JPH09304391A - 免疫学的梅毒トレポネーマ診断試薬およびその製造方法 - Google Patents
免疫学的梅毒トレポネーマ診断試薬およびその製造方法Info
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- JPH09304391A JPH09304391A JP11623296A JP11623296A JPH09304391A JP H09304391 A JPH09304391 A JP H09304391A JP 11623296 A JP11623296 A JP 11623296A JP 11623296 A JP11623296 A JP 11623296A JP H09304391 A JPH09304391 A JP H09304391A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 遺伝子工学的に生産された梅毒トレポネーマ
抗原を用いて診断試薬を製造し、菌体から精製された抗
原を用いて得た診断試薬と同等の性能を有する診断試薬
を提供する。 【解決手段】 遺伝子工学的手法を用いてクローニング
され得る梅毒トレポネーマ抗原タンパク質を不溶性担体
に担持させて、免疫学的診断試薬を製造するに際し、水
溶性高分子を含有している水溶液中で不溶性担体と該梅
毒トレポネーマ抗原タンパク質を混合することを特徴す
る免疫学的梅毒トレポネーマ診断試薬の製造方法であ
る。
抗原を用いて診断試薬を製造し、菌体から精製された抗
原を用いて得た診断試薬と同等の性能を有する診断試薬
を提供する。 【解決手段】 遺伝子工学的手法を用いてクローニング
され得る梅毒トレポネーマ抗原タンパク質を不溶性担体
に担持させて、免疫学的診断試薬を製造するに際し、水
溶性高分子を含有している水溶液中で不溶性担体と該梅
毒トレポネーマ抗原タンパク質を混合することを特徴す
る免疫学的梅毒トレポネーマ診断試薬の製造方法であ
る。
Description
【０００１】
【発明の属する分野】本発明は、被検物質中に含まれて
いる抗トレポネーマ抗体と、抗原を担持（感作）した担
体との抗原抗体反応によって生じた凝集の度合いを光学
的に測定することにより、被検物質中の抗トレポネーマ
抗体を測定し、これによって梅毒トレポネーマの感染を
診断するのに用いる診断試薬に関する。より詳しくは、
本発明は、遺伝子工学的手法によりクローニングされた
梅毒トレポネーマ抗原を不溶性担体に担持させることに
より得られる診断試薬の製造方法に関する。
いる抗トレポネーマ抗体と、抗原を担持（感作）した担
体との抗原抗体反応によって生じた凝集の度合いを光学
的に測定することにより、被検物質中の抗トレポネーマ
抗体を測定し、これによって梅毒トレポネーマの感染を
診断するのに用いる診断試薬に関する。より詳しくは、
本発明は、遺伝子工学的手法によりクローニングされた
梅毒トレポネーマ抗原を不溶性担体に担持させることに
より得られる診断試薬の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】梅毒は梅毒トレポネーマにより引き起こ
される感染症であり、梅毒に感染しているか否かは、血
液中に抗梅毒トレポネーマ抗体の存在で判断される。臨
床検査分野において、従来より梅毒トレポネーマ抗原を
不溶性担体に担持させ、抗梅毒トレポネーマ抗体との抗
原抗体反応により生じた不溶性担体の凝集の度合いを検
出することにより該抗体を測定する免疫測定法が用いら
れてきた。このような測定方法としては、赤血球凝集反
応法、ラテックス凝集法が知られている。
される感染症であり、梅毒に感染しているか否かは、血
液中に抗梅毒トレポネーマ抗体の存在で判断される。臨
床検査分野において、従来より梅毒トレポネーマ抗原を
不溶性担体に担持させ、抗梅毒トレポネーマ抗体との抗
原抗体反応により生じた不溶性担体の凝集の度合いを検
出することにより該抗体を測定する免疫測定法が用いら
れてきた。このような測定方法としては、赤血球凝集反
応法、ラテックス凝集法が知られている。
【０００３】従来、これらの方法に用いられていた梅毒
トレポネーマ抗原は梅毒菌体から抽出する方法によって
得られていた（特開平２−２３４０６３号公報参照）。
トレポネーマ抗原は梅毒菌体から抽出する方法によって
得られていた（特開平２−２３４０６３号公報参照）。
【０００４】しかし、梅毒菌体を試験管内(in vitro)で
培養することは現在の技術ではウサギ睾丸中での培養を
除いて不可能であり、大量の抗原を得ることは困難であ
った。また、ウサギ睾丸中での梅毒菌体の培養にして
も、培養がウサギの体調に左右される、菌体からの精製
過程が煩雑である等、不安定な要素が多く、診断試薬作
製に必要な抗原活性があるものが毎回コンスタントに得
られるとは限らなかった。
培養することは現在の技術ではウサギ睾丸中での培養を
除いて不可能であり、大量の抗原を得ることは困難であ
った。また、ウサギ睾丸中での梅毒菌体の培養にして
も、培養がウサギの体調に左右される、菌体からの精製
過程が煩雑である等、不安定な要素が多く、診断試薬作
製に必要な抗原活性があるものが毎回コンスタントに得
られるとは限らなかった。
【０００５】梅毒トレポネーマの表面抗原タンパク質に
は種々の分子量のものが存在することが知られており、
その抗原抗体反応において主要なものとしては分子量４
７ｋＤａの抗原タンパク質、分子量１７ｋＤａの抗原タ
ンパク質、および分子量１５ｋＤａの抗原タンパク質が
知られている。これら表面抗原をコードする遺伝子はす
でにクローニングされ、アミノ酸配列も決定されている
ので、これらを遺伝子工学的に生産することが可能であ
る（Infection and Immunity 57(1),196-203(1989)、In
fection and Immunity 61,1202-1210(1993) 、Molecula
r Microbiology4,1371-1379(1990)）。これら３種類の
表面抗原タンパク質のアミノ酸配列は異なっており、全
