JPH09288110A - 免疫学的梅毒診断試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 大量生産可能で、安定した抗原活性を持つ、
遺伝子組換え手法を用いて得られた梅毒トレポネーマの
表面抗原蛋白質を使用し、菌体から得られた従来の梅毒
トレポネーマ抗原を用いて製造された試薬と同等の感度
を有する免疫学的梅毒診断試薬を提供する。 【解決手段】 遺伝子組換え手法を用いて得られた梅毒
トレポネーマ表面抗原蛋白質の少なくとも２種類以上
（例、分子量４７ｋＤａ、分子量１７ｋＤａ、分子量１
５ｋＤａの梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質）が担持さ
れた不溶性担体からなる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、梅毒トレポネーマ
表面抗原蛋白質が結合された不溶性担体を利用して、抗
梅毒トレポネーマ抗体との抗原抗体反応に基づいて同抗
体を測定する免疫学的梅毒診断試薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】梅毒は梅毒トレポネーマ（Treponema Pa
llidum）により引き起こされる感染症であり、梅毒に感
染しているか否かは、血液中の抗梅毒トレポネーマ抗体
の存在により判断される。梅毒診断の臨床検査におい
て、従来より、梅毒トレポネーマ抗原を不溶性担体に担
持させ、抗梅毒トレポネーマ抗体との抗原抗体反応によ
り生じた不溶性担体の凝集の度合いを検出することによ
り該抗体を測定する免疫測定法が用いられている。この
ような測定方法としては、赤血球凝集反応法、ラテック
ス凝集法が知られている。

【０００３】従来、これらの方法に用いられる梅毒トレ
ポネーマ抗原は梅毒菌体から抽出されたものが用いられ
ていた（特開平２−２３４０６３号公報）。しかし、梅
毒菌体はin vitroでの培養が現在の技術では不可能であ
り、in vivo であってもウサギ睾丸中での培養のみ可能
であるため、大量の抗原を得ることが困難であった。ま
た、ウサギの体調や菌体からの精製過程も煩雑であるこ
と等、不安定な要素が多く、精製毎に診断試薬作成に必
要な抗原活性があるものが得られるとは限らなかった。

【０００４】また、梅毒トレポネーマの表面抗原蛋白質
には種々の分子量のものが存在することが知られてお
り、その抗原抗体反応において主要なものとしては、分
子量が４７ｋＤａの梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質
（以下、４７ｋＤａ抗原という場合がある）、１７ｋＤ
ａの梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質（以下、１７ｋＤ
ａ抗原という場合がある）、１５ｋＤａの梅毒トレポネ
ーマ表面抗原蛋白質（以下、１５ｋＤａ抗原という場合
がある）などが知られている。これらの表面抗原蛋白質
をコードする遺伝子はすでにクローニングされ、アミノ
酸配列も決定されているので、遺伝子組換え手法を用い
てこれらの表面抗原蛋白質を生産することが可能である
（Infection and Immunity 57(1),196-203(1989)。Infe
ction and Immunity 61,1202-1210(1993) 。Molecular
Microbiology 4,1371-1379(1990)) 。

【０００５】特に、４７ｋＤａ抗原は、その遺伝子組換
え手法を用いた生産方法が提案されるとともに、得られ
た４７ｋＤａ抗原を用いて抗梅毒トレポネーマ抗体を検
出する方法も提案されている（特表平２−５００４０３
号公報）。この方法を使用すれば、梅毒トレポネーマ抗
原を大量に、且つ安定的に得ることが可能と考えられ
る。しかし、特表平２−５００４０３号公報には、この
４７ｋＤａ抗原を用いて抗梅毒トレポネーマ抗体を検出
する方法の詳細については、記載されていない。

【０００６】上記の４７ｋＤａ抗原、１７ｋＤａ抗原、
１５ｋＤａ抗原は、それぞれアミノ酸配列が異なってお
り、それぞれ全く別の表面抗原蛋白質である。つまり、
抗梅毒トレポネーマ抗体は、これらの抗原に対して作ら
れるのであり、より正確に該抗体の有無を検査するため
には、これらの抗原の一種類だけではなく、２種類以上
を含む試薬であることが望ましい。

【０００７】特開平７−２８７０１７号公報には、遺伝
子組換え手法を用いてグルタチオン−Ｓ−トランスフェ
ラーゼと１７ｋＤａ抗原の融合タンパク質、およびグル
タチオン−Ｓ−トランスフェラーゼと１５ｋＤａ抗原の
融合タンパク質を生産し、それらを用いて、抗梅毒トレ
ポネーマ抗体を測定する診断試薬が開示されている。し
かしながら、この試薬は、なお感度が十分ではなく、ま
た、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼが試薬の反
応系に存在することになり、検体への悪影響も懸念され
る。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記問題点
を解決するものであり、その目的は、大量生産可能で、
安定した抗原活性を持つ、遺伝子組換え手法を用いて得
られた梅毒トレポネーマの表面抗原蛋白質を使用し、菌
体から得られた従来の梅毒トレポネーマ抗原を用いて製
造された試薬と同等の感度を有する免疫学的梅毒診断試
薬を提供することにある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】請求項１記載の免疫学的
梅毒診断試薬（以下、本発明１という）は、遺伝子組換
え手法を用いて得られた梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白
質の少なくとも２種類以上が担持された不溶性担体から
なることを特徴とする。

