JPH09313181A - 核酸増幅のための試料材料の調製方法 - Google Patents
核酸増幅のための試料材料の調製方法Info
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- JPH09313181A JPH09313181A JP9005265A JP526597A JPH09313181A JP H09313181 A JPH09313181 A JP H09313181A JP 9005265 A JP9005265 A JP 9005265A JP 526597 A JP526597 A JP 526597A JP H09313181 A JPH09313181 A JP H09313181A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 試験試料中の複数の分析対象物を検出および
識別するための簡単で、使いやすく、経済的で迅速な方
法および装置、特に、試料調製、核酸配列増幅および核
酸配列識別の全体の時間が好ましくは約５時間以内であ
る方法および装置を提供する。 【解決手段】 独特の核酸抽出緩衝溶液調製物を用い、
核酸配列増幅のために種々の試料材料を迅速に調製する
ための迅速試料処理方法、実質上同様な増幅効率を得ら
れるように最適化された適切なプライマーオリゴヌクレ
オチドを用い、試料中に存在する可能性のある複数の標
的核酸配列を同時かつ非優先的に増幅させるための複数
分析対象物非優先的増幅処理方法、中性塩基置換分子で
修飾された適切なプローブオリゴヌクレオチドを用い、
一塩基ミスマッチのみを含む増幅された複数核酸配列間
の小さいミスマッチを識別するための核酸配列ミスマッ
チ検出方法からなる複数分析対象物認識処理法。
識別するための簡単で、使いやすく、経済的で迅速な方
法および装置、特に、試料調製、核酸配列増幅および核
酸配列識別の全体の時間が好ましくは約５時間以内であ
る方法および装置を提供する。 【解決手段】 独特の核酸抽出緩衝溶液調製物を用い、
核酸配列増幅のために種々の試料材料を迅速に調製する
ための迅速試料処理方法、実質上同様な増幅効率を得ら
れるように最適化された適切なプライマーオリゴヌクレ
オチドを用い、試料中に存在する可能性のある複数の標
的核酸配列を同時かつ非優先的に増幅させるための複数
分析対象物非優先的増幅処理方法、中性塩基置換分子で
修飾された適切なプローブオリゴヌクレオチドを用い、
一塩基ミスマッチのみを含む増幅された複数核酸配列間
の小さいミスマッチを識別するための核酸配列ミスマッ
チ検出方法からなる複数分析対象物認識処理法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、核酸配列に基づく
検出技術に関し、特に、種々のタイプの試料材料内の複
数分析対象物（multiple analytes)の検出および識別を
可能にする方法および装置に関する。
検出技術に関し、特に、種々のタイプの試料材料内の複
数分析対象物（multiple analytes)の検出および識別を
可能にする方法および装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】種々のタイプの試験試料中に存在する生
物学的分析対象物を正確に検出することは、臨床的、実
験的および疫学的分析などの多くの目的において有用で
ある。すべての生物の遺伝情報は大部分が二本鎖のデオ
キシリボ核酸（ＤＮＡ）、またはリボ核酸（ＲＮＡ）の
いずれかの核酸において伝えられることから、特定の核
酸配列を検出および識別することにより、試験試料内に
特定の分析対象物が存在するか否かを決定できる。
物学的分析対象物を正確に検出することは、臨床的、実
験的および疫学的分析などの多くの目的において有用で
ある。すべての生物の遺伝情報は大部分が二本鎖のデオ
キシリボ核酸（ＤＮＡ）、またはリボ核酸（ＲＮＡ）の
いずれかの核酸において伝えられることから、特定の核
酸配列を検出および識別することにより、試験試料内に
特定の分析対象物が存在するか否かを決定できる。
【０００３】核酸試料またはその混合物内の一つまたは
複数の標的核酸配列を増幅（amplfying)させることがで
きるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法の開発により、
特定の核酸の配列を検出または識別することが容易にな
った。例えば、ここに参考として組み入れた米国特許第
４，９６５，１８８号明細書の開示を参照されたい。Ｐ
ＣＲ法では、増幅させようとする各標的核酸配列に対し
て、二本鎖内の標的核酸配列の複数の部分と実質的に相
補的であるように選択した二種のプライマーで、核酸の
別個の相補的鎖を処理する。これらのプライマーは熱安
定性酵素で伸ばされて、相補的プライマー・エクステン
ション生成物を生成し、これを相補的鎖に分離すると、
相補的プライマーを標的核酸配列に延長する鋳型鎖を生
じる。この標的核酸配列もまた、それらの相補的鎖に分
離すると、さらに、標的核酸配列を合成する鋳型として
働く。ＰＣＲ増幅処理法には温度サイクルが含まれ、こ
れによりプライマーおよび鋳型のハイブリダイゼーショ
ン、プライマー・エクステンション生成物の合成を可能
にする酵素活性の促進、および合成された標的核酸配列
鎖を含む追加の鋳型鎖を生成するために形成されたハイ
ブリッド二重ＤＮＡ鎖の分離が生じる。各サイクルは、
指数的に標的核酸配列の合成量を増加する。
複数の標的核酸配列を増幅（amplfying)させることがで
きるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法の開発により、
特定の核酸の配列を検出または識別することが容易にな
った。例えば、ここに参考として組み入れた米国特許第
４，９６５，１８８号明細書の開示を参照されたい。Ｐ
ＣＲ法では、増幅させようとする各標的核酸配列に対し
て、二本鎖内の標的核酸配列の複数の部分と実質的に相
補的であるように選択した二種のプライマーで、核酸の
別個の相補的鎖を処理する。これらのプライマーは熱安
定性酵素で伸ばされて、相補的プライマー・エクステン
ション生成物を生成し、これを相補的鎖に分離すると、
相補的プライマーを標的核酸配列に延長する鋳型鎖を生
じる。この標的核酸配列もまた、それらの相補的鎖に分
離すると、さらに、標的核酸配列を合成する鋳型として
働く。ＰＣＲ増幅処理法には温度サイクルが含まれ、こ
れによりプライマーおよび鋳型のハイブリダイゼーショ
ン、プライマー・エクステンション生成物の合成を可能
にする酵素活性の促進、および合成された標的核酸配列
鎖を含む追加の鋳型鎖を生成するために形成されたハイ
ブリッド二重ＤＮＡ鎖の分離が生じる。各サイクルは、
指数的に標的核酸配列の合成量を増加する。
【０００４】ＰＣＲ増幅は、感染性疾患および病理学的
染色体異常並びに病理学的状態に結びつかないこともあ
るＤＮＡ多型現象の検知および／または診断を含む数多
くの臨床的適用において有用であることが証明されてい
る。ＰＣＲ増幅は、標的核酸の量が試料中に存在する他
の核酸に比べて相対的に少量の場合、少量の標的核酸し
か得られない場合、検出テクニックの感度が低い場合、
または、より迅速な検出が望ましい場合に、特に有用で
ある。例えば、感染性物質は特定の特徴を有する核酸配
列の検出によって正確に識別される。このような感染性
物質の例にはサルモネラ、シゲラ、クラミジアおよびナ
イゼリアなどの細菌、肝炎ウイルスなどのウイルスおよ
びマラリア性プラスモジウムなどの寄生虫がある。試料
には比較的少量の病原性微生物が存在するので、これら
の微生物から抽出されたＤＮＡは、通常試料中のＤＮＡ
総量の極小部分のみを含む。特徴的ＤＮＡ配列が存在す
る場合、これを特異的に増幅することにより、検出およ
び識別処理の感度および特異性を大きく高めることがで
きる。
染色体異常並びに病理学的状態に結びつかないこともあ
るＤＮＡ多型現象の検知および／または診断を含む数多
くの臨床的適用において有用であることが証明されてい
る。ＰＣＲ増幅は、標的核酸の量が試料中に存在する他
の核酸に比べて相対的に少量の場合、少量の標的核酸し
か得られない場合、検出テクニックの感度が低い場合、
または、より迅速な検出が望ましい場合に、特に有用で
ある。例えば、感染性物質は特定の特徴を有する核酸配
列の検出によって正確に識別される。このような感染性
物質の例にはサルモネラ、シゲラ、クラミジアおよびナ
イゼリアなどの細菌、肝炎ウイルスなどのウイルスおよ
びマラリア性プラスモジウムなどの寄生虫がある。試料
には比較的少量の病原性微生物が存在するので、これら
の微生物から抽出されたＤＮＡは、通常試料中のＤＮＡ
総量の極小部分のみを含む。特徴的ＤＮＡ配列が存在す
る場合、これを特異的に増幅することにより、検出およ