く別のタンパク質である。
は種々の分子量のものが存在することが知られており、
その抗原抗体反応において主要なものとしては分子量４
７ｋＤａの抗原タンパク質、分子量１７ｋＤａの抗原タ
ンパク質、および分子量１５ｋＤａの抗原タンパク質が
知られている。これら表面抗原をコードする遺伝子はす
でにクローニングされ、アミノ酸配列も決定されている
ので、これらを遺伝子工学的に生産することが可能であ
る（Infection and Immunity 57(1),196-203(1989)、In
fection and Immunity 61,1202-1210(1993) 、Molecula
r Microbiology4,1371-1379(1990)）。これら３種類の
表面抗原タンパク質のアミノ酸配列は異なっており、全
く別のタンパク質である。
【０００６】また、これらのタンパク質を使用した診断
試薬の製造方法として、特表昭５９−５０２１３１号公
報、特表平２−５００４０３号公報に記載のもの等が知
られているが、実用的に使用可能な報告例はまだない。
この原因として、測定の感度が不足していること、特異
性が一致しない等が考えられる。
試薬の製造方法として、特表昭５９−５０２１３１号公
報、特表平２−５００４０３号公報に記載のもの等が知
られているが、実用的に使用可能な報告例はまだない。
この原因として、測定の感度が不足していること、特異
性が一致しない等が考えられる。
【０００７】また、特開平７−２８７０１７号公報の手
法では、遺伝子工学的方法を用いてグルタチオン−Ｓ−
トランスフェラーゼと１５ｋＤａ抗原または１７ｋＤａ
抗原との複合タンパク質で診断試薬を作製しているが、
得られた抗原はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ
を結合しているため、純粋な梅毒抗原とは言い難く、ま
た、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼが反応系に
存在することとなり、検体へ悪影響を及ぼすことが考え
られる。
法では、遺伝子工学的方法を用いてグルタチオン−Ｓ−
トランスフェラーゼと１５ｋＤａ抗原または１７ｋＤａ
抗原との複合タンパク質で診断試薬を作製しているが、
得られた抗原はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ
を結合しているため、純粋な梅毒抗原とは言い難く、ま
た、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼが反応系に
存在することとなり、検体へ悪影響を及ぼすことが考え
られる。
【０００８】
【本発明が解決しようとする課題】本発明は、上記問題
点を解決することを企図したものであり、その目的とす
るところは遺伝子工学的に生産された梅毒トレポネーマ
抗原を用いて診断試薬を製造し、菌体から精製された抗
原を用いて得た診断試薬と同等の性能を有する診断試薬
を提供することにある。
点を解決することを企図したものであり、その目的とす
るところは遺伝子工学的に生産された梅毒トレポネーマ
抗原を用いて診断試薬を製造し、菌体から精製された抗
原を用いて得た診断試薬と同等の性能を有する診断試薬
を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明の免疫学的梅毒ト
レポネーマ診断試薬の製造方法は、遺伝子工学的手法を
用いてクローニングされ得る梅毒トレポネーマ抗原タン
パク質を不溶性担体に担持させて、免疫学的診断試薬を
製造するに際し、水溶性高分子を含有している水性媒体
中で不溶性担体と該梅毒トレポネーマ抗原タンパク質を
混合することを特徴するものである。上記梅毒トレポネ
ーマ抗原タンパク質は、通常、数種類ある。
レポネーマ診断試薬の製造方法は、遺伝子工学的手法を
用いてクローニングされ得る梅毒トレポネーマ抗原タン
パク質を不溶性担体に担持させて、免疫学的診断試薬を
製造するに際し、水溶性高分子を含有している水性媒体
中で不溶性担体と該梅毒トレポネーマ抗原タンパク質を
混合することを特徴するものである。上記梅毒トレポネ
ーマ抗原タンパク質は、通常、数種類ある。
【００１０】上記梅毒トレポネーマ抗原タンパク質とし
ては、分子量４７ｋＤａの抗原タンパク質（以下４７ｋ
Ｄａ抗原と略記する）、分子量１７ｋＤａの抗原タンパ
ク質（以下１７ｋＤａ抗原と略記する）、または分子量
１５ｋＤａの抗原タンパク質（以下１５ｋＤａ抗原と略
記する）が好ましい。
ては、分子量４７ｋＤａの抗原タンパク質（以下４７ｋ
Ｄａ抗原と略記する）、分子量１７ｋＤａの抗原タンパ
ク質（以下１７ｋＤａ抗原と略記する）、または分子量
１５ｋＤａの抗原タンパク質（以下１５ｋＤａ抗原と略
記する）が好ましい。
【００１１】上記水溶性高分子としては、ポリエチレン
グリコールまたはポリグリコシルエチルメタクリレート
が好ましい。
グリコールまたはポリグリコシルエチルメタクリレート
が好ましい。
【００１２】上記不溶性担体としては、合成高分子から
なるラテックスが好ましい。
なるラテックスが好ましい。
【００１３】上記方法によって、遺伝子工学的手法によ
りクローニングされた梅毒トレポネーマ抗原を不溶性担
体に担持させてなる、高感度かつ高精度の免疫学的梅毒
トレポネーマ診断試薬が提供される。
りクローニングされた梅毒トレポネーマ抗原を不溶性担
体に担持させてなる、高感度かつ高精度の免疫学的梅毒
トレポネーマ診断試薬が提供される。
【００１４】
【発明の実施の形態】本発明に用いられる梅毒トレポネ
ーマ抗原は遺伝子工学的手法により梅毒菌体遺伝子から
クローニングされたものであればよく、そのクローニン
グ法はどのような方法でもよい。梅毒トレポネーマ抗原
の遺伝子はすでに公知であるので、４７ｋＤａ抗原を例
として挙げると、まずＰＣＲ法により４７ｋＤａ抗原に
対するＤＮＡを増幅、精製し、得られたＤＮＡ断片を適
当な発現ベクターに組み込み、ついでこのベクターを大
腸菌に導入し、大腸菌に大量生産させる方法が用いられ
る。大腸菌から効率よく４７ｋＤａ抗原を精製するに