【００１０】本発明１に用いられる梅毒トレポネーマ表
面抗原蛋白質は、遺伝子組換え手法を用いて得られた、
梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質であれば、特に限定さ
れないが、例えば、分子量４７ｋＤａの梅毒トレポネー
マ表面抗原蛋白質、４４ｋＤａの梅毒トレポネーマ表面
抗原蛋白質（Journal of Genetical Microbiology 133,
1793-1803(1987))、４２ｋＤａの梅毒トレポネーマ表面
抗原蛋白質（Infection and Immunity 57(9),2612-2623
(1989)) 、３５ｋＤａの梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白
質（Infection and Immunity 59(10),3536-3546(199
1))、３４ｋＤａの梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質（I
nfection and Immunity 57(11),3314-3323(1989))、１
７ｋＤａの梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質、１５ｋＤ
ａの梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質などが挙げられ、
梅毒トレポネーマの主要な表面抗原蛋白質と考えられて
いる４７ｋＤａの表面抗原蛋白質、１７ｋＤａの表面抗
原蛋白質および１５ｋＤａの表面抗原蛋白質からなる群
より選ばれるのが好ましい。

【００１１】本発明１に用いられる梅毒トレポネーマ表
面抗原蛋白質は、遺伝子組換え手法を用いて得られたも
のに限定されるが、梅毒菌体遺伝子からクローニングさ
れたものであれば、そのクローニング法はどのような方
法でもよい。梅毒トレポネーマの表面抗原蛋白質を得る
ための方法の例を４７ｋＤａ抗原の場合を例として挙げ
ると、４７ｋＤａ抗原のＤＮＡ配列は、前述のように公
知であるので、例えば、ＰＣＲ法により４７ｋＤａ抗原
に対するＤＮＡを増幅、精製し、これを適当な発現ベク
ターに組み込む。このベクターを大腸菌に導入し、大腸
菌に大量生産させる方法が挙げられる。大腸菌から効率
よく４７ｋＤａ抗原を精製するには、ベクターとして特
公平６−８１５９６号公報に記載されているようなグル
タチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（以下、ＧＳＴとい
う）遺伝子を含むものを用いるのが好ましい。この方法
を用いる場合は、ＧＳＴ遺伝子の後に４７ｋＤａ抗原遺
伝子を挿入し、大腸菌にＧＳＴと４７ｋＤａ抗原の融合
タンパク質として生産させる。十分に生産させた後、菌
体を破壊し、リゼイドを固定グルタチオンカラムと接触
させることにより融合タンパク質を分離する。次いで、
この融合タンパク質を開裂させて４７ｋＤａ抗原を得
る。他の梅毒トレポネーマの表面抗原蛋白質を得るに
は、上記の４７ｋＤａ抗原に対するＤＮＡの代わりに、
それぞれの所望の分子量の抗原に対するＤＮＡとするこ
とにより、同様にして所望の分子量の抗原を得ることが
できる。

【００１２】本発明１に用いられる不溶性担体として
は、例えば、有機高分子粒子、微生物、血球、細胞膜
片、プラスチック製マイクロタイタープレート等が挙げ
られる。

【００１３】上記有機高分子粒子としては、例えば、不
溶性アガロース、セルロース、不溶性デキストラン等の
天然高分子粒子；ポリスチレン、スチレン−メタクリル
酸共重合体、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合
体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合
体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビ
ニル−アクリル酸エステル共重合体等の合成高分子粒子
等が挙げられ、特に合成高分子粒子を均一に懸濁させた
ラテックスが好ましい。

【００１４】上記ラテックス粒子を用いる場合、粒径
は、０．１〜１．０μｍが好ましく、０．１〜０．５μ
ｍがより好ましい。

【００１５】上記不溶性担体に梅毒トレポネーマ表面抗
原蛋白質を担持させる方法としては、化学的結合法、物
理吸着法のいずれでもよい。

【００１６】上記化学的結合法で担持させる場合には、
不溶性担体としては、上記表面抗原蛋白質と共有結合を
形成し得る活性基、例えば、カルボキシル基、アミノ
基、チオール基等を有しているものが用いられる。この
場合、不溶性担体が上記の活性基をもともと有している
ときは、そのままでよいが、上記活性基を有していない
ときは、不溶性担体に、例えば、酸化、還元、修飾など
の反応を行って上記活性基が導入されてもよい。

【００１７】上記不溶性担体として、カルボキシル基を
有するラテックス粒子を用いる場合、水溶性カルボジイ
ミドにより、上記表面抗原蛋白質を縮合反応により結合
させることができる。この場合、ラテックス粒子のカル
ボキシル基の量は、表面荷電が０．０３〜０．７５ｍｅ
ｑＣＯＯ^- ／ｇが好ましく、０．０５〜０．４０ｍｅｑ
ＣＯＯ^- ／ｇがより好ましい。