び識別処理の感度および特異性を大きく高めることがで
きる。
【０００５】さらに、鎌状赤血球貧血、α−サラセミ
ア、β−サラセミアおよび膵嚢胞性線維症などの遺伝病
を示す遺伝配列を増幅し、検出することができる。イン
シュリン依存性糖尿病または特定の癌などの病状と関連
する遺伝子を検出することもまた、有用である。胎児細
胞から得られたＤＮＡを用いた遺伝病の出生前診断な
ど、分析に使用できる核酸の量が非常に少量である場合
に、ＰＣＲ増幅は特に有用である。また、ＰＣＲ増幅プ
ロセスは、例えば、移植、疾患感受性、および父系の組
織の適合性を決定するのに役立つＨＬＡタイピングのよ
うな異なる対立遺伝子を示す遺伝的変異体の検出および
識別を向上させる。
ア、β−サラセミアおよび膵嚢胞性線維症などの遺伝病
を示す遺伝配列を増幅し、検出することができる。イン
シュリン依存性糖尿病または特定の癌などの病状と関連
する遺伝子を検出することもまた、有用である。胎児細
胞から得られたＤＮＡを用いた遺伝病の出生前診断な
ど、分析に使用できる核酸の量が非常に少量である場合
に、ＰＣＲ増幅は特に有用である。また、ＰＣＲ増幅プ
ロセスは、例えば、移植、疾患感受性、および父系の組
織の適合性を決定するのに役立つＨＬＡタイピングのよ
うな異なる対立遺伝子を示す遺伝的変異体の検出および
識別を向上させる。
【０００６】ＰＣＲ増幅は研究者にとって強力な手段で
ある。しかし、それに適する核酸またはその混合物を抽
出するために臨床試料を調製する手順は、通常きわめて
困難であり、時間を費やすものである。例えば、ＨＬＡ
タイピング（ＨＬＡ型の同定) は、通常ＰＣＲ処理のた
めの鋳型として精製ゲノムＤＮＡを必要とする。しか
し、試料材料によっては、標的核酸が存在する場合、こ
れを抽出および／または精製することは、非常に困難で
ある。このように、最近進歩してきてはいるが、状況に
よってはＰＣＲ法の有用性には限度がある。例えば、Ｐ
ＣＲを行う前に、10分間試料を水中で煮沸することによ
り、洗浄された血液細胞または全血の少量の試料に直接
ＰＣＲを行うことが可能であることが報告されている。
Wu,L., McCarthy, B.J., Kadushin, J.M., Nuss,C.E.,
A simple and Economic Method forDirectly Performin
g PCR on Washed Blodd Cells or on Whole Blood, Tra
nsgenica, 1994: 1(1):1-5. 一方、例えば、便検体、
喀痰検体、凝血検体およびその他などの他の種類の臨床
的試料の処理は、まだ時間がかかり、困難である。
ある。しかし、それに適する核酸またはその混合物を抽
出するために臨床試料を調製する手順は、通常きわめて
困難であり、時間を費やすものである。例えば、ＨＬＡ
タイピング（ＨＬＡ型の同定) は、通常ＰＣＲ処理のた
めの鋳型として精製ゲノムＤＮＡを必要とする。しか
し、試料材料によっては、標的核酸が存在する場合、こ
れを抽出および／または精製することは、非常に困難で
ある。このように、最近進歩してきてはいるが、状況に
よってはＰＣＲ法の有用性には限度がある。例えば、Ｐ
ＣＲを行う前に、10分間試料を水中で煮沸することによ
り、洗浄された血液細胞または全血の少量の試料に直接
ＰＣＲを行うことが可能であることが報告されている。
Wu,L., McCarthy, B.J., Kadushin, J.M., Nuss,C.E.,
A simple and Economic Method forDirectly Performin
g PCR on Washed Blodd Cells or on Whole Blood, Tra
nsgenica, 1994: 1(1):1-5. 一方、例えば、便検体、
喀痰検体、凝血検体およびその他などの他の種類の臨床
的試料の処理は、まだ時間がかかり、困難である。
【０００７】検査試料中に存在する、または存在する可
能性のある複数の標的核酸配列を同時に検出および識別
することが役に立つ状況が多々ある。例えば、感染性疾
患を正確に診断するには、臨床試料に、数多くの感染性
物質が存在する可能性がある場合、その中のどの感染性
物質が存在するかを決定することが必要である。一般
に、試料は分割する必要があり、そして、異なった、可
能性のある標的核酸配列に、入手可能であれば、異なる
プライマーで複数のＰＣＲ増幅処理を別々に行う必要が
ある。このアプローチは非常に面倒である。さらに、入
手可能なプライマーで行った各ＰＣＲ増幅処理は、オリ
ジナルのテンプレート核酸、予測した標的核酸配列生成
物および種々の背景を有する非標的核酸配列生成物から
なる核酸の混合物を産する。
能性のある複数の標的核酸配列を同時に検出および識別
することが役に立つ状況が多々ある。例えば、感染性疾
患を正確に診断するには、臨床試料に、数多くの感染性
物質が存在する可能性がある場合、その中のどの感染性
物質が存在するかを決定することが必要である。一般
に、試料は分割する必要があり、そして、異なった、可
能性のある標的核酸配列に、入手可能であれば、異なる
プライマーで複数のＰＣＲ増幅処理を別々に行う必要が
ある。このアプローチは非常に面倒である。さらに、入
手可能なプライマーで行った各ＰＣＲ増幅処理は、オリ
ジナルのテンプレート核酸、予測した標的核酸配列生成
物および種々の背景を有する非標的核酸配列生成物から
なる核酸の混合物を産する。
【０００８】方法によっては、三種類にものぼる分析対
象物を同時に増幅させているが、これらの方法も、また
困難で、時間のかかる検査試料調製のステップを必要と
する。複数の標的核酸配列を同時に増幅させようとする
場合に生じる問題は、優先的増幅の現象である。同時処
理の条件下で、異なったプライマーは異なった増幅効率
を有するため、優先的増幅により、優先的増幅配列の量
が他の存在する増幅配列の量を大幅に越えてしまうよう
な、一つまたは複数の標的核酸配列の均一でない増幅に
なる。複数の分析対象物の同時増幅時に生じるもう一つ
の問題は、交差反応性である。異なるプライマー間の有
意の配列マッチにより、特定の標的核酸配列の増幅効率
が低下するか、あるいは、疑似陽性の増幅を生じる。し
たがって、複数の分析対象物の正確で効率的な同時分析
を可能にするために、優先的増幅および交差反応を共に
防止するか、または最小限にする必要がある。
象物を同時に増幅させているが、これらの方法も、また
困難で、時間のかかる検査試料調製のステップを必要と
する。複数の標的核酸配列を同時に増幅させようとする
場合に生じる問題は、優先的増幅の現象である。同時処
理の条件下で、異なったプライマーは異なった増幅効率
を有するため、優先的増幅により、優先的増幅配列の量
が他の存在する増幅配列の量を大幅に越えてしまうよう
な、一つまたは複数の標的核酸配列の均一でない増幅に
なる。複数の分析対象物の同時増幅時に生じるもう一つ
の問題は、交差反応性である。異なるプライマー間の有
意の配列マッチにより、特定の標的核酸配列の増幅効率
が低下するか、あるいは、疑似陽性の増幅を生じる。し
たがって、複数の分析対象物の正確で効率的な同時分析
を可能にするために、優先的増幅および交差反応を共に
防止するか、または最小限にする必要がある。
【０００９】オリゴヌクレオチドプローブ、すなわちＰ
ＣＲ増幅生成物に相補的なプローブを用いて核酸配列を
検出および識別する多くの方法が公知である。通常、固
相システムが用いられる。例えば、ＰＣＲ増幅生成物ま
たはプローブのいずれかを一連の膜に直接付着させる。
次いで、非付着成分、すなわちプローブまたはＰＣＲ生
成物のいずれかを各々、ハイブリダイゼーション条件で
別々の膜に付着させる。プローブまたはＰＣＲ生成物の
いずれかを分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的ま
たは化学的方法によって検出できるように、ある種の標
識成分で標識する。標識成分（label moiety) の例とし
て、蛍光染料、高電子密度試薬、セイヨウワサビペルオ
キシダーゼまたはアルカリ性ホスファターゼなどの不溶
性反応生成物を沈殿させる酵素、または色素生成的に検
出される酵素、32P 、またはビオチンなどの放射性標識
などがある。成分が互いに十分相補的である場合にの
み、ＰＣＲ生成物およびプローブ間のハイブリダイゼー
ションが生じる。ハイブリダイゼーションの後、洗浄処
理により、ハイブリダイゼーションされていない分子は
除去されて、残った標識成分の検出により、プローブ／
標的核酸ハイブリッドの存在が示される。
ＣＲ増幅生成物に相補的なプローブを用いて核酸配列を
検出および識別する多くの方法が公知である。通常、固
相システムが用いられる。例えば、ＰＣＲ増幅生成物ま
たはプローブのいずれかを一連の膜に直接付着させる。
次いで、非付着成分、すなわちプローブまたはＰＣＲ生