は、ベクターとしてグルタチオン−Ｓ−トランスフェラ
ーゼ（以下ＧＳＴと略記する）遺伝子を含むものを用い
る（特公平６−８１５９６号公報参照）。この方法で
は、ＧＳＴ遺伝子の後に梅毒トレポネーマ抗原遺伝子を
挿入し、このベクターを大腸菌に導入して大腸菌にＧＳ
Ｔと４７ｋＤａ抗原の融合タンパク質を生産させる。こ
れが十分に生産された後、菌体を破壊し、これを遠心分
離して得られる上清を固定グルタチオンと接触させるこ
とで融合タンパク質を分離できる。次いでこの融合タン
パク質を開裂させて４７ｋＤａ抗原を得ることができ
る。
ーマ抗原は遺伝子工学的手法により梅毒菌体遺伝子から
クローニングされたものであればよく、そのクローニン
グ法はどのような方法でもよい。梅毒トレポネーマ抗原
の遺伝子はすでに公知であるので、４７ｋＤａ抗原を例
として挙げると、まずＰＣＲ法により４７ｋＤａ抗原に
対するＤＮＡを増幅、精製し、得られたＤＮＡ断片を適
当な発現ベクターに組み込み、ついでこのベクターを大
腸菌に導入し、大腸菌に大量生産させる方法が用いられ
る。大腸菌から効率よく４７ｋＤａ抗原を精製するに
は、ベクターとしてグルタチオン−Ｓ−トランスフェラ
ーゼ（以下ＧＳＴと略記する）遺伝子を含むものを用い
る（特公平６−８１５９６号公報参照）。この方法で
は、ＧＳＴ遺伝子の後に梅毒トレポネーマ抗原遺伝子を
挿入し、このベクターを大腸菌に導入して大腸菌にＧＳ
Ｔと４７ｋＤａ抗原の融合タンパク質を生産させる。こ
れが十分に生産された後、菌体を破壊し、これを遠心分
離して得られる上清を固定グルタチオンと接触させるこ
とで融合タンパク質を分離できる。次いでこの融合タン
パク質を開裂させて４７ｋＤａ抗原を得ることができ
る。
【００１５】本発明に用いられる梅毒トレポネーマ抗原
はすでに述べた４７ｋＤａ抗原、１７ｋＤａ抗原および
１５ｋＤａ抗原の他に、４４ｋＤａ（Journal of Genet
icalMicrobiology 133,1793-1803(1987) ）、４２ｋＤ
ａ（Infection and Immunity57(9),2612-2623(198
9)）、３５ｋＤａ（Infection and Immunity 59(10),35
36-3546(1991) ）、３４ｋＤａ（Infection and Immuni
ty 57(11),3314-3323(1989) ）等の大きさの分子量を有
する抗原であってもよい。これらの抗原のうち、４７ｋ
Ｄａ抗原、１７ｋＤａ抗原および１５ｋＤａ抗原が主抗
原となっていると考えられており、好適に使用される。
はすでに述べた４７ｋＤａ抗原、１７ｋＤａ抗原および
１５ｋＤａ抗原の他に、４４ｋＤａ（Journal of Genet
icalMicrobiology 133,1793-1803(1987) ）、４２ｋＤ
ａ（Infection and Immunity57(9),2612-2623(198
9)）、３５ｋＤａ（Infection and Immunity 59(10),35
36-3546(1991) ）、３４ｋＤａ（Infection and Immuni
ty 57(11),3314-3323(1989) ）等の大きさの分子量を有
する抗原であってもよい。これらの抗原のうち、４７ｋ
Ｄａ抗原、１７ｋＤａ抗原および１５ｋＤａ抗原が主抗
原となっていると考えられており、好適に使用される。
【００１６】本発明に用いられる不溶性担体の例として
は、例えば、有機高分子粉末、微生物、血球、細胞膜
片、プラスチック製マイクロタイタープレート等が挙げ
られる。
は、例えば、有機高分子粉末、微生物、血球、細胞膜
片、プラスチック製マイクロタイタープレート等が挙げ
られる。
【００１７】上記有機高分子粉末としては、例えば、不
溶性アガロース、セルロース、不溶性デキストラン等の
天然高分子粉末や、ポリスチレン、スチレン−スチレン
スルホン酸共重合体、スチレン−メタクリル酸共重合
体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合
体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビ
ニル−アクリル酸エステル共重合体等の合成高分子粉末
等が挙げられ、特に合成高分子粉末を均一に懸濁させた
ラテックスが好ましい。
溶性アガロース、セルロース、不溶性デキストラン等の
天然高分子粉末や、ポリスチレン、スチレン−スチレン
スルホン酸共重合体、スチレン−メタクリル酸共重合
体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合
体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビ
ニル−アクリル酸エステル共重合体等の合成高分子粉末
等が挙げられ、特に合成高分子粉末を均一に懸濁させた
ラテックスが好ましい。
【００１８】上記ラテックスを用いる場合、粒径は好ま
しくは０．１〜１．０μｍ、より好ましくは０．１〜
０．５μｍである。
しくは０．１〜１．０μｍ、より好ましくは０．１〜
０．５μｍである。
【００１９】本発明に用いられる水溶性高分子として
は、例えば、ポリエチレングリコールや、ポリグリコシ
ルエチルメタクリレート、すなわち、下記式で表される
グリコシルエチルメタクリレート
は、例えば、ポリエチレングリコールや、ポリグリコシ
ルエチルメタクリレート、すなわち、下記式で表される
グリコシルエチルメタクリレート
【化１】
【００２０】を用いて得られた（共）重合体（特開平４
−１２２８５８号公報参照）等が挙げられるが、特に限
定するものではない。ポリエチレングリコールとして
は、平均分子量が１，０００〜５０，０００のものが好
ましく、６，０００〜２０，０００ものがより好まし
い。平均分子量が１，０００以下であれば、後述する本
発明の効果が得られないことがある。また、平均分子量
が５０，０００以上になれば、不溶性担体が自己凝集し
てしまう恐れがある。ポリグリコシルエチルメタクリレ
ートとしては、平均分子量が１００，０００〜１，５０