【００１８】上記水溶性カルボジイミドとしては、例え
ば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）
カルボジイミド塩酸塩（以下、ＥＤＣという）、１−シ
クロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジ
イミドメト−ｐ−トルエンスルホン酸塩、１−エチル−
３−（３−ジエチルアミノプロピル）カルボジイミド過
塩素酸塩等が挙げられるが、溶解度、反応性等の点から
ＥＤＣが好ましい。

【００１９】上記縮合反応を用いる場合、ラテックス粒
子と抗原の間に適当なスペーサーを介して結合させるこ
ともできる。上記スペーサーとは、不溶性担体と上記表
面抗原蛋白質との間に介在して、不溶性担体と上記表面
抗原蛋白質とを結合させるものであり、不溶性担体及び
上記表面抗原蛋白質上の活性基と共有結合を生じるもの
である。このようなスペーサーとしては、β−アミノア
ラニン、γ−アミノ酪酸、ε−アミノカプロン酸、グル
タミン酸、ｐ−アミノベンゾエート等のアミノ酸が好ま
しい。スペーサーとして特に好ましいものは、抗原がス
ペーサーを介して、より安定性良く担体に結合される点
からγ−アミノ酪酸、ε−アミノカプロン酸である。

【００２０】上記ＥＤＣによるカップリング反応の反応
温度は、低くなると十分に反応が進行しなくなり、高く
なると上記表面抗原蛋白質が変性し抗原性を失う恐れが
あるので、０℃〜４０℃が好ましい。

【００２１】上記不溶性担体に梅毒トレポネーマ表面抗
原蛋白質を物理吸着法で担持させる場合、不溶性担体と
該表面抗原蛋白質とを溶液中で接触させることにより、
該表面抗原蛋白質と不溶性担体の荷電により容易に吸着
が起こる。この吸着反応の反応温度は、低くなると十分
に反応が進行しなくなり、高くなると表面抗原蛋白質が
変性し抗原性を失う恐れがあるので、０℃〜４０℃が好
ましい。

【００２２】本発明１の免疫学的梅毒診断試薬を製造す
るには、例えば、活性基を有する不溶性担体にＥＤＣを
カップリング剤として用いて、γ−アミノ酪酸又はε−
アミノカプロン酸などのスペーサーを共有結合し、次
に、更にＥＤＣをカップリング剤として用いてスペーサ
ーに、遺伝子組換え手法を用いて得られた梅毒トレポネ
ーマ表面抗原蛋白質の少なくとも２種類以上の混合物を
反応させて共有結合する方法が挙げられる。

【００２３】また、他の製造方法としては、不溶性担体
と遺伝子組換え手法を用いて得られた梅毒トレポネーマ
表面抗原蛋白質の少なくとも２種類以上の混合物とを、
溶液中で接触させて物理的に吸着させる方法が挙げられ
る。

【００２４】本発明１の免疫学的梅毒診断試薬は、検体
と混合されて使用されることにより、検体中の抗梅毒ト
レポネーマ抗体との抗原抗体反応に基づいて同抗体を測
定することができる。

【００２５】上記の抗原抗体反応に際しては、検体を、
ｐＨ５．０〜９．０の緩衝液を用いて希釈してもよい。
上記の検体の希釈液としては、例えば、リン酸緩衝液、
グリシン緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、ク
エン酸緩衝液、トリス緩衝液などが挙げられる。

【００２６】上記検体希釈液には、測定感度の向上、及
び抗原抗体反応の促進を目的として種々の増感剤を添加
することができる。上記増感剤としては、例えば、特開
平２−１７３５６７号公報に記載されたメチルセルロー
ス、エチルセルロース等のアルキル化多糖類、特開平５
−１８０８３８号公報に記載されたプルラン、ポリビニ
ルピロリドン等が挙げられる。

【００２７】また、上記検体希釈液には、非特異反応抑
制を目的として牛血清アルブミン、卵性アルブミン等を
添加することもできる。

【００２８】本発明１の免疫学的梅毒診断試薬によっ
て、抗梅毒トレポネーマ抗体を測定する際の測定系とし
ては、例えば、前記不溶性担体と抗梅毒トレポネーマ抗
体との反応による前記不溶性担体の凝集の程度を測定す
るものが挙げられ、特に、不溶性担体としてラテックス
粒子を用いるラテックス凝集反応系が好ましい。

【００２９】上記反応により生じた凝集を測定する方法
としては、凝集の程度を光学的に観察する方法あるいは
目視により観察する方法などが挙げられる。

【００３０】具体的には、光学的に観察する方法におい
ては、検体を検体希釈液で希釈した液に、本発明１の免
疫学的梅毒診断試薬を含有する液（通常、リン酸緩衝
液、グリシン緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝
液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液など）を混合した
後、該混合液の散乱光強度、吸光度又は透過光強度を測
定する。測定の波長は３００〜２４００ｎｍが使用で
き、測定方法は公知の方法に従い、用いる不溶性担体の
粒径、濃度、反応時間によって散乱光強度、吸光度、又
は透過光強度の増加もしくは減少を測定する。またこれ
らの方法は単独で用いられても併用されてもよい。