成物のいずれかを各々、ハイブリダイゼーション条件で
別々の膜に付着させる。プローブまたはＰＣＲ生成物の
いずれかを分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的ま
たは化学的方法によって検出できるように、ある種の標
識成分で標識する。標識成分（label moiety) の例とし
て、蛍光染料、高電子密度試薬、セイヨウワサビペルオ
キシダーゼまたはアルカリ性ホスファターゼなどの不溶
性反応生成物を沈殿させる酵素、または色素生成的に検
出される酵素、32P 、またはビオチンなどの放射性標識
などがある。成分が互いに十分相補的である場合にの
み、ＰＣＲ生成物およびプローブ間のハイブリダイゼー
ションが生じる。ハイブリダイゼーションの後、洗浄処
理により、ハイブリダイゼーションされていない分子は
除去されて、残った標識成分の検出により、プローブ／
標的核酸ハイブリッドの存在が示される。
【００１０】古典的ドットブロット検出法に加えて、マ
イクロタイター・プレートを用いた固相システムもまた
公知である。プローブまたはＰＣＲ生成物のいずれかの
所望成分をマイクロプレート上に固定するために様々な
方法が用いられている。一つの方法では、疎水性作用に
より、所望成分をマイクロプレートに受動的に吸収させ
る。あるいは、例えば、ビオチンを所望成分に組み込ま
せて、ビオチン化した成分がアビジンに結合するように
アビジン分子を受動的にマイクロプレートに吸収させる
ことにより、ビオチン・アビジン相互作用を利用する。
しかし、これらの技術における問題は、所望成分をマイ
クロプレートに固定するために用いられる疎水性結合の
効率が、期待した程に良くないことである。比較的少量
の所望成分のみがマイクロプレートに結合し、疎水性結
合はストリンジェント（緊縮型)ハイブリダイゼーショ
ン、あるいは、結合成分またはプローブ／核酸複合体の
幾分かが処理中に洗い流されてしまうような洗浄処理に
耐えることができない。最近、共有結合化学を用いるこ
とにより、オリゴヌクレオチドプローブをマイクロプレ
ートプラスチック表面により堅実に、かつ効率的に結合
できることが示されている。Wu,L.,Chaar, O., Bradle
y, K., Kadushin, J., HLA DR DNA Typing With a Micr
otiter Plate-Based Hybridization Assay, Hum. Immu
n., 1993；37；p.141.この技術において、オリゴヌクレ
オチドプローブは5'末端燐酸基、アミン基または他の反
応性部分を介してプラスチック表面の化学的リンカーに
共有結合する。この方法は手順を単純化し効率を高める
と思われる。
イクロタイター・プレートを用いた固相システムもまた
公知である。プローブまたはＰＣＲ生成物のいずれかの
所望成分をマイクロプレート上に固定するために様々な
方法が用いられている。一つの方法では、疎水性作用に
より、所望成分をマイクロプレートに受動的に吸収させ
る。あるいは、例えば、ビオチンを所望成分に組み込ま
せて、ビオチン化した成分がアビジンに結合するように
アビジン分子を受動的にマイクロプレートに吸収させる
ことにより、ビオチン・アビジン相互作用を利用する。
しかし、これらの技術における問題は、所望成分をマイ
クロプレートに固定するために用いられる疎水性結合の
効率が、期待した程に良くないことである。比較的少量
の所望成分のみがマイクロプレートに結合し、疎水性結
合はストリンジェント（緊縮型)ハイブリダイゼーショ
ン、あるいは、結合成分またはプローブ／核酸複合体の
幾分かが処理中に洗い流されてしまうような洗浄処理に
耐えることができない。最近、共有結合化学を用いるこ
とにより、オリゴヌクレオチドプローブをマイクロプレ
ートプラスチック表面により堅実に、かつ効率的に結合
できることが示されている。Wu,L.,Chaar, O., Bradle
y, K., Kadushin, J., HLA DR DNA Typing With a Micr
otiter Plate-Based Hybridization Assay, Hum. Immu
n., 1993；37；p.141.この技術において、オリゴヌクレ
オチドプローブは5'末端燐酸基、アミン基または他の反
応性部分を介してプラスチック表面の化学的リンカーに
共有結合する。この方法は手順を単純化し効率を高める
と思われる。
【００１１】目的によっては、一個または複数のヌクレ
オチド置換、挿入または欠失のような核酸配列における
変異を同定することが必要となる。これらのヌクレオチ
ド変異は突然変異体または多形対立遺伝子変異である。
特に注目すべき難点は、一つの塩基がミスマッチしてい
る核酸配列の識別である。配列特異的オリゴヌクレオチ
ドプローブ、すなわち標的核酸配列の適切な領域に完全
に相補的であるプローブが通常用いられる。しかし、す
べてのプライマーおよびプローブは、完全に相補的な核
酸配列領域、および、充分ではあるが完全には相補的で
ない配列、すなわち、少なくとも一つのミスマッチした
塩基を含む領域の両方とハイブリダイゼーションする。
したがって、特異的プローブは、完全な標的核酸配列な
らびに増幅処理後に存在する実質的に類似しているが標
的ではない核酸配列と、ハイブリダイゼーションする。
オチド置換、挿入または欠失のような核酸配列における
変異を同定することが必要となる。これらのヌクレオチ
ド変異は突然変異体または多形対立遺伝子変異である。
特に注目すべき難点は、一つの塩基がミスマッチしてい
る核酸配列の識別である。配列特異的オリゴヌクレオチ
ドプローブ、すなわち標的核酸配列の適切な領域に完全
に相補的であるプローブが通常用いられる。しかし、す
べてのプライマーおよびプローブは、完全に相補的な核
酸配列領域、および、充分ではあるが完全には相補的で
ない配列、すなわち、少なくとも一つのミスマッチした
塩基を含む領域の両方とハイブリダイゼーションする。
したがって、特異的プローブは、完全な標的核酸配列な
らびに増幅処理後に存在する実質的に類似しているが標
的ではない核酸配列と、ハイブリダイゼーションする。
【００１２】これらの類似ハイブリッドを他のハイブリ
ッドから識別する様々な方法が用いられている。例え
ば、プローブと核酸配列の間の塩基マッチングが完全に
相補的なハイブリッド、すなわち、完全な標的配列を含
むハイブリッドは、塩基マッチングがより完全でないハ
イブリッドよりも結合が強いことが知られている。した
がって、厳しい洗浄状態および／または毒性化学薬品に
よる処理は、ハイブリッド複合体の物理的性質に影響を
与え、理論的に、弱い複合体を分離させる原因となる。
核酸配列塩基のミスマッチを検出するこれらの公知の方
法は、実験室で日常的に使用するには困難すぎ、苛酷か
つ不便である。
ッドから識別する様々な方法が用いられている。例え
ば、プローブと核酸配列の間の塩基マッチングが完全に
相補的なハイブリッド、すなわち、完全な標的配列を含
むハイブリッドは、塩基マッチングがより完全でないハ
イブリッドよりも結合が強いことが知られている。した
がって、厳しい洗浄状態および／または毒性化学薬品に
よる処理は、ハイブリッド複合体の物理的性質に影響を
与え、理論的に、弱い複合体を分離させる原因となる。
核酸配列塩基のミスマッチを検出するこれらの公知の方
法は、実験室で日常的に使用するには困難すぎ、苛酷か
つ不便である。
【００１３】以上のことから、種々の種類の試料材料
を、骨の折れる核酸抽出および精製の工程を行わずに、
ＤＮＡ増幅のために調製できるようにすることにより、
検査試料中の複数の標的核酸配列を調製および増幅する
効率を改善し、これに必要な時間を短くする方法および
装置を提供することは有利である。
を、骨の折れる核酸抽出および精製の工程を行わずに、
ＤＮＡ増幅のために調製できるようにすることにより、
検査試料中の複数の標的核酸配列を調製および増幅する
効率を改善し、これに必要な時間を短くする方法および
装置を提供することは有利である。
【００１４】試料中の複数の標的核酸配列を同時かつ非
優先的に増幅することを可能にすることによって、検査
試料中の複数の標的核酸配列を調製および増幅する効率
を改善し、これに必要な時間を短くする方法および装置
を提供することは、もう一つの利点である。
優先的に増幅することを可能にすることによって、検査
試料中の複数の標的核酸配列を調製および増幅する効率
を改善し、これに必要な時間を短くする方法および装置
を提供することは、もう一つの利点である。
【００１５】検査試料中の複数の標的核酸配列を調製お
よび増幅する効率を改善し、これに要する時間を短くす
る、簡単で使いやすく、経済的かつ迅速な方法および装
置を提供することは、もう一つの利点である。
よび増幅する効率を改善し、これに要する時間を短くす
