル、から
選ばれ且つＺは酸アニオン、例えば塩化物、臭化物、ヨ
ウ化物、フッ化物、ｐ−トルエンスルホネート、等、で
ある〕であるか、或いはＸは（−ＯＣＨ2 ＣＨ2 ）y Ｏ
Ｈ〔但しｙは２〜５である〕であり、Ｒ1 とＲ6 が一緒
になって、部分飽和環を形成するエチレン、トリメチレ
ン又はテトラメチレン基を表し、Ｒ2 、Ｒ3 及びＲ4 は
各々独立に水素、炭素原子数１〜４個のアルキル基及び
炭素原子数１〜４個のアルコキシ基から選ばれる。
【００１１】本発明の別の実施態様として、（ａ）上記
の分析要素に水性液体試料を接触させる工程；及び
（ｂ）着色化合物の生成量を前記液体試料中のアセトア
ミノフェン濃度と相関させる工程を含む、水性液体中の
アセトアミノフェンを測定するための方法が提供され
る。
【００１２】本発明の有利な効果は、水溶性カップリン
グ剤と酵素触媒酸化的カップリング又はフェリシアン化
物カップリングのいずれかとによって迅速な反応が可能
になることである。本発明者らは、検出可能な色信号を
５７秒以内に発生させることができた。水不溶性カップ
リング剤でははるかに遅い反応となる。許容量の着色生
成物を所望の時間内（５分以内）に得るために、水溶性
カップリング剤と酵素を組み合わせる必要があることを
見い出したことは意外であった。溶液アッセイの場合で
さえ、５分以内で結果を得るためには、酸化性酵素
（例、アスコルベートオキシダーゼ）を水溶性カップリ
ング剤と予め混合してから緩衝液で希釈する必要があっ
た。この理由はわからない。科学的理論によって拘束さ
れることを望むものではないが、本出願人は、カップリ
ング剤の水溶性によって、保存中（すなわち、製造時と
使用時の間）の分析要素においてカップリング剤と酵素
が十分に混合されると考えている。十分な発色反応を５
分以内に行わせるためには、反応前にカップリング剤と
酸化性酵素とを予め接触させる必要があるようである。
【００１３】本発明は、アセトアミノフェンの酵素加水
分解とそれに続く該加水分解による生成物の検出に基づ
いてアセトアミノフェンを測定するための比色定量法に
よるアッセイを開示するものである。より具体的には、
本発明によるアッセイでは、アセトアミノフェンのアミ
ド結合を切断して酢酸とｐ−アミノフェノールを生成さ
せるために、第一の酵素としてアリールアシルアミダー
ゼ(E.C.3.5.1.13)が用いられる。第二の酵素、例えば、
アスコルビン酸オキシダーゼ(E.C.1.10.3.3)、チロシナ
ーゼ(E.C.1.14.18.1) 又はラクターゼ(E.C.1.10.3.2)が
ｐ−アミノフェノールを酸化してこれを本明細書中で定
義した水溶性カップリング剤に結合させて色素を生成さ
せる。ｐ−アミノフェノールの酸化にはフェリシアン化
物を使用することもできる。この色素は６７０ｎｍで検
出することができる。この反応は下記のように進行す
る。
【００１４】
【化５】
【００１５】本発明において有用な水溶性のカップリン
グ剤は、構造の類似した数種類のカプラーの中からスク
リーニング及び選定することによって同定された。水不
溶性のカプラーは、この検査条件下では、幅広いダイナ
ミックレンジのアナライト濃度を分析差別化するに十分
な吸光度を与える程十分なカップリング（色素生成）を
提供しなかった。上記構造のものであって、Ｒ1 とＲ6
が一緒になってトリメチレンを表す、すなわち部分飽和
六員窒素含有複素環式環を形成するものは、特に望まし
い吸収極大（約６７０ｎｍ）を示し、分析要素では特に
有用である。というのは、この吸収は、より短波長側で
吸収するビリルビンのような妨害因子によって遮蔽され
ることがないからである。好適な水溶性種は１−（３−
スルホプロピル）−１，２，３，４−テトラヒドロキノ
リンである。このスクリーニング手順とその結果につい
ては後述する。反応終了時における着色化合物の生成量
は、その検査試料中のアセトアミノフェン濃度を示す。
【００１６】上記の試薬を支持体表面に塗布することで
本発明の乾式分析要素が得られる。この分析要素は、所