【００３１】目視により観察する方法においては、通
常、検体と本発明の免疫学的梅毒診断試薬を含む液を判
定板上で混合し、揺り動かした後、凝集の有無を判定す
る。判定には単に肉眼で判定する以外に、ビデオカメラ
で撮影し画像処理を施すことによって判定することもで
きる。

【００３２】前記抗原抗体反応は通常の条件で行われ、
反応媒体としては、例えば、上記のように、リン酸緩衝
液、クエン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液等
が用いられる。反応時のｐＨは、４．５〜１０．０が好
ましく、さらに好ましくは５．８〜８．０である。反応
時の温度は、０〜５０℃が好ましく、さらに好ましくは
２０〜４０℃である。反応時間は適宜決められる。

【００３３】請求項２記載の免疫学的梅毒診断試薬（以
下、本発明２という）は、遺伝子組換え手法を用いて得
られた梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質が担持された不
溶性担体と、遺伝子組換え手法を用いて得られた上記梅
毒トレポネーマ表面抗原蛋白質と異なる梅毒トレポネー
マ表面抗原蛋白質が担持された不溶性担体とが混合され
ていることを特徴とする。

【００３４】本発明２で用いられる梅毒トレポネーマ表
面抗原蛋白質および不溶性担体の材質は、本発明１と同
様である。

【００３５】本発明２では、遺伝子組換え手法を用いて
得られた梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質が担持された
不溶性担体と、遺伝子組換え手法を用いて得られた上記
梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質と異なる梅毒トレポネ
ーマ表面抗原蛋白質が担持された不溶性担体とが混合さ
れている。

【００３６】本発明２で用いられる、遺伝子組換え手法
を用いて得られた梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質が担
持された不溶性担体、および遺伝子組換え手法を用いて
得られた上記梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質と異なる
梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質が担持された不溶性担
体を得る方法は、上記それぞれの表面抗原蛋白質担持不
溶性担体を製造する際に、梅毒トレポネーマ表面抗原蛋
白質として少なくとも１種類以上が用いられること、お
よび、上記それぞれの不溶性担体に担持される梅毒トレ
ポネーマ表面抗原蛋白質が互いに異なる種類のものが用
いられることの他は、本発明１で用いられる不溶性担体
を得る方法と同様である。

【００３７】本発明２の免疫学的梅毒診断試薬を製造す
るには、上記のようにして得られた、遺伝子組換え手法
を用いて得られた梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質が担
持された不溶性担体、および遺伝子組換え手法を用いて
得られた上記梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質と異なる
梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質が担持された不溶性担
体を混合すればよい。この場合、互いに異なる梅毒トレ
ポネーマ表面抗原蛋白質が担持された不溶性担体を２種
類だけでなく、３種類以上を混合してもよい。

【００３８】本発明２の免疫学的梅毒診断試薬の使用方
法は、本発明１と同様である。

【００３９】

【発明の実施の形態】本発明を実施例及び比較例につき
説明する。 参考例１ ４７ｋＤａ抗原の調製 （１）発現ベクターの調製 トレポネーマパリダム（Treponema Pallidum）継代ウサ
ギ睾丸の破砕物（常磐化学社製）より、トレポネーマパ
リダム菌体を抽出し、ゲノムＤＮＡを抽出した。すでに
４７ｋＤａ抗原のＤＮＡ配列は既知であるので、それを
もとにＤＮＡ合成装置を用いてプライマーを作成した。
前記で抽出されたゲノムＤＮＡを鋳型とし、上記のプラ
イマーを用いて、ＰＣＲ法により４７ｋＤａ抗原のＤＮ
Ａ断片を得た。次に、ＧＳＴとの融合タンパク質を発現
するために作られたベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−３（ファ
ルマシア社製）に、上記のＤＮＡ断片を挿入し、ｐＧＥ
Ｘ−４Ｔ−３−４７ｋと命名した。

【００４０】（２）４７ｋＤａ抗原の製造 次に、ｐＧＥＸ−４Ｔ−３−４７ｋを大腸菌に導入し、
培養した。培養液にイソプロピル−β−（−）−チオガ
ラクトピラノシドを加えることにより、４７ｋＤａ抗原
とＧＳＴの融合タンパク質の発現を誘導した。十分に融
合タンパク質が発現した大腸菌を超音波処理により菌体
を破砕し、遠心分離により細胞膜、核などを除いた上清
に、グルタチオンセファロース４Ｂ（ファルマシア社
製）を加え、一晩放置し、融合タンパク質をグルタチオ
ンセファロース４Ｂに吸着させた。遠心分離により融合
タンパク質が吸着したグルタチオンセファロース４Ｂを
回収し、これをカラムに充填した。数回洗浄の後、グル
タチオン溶液を流すことにより融合タンパク質がグルタ
チオンセファロース４Ｂから遊離し溶出した。こうして
精製された４７ｋＤａ抗原−ＧＳＴ融合タンパク質溶液
にトロンビン溶液を添加し、４７ｋＤａ抗原とＧＳＴの
結合を切断した。この結果、４７ｋＤａ抗原、ＧＳＴ及
びトロンビンを含む溶液が得られた。この溶液をグルタ
チオンセファロース４Ｂカラムに流すことによりＧＳＴ
を除去した。さらにヘパリンセファロースＣＬ−６Ｂ
（ファルマシア社製）を充填したカラムに流すことによ
り、トロンビンを除去し、４７ｋＤａ抗原を得た。