る、簡単で使いやすく、経済的かつ迅速な方法および装
置を提供することは、もう一つの利点である。
【００１６】なお、複数の増幅核酸配列間の一塩基ミス
マッチさえも検出、識別でき、厳密かつ苛酷で不便な処
理条件を必要としない、方法および装置を提供すること
は、さらにもう一つの利点である。
マッチさえも検出、識別でき、厳密かつ苛酷で不便な処
理条件を必要としない、方法および装置を提供すること
は、さらにもう一つの利点である。
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】本発明の主な目的は、
種々のタイプの試料材料を核酸増幅のために迅速かつ簡
単に調製することを可能にし、試料中の複数の標的核酸
配列を同時かつ非優先的に増幅させることを可能にする
ことにより、検査試料中の複数の分析対象物の検出およ
び識別の効率を改善する方法および装置を提供すること
にある。
種々のタイプの試料材料を核酸増幅のために迅速かつ簡
単に調製することを可能にし、試料中の複数の標的核酸
配列を同時かつ非優先的に増幅させることを可能にする
ことにより、検査試料中の複数の分析対象物の検出およ
び識別の効率を改善する方法および装置を提供すること
にある。
【００１８】本発明の他の目的は、検査試料中の複数の
分析対象物を検出、識別するための、簡単で使いやす
く、経済的かつ迅速な方法および装置を提供することに
ある。
分析対象物を検出、識別するための、簡単で使いやす
く、経済的かつ迅速な方法および装置を提供することに
ある。
【００１９】本発明のさらなる目的は、事実上、すべて
の種類の試料材料を核酸増幅処理のために簡単かつ迅速
に調製できるようにする上述の方法および装置を提供す
ることにある。特に、骨の折れる核酸抽出および精製工
程を必要とせずに試料調製するための迅速な試料処理方
法を提供するのが望ましい。好ましくは、迅速な試料処
理方法の操作時間は約５分以内である。
の種類の試料材料を核酸増幅処理のために簡単かつ迅速
に調製できるようにする上述の方法および装置を提供す
ることにある。特に、骨の折れる核酸抽出および精製工
程を必要とせずに試料調製するための迅速な試料処理方
法を提供するのが望ましい。好ましくは、迅速な試料処
理方法の操作時間は約５分以内である。
【００２０】本発明の他の目的は、複数の標的核酸配列
を同時かつ非優先的に増幅させることを可能にする、検
査試料中の複数の分析対象物を検出、識別する方法およ
び装置を提供することにある。特に、複数の標的核酸配
列が存在する場合に、該標的核酸配列を同時かつ非優先
的に増幅させるための、迅速かつ効率的な複数分析対象
物非優先的増幅処理方法を提供するのが望ましい。複数
分析対象物非優先的増幅処理方法の操作時間は約２時間
以内であるのが好ましい。
を同時かつ非優先的に増幅させることを可能にする、検
査試料中の複数の分析対象物を検出、識別する方法およ
び装置を提供することにある。特に、複数の標的核酸配
列が存在する場合に、該標的核酸配列を同時かつ非優先
的に増幅させるための、迅速かつ効率的な複数分析対象
物非優先的増幅処理方法を提供するのが望ましい。複数
分析対象物非優先的増幅処理方法の操作時間は約２時間
以内であるのが好ましい。
【００２１】さらに、本発明の他の目的は、迅速かつ正
確な標的核酸配列の検出および識別を可能にする、検査
試料内の複数分析物対象物を検出、識別する方法および
装置を提供することにある。特に、簡単で使いやすく、
迅速であって、一塩基ミスマッチのみを含む少数の塩基
ミスマッチを有する増幅させた核酸配列を識別するため
の核酸配列ミスマッチ検出手段が組み込まれている複数
分析対象物認識処方理法を提供するのが望ましい。所要
に応じて核酸配列ミスマッチ検出をも含む複数分析対象
物認識処理方法の操作時間は約２時間以内であるのが好
ましい。本発明のこれらおよび他の目的および利点は、
詳細な説明を参照することにより一層良く理解され、ま
た、本発明の実施例によって認められるであろう。
確な標的核酸配列の検出および識別を可能にする、検査
試料内の複数分析物対象物を検出、識別する方法および
装置を提供することにある。特に、簡単で使いやすく、
迅速であって、一塩基ミスマッチのみを含む少数の塩基
ミスマッチを有する増幅させた核酸配列を識別するため
の核酸配列ミスマッチ検出手段が組み込まれている複数
分析対象物認識処方理法を提供するのが望ましい。所要
に応じて核酸配列ミスマッチ検出をも含む複数分析対象
物認識処理方法の操作時間は約２時間以内であるのが好
ましい。本発明のこれらおよび他の目的および利点は、
詳細な説明を参照することにより一層良く理解され、ま
た、本発明の実施例によって認められるであろう。
【００２２】
【課題を解決するための手段】上述の目的を達成するた
めに、ここに具体化して広く説明されている本発明によ
れば、本発明の方法は、(i) 独特な核酸抽出緩衝溶液配
合物を用いて核酸配列を増幅させるための種々の試料材
料を迅速に調製するための迅速試料処理方法、(ii)実質
的に同様な増幅効率が達成されるよう最適化した適切な
プライマーオリゴヌクレオチドを用いて、試料中に複数
の標的核酸配列が存在する場合に、該標的核酸配列を同
時かつ非優先的に増幅させるための複数分析対象物非優
先的増幅処理方法、および(iii) 一塩基ミスマッチのみ
を含む複数の増幅された核酸配列間の少数のミスマッチ
を識別するための核酸配列ミスマッチ検出手段が組み込
まれており、中性塩基置換分子で修飾された適切なプロ
ーブオリゴヌクレオチドが用いられている、増幅された
核酸配列を検出識別するための複数分析対象物認識処理
方法を含む。
めに、ここに具体化して広く説明されている本発明によ
れば、本発明の方法は、(i) 独特な核酸抽出緩衝溶液配
合物を用いて核酸配列を増幅させるための種々の試料材
料を迅速に調製するための迅速試料処理方法、(ii)実質
的に同様な増幅効率が達成されるよう最適化した適切な
プライマーオリゴヌクレオチドを用いて、試料中に複数
の標的核酸配列が存在する場合に、該標的核酸配列を同
時かつ非優先的に増幅させるための複数分析対象物非優
先的増幅処理方法、および(iii) 一塩基ミスマッチのみ
を含む複数の増幅された核酸配列間の少数のミスマッチ
を識別するための核酸配列ミスマッチ検出手段が組み込
まれており、中性塩基置換分子で修飾された適切なプロ
ーブオリゴヌクレオチドが用いられている、増幅された
核酸配列を検出識別するための複数分析対象物認識処理
方法を含む。
【００２３】迅速試料処理方法の独特な抽出緩衝溶液配
合物は、実質的にすべての種類の試料材料に用いても有
効である。試料処理方法の操作時間は約５分以内である
のが好ましい。複数分析対象物非優先的増幅処理方法の
独特なオリゴヌクレオチドプライマーは、確実に、交差
反応を避け、かつ選択された処理条件において増幅効率
を実質的に等しくするように、適合している。複数分析
対象物非優先的増幅処理の操作時間は２時間以内である
のが好ましい。所要に応じて核酸配列ミスマッチ検出を
含む複数分析対象物認識処理方法の操作時間は、約２時
間以内であるのが好ましい。
合物は、実質的にすべての種類の試料材料に用いても有
効である。試料処理方法の操作時間は約５分以内である
のが好ましい。複数分析対象物非優先的増幅処理方法の
独特なオリゴヌクレオチドプライマーは、確実に、交差
反応を避け、かつ選択された処理条件において増幅効率
を実質的に等しくするように、適合している。複数分析
対象物非優先的増幅処理の操作時間は２時間以内である
のが好ましい。所要に応じて核酸配列ミスマッチ検出を
含む複数分析対象物認識処理方法の操作時間は、約２時
間以内であるのが好ましい。
【００２４】本発明の装置は、(i) 核酸配列増幅のため
に、適切な試薬を用いて、事実上、すべての種類の試料
材料をも迅速に調製する手段、(ii)試料中に複数の標的
核酸配列が存在する場合に、適切なプライマーオリゴヌ
クレオチドを用いて、該標的核酸配列を同時かつ非優先
的に増幅させる手段、および(iii) 適切なプローブオリ
ゴヌクレオチドを用いて、一塩基ミスマッチのみを有す
る核酸配列を含む複数の増幅核酸配列を検出、識別する
手段を備える処理キット製品からなる。本発明の処理キ
ット製品には上述の手段のすべてまたは一部のみを組み
込むことができる。
に、適切な試薬を用いて、事実上、すべての種類の試料
材料をも迅速に調製する手段、(ii)試料中に複数の標的
核酸配列が存在する場合に、適切なプライマーオリゴヌ
クレオチドを用いて、該標的核酸配列を同時かつ非優先
的に増幅させる手段、および(iii) 適切なプローブオリ
ゴヌクレオチドを用いて、一塩基ミスマッチのみを有す
る核酸配列を含む複数の増幅核酸配列を検出、識別する
手段を備える処理キット製品からなる。本発明の処理キ
ット製品には上述の手段のすべてまたは一部のみを組み