０，０００のものが好ましく、５００，０００〜１，２
００，０００ものがより好ましい。平均分子量が１０
０，０００以下であれば、本発明の効果が得られないこ
とがある。また、平均分子量が１，５００，０００以上
になれば、不溶性担体が自己凝集してしまう恐れがあ
る。
−１２２８５８号公報参照）等が挙げられるが、特に限
定するものではない。ポリエチレングリコールとして
は、平均分子量が１，０００〜５０，０００のものが好
ましく、６，０００〜２０，０００ものがより好まし
い。平均分子量が１，０００以下であれば、後述する本
発明の効果が得られないことがある。また、平均分子量
が５０，０００以上になれば、不溶性担体が自己凝集し
てしまう恐れがある。ポリグリコシルエチルメタクリレ
ートとしては、平均分子量が１００，０００〜１，５０
０，０００のものが好ましく、５００，０００〜１，２
００，０００ものがより好ましい。平均分子量が１０
０，０００以下であれば、本発明の効果が得られないこ
とがある。また、平均分子量が１，５００，０００以上
になれば、不溶性担体が自己凝集してしまう恐れがあ
る。
【００２１】梅毒トレポネーマ抗原タンパク質を不溶性
担体に担持させる際に用いられる水性媒体としては、各
種緩衝液が好ましい。この緩衝液は、被検物質を失活さ
せることなく、かつ、抗原抗体反応を阻害しないような
イオン強度やｐＨを有するものであればよい。例えば、
リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液等が使用
される。
担体に担持させる際に用いられる水性媒体としては、各
種緩衝液が好ましい。この緩衝液は、被検物質を失活さ
せることなく、かつ、抗原抗体反応を阻害しないような
イオン強度やｐＨを有するものであればよい。例えば、
リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液等が使用
される。
【００２２】また、梅毒トレポネーマ抗原タンパク質を
不溶性担体に担持させる際の水溶性高分子の濃度は、好
ましくは０．０５〜１０％（Ｗ／Ｖ）、より好ましくは
１〜５％（Ｗ／Ｖ）である。水溶性高分子の濃度が０．
０５％（Ｗ／Ｖ）以下であれば、後述する本発明の効果
が得られないことがある。また、この濃度が１０％（Ｗ
／Ｖ）以上になれば、梅毒トレポネーマ抗原タンパク質
が水溶性高分子により自己凝集してしまう恐れがある。
不溶性担体に担持させる際の水溶性高分子の濃度は、好
ましくは０．０５〜１０％（Ｗ／Ｖ）、より好ましくは
１〜５％（Ｗ／Ｖ）である。水溶性高分子の濃度が０．
０５％（Ｗ／Ｖ）以下であれば、後述する本発明の効果
が得られないことがある。また、この濃度が１０％（Ｗ
／Ｖ）以上になれば、梅毒トレポネーマ抗原タンパク質
が水溶性高分子により自己凝集してしまう恐れがある。
【００２３】これら水溶性高分子は、種々の方法により
製造することができるが、市販品を使用してもよい。
製造することができるが、市販品を使用してもよい。
【００２４】梅毒トレポネーマ抗原タンパク質の不溶性
担体への担持は、主として物理的吸着により梅毒トレポ
ネーマ抗原タンパク質を不溶性担体に結合させるもので
ある。この際、梅毒トレポネーマ抗原タンパク質と不溶
性担体は荷電により水性媒体中で容易に吸着を起こす。
担体への担持は、主として物理的吸着により梅毒トレポ
ネーマ抗原タンパク質を不溶性担体に結合させるもので
ある。この際、梅毒トレポネーマ抗原タンパク質と不溶
性担体は荷電により水性媒体中で容易に吸着を起こす。
【００２５】本発明の製造方法において、水溶性高分子
は、梅毒トレポネーマ抗原タンパク質を不溶性担体に担
持させる際に水性媒体中に存在しておればよく、予め梅
毒トレポネーマ抗原タンパク質や不溶性担体を含む水性
媒体中に含有させておいてもよい。
は、梅毒トレポネーマ抗原タンパク質を不溶性担体に担
持させる際に水性媒体中に存在しておればよく、予め梅
毒トレポネーマ抗原タンパク質や不溶性担体を含む水性
媒体中に含有させておいてもよい。
【００２６】上記物理的吸着のための水性媒体の温度
は、０℃〜５０℃であることが好ましい。０℃よりも低
い温度では十分に吸着が進行しない場合があり、また、
５０℃よりも高い温度では抗原タンパク質が変性してし
てしまい抗原性を失ってしまう等の恐れがある。
は、０℃〜５０℃であることが好ましい。０℃よりも低
い温度では十分に吸着が進行しない場合があり、また、
５０℃よりも高い温度では抗原タンパク質が変性してし
てしまい抗原性を失ってしまう等の恐れがある。
【００２７】上記物理的吸着のための水性媒体のｐＨ
は、４〜１０であることが好ましい。ｐＨ４よりも酸
性、あるいは、ｐＨ１０よりもアルカリ性では、抗原タ
ンパク質が変性してしまう等の恐れがある。
は、４〜１０であることが好ましい。ｐＨ４よりも酸
性、あるいは、ｐＨ１０よりもアルカリ性では、抗原タ
ンパク質が変性してしまう等の恐れがある。
【００２８】本発明によって作製された診断試薬を用い
た抗トレポネーマ抗体の測定は公知の方法に従って行わ
れる。すなわち、被検物質中に含まれている抗トレポネ
ーマ抗体と本発明によって作製された診断試薬を混合
し、生じた凝集の度合いを光学的に測定することによ
り、被検物質中の抗トレポネーマ抗体を測定する。
た抗トレポネーマ抗体の測定は公知の方法に従って行わ
れる。すなわち、被検物質中に含まれている抗トレポネ
ーマ抗体と本発明によって作製された診断試薬を混合
し、生じた凝集の度合いを光学的に測定することによ
り、被検物質中の抗トレポネーマ抗体を測定する。
【００２９】具体的には、不溶性担体の凝集の度合いを
光学的に検出する方法は、散乱光強度、吸光度および透
過光強度を測定する光学機器を用いて行う。使用される
測定波長としては２５０〜１，０００ｎｍが好ましい。
また、この検出方法は、公知の方法に従い、使用する不
溶性担体の粒子の大きさ、あるいは、反応体の濃度の選
択、反応時間の設定により、散乱光強度、吸光度または
透過光強度の増加もしくは減少を測定することにより行
われ、これらの方法を併用することもできる。