望の任意の幅を有する細長いテープ状、シート状、スラ
イド状、チップ状をはじめとして様々な形状をとること
ができる。本発明の分析要素は、手動式又は自動式いず
れのアッセイ法でも使用することができる。一般に、分
析要素を使用する際には、その要素を供給用ロール、チ
ップパケット又はその他のソースから取り出し、それを
被検液体試料（例、２００ｍＬ以下）と物理的に接触さ
せることにより、要素の内部で試料と試薬を逐次的に相
互作用させて混合させることによって、アセトアミノフ
ェンを測定する。このような接触は適当な任意の方法
で、例えば、分析要素を試料液に浸漬する方法や、好ま
しくは適当な分配手段で試料の液滴を手動で又は機械で
分析要素に点着する方法によって、行うことができる。
【００１７】試料をアプライした後、その分析要素を最
長で５分間インキュベーションし、発色を促進させる。
インキュベーションとは、測色前に、試薬を互いに接触
させた状態で３７℃において最長で５分間維持する工程
を意味する。このアッセイで検査することができる水性
液体には、全血、血漿、血清、リンパ液、胆汁、尿、脊
髄液、唾液、汗、等の他、排泄物も含まれるが、これら
に限定はされない。また、ヒト又は動物の細胞、例え
ば、骨格筋、心臓、腎臓、肺、脳、骨髄、皮膚、等の流
体調製物を検定することも可能である。
【００１８】液体のアッセイに有用な乾式分析要素は、
米国特許第３，９９２，１５８号及び同第４，３５７，
３６３号明細書の教示に従い製造することができ、本明
細書ではその記載を援用する。簡単に説明すると、本発
明の分析要素は適当な支持体表面に塗布された単一又は
複数の層を含む。支持体表面に塗布された単一の層にす
べての試薬が含まれていてもよい。好ましくは、下記表
１に示すように、区別された二つの試薬層に試薬を塗布
する。分析要素の同じ層に含まれる場合でも異なる層に
含まれる場合でも、すべての試薬が互いに液絡可能な状
態になければならない。つまり、試薬と反応生成物が層
の内部及び隣接層の重畳領域間を通過できることが必要
である。換言すれば、分析要素を水性流体と接触させた
時に、上述したように本発明の分析組成物のすべての試
薬が逐次混合される。
【００１９】支持体は、寸法安定性があり、そして好ま
しくは非孔質且つ波長約２００〜約９００ｎｍの電磁輻
射線を透過する透明な（すなわち、輻射線透過性）材料
であれば適当ないずれの材料であってもよい。各種輻射
線検出法を利用してこれら分析要素で起こる検出可能な
変化の測定を向上、促進するためには、輻射線透過性支
持体が特に好ましい。個別の要素に対する支持体の選定
は、所期の検出様式（反射、透過又は蛍光分光光度分
析）に適合させるべきである。有用な支持体材料として
ポリスチレン、ポリエステル〔例、ポリ（エチレンテレ
フタレート）〕、ポリカーボネート、セルロースエステ
ル（例、酢酸セルロース）、等が挙げられる。この支持
体の表面には少なくとも一つの試薬層が塗布される。こ
の試薬層は、一種又は二種以上の合成又は天然のバイン
ダー物質、例えばゼラチン若しくはその他の天然コロイ
ド、並びに種々の合成親水性ポリマー、例えばポリアク
リルアミド、ポリ（Ｎ−ビニル−２−ピロリドン）、ポ
リ（アクリルアミド−コ−Ｎ−ビニル−２−ピロリド
ン）、これらのコポリマー、及び架橋性モノマーを添加
したポリマー若しくはコポリマー、の中に一種又は二種
以上の試薬が分散している指示組成物を含有する。
【００２０】この試薬層は緩衝剤を含有することができ
る。有用な緩衝剤として、ホスフェート、ピロホスフェ
ート、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲ
ＩＳ）、２｛〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕ア
ミノ｝−１−エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、４−（２−
ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸
（ＨＥＰＥＳ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）
−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸（ＥＰＰＥ
Ｓ）、２−ヒドロキシ−３−｛Ｎ−〔トリス（ヒドロキ
シメチル）メチル〕アミノ｝−プロパンスルホン酸（Ｔ
ＡＰＳＯ）及びその他ｐＨが約６．５〜約８．５の範囲
に、好ましくは約７．５である緩衝剤が挙げられる。緩
衝剤は、分析要素のいずれかの層に含まれても、またす
べての層に含まれてもよく、さらには他の試薬を含まな
い独立した層に含まれてもよい。この試薬層には、必要
に応じていくつかの界面活性剤、例えば、Ｏｌｉｎ−１
０Ｇ（商標）、ＴＸ−１０２（商標）、ＴＸ−４０５
（商標）、Ｚｏｎｙｌ ＦＳＮ（商標）、好ましくはＴ
Ｘ−１００（商標）及びＴＸ−１６５（商標）（これら
ＴＸ系界面活性剤はＵｎｉｏｎ Ｃａｒｂｉｄｅ社より
市販されているオクチルフェノキシポリエトキシエタノ
ール系非イオン性界面活性剤の一族である）を含めるこ
とができる。さらに、数種類の架橋剤、例えば、ビスビ
ニルスルホニルメタン、グルタルアルデヒド、等も任意
に含めることができる。
【００２１】本発明の分析要素には、液体被検試料を要
素全体に均一に分布させるために多孔質の反射性展開層
を設けることができる。この展開層は試薬を含有しても
よいが、下記表１に示すように別個の層であることが好
ましい。展開層用の材料については、例えば米国特許第
４，２５８，００１号明細書や先に引用した特許明細書
に開示されているように、乾式分析要素の製造分野では
よく知られている。有用な展開層は、米国特許第４，２
９２，２７２号明細書（１９８１年９月２９日発行、北
島ら）に記載されているように適当なバインダー物質と
混合するか又は織物にした繊維材料を用いて、米国特許
第３，９９２，１５８号明細書に記載されているように
高分子組成物又は粒状材料、例えばブラシポリマーを用
いて、米国特許第４，２５８，００１号（１９８１年３
月２４日発行、Ｐｉｅｒｃｅら）及び米国特許第４，４
３０，４３６号明細書（１９８４年２月７日発行、小山
ら）並びに特開昭５７−１０１７６０号公報に記載され
ているように接着剤を使用するか又は使用せずにビーズ
を用いて、調製することができる。特に有用な展開層は
硫酸バリウム又は二酸化チタンを含む。一般に、展開層
には試料が直接アプライされるので、展開層は等方性多
孔質であること、すなわち粒子間、繊維間又は高分子ス
トランド間の内部連続空間又は気孔によって生じた多孔
性が層内の各方向において同等であることが望ましい。
展開層の一例を表１に示す。
【００２２】ある実施態様では、展開層は、検査流体中
に存在しうる特定の妨害因子をブロックするのに有用で
あることが知られている化合物のＮ−エチルマレイミド
を含有する。この発明については、１９９５年６月２２
日出願のＴ．Ｃ．Ａｒｔｅｒらの発明の名称「Sulfhydr
yl Complexing Agents in Clinical Test Elements」の
共有米国特許出願明細書に記載されている。下塗層、輻
射線遮断層、等のその他の層を所望であれば必要に応じ
て含めることもできる。本発明の要素の層は、その他の
任意ではあるが望ましい成分を各種含有することができ
る。そのような成分として、界面活性剤、増粘剤、緩衝
剤、硬膜剤、静菌剤、酸化防止剤、カプラー溶剤、その
他当該技術分野で公知の物質が挙げられる。これら成分
の量についても当業者であれば適宜選定することができ
る。
【００２３】分析要素における変化は、例えば、米国特
許第３，９９２，１５８号明細書の第１４〜１５欄及び
米国特許第４，３５７，３６３号明細書の第２７欄に記
載されている公知の方法を用いて、適当な分光光度計装
置、通常は反射計、によって検出することができる。酵