込むことができる。
【００２５】本発明は、種々のタイプの試料材料中に存
在する可能性のある複数の分析対象物を検出、識別する
のに有用な方法および装置に関する。特に、本発明の方
法および装置は、試料材料中に含まれる核酸配列を増幅
させるために、事実上すべての種類の試料材料をも調製
するための迅速試料処理手段、試料中に複数の標的核酸
配列が存在する場合に、該標的核酸配列を同時かつ非優
先的に増幅させる複数分析対象物非優先的増幅処理手
段、および増幅された複数の核酸配列間に、一塩基ミス
マッチを含む少数の塩基ミスマッチを検出、識別するた
めの核酸配列ミスマッチ検出手段が組み込まれている複
数分析対象物認識処理手段を利用するものである。
在する可能性のある複数の分析対象物を検出、識別する
のに有用な方法および装置に関する。特に、本発明の方
法および装置は、試料材料中に含まれる核酸配列を増幅
させるために、事実上すべての種類の試料材料をも調製
するための迅速試料処理手段、試料中に複数の標的核酸
配列が存在する場合に、該標的核酸配列を同時かつ非優
先的に増幅させる複数分析対象物非優先的増幅処理手
段、および増幅された複数の核酸配列間に、一塩基ミス
マッチを含む少数の塩基ミスマッチを検出、識別するた
めの核酸配列ミスマッチ検出手段が組み込まれている複
数分析対象物認識処理手段を利用するものである。
【００２６】本発明の方法および装置は、試料中の複数
分析対象物の検出および識別を、比較的短時間、好まし
くは約５時間以内で行うことができる。最も好ましく
は、試料調製時間は約５分以内、標的核酸配列の同時非
優先的増幅時間は約２時間以内、また複数の増幅された
核酸配列の認識時間は約２時間以内である。
分析対象物の検出および識別を、比較的短時間、好まし
くは約５時間以内で行うことができる。最も好ましく
は、試料調製時間は約５分以内、標的核酸配列の同時非
優先的増幅時間は約２時間以内、また複数の増幅された
核酸配列の認識時間は約２時間以内である。
【００２７】複数の核酸配列を増幅させるための試料を
調製するための迅速試料処理手段は、事実上すべての種
類の試料材料について有効である独特な抽出緩衝溶液配
合物を使用する。複数分析対象物非優先的増幅処理方法
は、確実に交差反応性が避けわれるように、また、選択
された処理条件において確実に増幅効率が実質的に等し
くなるように最適化された複数の適切なプライマーオリ
ゴヌクレオチドを使用する。複数分析対象物認識処理は
適切なプローブオリゴヌクレオチドを用いて行われ、プ
ローブ／核酸配列ハイブリッドの結合効率を高めるため
に共有結合による結合技術を組み入れて、マイクロタイ
ター(microtiter)プレート上で行うのが好ましい。さら
に、核酸配列ミスマッチの検出は、一塩基ミスマッチの
みを含む少数のミスマッチを有する増幅核酸配列間にお
ける識別を可能にするものである。核酸配列ミスマッチ
の検出方法は、少なくとも一つの中性塩基置換で修飾さ
れた適切なプローブオリゴヌクレオチドを使用し、厳密
または苛酷な処理条件を必要としない。
調製するための迅速試料処理手段は、事実上すべての種
類の試料材料について有効である独特な抽出緩衝溶液配
合物を使用する。複数分析対象物非優先的増幅処理方法
は、確実に交差反応性が避けわれるように、また、選択
された処理条件において確実に増幅効率が実質的に等し
くなるように最適化された複数の適切なプライマーオリ
ゴヌクレオチドを使用する。複数分析対象物認識処理は
適切なプローブオリゴヌクレオチドを用いて行われ、プ
ローブ／核酸配列ハイブリッドの結合効率を高めるため
に共有結合による結合技術を組み入れて、マイクロタイ
ター(microtiter)プレート上で行うのが好ましい。さら
に、核酸配列ミスマッチの検出は、一塩基ミスマッチの
みを含む少数のミスマッチを有する増幅核酸配列間にお
ける識別を可能にするものである。核酸配列ミスマッチ
の検出方法は、少なくとも一つの中性塩基置換で修飾さ
れた適切なプローブオリゴヌクレオチドを使用し、厳密
または苛酷な処理条件を必要としない。
【００２８】本発明の装置は、検査試料中の複数の分析
対象物を検出、識別するための処理キット製品からな
る。処理キット製品は以下のいずれか、またはすべてを
含むものである。すなわち (i)核酸配列増幅のために、
適切な試薬を用いて、事実上すべてのタイプの試料材料
を迅速に調製する手段、(ii)試料中に複数の標的核酸配
列が存在する場合に、適切なプライマーオリゴヌクレオ
チドを用いて、該標的核酸配列を同時かつ非優先的に増
幅させる手段、および(iii) 一塩基ミスマッチのみを有
する核酸配列を含む複数の核酸配列間の少数のミスマッ
チを、適切なプローブオリゴヌクレオチドを用いて、検
出および識別手段を含む。
対象物を検出、識別するための処理キット製品からな
る。処理キット製品は以下のいずれか、またはすべてを
含むものである。すなわち (i)核酸配列増幅のために、
適切な試薬を用いて、事実上すべてのタイプの試料材料
を迅速に調製する手段、(ii)試料中に複数の標的核酸配
列が存在する場合に、適切なプライマーオリゴヌクレオ
チドを用いて、該標的核酸配列を同時かつ非優先的に増
幅させる手段、および(iii) 一塩基ミスマッチのみを有
する核酸配列を含む複数の核酸配列間の少数のミスマッ
チを、適切なプローブオリゴヌクレオチドを用いて、検
出および識別手段を含む。
【００２９】本発明の方法および装置の最も重要な利点
の一つは、時間を省けることである。独特な組成の抽出
緩衝溶液を使用することにより、事実上すべてのタイプ
の試料材料の調製を迅速に行うことができる。独特な最
適化したオリゴヌクレオチドプライマーを使用すること
により優先的増幅を確実に回避し、かつ複数の標的核酸
配列の同時増幅を確実に可能にすることにより、標的核
酸配列の増幅処理時間は劇的に短縮される。本発明によ
れば、一つの試料中で６個あるいはそれ以上の異なる標
的核酸配列を非優先的に増幅できる。したがって、本発
明によれば、異なるタイプの試料材料の調製および別個
の試料部分における反復増幅処理のために、従来費やし
ていた途方もなく長い時間を短縮できる。さらに、複数
分析対象物認識処理で用いられる独特なプローブは、中
性塩基置換を組み入れて、簡単で使いやすい処理条件に
おいても、一塩基の相違のみを有する配列も含めて、核
酸配列の正確な識別を容易にする。
の一つは、時間を省けることである。独特な組成の抽出
緩衝溶液を使用することにより、事実上すべてのタイプ
の試料材料の調製を迅速に行うことができる。独特な最
適化したオリゴヌクレオチドプライマーを使用すること
により優先的増幅を確実に回避し、かつ複数の標的核酸
配列の同時増幅を確実に可能にすることにより、標的核
酸配列の増幅処理時間は劇的に短縮される。本発明によ
れば、一つの試料中で６個あるいはそれ以上の異なる標
的核酸配列を非優先的に増幅できる。したがって、本発
明によれば、異なるタイプの試料材料の調製および別個
の試料部分における反復増幅処理のために、従来費やし
ていた途方もなく長い時間を短縮できる。さらに、複数
分析対象物認識処理で用いられる独特なプローブは、中
性塩基置換を組み入れて、簡単で使いやすい処理条件に
おいても、一塩基の相違のみを有する配列も含めて、核
酸配列の正確な識別を容易にする。
【００３０】本発明の方法および装置は極めて多目的に
利用でき、広範囲にわたり使用できる。例えば、生物試
料において、存在する可能性のある複数の微生物を同時
検出および識別することにより、感染症の診断を迅速に
行うことができる。また、食物などの他の種類の試料に
おいて、存在する可能性のある複数の微生物を、診断/
法医学鑑定または品質管理目的などの種々の目的で、迅
速に検出および識別するためにも役立つものである。遺
伝学的研究においても、数多くかつ多目的に用いられ
る。本発明によれば、一塩基ミスマッチ配列の識別を含
めて、特定の遺伝子配列を、遺伝病の診断、あるいは遺
伝子分散の同定などの目的で検出および識別すること
が、迅速、簡単かつ正確に行われる。
利用でき、広範囲にわたり使用できる。例えば、生物試
料において、存在する可能性のある複数の微生物を同時
検出および識別することにより、感染症の診断を迅速に
行うことができる。また、食物などの他の種類の試料に
おいて、存在する可能性のある複数の微生物を、診断/
法医学鑑定または品質管理目的などの種々の目的で、迅
速に検出および識別するためにも役立つものである。遺
伝学的研究においても、数多くかつ多目的に用いられ
る。本発明によれば、一塩基ミスマッチ配列の識別を含
めて、特定の遺伝子配列を、遺伝病の診断、あるいは遺
伝子分散の同定などの目的で検出および識別すること
が、迅速、簡単かつ正確に行われる。
【００３１】本発明の方法および装置を一般的に、また
特定の臨床的使用に関して説明する。本発明の方法およ
び装置の臨床的使用の一例は、複数の潜在的感染性病原