光学的に検出する方法は、散乱光強度、吸光度および透
過光強度を測定する光学機器を用いて行う。使用される
測定波長としては２５０〜１，０００ｎｍが好ましい。
また、この検出方法は、公知の方法に従い、使用する不
溶性担体の粒子の大きさ、あるいは、反応体の濃度の選
択、反応時間の設定により、散乱光強度、吸光度または
透過光強度の増加もしくは減少を測定することにより行
われ、これらの方法を併用することもできる。
【００３０】この抗原抗体反応による免疫測定法におい
て、反応条件は通常の場合と同様であり、反応媒体とし
ては各種緩衝液が用いられる。この緩衝液は、被検物質
を失活させることなく、かつ、抗原抗体反応を阻害しな
いようなイオン強度やｐＨを有するものであればよい。
例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液
等が使用される。反応のｐＨは好ましくは４〜１０、特
に好ましくは６〜８である。反応温度は好ましくは１０
〜５０℃、特に好ましくは３０〜４０℃である。
て、反応条件は通常の場合と同様であり、反応媒体とし
ては各種緩衝液が用いられる。この緩衝液は、被検物質
を失活させることなく、かつ、抗原抗体反応を阻害しな
いようなイオン強度やｐＨを有するものであればよい。
例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液
等が使用される。反応のｐＨは好ましくは４〜１０、特
に好ましくは６〜８である。反応温度は好ましくは１０
〜５０℃、特に好ましくは３０〜４０℃である。
【００３１】
【実施例】以下に本発明の実施例を述べ、その効果を具
体的に説明する。
体的に説明する。
【００３２】実施例１ １）抗原の調製 例として４７ｋＤａ抗原の調製法を挙げる。
【００３３】梅毒トレポネーマ継代ウサギ睾丸より梅毒
トレポネーマ菌体を抽出し、ゲノムＤＮＡを取得した。
すでに４７ｋＤａ抗原のＤＮＡ配列は既知であるので、
それらをもとにＤＮＡ合成装置を用いてプライマーを作
製した。このプライマーを用いてＰＣＲ法により４７ｋ
Ｄａ抗原のＤＮＡ断片を得た。ＧＳＴとの融合タンパク
質を発現するために作られたベクターｐＧＥＸ４３にこ
のＤＮＡ断片を挿入した。こうして得られた組換え体を
ｐＧＥＸ４３−４７ｋと命名した。これを大腸菌に導入
し、培養液にイソプロピル−β−（−）−チオガラクト
ピラノシドを加えることにより４７ｋＤａ抗原とＧＳＴ
の融合タンパク質の発現を誘導した。十分に融合タンパ
ク質が発現した大腸菌を超音波処理により菌体を破砕
し、遠心分離により細胞膜、核等を除いた上清にグルタ
チオンセファロース４Ｂ（ファルマシア社製）を加え、
一晩放置し融合タンパク質をグルタチオンセファロース
に吸着させた。遠心分離により融合タンパク質が吸着し
たグルタチオンセファロースを回収し、これをカラムに
充填した。数回洗浄の後、グルタチオン溶液を流すこと
により融合タンパク質がグルタチオンセファロースから
遊離し溶出した。
トレポネーマ菌体を抽出し、ゲノムＤＮＡを取得した。
すでに４７ｋＤａ抗原のＤＮＡ配列は既知であるので、
それらをもとにＤＮＡ合成装置を用いてプライマーを作
製した。このプライマーを用いてＰＣＲ法により４７ｋ
Ｄａ抗原のＤＮＡ断片を得た。ＧＳＴとの融合タンパク
質を発現するために作られたベクターｐＧＥＸ４３にこ
のＤＮＡ断片を挿入した。こうして得られた組換え体を
ｐＧＥＸ４３−４７ｋと命名した。これを大腸菌に導入
し、培養液にイソプロピル−β−（−）−チオガラクト
ピラノシドを加えることにより４７ｋＤａ抗原とＧＳＴ
の融合タンパク質の発現を誘導した。十分に融合タンパ
ク質が発現した大腸菌を超音波処理により菌体を破砕
し、遠心分離により細胞膜、核等を除いた上清にグルタ
チオンセファロース４Ｂ（ファルマシア社製）を加え、
一晩放置し融合タンパク質をグルタチオンセファロース
に吸着させた。遠心分離により融合タンパク質が吸着し
たグルタチオンセファロースを回収し、これをカラムに
充填した。数回洗浄の後、グルタチオン溶液を流すこと
により融合タンパク質がグルタチオンセファロースから
遊離し溶出した。
【００３４】こうして精製された４７ｋＤａ抗原−ＧＳ
Ｔ融合タンパク質溶液にトロンビン溶液を添加し、４７
ｋＤａ抗原とＧＳＴの結合を切断した。この結果、４７
ｋＤａ抗原、ＧＳＴおよびトロンビンを含む溶液が得ら
れた。この溶液をグルタチオンセファロースカラムにか
けることによりＧＳＴを除去することができた。さらに
この溶液をヘパリンカラムにかけることによりトロンビ
ンを除去することができ、精製４７ｋＤａ抗原が得られ
た。
Ｔ融合タンパク質溶液にトロンビン溶液を添加し、４７
ｋＤａ抗原とＧＳＴの結合を切断した。この結果、４７
ｋＤａ抗原、ＧＳＴおよびトロンビンを含む溶液が得ら
れた。この溶液をグルタチオンセファロースカラムにか
けることによりＧＳＴを除去することができた。さらに
この溶液をヘパリンカラムにかけることによりトロンビ
ンを除去することができ、精製４７ｋＤａ抗原が得られ
た。
【００３５】上記方法と同様にして精製１７ｋＤａ抗原
および精製１５ｋＤａ抗原も得ることができた。
および精製１５ｋＤａ抗原も得ることができた。
【００３６】２）４７ｋＤａ抗原タンパク質担持ラテッ
クス液の調製 １００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）１ｍｌに、上記
１）で得られた４７ｋＤａ抗原タンパク質（タンパク濃
度；１ｍｇ／ｍｌ）を０．１ｍｌ加えた。この抗原タン
パク質溶液０．５ｍｌと、１０％（Ｗ／Ｖ）のポリエチ
レングリコール６，０００（以下ＰＥＧ６，０００と略
記する、平均分子量７，５００、ナカライテスク社製）
を含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）０．５ｍ
ｌを添加し、混合した。
クス液の調製 １００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）１ｍｌに、上記