【００４１】参考例２ １７ｋＤａ抗原の調製 （１）発現ベクターの調製 トレポネーマパリダム（Treponema Pallidum）継代ウサ
ギ睾丸の破砕物（常磐化学社製）より、トレポネーマパ
リダム菌体を抽出し、ゲノムＤＮＡを抽出した。すでに
１７ｋＤａ抗原のＤＮＡ配列は既知であるので、それを
もとにＤＮＡ合成装置を用いてプライマーを作成した。
前記で抽出されたゲノムＤＮＡを鋳型とし、上記のプラ
イマーを用いて、ＰＣＲ法により１７ｋＤａ抗原のＤＮ
Ａ断片を得た。次に、ＧＳＴとの融合タンパク質を発現
するために作られたベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−３（ファ
ルマシア社製）に、上記のＤＮＡ断片を挿入し、ｐＧＥ
Ｘ−４Ｔ−３−１７ｋと命名した。

【００４２】（２）１７ｋＤａ抗原の製造 次に、ｐＧＥＸ−４Ｔ−３−１７ｋを大腸菌に導入し、
培養した。培養液にイソプロピル−β−（−）−チオガ
ラクトピラノシドを加えることにより、１７ｋＤａ抗原
とＧＳＴの融合タンパク質の発現を誘導した。十分に融
合タンパク質が発現した大腸菌を用い、参考例１の
（２）４７ｋＤａ抗原の製造の説明における、４７ｋＤ
ａ抗原という表現を、１７ｋＤａ抗原という表現に置き
変える他は、参考例１の（２）と同様に操作して、１７
ｋＤａ抗原を得た。

【００４３】参考例３ １５ｋＤａ抗原の調製 （１）発現ベクターの調製 トレポネーマパリダム（Treponema Pallidum）継代ウサ
ギ睾丸の破砕物（常磐化学社製）より、トレポネーマパ
リダム菌体を抽出し、ゲノムＤＮＡを抽出した。すでに
１５ｋＤａ抗原のＤＮＡ配列は既知であるので、それを
もとにＤＮＡ合成装置を用いてプライマーを作成した。
前記で抽出されたゲノムＤＮＡを鋳型とし、上記のプラ
イマーを用いて、ＰＣＲ法により１５ｋＤａ抗原のＤＮ
Ａ断片を得た。次に、ＧＳＴとの融合タンパク質を発現
するために作られたベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−３（ファ
ルマシア社製）に、上記のＤＮＡ断片を挿入し、ｐＧＥ
Ｘ−４Ｔ−３−１５ｋと命名した。

【００４４】（２）１５ｋＤａ抗原の製造 次に、ｐＧＥＸ−４Ｔ−３−１５ｋを大腸菌に導入し、
培養した。培養液にイソプロピル−β−（−）−チオガ
ラクトピラノシドを加えることにより、１５ｋＤａ抗原
とＧＳＴの融合タンパク質の発現を誘導した。十分に融
合タンパク質が発現した大腸菌を用い、参考例１の
（２）４７ｋＤａ抗原の製造の説明における、４７ｋＤ
ａ抗原という表現を、１５ｋＤａ抗原という表現に置き
変える他は、参考例１の（２）４７ｋＤａ抗原の製造と
同様に操作して、１５ｋＤａ抗原を得た。

【００４５】実施例１ （１）ラテックスへのスペーサーの結合 スチレン−メタクリル酸共重合体ラテックス（カルボキ
シル基０．２５ｍｅｑＣＯＯ^- ／ｇ、粒径０．４μｍ、
積水化学工業社製）を５％（ｗ／ｖ）含有する水懸濁液
１５０μｌに対し、ｐＨ５．０のリン酸緩衝液（以下、
ＰＢ緩衝液という）にＥＤＣを１５％（ｗ／ｖ）の割合
で溶解した溶液を１ｍｌ加え、室温で５時間攪拌した。
遠心分離により未反応のＥＤＣを除去し、ＰＢ緩衝液で
２回洗浄後、１ｍｌのｐＨ９．０のホウ酸緩衝液（以
下、ＢＢ緩衝液という）に懸濁した。この懸濁液に、Ｂ
Ｂ緩衝液にγ−アミノ酪酸を１０％（ｗ／ｖ）の割合で
溶解した溶液を１ｍｌ加え、室温で２４時間攪拌した。
遠心分離により未反応のγ−アミノ酪酸を除去し、ＢＢ
緩衝液で２回洗浄後、１ｍｌのＰＢ緩衝液に懸濁して、
ラテックスのカルボキシル基とγ−アミノ酪酸のアミノ
基が共有結合された、スペーサー結合ラテックスを得
た。