素反応の場合、例えば、検定試料を接触させた本発明の
要素の有限領域内の反射濃度又は透過濃度の変化速度を
計測することによって、得られた生成物を測定する。測
定領域は一般に約３〜約５ｍｍの範囲である。本発明の
代表的な要素を下記表１ａ及び表１ｂに示す。
【００２４】表１ａ：オキシダーゼ酵素を用いたアセトアミノフェン分析要素 被覆量；ｇ／ｍ2 * 試薬／展開層 有用な範囲 実例 硫酸バリウム 75-120 100 セルロース 1-20 8 界面活性剤 TX-405(商標) 0.2-4 1.6 Estane 1-15 12.3 マレイミド 0.1-3.0 1.0下塗層 ポリビニルピロリドン 0.5-2.5 1.0試薬層１ 未硬化ゼラチン 4-24 6 界面活性剤 TX-165(商標) 0.005-0.1 0.01 HEPES 緩衝剤 2-10 2.4 アスコルビン酸オキシダーゼ 50,000-300,000 IU/m2 175,000 IU/m2 アリールアシルアミダーゼ 1,000-50,000 IU/m2 5,000 IU/m2 試薬層２ 硬化ゼラチン 4-24 6 カプラー THQSO3H 0.2-2 1.0 HEPES 緩衝剤 2-10 4.8 界面活性剤 TX-165(商標) 0.005-0.1 0.01 略号解 * アルコルビン酸オキシダーゼとアリールアシルアミダーゼはＩＵ／ｍ2 TX-405 (商標): TX-100 (商標):オクチルフェノキシポリエトキシの一族 TX-165 (商標): Union Carbideより市販されているエタノール Triton X-100 (商標): THQSO3H:表１の化合物２、すなわち１−（３−スルホプロピル）−１，２，３， ４−テトラヒドロキノリン Estane: B.F. Goodrich より市販されているポリエステル／ポリウレタン系ポリ マー HEPES:４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸
【００２５】表１ｂ：フェリシアン化物を用いたアセトアミノフェン分析要素 被覆量；ｇ／ｍ2 * 試薬／展開層 有用な範囲 実例 硫酸バリウム 75-120 100 セルロース 1-20 8 界面活性剤 TX-405(商標) 0.2-4 1.6 Estane 1-15 12.3 マレイミド 0.1-3.0 1.0下塗層 ポリビニルピロリドン 0.5-2.5 1.0試薬層１ 未硬化ゼラチン 4-24 6 界面活性剤 TX-165(商標) 0.005-0.1 0.01 HEPES 緩衝剤 2-10 2.4 フェリシアン化カリウム 0.1-5.0 1.8 アリールアシルアミダーゼ 1,000-50,000 IU/m2 5,000 IU/m2 試薬層２ 硬化ゼラチン 4-24 6 カプラー THQSO3H 0.2-2 1.0 HEPES 緩衝剤 2-10 4.8 界面活性剤 TX-165(商標) 0.005-0.1 0.01 略号解 * アリールアシルアミダーゼはＩＵ／ｍ2 TX-405 (商標): TX-100 (商標):オクチルフェノキシポリエトキシの一族 TX-165 (商標): Union Carbideより市販されているエタノール Triton X-100 (商標): THQSO3H:表１の化合物２、すなわち１−（３−スルホプロピル）−１，２，３， ４−テトラヒドロキノリン Estane: B.F. Goodrich より市販されているポリエステル／ポリウレタン系ポリ マー HEPES:４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸
【００２６】
【実施例】有用なカップリング剤についての試験 下記の手順によって、アスコルビン酸オキシダーゼの存
在下でｐ−アミノフェノールと結合して溶液中に色の強
い化合物を生ぜしめるカップリング剤を同定した。さら
に、これらの化合物を、アセトアミノフェンを定量検定
するための乾式分析要素における性能について試験し
た。ｐＨ７．５の０．１Ｍ ＴＲＩＳ緩衝液３ｍＬと