体の検出および識別である。特に、本発明の方法および
装置を、急性胃腸炎の原因の診断補助の目的で胃腸炎パ
ネルに使用する利点を説明する。
特定の臨床的使用に関して説明する。本発明の方法およ
び装置の臨床的使用の一例は、複数の潜在的感染性病原
体の検出および識別である。特に、本発明の方法および
装置を、急性胃腸炎の原因の診断補助の目的で胃腸炎パ
ネルに使用する利点を説明する。
【００３２】急性胃腸炎の原因には多くの可能性があ
る。類似の徴候および症状を示す他の疾患から急性胃腸
炎を区別することは、しばしば重要である。さらに、感
染性病因の症例によっては、特定の原因病原体を決定す
ることは重大である。場合によっては、特定の効果的か
つ薬理学的治療を迅速に開始することが命を助けること
になるが、他の場合には、不適切な抗菌剤の使用が患者
にとって実際に有害となる。迅速な検出および識別分析
が特に役立つ５つのグループの潜在的感染性病源体は、
サルモネラ(Salmonella ）菌種、シゲラ(Shigella)菌種
および腸管侵入型大腸菌(enteroinvasive Esherichia c
oli)、カンピロバクター ( Campylobacter) 菌種、腸管
出血型大腸菌(enterohemorrhagic E. coli)(特に大腸菌
O157:H7(E.coli O157:H7))、および腸炎エルシニア(Yer
sinia enterocolitica) である。これらの５つのグルー
プの選択された特徴を以下に詳述する。
る。類似の徴候および症状を示す他の疾患から急性胃腸
炎を区別することは、しばしば重要である。さらに、感
染性病因の症例によっては、特定の原因病原体を決定す
ることは重大である。場合によっては、特定の効果的か
つ薬理学的治療を迅速に開始することが命を助けること
になるが、他の場合には、不適切な抗菌剤の使用が患者
にとって実際に有害となる。迅速な検出および識別分析
が特に役立つ５つのグループの潜在的感染性病源体は、
サルモネラ(Salmonella ）菌種、シゲラ(Shigella)菌種
および腸管侵入型大腸菌(enteroinvasive Esherichia c
oli)、カンピロバクター ( Campylobacter) 菌種、腸管
出血型大腸菌(enterohemorrhagic E. coli)(特に大腸菌
O157:H7(E.coli O157:H7))、および腸炎エルシニア(Yer
sinia enterocolitica) である。これらの５つのグルー
プの選択された特徴を以下に詳述する。
【００３３】1.サルモネラ菌種 疾病：軽症な胃腸炎から生命を脅かす腸チフス、菌血
症、髄膜炎、呼吸器疾患、心疾患および骨感染症まで。
無症候性保菌状態もよくみられる。 流行：米国で毎年、三百万症例と推定される。通常、食
物原因の感染である。 診断：確認寒天培地および中等度選択性寒天培地を用い
てスクリーニングする。生化学的総合試験および血清型
決定を行って同定する。 予備検査結果までの時間：１８−４８時間 治療：抗生物質療法はある臨床状況においてのみ適切で
あり、他の状況においては有害な場合もある。抗生物質
耐性がよく見られる。
症、髄膜炎、呼吸器疾患、心疾患および骨感染症まで。
無症候性保菌状態もよくみられる。 流行：米国で毎年、三百万症例と推定される。通常、食
物原因の感染である。 診断：確認寒天培地および中等度選択性寒天培地を用い
てスクリーニングする。生化学的総合試験および血清型
決定を行って同定する。 予備検査結果までの時間：１８−４８時間 治療：抗生物質療法はある臨床状況においてのみ適切で
あり、他の状況においては有害な場合もある。抗生物質
耐性がよく見られる。
【００３４】2.シゲラ菌種および腸管侵入型大腸菌(EIE
C) 疾病：細菌性赤痢の大部分の症例の原因となる。血液お
よび粘液を伴う水様性下痢。また、死に至る全身性感染
症を併発する。 流行：極めて伝染性の高い細菌性下痢。世界中の１０−
４０％の下痢が関係している。しばしば、デェイケアセ
ンターで発生するものの原因となる。 診断：確認寒天培地および中等度選択性寒天培地を用い
てスクリーニングする。生化学的総合試験および/ また
は血清型決定を行って同定する。 予備検査結果までの時間：１８−４８時間 治療：スルホンアミド剤、テトラサイクリン、アンピシ
リン、およびトリメトプリム−スルファメトキサゾール
にしばしば耐性を有する。
C) 疾病：細菌性赤痢の大部分の症例の原因となる。血液お
よび粘液を伴う水様性下痢。また、死に至る全身性感染
症を併発する。 流行：極めて伝染性の高い細菌性下痢。世界中の１０−
４０％の下痢が関係している。しばしば、デェイケアセ
ンターで発生するものの原因となる。 診断：確認寒天培地および中等度選択性寒天培地を用い
てスクリーニングする。生化学的総合試験および/ また
は血清型決定を行って同定する。 予備検査結果までの時間：１８−４８時間 治療：スルホンアミド剤、テトラサイクリン、アンピシ
リン、およびトリメトプリム−スルファメトキサゾール
にしばしば耐性を有する。
【００３５】3.カンピロバクター菌種 疾患：米国における散発性細菌性腸炎の最も一般的原因
の一つである。全身性感染症を生じることがある。疑似
急性盲腸炎を生じ、不必要な手術を行う結果となること
がある。ギラン・バレー症候群が感染に強く関連してい
る。 流行：先進国において一年に二百万以上の症例が発症す
ると推定されており、発達途上国においては、これの数
十倍多い発症例とされる。通常、動物が宿主。 診断：通常、微好気的環境および高温を必要とする。正
常菌叢の増殖を阻止する抗生物質を含む選択培地を使用
する。グラム染色およびオキシダーゼ試験を用いて同定
する。さらに、同定が必要な場合、レファレンス検査室
に送られる。 予備検査結果までの時間：４８−７２時間 治療：通常、エリスロマイシンおよびシプロフロキサシ
ンが選択される。
の一つである。全身性感染症を生じることがある。疑似
急性盲腸炎を生じ、不必要な手術を行う結果となること
がある。ギラン・バレー症候群が感染に強く関連してい
る。 流行：先進国において一年に二百万以上の症例が発症す
ると推定されており、発達途上国においては、これの数
十倍多い発症例とされる。通常、動物が宿主。 診断：通常、微好気的環境および高温を必要とする。正
常菌叢の増殖を阻止する抗生物質を含む選択培地を使用
する。グラム染色およびオキシダーゼ試験を用いて同定
する。さらに、同定が必要な場合、レファレンス検査室
に送られる。 予備検査結果までの時間：４８−７２時間 治療：通常、エリスロマイシンおよびシプロフロキサシ
ンが選択される。
【００３６】4.腸管出血性大腸菌(EHEC)、特にO157:H7
菌株 疾病：血液性および非血液性下痢( 出血性大腸炎) 、溶
血性尿毒性症状(HUSー小児における急性腎不全の主要原
因) 、血栓性血小板減少性紫斑病および死亡。 流行：大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７は20,000以上の感染症を引
き起こし、米国において毎年２５０以上の死亡例がある
と推定されている。一般に加熱不十分のハンバーガーに
関連している。 診断：ソルビトールを迅速には発酵させない。ソルビト
ール・マッコンキー寒天( ＳＭＡＣ) プレートを用いて
スクリーニングする。抗血清を用いて、Ｏ１５７抗原を
検定する。Ｈ７を確認するために、レファレンス検査室
に送る。 予備検査結果までの時間：１８−４８時間 治療：抗生物質による治療は症状を悪化させる可能性が
ある。
菌株 疾病：血液性および非血液性下痢( 出血性大腸炎) 、溶
血性尿毒性症状(HUSー小児における急性腎不全の主要原
因) 、血栓性血小板減少性紫斑病および死亡。 流行：大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７は20,000以上の感染症を引
き起こし、米国において毎年２５０以上の死亡例がある
と推定されている。一般に加熱不十分のハンバーガーに
関連している。 診断：ソルビトールを迅速には発酵させない。ソルビト
ール・マッコンキー寒天( ＳＭＡＣ) プレートを用いて
スクリーニングする。抗血清を用いて、Ｏ１５７抗原を
検定する。Ｈ７を確認するために、レファレンス検査室
に送る。 予備検査結果までの時間：１８−４８時間 治療：抗生物質による治療は症状を悪化させる可能性が
ある。
【００３７】５. 腸炎エルニシア 疾患：重症全身性感染症につながるヒト胃腸炎の主要原
因。数カ国で、感染血液の輸血によるエルシニア菌症の
致命的症例が報告されている。 流行：米国、カナダおよび北欧で、次第に、重要になっ
てきている。通常、食物に強く関連している。 診断：ＣＩＮ(cefsulodin-irgasan-novobiocin )寒天な
どの選択培地を用いて低温で培養される。生化学的総合