【００４６】（２）梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質の
結合 上記スペーサー結合ラテックス１ｍｌに、ＰＢ緩衝液に
ＥＤＣを３０％（ｗ／ｖ）の割合で溶解した溶液を１ｍ
ｌ加え、室温で５時間攪拌した。遠心分離により未反応
のＥＤＣを除去し、ＰＢ緩衝液で２回洗浄後、２ｍｌの
ＢＢ緩衝液に懸濁した。この懸濁液に、混合抗原蛋白質
溶液〔リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に参考例１で調製し
た４７ｋＤａ抗原が５００μｇ／ｍｌになるように溶解
された溶液、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に参考例２で
調製した１７ｋＤａ抗原が５００μｇ／ｍｌになるよう
に溶解された溶液およびリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に
参考例３で調製した１５ｋＤａ抗原が５００μｇ／ｍｌ
になるように溶解された溶液を１：１：１の比率で混合
して得られた溶液〕１００μｌを加え、室温で２４時間
攪拌した。遠心分離により未反応の４７ｋＤａ抗原、１
７ｋＤａ抗原および１５ｋＤａ抗原を除去し、ＢＢ緩衝
液で２回洗浄後、ウシ血清アルブミン（以下、ウシ血清
アルブミンをＢＳＡという）を１％（ｗ／ｖ）含有する
ＰＢＳ緩衝液（０．９重量％塩化ナトリウム−リン酸緩
衝液、ｐＨ７．４。以下で用いられるＰＢＳ緩衝液も、
全て同様の組成である）の２ｍｌに懸濁し、室温で１時
間攪拌し、ブロッキング（非特異的反応を防ぐために、
ラテックス表面にＢＳＡを吸着させること）を行った。
次に、遠心分離により未反応のＢＳＡを除去し、ＢＳＡ
を１％（ｗ／ｖ）含有するＰＢＳ緩衝液４ｍｌに懸濁
し、４７ｋＤａ抗原、１７ｋＤａ抗原および１５ｋＤａ
抗原結合ラテックス（本発明１の免疫学的梅毒診断試
薬）液を得た。

【００４７】実施例２ 実施例１の（２）梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質の結
合の項における、混合抗原蛋白質溶液１００μｌを、参
考例１で調製した４７ｋＤａ抗原が５００μｇ／ｍｌに
なるように溶解された溶液およびリン酸緩衝液（ｐＨ
７．２）に参考例２で調製した１７ｋＤａ抗原が５００
μｇ／ｍｌになるように溶解された溶液を１：１の比率
で混合した混合抗原蛋白質溶液１００μｌに代えたこと
の他は、実施例１と同様に操作して、４７ｋＤａ抗原及
び１７ｋＤａ抗原結合ラテックス（本発明１の免疫学的
梅毒診断試薬）液を得た。

【００４８】実施例３ 実施例１の（２）梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質の結
合の項における、混合抗原蛋白質溶液１００μｌを、参
考例１で調製した４７ｋＤａ抗原が５００μｇ／ｍｌに
なるように溶解された溶液およびリン酸緩衝液（ｐＨ
７．２）に参考例３で調製した１５ｋＤａ抗原が５００
μｇ／ｍｌになるように溶解された溶液を１：１の比率
で混合した混合抗原蛋白質溶液１００μｌに代えたこと
の他は、実施例１と同様に操作して、４７ｋＤａ抗原及
び１５ｋＤａ抗原結合ラテックス（本発明１の免疫学的
梅毒診断試薬）液を得た。

【００４９】実施例４ 実施例１の（２）梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質の結
合の項における、混合抗原蛋白質溶液１００μｌを、参
考例２で調製した１７ｋＤａ抗原が５００μｇ／ｍｌに
なるように溶解された溶液およびリン酸緩衝液（ｐＨ
７．２）に参考例３で調製した１５ｋＤａ抗原が５００
μｇ／ｍｌになるように溶解された溶液を１：１の比率
で混合した混合抗原蛋白質溶液１００μｌに代えたこと
の他は、実施例１と同様に操作して、１７ｋＤａ抗原及
び１５ｋＤａ抗原結合ラテックス（本発明１の免疫学的
梅毒診断試薬）液を得た。