０．０４Ｍの試験すべきカップリング剤を含有する溶液
３００μＬとを混合した。この溶液に１５０μＬのアス
コルビン酸オキシダーゼ溶液（４０００Ｕ／ｍＬ）と、
１５０μＬのアリールアシルアミダーゼ溶液（７０Ｕ／
ｍＬ）と、１５０μＬのアセトアミノフェン溶液（３０
０ｍｇ／Ｌ）とを添加した。５分後、各色素のλmax に
対応する波長における吸光度を３７℃で測定した。各色
素のλmax を決定するため、各色素溶液のスペクトルを
λ＝３００〜８００ｎｍの範囲で作成した。５分後の吸
光度が０．３よりも高いカップリング剤は乾式分析要素
用として十分であるものと見なした（０．３の値は、色
素のλmax 波長におけるカップリング剤の値を差し引い
て求めた値である）。代表的カップリング剤のアセトア
ミノフェン３００ｍｇ／Ｌにおける吸光度値を表２に記
載する。下記の９種類の化合物が潜在的なカップリング
剤として試験したものの一部である。表２：アセトアミノフェンを検定するためのカップリン
グ剤の選択
【００２７】
【化６】
【００２８】
【化７】
【００２９】
【化８】
【００３０】
【化９】
【００３１】
【化１０】
【００３２】＊この化合物は水不溶性であるため、その
ＤＭＦ溶液を分析溶液へ添加した。 表２のデータは、示したカップリング剤のうち、化合物
１、２及び４だけが吸光度の基準を満たしており（すな
わち、λ＝６７０、吸光度０．３超）、乾式分析要素用
としての試験をする価値があった。化合物２が最高の不
感受性を示した。化合物１及び４はジメチルホルムアミ
ド（ＤＭＦ）を添加しないと溶解しなかった。これらの
化合物をカプラー溶剤（２，４−ジ−ｎ−ペンチルフェ
ノール）に溶解して本発明の乾式分析要素に塗布した場
合（下記実施例１、２及び３）、化合物２よりも有意に
小さい信号が発生した。これらの結果を図１、図２及び
図３に示す。
【００３３】１−（３−スルホプロピル）−１，２，
３，４−テトラヒドロキノリン（化合物２、ＴＨＱＳＯ
3 Ｈ）の合成 試薬グレードのアセトニトリル５０ｍＬに１，２，３，
４−テトラヒドロキノリン（４．７６ｇ、４０ミリモ
ル）と１，３−プロパンスルトン（４．８８ｇ、４０ミ
リモル）とを含む混合物を窒素雰囲気中で加熱して一晩
還流させた。室温まで冷却した後に氷浴温度まで冷却
し、得られた白色固形分を濾過して低温のアセトニトリ
ルで洗浄した。収量は８．１ｇ（８４％）であり、その
生成物の融点は２００℃よりも高かった。核磁気共鳴
（ＮＭＲ）及び元素分析によって、その生成物の構造を
確認した。ＮＭＲ（Ｄ2 Ｏ）：７．４５（ｓ，４Ｈ）、
２．８−４．０（ｍ，８Ｈ）、２．２（Ｔ，２Ｈ）。
【００３４】実施例１：分析要素におけるカップリング
剤ＴＨＱＳＯ3 Ｈ（第２番） 合成後、カップリング化合物２を表１ａに示した本発明
の分析要素に塗布し、そして各種既知濃度（１．０、
５．４、１０．０、１９．０、３０．０、３９．０、５
２．０、９８．０、２０２．０及び２９４．０ｍｇ／
Ｌ）のアセトアミノフェン水溶液をアッセイする際の性
能について試験した。分析要素のコーティングは米国特
許第３，９９２，１５８号、同第４，３５７，３６３号
及び同第４，２５８，００１号明細書の教示に従い実施
した。図１に示した反応速度応答は、このカプラーによ
ると、実施したダイナミックレンジ（１〜３０ｍｇ／ｄ
Ｌ）の全体にわたり良好な感度が得られることを示唆し
ている。
【００３５】比較例１：分析要素におけるカップリング
剤１−（ｎ−ブチル）−１，２，３，４−テトラヒドロ
キノリン（化合物１、ＢＴＨＯ） 実施例１と同様に分析要素を作製して各種濃度のアセト
アミノフェン試料を点着したが、但し、化合物２（ＴＨ
ＱＳＯ3 Ｈ）の代わりに化合物１（ＢＴＨＯ）を使用し
た。また、化合物１は水溶性ではないため、２−４−ジ
−ｎ−ペンチルフェノール中に分散させなければならな
かった。図２に示した結果は、このカップリング剤は分
析要素において有用ではなく、得られるダイナミックレ
ンジは非常に狭いことを示唆している。