１）で得られた４７ｋＤａ抗原タンパク質（タンパク濃
度；１ｍｇ／ｍｌ）を０．１ｍｌ加えた。この抗原タン
パク質溶液０．５ｍｌと、１０％（Ｗ／Ｖ）のポリエチ
レングリコール６，０００（以下ＰＥＧ６，０００と略
記する、平均分子量７，５００、ナカライテスク社製）
を含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）０．５ｍ
ｌを添加し、混合した。
【００３７】このポリエチレングリコール含有抗原タン
パク質溶液０．５ｍｌに、平均粒径４００ｎｍのポリス
チレンからなるラテックス（固形分１０％、積水化学社
製）０．１ｍｌを添加し、液全体を室温で１時間撹拌し
た。
パク質溶液０．５ｍｌに、平均粒径４００ｎｍのポリス
チレンからなるラテックス（固形分１０％、積水化学社
製）０．１ｍｌを添加し、液全体を室温で１時間撹拌し
た。
【００３８】次いで、牛血清アルブミン（以下ＢＳＡと
略記する）を１％（Ｗ／Ｖ）含有する１００ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ７．４）を５ｍｌ添加し、更に液全体を室
温で１時間撹拌した。
略記する）を１％（Ｗ／Ｖ）含有する１００ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ７．４）を５ｍｌ添加し、更に液全体を室
温で１時間撹拌した。
【００３９】この混合液を、１５，０００ｒｐｍで３０
分間遠心分離した。得られた沈澱物に、ＢＳＡを１％
（Ｗ／Ｖ）含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
４）を５ｍｌ添加し、ラテックスを再懸濁し、４７ｋＤ
ａ抗原タンパク質担持ラテックス溶液を調製した。
分間遠心分離した。得られた沈澱物に、ＢＳＡを１％
（Ｗ／Ｖ）含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
４）を５ｍｌ添加し、ラテックスを再懸濁し、４７ｋＤ
ａ抗原タンパク質担持ラテックス溶液を調製した。
【００４０】３）検体希釈液の調製 １００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に、ＢＳＡを１
％（Ｗ／Ｖ）、ＰＥＧ６，０００を２％（Ｗ／Ｖ）とな
るようにそれぞれ溶解し、検体希釈液を調製した。
％（Ｗ／Ｖ）、ＰＥＧ６，０００を２％（Ｗ／Ｖ）とな
るようにそれぞれ溶解し、検体希釈液を調製した。
【００４１】尚、この溶液に含まれるＰＥＧ６，０００
は、抗原抗体反応の促進剤として使用した。
は、抗原抗体反応の促進剤として使用した。
【００４２】４）抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬 本実施例の抗トレポネーマ抗体の測定試薬は、上記抗原
タンパク質担持ラテックス液からなる第１試薬と、上記
検体希釈液からなる第２試薬とから構成される２液系の
試薬である。
タンパク質担持ラテックス液からなる第１試薬と、上記
検体希釈液からなる第２試薬とから構成される２液系の
試薬である。
【００４３】５）抗梅毒トレポネーマ抗体の測定方法 生化学用自動分析装置（日立７０５０形、日立製作所社
製）により、検量線感度の測定およびヒト血清中の抗ト
レポネーマ抗体量の測定を実施した。操作法を以下に示
す。
製）により、検量線感度の測定およびヒト血清中の抗ト
レポネーマ抗体量の測定を実施した。操作法を以下に示
す。
【００４４】梅毒陽性標準血清（抗トレポネーマ抗体量
は既知）２０μｌに、検体希釈液（第２試薬）３５０μ
ｌを添加して混合し、一定時間経過後、抗原タンパク質
担持ラテックス液（第１試薬）５０μｌを添加して混合
した。
は既知）２０μｌに、検体希釈液（第２試薬）３５０μ
ｌを添加して混合し、一定時間経過後、抗原タンパク質
担持ラテックス液（第１試薬）５０μｌを添加して混合
した。
【００４５】ラテックス液添加後、８０秒から３２０秒
間の濁度変化量を、該標準血清の反応量とした。
間の濁度変化量を、該標準血清の反応量とした。
【００４６】標準血清の代わりにヒト血清（１５検体、
抗トレポネーマ抗体量は不明）を用いた点を除いて、上
記と同様に操作し、該血清の反応量を求めた。標準血清
とヒト血清の反応量から、ヒト血清中の抗トレポネーマ
抗体の量を求めた。尚、全反応は、３７℃で実施し、測
定波長は５７０ｎｍとした。
抗トレポネーマ抗体量は不明）を用いた点を除いて、上
記と同様に操作し、該血清の反応量を求めた。標準血清
とヒト血清の反応量から、ヒト血清中の抗トレポネーマ
抗体の量を求めた。尚、全反応は、３７℃で実施し、測
定波長は５７０ｎｍとした。
【００４７】また、検体測定では、市販品（メディエー
スＴＰＬＡ、積水化学社製）を用いて測定した値を対照
とした（以下対照品とする）。
スＴＰＬＡ、積水化学社製）を用いて測定した値を対照
とした（以下対照品とする）。
【００４８】実施例２ 実施例１の工程２）において、４７ｋＤａ抗原の代わり
に、１５ｋＤａ抗原を用いた以外は、実施例１）と同様
にして、抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬の製造および
これを用いた抗梅毒トレポネーマ抗体測定を実施した。
に、１５ｋＤａ抗原を用いた以外は、実施例１）と同様
にして、抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬の製造および
これを用いた抗梅毒トレポネーマ抗体測定を実施した。
【００４９】実施例３ 実施例１の工程２）において、４７ｋＤａ抗原の代わり
に、１７ｋＤａ抗原を用いた以外は、実施例１）と同様
にして、抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬の製造および
これを用いた抗梅毒トレポネーマ抗体測定を実施した。
に、１７ｋＤａ抗原を用いた以外は、実施例１）と同様
にして、抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬の製造および