【００５０】実施例５ 実施例１の（２）梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質の結
合の項における、混合抗原蛋白質溶液１００μｌを、参
考例１で調製した４７ｋＤａ抗原が５００μｇ／ｍｌに
なるように溶解された溶液単独からなる表面抗原蛋白質
溶液１００μｌに代えたことの他は、実施例１と同様に
操作して、４７ｋＤａ抗原結合ラテックス液を得た。上
記の４７ｋＤａ抗原結合ラテックス液を得る際に使用し
た表面抗原蛋白質溶液１００μｌを、参考例２で調製し
た１７ｋＤａ抗原が５００μｇ／ｍｌになるように溶解
された溶液単独からなる表面抗原蛋白質溶液１００μｌ
に代えたことの他は、上記と同様に操作して、１７ｋＤ
ａ抗原結合ラテックス液を得た。前記の４７ｋＤａ抗原
結合ラテックス液を得る際に使用した表面抗原蛋白質溶
液１００μｌを、参考例３で調製した１５ｋＤａ抗原が
５００μｇ／ｍｌになるように溶解された溶液単独から
なる表面抗原蛋白質溶液１００μｌに代えたことの他
は、上記と同様に操作して、１５ｋＤａ抗原結合ラテッ
クス液を得た。得られた、４７ｋＤａ抗原結合ラテック
ス液、１７ｋＤａ抗原結合ラテックス液および１５ｋＤ
ａ抗原結合ラテックス液を、１：１：１の比率で混合し
て、梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質結合ラテックスの
混合液（本発明２の免疫学的梅毒診断試薬）を得た。

【００５１】実施例６ 実施例５で得られた、４７ｋＤａ抗原結合ラテックス液
および１７ｋＤａ抗原結合ラテックス液を、１：１の比
率で混合して、梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質結合ラ
テックスの混合液（本発明２の免疫学的梅毒診断試薬）
を得た。

【００５２】実施例７ 実施例５で得られた、４７ｋＤａ抗原結合ラテックス液
および１５ｋＤａ抗原結合ラテックス液を、１：１の比
率で混合して、梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質結合ラ
テックスの混合液（本発明２の免疫学的梅毒診断試薬）
を得た。

【００５３】実施例８ 実施例５で得られた、１７ｋＤａ抗原結合ラテックス液
および１５ｋＤａ抗原結合ラテックス液を、１：１の比
率で混合して、梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質結合ラ
テックスの混合液（本発明２の免疫学的梅毒診断試薬）
を得た。

【００５４】比較例１ 実施例５中で得られた、４７ｋＤａ抗原結合ラテックス
液単独を比較例１の免疫学的梅毒診断試薬とする。 比較例２ 実施例５中で得られた、１７ｋＤａ抗原結合ラテックス
液単独を比較例２の免疫学的梅毒診断試薬とする。 比較例３ 実施例５中で得られた、１５ｋＤａ抗原結合ラテックス
液単独を比較例３の免疫学的梅毒診断試薬とする。

【００５５】免疫学的梅毒診断試薬の性能評価 実施例１〜８および比較例１〜３で得られた免疫学的梅
毒診断試薬の性能を評価するために、上記各試薬および
市販の梅毒トレポネーマ診断試薬を用いて、梅毒トレポ
ネーマ陽性検体および梅毒トレポネーマ陰性検体を測定
し、測定結果の相関を調べた。

【００５６】実施例１〜８および比較例１〜３で得られ
た各免疫学的梅毒診断試薬による梅毒トレポネーマ陽性
検体および梅毒トレポネーマ陰性検体の測定は、具体的
には以下のようにして行った。生化学自動分析装置（日
立７０５０形、日立製作所社製）により、０、５０、１
００、２５０、５００各タイターユニット（以下、Ｔ．
Ｕ．と略す）の標準梅毒トレポネーマ陽性血清からなる
標準液、並びに梅毒トレポネーマ陽性検体３０検体（検
体番号１〜３０）、梅毒トレポネーマ陰性検体２０検体
（検体番号３１〜５０）を測定した。測定条件は、温度
３７℃、波長５７０ｎｍとした。測定方法は、上記標準
液または検体２０μｌを分注後、直ちに検体希釈液（梅
毒診断用試薬「メディエースＴＰＬＡ」（積水化学工業
社製）に含まれているものを用いた。）３５０μｌを添
加・混合し、次いで上記免疫学的梅毒診断試薬の５０μ
ｌを添加・混合した。反応量は、上記免疫学的梅毒診断
試薬添加後８０秒から３２０秒の間の吸光度変化量とし
た。各標準液について得られた吸光度変化量と各標準液
のＴ．Ｕ．から検量線を作成し、得られた検量線に、上
記各検体を測定して得られた吸光度変化量を当てはめ
て、各検体のＴ．Ｕ．を求め、結果を表１〜４に示し
た。

【００５７】次に、上記梅毒トレポネーマ陽性検体３０
検体、梅毒トレポネーマ陰性検体２０検体のＴ．Ｕ．
を、市販の梅毒トレポネーマ診断試薬である、「メディ
エースＴＰＬＡ」（積水化学工業社製）を用いて測定
し、その結果を表１〜４の市販品の欄に示した。

【００５８】

【表１】

【００５９】

【表２】

【００６０】

【表３】

【００６１】

【表４】

【００６２】次に、実施例１〜８および比較例１〜３の
各試薬について、それぞれ得られた測定結果と市販の梅
毒トレポネーマ診断試薬を用いて得られた測定結果との
相関係数を調べ、結果を表５に示した。