【００３６】比較例２：分析要素におけるカップリング
剤１，２，３，５，６，７−ヘキサヒドロベンゾ〔Ｉ．
Ｊ〕キノリジン（化合物４、ジュロリジン） 実施例１と同様に分析要素を作製して各種濃度のアセト
アミノフェン試料を点着したが、但し、化合物２（ＴＨ
ＱＳＯ3 Ｈ）の代わりに化合物４（ジュロリジン）を使
用した。化合物４は水溶性ではないため、２−４−ジ−
ｎ−ペンチルフェノール中に分散させなければならなか
った。図３に示した結果は、このカップリング剤で得ら
れるダイナミックレンジは非常に狭いため、本発明の目
的には有用ではないことを示唆している。
【００３７】実施例２：分析要素における酸化剤として
のチロシナーゼ この実施例は実施例１と同様に実施したが、但し、１７
５，０００Ｕ／ｍ2 のアスコルビン酸オキシダーゼの代
わりに別の酸化剤として６，４００Ｕ／ｍ2 のチロシナ
ーゼを使用した。反射率濃度法により６７０ｎｍにおけ
る濃度応答を測定した。得られた濃度について濃度／予
測値スプライン(spline)を作成し、その濃度から試料の
アセトアミノフェン濃度を予測した。分析要素の濃度応
答に基づいて行われた予測（表３）は、試験用要素に点
着した検査流体中の既知のアセトアミノフェン濃度とよ
く相関している。
【００３８】分析要素における酸化剤としてチロシナーゼを使用した例 表３ アセトアミノフェン濃度(mg/dL) 濃度応答(670 nm) 予測値(mg/dL) ０．１ ０．１６５ ０．１ ０．５ ０．１７８ ０．５ １．０ ０．１９０ ０．９ １．９ ０．２２０ １．９ ３．０ ０．２５１ ３．０ ３．９ ０．２８０ ４．１ ５．２ ０．３０７ ５．２ ９．８ ０．４９５ １０．０ ２０．９ ０．６５０ ２０．８ ２９．４ ０．７２３ ２９．４
【００３９】実施例３：分析要素における酸化剤として
フェリシアン化カリウムを使用した例 合成後、カップリング化合物２を表１ｂに示したように
酸化剤としてフェリシアン化カリウムを用いた本発明の
分析要素に塗布した。その要素を、各種既知濃度（０．
０、１０、２４、５０、１００、１４６、１９３、２４
７、２９５、３５０及び３９１ｍｇ／Ｌ）のヒト血清中
のアセトアミノフェンをアッセイする際の性能について
試験した。図４に示した反応速度応答は、このフェリシ
アン化物によると、実施したダイナミックレンジ（１〜
３０ｍｇ／ｄＬ）の全体にわたり良好な感度が得られる
ことを示唆している。表１ｂの要素構造において別の金
属塩を使用した場合には、反応速度が非常に遅くなった
（表Ａ）。フェリシアン化物が、他の試験した酸化剤と
比較して低い酸化還元電位に基づいてより迅速な反応速
度を提供することは意外であった。
【００４０】表Ａ 物質 酸化還元電位 反応速度 硫酸第二銅 ＋０．３４Ｖ 遅い 塩化第二銅 ＋０．３４Ｖ 遅い 硝酸第二鉄 ＋０．７７Ｖ 非常に遅い 硝酸銀 ＋０．５９Ｖ 非常に遅い 硝酸銀 ＋０．８１Ｖ 非常に遅い フェリシアン化カリウム ＋０．４６Ｖ 非常に速い
【００４１】本発明をその好ましい実施態様を特に参照
しながら説明してきたが、本発明の精神及び範囲内で各
種変更が可能であることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の分析要素の性能を示すグラフである。
【図２】比較例の分析要素の性能を示すグラフである。
【図３】別の比較例の分析要素の性能を示すグラフであ
る。
【図４】本発明の分析要素の性能を示すグラフである。
フロントページの続き (72)発明者 ジョン シー．マウク アメリカ合衆国，ニューヨーク 14610, ロチェスター，クロイドン ロード 184 (72)発明者 ジェイムズ アール．スキャファー アメリカ合衆国，ニューヨーク 14526, ペンフィールド，ジャクソン ロード エ グジット 49 (72)発明者 ロバート エフ．ウインターコーン アメリカ合衆国，ニューヨーク 14609, ロチェスター，ウェストチェスター アベ ニュー 330