これを用いた抗梅毒トレポネーマ抗体測定を実施した。
【００５０】実施例４ 実施例１の工程２）において、１０％（Ｗ／Ｖ）ＰＥＧ
６，０００を含む１００ｍＭリン酸緩衝液の代わりに、
２％（Ｗ／Ｖ）ＰＥＧ６，０００を含む１００ｍＭリン
酸緩衝液を用いた以外は、実施例１）と同様にして、抗
梅毒トレポネーマ抗体測定試薬の製造およびこれを用い
た抗梅毒トレポネーマ抗体測定を実施した。
６，０００を含む１００ｍＭリン酸緩衝液の代わりに、
２％（Ｗ／Ｖ）ＰＥＧ６，０００を含む１００ｍＭリン
酸緩衝液を用いた以外は、実施例１）と同様にして、抗
梅毒トレポネーマ抗体測定試薬の製造およびこれを用い
た抗梅毒トレポネーマ抗体測定を実施した。
【００５１】実施例５ 実施例１の工程２）において、１０％（Ｗ／Ｖ）ＰＥＧ
６，０００を含む１００ｍＭリン酸緩衝液の代わりに、
１０％（Ｗ／Ｖ）ポリエチレングリコール２０，０００
を含む１００ｍＭリン酸緩衝液を用いた以外は、実施例
１）と同様にして、抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬の
製造およびこれを用いた抗梅毒トレポネーマ抗体測定を
実施した。
６，０００を含む１００ｍＭリン酸緩衝液の代わりに、
１０％（Ｗ／Ｖ）ポリエチレングリコール２０，０００
を含む１００ｍＭリン酸緩衝液を用いた以外は、実施例
１）と同様にして、抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬の
製造およびこれを用いた抗梅毒トレポネーマ抗体測定を
実施した。
【００５２】実施例６ 実施例１の工程２）において、１０％（Ｗ／Ｖ）ＰＥＧ
６，０００を含む１００ｍＭリン酸緩衝液の代わりに、
５％（Ｗ／Ｖ）ポリグリコシルエチルメタクリレートを
含む１００ｍＭリン酸緩衝液を用いた以外は、実施例
１）と同様にして、抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬の
製造およびこれを用いた抗梅毒トレポネーマ抗体測定を
実施した。
６，０００を含む１００ｍＭリン酸緩衝液の代わりに、
５％（Ｗ／Ｖ）ポリグリコシルエチルメタクリレートを
含む１００ｍＭリン酸緩衝液を用いた以外は、実施例
１）と同様にして、抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬の
製造およびこれを用いた抗梅毒トレポネーマ抗体測定を
実施した。
【００５３】比較例１ 実施例１の工程２）において、ＰＥＧ６，０００および
ＢＳＡを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）の
代わりに、これらを含まない１００ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．４）を用いた以外は、実施例１と同様にし
て、抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬の製造およびこれ
を用いた抗梅毒トレポネーマ抗体測定を実施した。
ＢＳＡを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）の
代わりに、これらを含まない１００ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．４）を用いた以外は、実施例１と同様にし
て、抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬の製造およびこれ
を用いた抗梅毒トレポネーマ抗体測定を実施した。
【００５４】比較例２ 実施例２の工程２）において、ＰＥＧ６，０００および
ＢＳＡを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）の
代わりに、これらを含まない１００ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．４）を用いた以外は、実施例２と同様にし
て、抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬の製造およびこれ
を用いた抗梅毒トレポネーマ抗体測定を実施した。
ＢＳＡを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）の
代わりに、これらを含まない１００ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．４）を用いた以外は、実施例２と同様にし
て、抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬の製造およびこれ
を用いた抗梅毒トレポネーマ抗体測定を実施した。
【００５５】比較例３ 実施例３の工程２）において、ＰＥＧ６，０００および
ＢＳＡを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）の
代わりに、これらを含まない１００ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．４）を用いた以外は、実施例３と同様にし
て、抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬の製造およびこれ
を用いた抗梅毒トレポネーマ抗体測定を実施した。
ＢＳＡを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）の
代わりに、これらを含まない１００ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．４）を用いた以外は、実施例３と同様にし
て、抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬の製造およびこれ
を用いた抗梅毒トレポネーマ抗体測定を実施した。