試験を用いて同定される。血清学的測定が有用である。 予備検査結果までの時間：２４時間から７日間 治療：アミノグリコシドおよび／または、トリメトプリ
ム- スルファメトキサゾールは、腸管外症例に適応され
る。
因。数カ国で、感染血液の輸血によるエルシニア菌症の
致命的症例が報告されている。 流行：米国、カナダおよび北欧で、次第に、重要になっ
てきている。通常、食物に強く関連している。 診断：ＣＩＮ(cefsulodin-irgasan-novobiocin )寒天な
どの選択培地を用いて低温で培養される。生化学的総合
試験を用いて同定される。血清学的測定が有用である。 予備検査結果までの時間：２４時間から７日間 治療：アミノグリコシドおよび／または、トリメトプリ
ム- スルファメトキサゾールは、腸管外症例に適応され
る。
【００３８】
1.迅速試料処理方法 上記の潜在的病原体を迅速に検出および識別することは
極めて有益であることが認められる。急性胃腸炎は胃腸
管に局在するため、潜在的病原体を分析するために最も
適切な試料材料は、便試料材料である。便試料材料を分
析する従来技術の方法は、通常時間がかかり、骨の折れ
る取扱いおよび調製処理を必要としていた。便試料材料
中に、病原体が存在する場合、この病原体の検出および
識別は、通常臨床検査室にとって困難を極めるものであ
る。しかし、本発明の方法および装置によれば、便試料
材料を、次の核酸配列の増幅、検出および識別のため
に、迅速かつ簡単に調製できる。
極めて有益であることが認められる。急性胃腸炎は胃腸
管に局在するため、潜在的病原体を分析するために最も
適切な試料材料は、便試料材料である。便試料材料を分
析する従来技術の方法は、通常時間がかかり、骨の折れ
る取扱いおよび調製処理を必要としていた。便試料材料
中に、病原体が存在する場合、この病原体の検出および
識別は、通常臨床検査室にとって困難を極めるものであ
る。しかし、本発明の方法および装置によれば、便試料
材料を、次の核酸配列の増幅、検出および識別のため
に、迅速かつ簡単に調製できる。
【００３９】本発明に従って、事実上すべての試料材料
を、迅速かつ簡単に核酸増幅処理のために調製できる方
法および装置を提供するのが望ましい。種々のタイプの
試料材料中の核酸を抽出および／または精製するための
従来技術は一般に時間を費やし、重労働である。さら
に、例えば、便試料、異なる抗凝血剤を含む血液試料、
または凝固血液検体などの特定のタイプの試料材料の核
酸を抽出および／または精製することは非常に困難で、
非実用的である。本発明は、困難な核酸抽出および精製
工程を回避する、核酸配列を増幅させるための試料を調
製する迅速試料処理方法を提供する。この試料処理方法
の操作時間は、好ましくは、約５分以内である。
を、迅速かつ簡単に核酸増幅処理のために調製できる方
法および装置を提供するのが望ましい。種々のタイプの
試料材料中の核酸を抽出および／または精製するための
従来技術は一般に時間を費やし、重労働である。さら
に、例えば、便試料、異なる抗凝血剤を含む血液試料、
または凝固血液検体などの特定のタイプの試料材料の核
酸を抽出および／または精製することは非常に困難で、
非実用的である。本発明は、困難な核酸抽出および精製
工程を回避する、核酸配列を増幅させるための試料を調
製する迅速試料処理方法を提供する。この試料処理方法
の操作時間は、好ましくは、約５分以内である。
【００４０】本発明の迅速試料処理方法は、独特な抽出
緩衝溶液を使用して、事実上あらゆるタイプの試料材料
において、核酸抽出を行う。既知の抽出緩衝溶液は、通
常トリス塩酸（米国ミズーリ州セントルイス所在の Sig
ma Chemical Co. から入手可能) のような緩衝溶液、Ｅ
ＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸) 、および少なくとも
一種の界面活性剤組成物を含む。これに対して、本発明
の抽出緩衝溶液は、トリス塩酸、ＥＤＴＡ、少なくとも
一種の界面活性剤、および好ましくはそのモル濃度が１
Ｍから６Ｍまでの範囲にある少なくとも一種の塩を含
む。本発明の抽出緩衝溶液は、好ましくは、例えばイゲ
パール（Igepal) ＣＡ６３０（商標名）およびツイーン
（Tween)２０（商標名）（共に米国ミズーリ州セントル
イス所在のSigma Chemical Co.から入手可能) のような
２種の界面活性剤およびＮａＣｌ約２．０Ｍを含むもの
である。
緩衝溶液を使用して、事実上あらゆるタイプの試料材料
において、核酸抽出を行う。既知の抽出緩衝溶液は、通
常トリス塩酸（米国ミズーリ州セントルイス所在の Sig
ma Chemical Co. から入手可能) のような緩衝溶液、Ｅ
ＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸) 、および少なくとも
一種の界面活性剤組成物を含む。これに対して、本発明
の抽出緩衝溶液は、トリス塩酸、ＥＤＴＡ、少なくとも
一種の界面活性剤、および好ましくはそのモル濃度が１
Ｍから６Ｍまでの範囲にある少なくとも一種の塩を含
む。本発明の抽出緩衝溶液は、好ましくは、例えばイゲ
パール（Igepal) ＣＡ６３０（商標名）およびツイーン
（Tween)２０（商標名）（共に米国ミズーリ州セントル
イス所在のSigma Chemical Co.から入手可能) のような
２種の界面活性剤およびＮａＣｌ約２．０Ｍを含むもの
である。
【００４１】実施例１は、本発明の迅速試料処理方法の
効果を、フェノール／クロロホルム抽出および蛋白質の
塩析と呼ばれる核酸増幅処理のための便試料の調製のた
めの、従来の二つの異なる試料処理方法と比較してい
る。迅速試料処理方法の操作時間は約３. ５分である。
極めて対照的に、フェノール／クロロホルム抽出の操作
時間は約４. ５時間であり、蛋白質塩析法の操作時間は
約１２. ７５時間であった。実施例２は便試料以外の試
料材料に用いた本発明の迅速試料処理方法の効果を説明
している。
効果を、フェノール／クロロホルム抽出および蛋白質の
塩析と呼ばれる核酸増幅処理のための便試料の調製のた
めの、従来の二つの異なる試料処理方法と比較してい
る。迅速試料処理方法の操作時間は約３. ５分である。
極めて対照的に、フェノール／クロロホルム抽出の操作
時間は約４. ５時間であり、蛋白質塩析法の操作時間は
約１２. ７５時間であった。実施例２は便試料以外の試
料材料に用いた本発明の迅速試料処理方法の効果を説明
している。
【００４２】
実施例１材料および方法 I.試料 臨床的便検体は、米国ユタ州ソルトレークシティ所在の
ユタ州立保健研究所(Utah State Health Laboratory)；
米国サウスカロライナ州チャールストン所在のサウスカ
ロライナ医科大学(Medical University of South Carol
ina)；米国ユタ州ソルトレークシティ所在のプライマリ
ー・チルドレンズ・メディカルセンターおよび米国ユタ
州ソルトレークシティラボラトリー・コーポレーション
・オブ・アメリカから得た。病原体は、すべての研究所
において、寒天プレート培養により分離された。ラボラ
トリー・コーポレーション・オブ・アメリカから得た検
体からの全病原性分離菌は、米国ユタ州立保健研究所に
よって確認された。
ユタ州立保健研究所(Utah State Health Laboratory)；
米国サウスカロライナ州チャールストン所在のサウスカ
ロライナ医科大学(Medical University of South Carol
ina)；米国ユタ州ソルトレークシティ所在のプライマリ
ー・チルドレンズ・メディカルセンターおよび米国ユタ
州ソルトレークシティラボラトリー・コーポレーション
・オブ・アメリカから得た。病原体は、すべての研究所
において、寒天プレート培養により分離された。ラボラ
トリー・コーポレーション・オブ・アメリカから得た検
体からの全病原性分離菌は、米国ユタ州立保健研究所に
よって確認された。
【００４３】II. 臨床的便試料からのＤＮＡ抽出 Ａ．迅速試料処理方法（所要時間：約３. ５分) よく混合した臨床検体の５％溶液は、以下のものを含む
本発明の好ましい抽出緩衝溶液、１０００μｌを用い
て、２ｍｌミクロ遠心管内で調製した。すなわち、緩衝
溶液は１％のイゲパールＣＡ６３０，０. ５％のツイー
ン２０、１０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ８. ０、１ｍＭの
ＥＤＴＡ、および２ＭのＮａＣｌ( 全化学薬品は、米国
ミズーリ州セントルイス所在のSigma Chemical Co.から
入手) からなる。混合物は強く渦動させた。この遠心管
をエッペンドルフ5415Ｃミクロ遠心分離機（米国ニュー
ヨーク州ウエストバリー所在のBrinkman Instruments,