Claims (17)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 支持体表面に少なくとも一つの試薬層を
    含み、前記試薬層中に下記（ａ）〜（ｃ）を含有する、
    水性流体中のアセトアミノフェンを測定するための分析
    要素： （ａ）アリールアシルアミダーゼ酵素； （ｂ）パラアミノフェノールをカップリング剤に対して
    酸化的カップリングさせて着色化合物を生成することが
    できるフェリシアン化物及び酵素から成る群より選ばれ
    た酸化剤；並びに （ｃ）下記一般式で示される水溶性の発色性カップリン
    グ剤： 【化１】 ｛上式中、Ｒは−（ＣＨ2 ）n Ｘから成る群より選ばれ
    た水可溶化基であるが、ここでｎは１〜５であり、そし
    てＸは−ＳＯ3 Ｍ〔但し、Ｍは水素、アルカリ金属、ア
    ルカリ土類金属若しくはアンモニウム（ＮＨ4 + ）カチ
    オンである〕又は−Ｎ（Ｒ7 ）3 + Ｚ- 〔但し、各Ｒ7
    は各々独立に炭素原子数１〜４個のアルキルから選ばれ
    且つＺは酸アニオンである〕であるか、或いはＸは（−
    ＯＣＨ2 ＣＨ2 ）y ＯＨ〔但しｙは２〜５である〕であ
    り、 Ｒ1 とＲ6 が一緒になって、部分飽和環を形成するエチ
    レン、トリメチレン又はテトラメチレン基を表し、 Ｒ2 、Ｒ3 及びＲ4 は各々独立に水素、炭素原子数１〜
    ４個のアルキル基及び炭素原子数１〜４個のアルコキシ
    基から選ばれる｝。
  2. 【請求項２】 支持体表面に少なくとも一つの試薬層を
    含み、前記試薬層中に下記（ａ）〜（ｃ）を含有する、
    水性流体中のアセトアミノフェンを測定するための請求
    項１に記載の分析要素： （ａ）アリールアシルアミダーゼ酵素； （ｂ）パラアミノフェノールをカップリング剤に対して
    酸化的カップリングさせて着色化合物を生成することが
    できる酸化性酵素；及び （ｃ）下記一般式で示される水溶性の発色性カップリン
    グ剤： 【化２】 ｛上式中、Ｒは−（ＣＨ2 ）n Ｘから成る群より選ばれ
    た水可溶化基であるが、ここでｎは１〜５であり、そし
    てＸは−ＳＯ3 Ｍ〔但し、Ｍは水素、アルカリ金属、ア
    ルカリ土類金属若しくはアンモニウム（ＮＨ4 + ）カチ
    オンである〕又は−Ｎ（Ｒ7 ）3 + Ｚ- 〔但し、各Ｒ7
    は各々独立に炭素原子数１〜４個のアルキルから選ばれ
    且つＺは酸アニオンである〕であるか、或いはＸは（−
    ＯＣＨ2 ＣＨ2 ）y ＯＨ〔但しｙは２〜５である〕であ
    り、 Ｒ1 とＲ6 が一緒になって、部分飽和環を形成するエチ
    レン、トリメチレン又はテトラメチレン基を表し、 Ｒ2 、Ｒ3 及びＲ4 は各々独立に水素、炭素原子数１〜
    ４個のアルキル基及び炭素原子数１〜４個のアルコキシ
    基から選ばれる｝。
  3. 【請求項３】 支持体表面に少なくとも一つの試薬層を
    含み、前記試薬層中に下記（ａ）〜（ｃ）を含有する、
    水性流体中のアセトアミノフェンを測定するための請求
    項１に記載の分析要素： （ａ）アリールアシルアミダーゼ酵素； （ｂ）パラアミノフェノールをカップリング剤に対して
    酸化的カップリングさせて着色化合物を生成することが
    できるフェリシアン化物；及び （ｃ）下記一般式で示される水溶性の発色性カップリン
    グ剤： 【化３】 ｛上式中、Ｒは−（ＣＨ2 ）n Ｘから成る群より選ばれ
    た水可溶化基であるが、ここでｎは１〜５であり、そし
    てＸは−ＳＯ3 Ｍ〔但し、Ｍは水素、アルカリ金属、ア
    ルカリ土類金属若しくはアンモニウム（ＮＨ4 + ）カチ
    オンである〕又は−Ｎ（Ｒ7 ）3 + Ｚ- 〔但し、各Ｒ7
    は各々独立に炭素原子数１〜４個のアルキルから選ばれ
    且つＺは酸アニオンである〕であるか、或いはＸは（−