【００６３】

【表５】

【００６４】表５より、実施例１〜８の試薬で得られた
測定結果と、市販の梅毒トレポネーマ診断試薬を用いて
得られた測定結果との相関は高く、また、比較例１〜３
の試薬で得られた測定結果と、市販の梅毒トレポネーマ
診断試薬を用いて得られた測定結果との相関に比べて高
いことが分かる。また、比較例２および３の試薬にあっ
ては、陰性検体でもＴ．Ｕ．の高いものが散見され、陰
性と陽性の区別がつきにくいものが見られる。

【００６５】

【発明の効果】請求項１記載の免疫学的梅毒診断試薬の
構成は上記の通り、遺伝子組換え手法を用いて得られた
梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質の少なくとも２種類以
上が担持された不溶性担体からなるので、菌体から得ら
れた従来の梅毒トレポネーマ抗原を用いて製造された試
薬と同等の感度を有する免疫学的梅毒診断試薬を提供す
る。このように、大量生産可能で、安定した抗原活性を
持つ、遺伝子組換え手法を用いて得られた梅毒トレポネ
ーマの表面抗原蛋白質を使用し、従来品と同等感度の試
薬が得られたので、請求項１記載の免疫学的梅毒診断試
薬は、高感度で、かつ安定に生産される試薬である。

【００６６】請求項２記載の免疫学的梅毒診断試薬の構
成は上記の通り、遺伝子組換え手法を用いて得られた梅
毒トレポネーマ表面抗原蛋白質が担持された不溶性担体
と、遺伝子組換え手法を用いて得られた上記梅毒トレポ
ネーマ表面抗原蛋白質と異なる梅毒トレポネーマ表面抗
原蛋白質が担持された不溶性担体とが混合されているの
で、菌体から得られた従来の梅毒トレポネーマ抗原を用
いて製造された試薬と同等の感度を有する免疫学的梅毒
診断試薬を提供する。このように、大量生産可能で、安
定した抗原活性を持つ、遺伝子組換え手法を用いて得ら
れた梅毒トレポネーマの表面抗原蛋白質を使用し、従来
品と同等感度の試薬が得られたので、請求項２記載の免
疫学的梅毒診断試薬は、高感度で、かつ安定に生産され
る試薬である。

【００６７】請求項３記載の免疫学的梅毒診断試薬の構
成は上記の通り、梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質が、
分子量４７ｋＤａの梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質、
分子量１７ｋＤａの梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質お
よび分子量１５ｋＤａの梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白
質からなる群より選ばれる請求項１又は請求項２記載の
免疫学的梅毒診断試薬なので、菌体から得られた従来の
梅毒トレポネーマ抗原を用いて製造された試薬に、より
一層感度が近い免疫学的梅毒診断試薬を提供する。この
ように、大量生産可能で、安定した抗原活性を持つ、遺
伝子組換え手法を用いて得られた梅毒トレポネーマの表
面抗原蛋白質を使用し、従来品に、より一層感度が近い
試薬が得られたので、請求項３記載の免疫学的梅毒診断
試薬は、高感度で、かつ安定に生産される試薬である。

【００６８】請求項４記載の免疫学的梅毒診断試薬の構
成は上記の通り、不溶性担体が合成高分子粒子からなる
ラテックスである請求項１、２又は３記載の免疫学的梅
毒診断試薬なので、菌体から得られた従来の梅毒トレポ
ネーマ抗原を用いて製造された試薬に、より一層感度が
近い免疫学的梅毒診断試薬を提供する。このように、大
量生産可能で、安定した抗原活性を持つ、遺伝子組換え
手法を用いて得られた梅毒トレポネーマの表面抗原蛋白
質を使用し、従来品に、より一層感度が近い試薬が得ら
れたので、請求項４記載の免疫学的梅毒診断試薬は、高
感度で、かつ安定に生産される試薬である。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 遺伝子組換え手法を用いて得られた梅毒
   トレポネーマ表面抗原蛋白質の少なくとも２種類以上が
   担持された不溶性担体からなることを特徴とする免疫学
   的梅毒診断試薬。
2. 【請求項２】 遺伝子組換え手法を用いて得られた梅毒
   トレポネーマ表面抗原蛋白質が担持された不溶性担体
   と、遺伝子組換え手法を用いて得られた上記梅毒トレポ
   ネーマ表面抗原蛋白質と異なる梅毒トレポネーマ表面抗
   原蛋白質が担持された不溶性担体とが混合されているこ
   とを特徴とする免疫学的梅毒診断試薬。
3. 【請求項３】 梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質が、分
   子量４７ｋＤａの梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質、分
   子量１７ｋＤａの梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質およ
   び分子量１５ｋＤａの梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質
   からなる群より選ばれる請求項１又は請求項２記載の免
   疫学的梅毒診断試薬。
4. 【請求項４】 不溶性担体が合成高分子粒子からなるラ
   テックスである請求項１、２又は３記載の免疫学的梅毒
   診断試薬。