【００５６】性能試験結果 １）検量線感度 上記実施例および比較例で実施した検量線感度測定の結
果を表１および表２に示す。
果を表１および表２に示す。
【００５７】
【表１】
【００５８】
【表２】
【００５９】表中、標準品は、上記市販品（メディエー
スＴＰＬＡ）の梅毒陽性標準血清である。また、Ｔ．
Ｕ．は、この市販品（メディエースＴＰＬＡ）で血清を
測定した時の抗トレポネーマ抗体量を表す単位である。
スＴＰＬＡ）の梅毒陽性標準血清である。また、Ｔ．
Ｕ．は、この市販品（メディエースＴＰＬＡ）で血清を
測定した時の抗トレポネーマ抗体量を表す単位である。
【００６０】上記表から、実施例では検量線感度が得ら
れているのに対し、比較例では検量線感度がほとんど得
られていないことがわかる。
れているのに対し、比較例では検量線感度がほとんど得
られていないことがわかる。
【００６１】２）検体測定 ヒト血清中の抗トレポネーマ抗体の測定については、比
較例１〜３では検量線感度がほとんど得られなかったた
め、検体測定を実施しなかった。実施例１〜６および対
照品では、抗体測定を実施した。この測定結果を表３に
示す。
較例１〜３では検量線感度がほとんど得られなかったた
め、検体測定を実施しなかった。実施例１〜６および対
照品では、抗体測定を実施した。この測定結果を表３に
示す。
【００６２】
【表３】
【００６３】上記表から、実施例では血清中の抗トレポ
ネーマ抗体の測定値においても市販品で測定した時の測
定値と良く一致することがわかる。
ネーマ抗体の測定値においても市販品で測定した時の測
定値と良く一致することがわかる。
【００６４】
【発明の効果】本発明によれば、遺伝子工学的に生産さ
れた梅毒トレポネーマ抗原を用いて診断試薬を製造し、
菌体から精製された抗原を用いて得た診断試薬と同等の
性能を有する診断試薬を提供することができる。
れた梅毒トレポネーマ抗原を用いて診断試薬を製造し、
菌体から精製された抗原を用いて得た診断試薬と同等の
性能を有する診断試薬を提供することができる。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (5)
- 【請求項１】 遺伝子工学的手法を用いてクローニング
され得る梅毒トレポネーマ抗原タンパク質を不溶性担体
に担持させて、免疫学的診断試薬を製造するに際し、水
溶性高分子を含有している水性媒体中で不溶性担体と該
梅毒トレポネーマ抗原タンパク質を混合することを特徴
する免疫学的梅毒トレポネーマ診断試薬の製造方法。 - 【請求項２】 梅毒トレポネーマ抗原タンパク質が分子
量４７ｋＤａの抗原タンパク質、分子量１７ｋＤａの抗
原タンパク質、および分子量１５ｋＤａの抗原タンパク
質よりなる群から選ばれる少なくとも１種であることを
特徴とする請求項１記載の製造方法。 - 【請求項３】 水溶性高分子がポリエチレングリコール
またはポリグリコシルエチルメタクリレートであること
を特徴とする請求項１または２記載の製造方法。 - 【請求項４】 不溶性担体が合成高分子からなるラテッ
クスであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに
記載の製造方法。 - 【請求項５】 請求項１〜４のいずれかに記載の方法に
よって製造された免疫学的梅毒トレポネーマ診断試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11623296A JPH09304391A (ja) | 1996-05-10 | 1996-05-10 | 免疫学的梅毒トレポネーマ診断試薬およびその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11623296A JPH09304391A (ja) | 1996-05-10 | 1996-05-10 | 免疫学的梅毒トレポネーマ診断試薬およびその製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09304391A true JPH09304391A (ja) | 1997-11-28 |
Family
ID=14682103
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11623296A Pending JPH09304391A (ja) | 1996-05-10 | 1996-05-10 | 免疫学的梅毒トレポネーマ診断試薬およびその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09304391A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH11183478A (ja) * | 1997-12-25 | 1999-07-09 | Hitachi Chem Co Ltd | 抗体測定試薬及びその製造法 |
-
1996
- 1996-05-10 JP JP11623296A patent/JPH09304391A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH11183478A (ja) * | 1997-12-25 | 1999-07-09 | Hitachi Chem Co Ltd | 抗体測定試薬及びその製造法 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040526 |
|
| A521 | Written amendment |
Effective date: 20040726 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Effective date: 20040929 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Effective date: 20050209 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 |