    ＯＣＨ2 ＣＨ2 ）y ＯＨ〔但しｙは２〜５である〕であ
    り、 Ｒ1 とＲ6 が一緒になって、部分飽和環を形成するエチ
    レン、トリメチレン又はテトラメチレン基を表し、 Ｒ2 、Ｒ3 及びＲ4 は各々独立に水素、炭素原子数１〜
    ４個のアルキル基及び炭素原子数１〜４個のアルコキシ
    基から選ばれる｝。
  4. 【請求項４】 支持体表面に、前記支持体から順に、 （ａ）アリールアシルアミダーゼ酵素と、パラアミノフ
    ェノールを発色性カプラーに対して酸化的カップリング
    させて着色化合物を生成することができる酸化性酵素
    と、請求項１に記載の水溶性の発色性カップリング剤と
    を内部に有する単一又は複数の層；及び （ｂ）多孔性展開層 を液絡可能に含む、水性流体中のアセトアミノフェンを
    測定するための請求項１に記載の多層分析要素。
  5. 【請求項５】 前記酸化性酵素がアスコルビン酸オキシ
    ダーゼ、ラクターゼ及びチロシナーゼから成る群より選
    ばれた、請求項２に記載の分析要素。
  6. 【請求項６】 前記カップリング剤が１−（３−スルホ
    プロピル）−１，２，３，４−テトラヒドロキノリンで
    ある、請求項２に記載の分析要素。
  7. 【請求項７】 前記分析要素のｐＨを約６．５〜約８．
    ５の範囲内に維持するための緩衝剤をさらに含有する、
    請求項２に記載の分析要素。
  8. 【請求項８】 マレイミドをさらに含有する、請求項２
    に記載の分析要素。
  9. 【請求項９】 支持体表面に、前記支持体から順に、 （ａ）アリールアシルアミダーゼ酵素と、パラアミノフ
    ェノールを発色性カプラーに対して酸化的カップリング
    させて着色化合物を生成することができるフェリシアン
    化物と、請求項１に記載の水溶性の発色性カップリング
    剤とを内部に有する単一又は複数の層；及び （ｂ）多孔性展開層 を液絡可能に含む、水性流体中のアセトアミノフェンを
    測定するための請求項１に記載の多層分析要素。
  10. 【請求項１０】 前記フェリシアン化物がアルカリ金属
    のフェリシアン化物塩である、請求項３に記載の分析要
    素。
  11. 【請求項１１】 前記カップリング剤が１−（３−スル
    ホプロピル）−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン
    である、請求項３に記載の分析要素。
  12. 【請求項１２】 前記分析要素のｐＨを約６．５〜約
    ８．５の範囲内に維持するための緩衝剤をさらに含有す
    る、請求項３に記載の分析要素。
  13. 【請求項１３】 マレイミドをさらに含有する、請求項
    ３に記載の分析要素。
  14. 【請求項１４】 支持体表面に、前記支持体から順に、 １−（３−スルホプロピル）−１，２，３，４−テトラ
    ヒドロキノリンを内部に有する第一の試薬層；アスコル
    ビン酸オキシダーゼ又はフェリシアン化物塩及びアリー
    ルアシルアミダーゼを内部に有する第二の試薬層；並び
    に多孔性展開層；を含む、水性流体中のアセトアミノフ
    ェンを測定するための請求項１に記載の多層分析要素。
  15. 【請求項１５】 マレイミドをさらに含有する、請求項
    １４に記載の分析要素。
  16. 【請求項１６】 前記マレイミドが前記展開層中に存在
    する、請求項１５に記載の分析要素。
  17. 【請求項１７】 （ａ）請求項１、２、３又は１４に記
    載の分析要素に水性液体試料を接触させる工程；及び
    （ｂ）着色化合物の生成量を前記液体試料中のアセトア
    ミノフェン濃度と相関させる工程を含む、水性液体中の
    アセトアミノフェンを測定するための方法。
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