Inc.) で１６, ０００×ｇにて５秒間遠心した。８００
μｌの上澄液をマイクロ波処理可能な２ｍｌ用ネジブタ
付き遠心管（米国ノースカロライナー州ニュートン所在
の Sarstadt 社）に移し、ケンモア 89250電子レンジ
（米国ユタ州ソルトレークシティ所在の Sears社）内
で、強い電力（〜750 ワット) で１５秒間マイクロ波処
理し、混合し、さらに、１０秒間マイクロ波処理した。
マイクロ波処理後、この遠心管を１６, ０００×ｇにて
１分間遠心処理して、沈殿した蛋白質をペレット化し
た。ペレット化した材料を乱すことなく、測定量の上澄
液を、同容積の室温のイソプロパノール(Sigma Chemica
l Co.)の入っている新しいミクロ遠心管に移し、渦動さ
せることにより混合した。この遠心管を１６，０００×
ｇで１分間遠心処理し、ＤＮＡをペレット化した。上澄
液をデカンテーションして、１ｍｌの７０％エタノール
をペレットに加えた。この遠心管の内容物を渦動させ、
この遠心管を１６，０００×ｇで１分間遠心処理した。
ペレットを乱すことなく、上澄液を吸引除去し、３５μ
のＴＥ緩衝溶液（１０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０、
１ｍＭＥＤＴＡ）を加えて、ＤＮＡを溶解した。調製し
た試料は、定量分析、純度分析およびポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）分析を行うまで、ー20℃で冷凍保存し
た。
本発明の好ましい抽出緩衝溶液、１０００μｌを用い
て、２ｍｌミクロ遠心管内で調製した。すなわち、緩衝
溶液は１％のイゲパールＣＡ６３０，０. ５％のツイー
ン２０、１０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ８. ０、１ｍＭの
ＥＤＴＡ、および２ＭのＮａＣｌ( 全化学薬品は、米国
ミズーリ州セントルイス所在のSigma Chemical Co.から
入手) からなる。混合物は強く渦動させた。この遠心管
をエッペンドルフ5415Ｃミクロ遠心分離機（米国ニュー
ヨーク州ウエストバリー所在のBrinkman Instruments,
Inc.) で１６, ０００×ｇにて５秒間遠心した。８００
μｌの上澄液をマイクロ波処理可能な２ｍｌ用ネジブタ
付き遠心管（米国ノースカロライナー州ニュートン所在
の Sarstadt 社）に移し、ケンモア 89250電子レンジ
（米国ユタ州ソルトレークシティ所在の Sears社）内
で、強い電力（〜750 ワット) で１５秒間マイクロ波処
理し、混合し、さらに、１０秒間マイクロ波処理した。
マイクロ波処理後、この遠心管を１６, ０００×ｇにて
１分間遠心処理して、沈殿した蛋白質をペレット化し
た。ペレット化した材料を乱すことなく、測定量の上澄
液を、同容積の室温のイソプロパノール(Sigma Chemica
l Co.)の入っている新しいミクロ遠心管に移し、渦動さ
せることにより混合した。この遠心管を１６，０００×
ｇで１分間遠心処理し、ＤＮＡをペレット化した。上澄
液をデカンテーションして、１ｍｌの７０％エタノール
をペレットに加えた。この遠心管の内容物を渦動させ、
この遠心管を１６，０００×ｇで１分間遠心処理した。
ペレットを乱すことなく、上澄液を吸引除去し、３５μ
のＴＥ緩衝溶液（１０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０、
１ｍＭＥＤＴＡ）を加えて、ＤＮＡを溶解した。調製し
た試料は、定量分析、純度分析およびポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）分析を行うまで、ー20℃で冷凍保存し
た。
【００４４】Ｂ．フェノール／クロロホルム抽出 (所要
時間：約４．５時間） よく混合した臨床便試料の５％溶液を１０００μl のＰ
ＢＳ中で調製し、渦動させることによりよく混合した。
この溶液をエッペンドルフ 5415 Ｃミクロ遠心分離機
（米国ニューヨーク州ウエストバリー所在の Brinkman
Instruments, Inc. ）で、１７５０×ｇで１分間遠心処
理し、不溶性粒子物をペレット化した。上澄液を新しい
ミクロ遠心管に移して、１６，０００×ｇで５分間遠心
処理し、細菌をペレット化した。上澄液を除去し、ペレ
ットを１００μｌの燐酸緩衝溶液(PBS）、ｐＨ７．４中
で再懸濁させた。５０μｌの消化／溶解緩衝溶液（５０
ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ８．０、１００ｍＭのＥＤＴ
Ａ、１００ｍＭのＮａＣｌ, ３％のドデシル硫酸ナトリ
ウム(SDS）、２ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ)(全化学
薬品はSigma Chemical Co.から入手）を該遠心管に加
え、緩やかに渦動させて混合した。試料を２．５時間、
５５℃でインキュベートし、３０分毎に緩やかに渦動さ
せた。フェノール／クロロホルム／イソアミル抽出は次
のように行った。すなわち同容積のフェノール／クロロ
ホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１)( Sig
ma Chemical Co.)を該遠心管に加え、２−３回転倒混合
した。１７５０×ｇで１５分間遠心処理することによっ
て有機相と水相とを分離した。水層を新しいミクロ遠心
管に移した。フェノール／クロロホルム／イソアミル抽
出をさらに三回行った。次いで、同様の抽出手順をクロ
ロホルム／イソアミルアルコール（２４：１)( Sigma C
hemical Co.)でさらに二回行った。最終抽出液から、水
層を新しい管に移し、同容積の室温のイソプロピルアル
コールを加えることにより、ＤＮＡを沈殿させた。ＤＮ
Ａは１６，０００×ｇで５分間遠心処理して回収した。
上澄液を除去し、ＤＮＡペレットを１５分間空気乾燥
し、次いで３５μｌのＴＥ緩衝溶液（１０ｍＭトリス塩
酸、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に再懸濁させて
ＤＮＡを溶解した。調製した試料は、定量分析、純度分
析およびポリメラーゼ連鎖反応(PCR）分析を行うまで、
ー２０℃で冷凍保存した。
時間：約４．５時間） よく混合した臨床便試料の５％溶液を１０００μl のＰ
ＢＳ中で調製し、渦動させることによりよく混合した。
この溶液をエッペンドルフ 5415 Ｃミクロ遠心分離機
（米国ニューヨーク州ウエストバリー所在の Brinkman
Instruments, Inc. ）で、１７５０×ｇで１分間遠心処
理し、不溶性粒子物をペレット化した。上澄液を新しい
ミクロ遠心管に移して、１６，０００×ｇで５分間遠心
処理し、細菌をペレット化した。上澄液を除去し、ペレ
ットを１００μｌの燐酸緩衝溶液(PBS）、ｐＨ７．４中
で再懸濁させた。５０μｌの消化／溶解緩衝溶液（５０
ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ８．０、１００ｍＭのＥＤＴ
Ａ、１００ｍＭのＮａＣｌ, ３％のドデシル硫酸ナトリ
ウム(SDS）、２ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ)(全化学
薬品はSigma Chemical Co.から入手）を該遠心管に加
え、緩やかに渦動させて混合した。試料を２．５時間、
５５℃でインキュベートし、３０分毎に緩やかに渦動さ
せた。フェノール／クロロホルム／イソアミル抽出は次
のように行った。すなわち同容積のフェノール／クロロ
ホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１)( Sig
ma Chemical Co.)を該遠心管に加え、２−３回転倒混合
した。１７５０×ｇで１５分間遠心処理することによっ
て有機相と水相とを分離した。水層を新しいミクロ遠心
管に移した。フェノール／クロロホルム／イソアミル抽
出をさらに三回行った。次いで、同様の抽出手順をクロ
ロホルム／イソアミルアルコール（２４：１)( Sigma C
hemical Co.)でさらに二回行った。最終抽出液から、水
層を新しい管に移し、同容積の室温のイソプロピルアル
コールを加えることにより、ＤＮＡを沈殿させた。ＤＮ
Ａは１６，０００×ｇで５分間遠心処理して回収した。
上澄液を除去し、ＤＮＡペレットを１５分間空気乾燥
し、次いで３５μｌのＴＥ緩衝溶液（１０ｍＭトリス塩
酸、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に再懸濁させて
ＤＮＡを溶解した。調製した試料は、定量分析、純度分
析およびポリメラーゼ連鎖反応(PCR）分析を行うまで、
ー２０℃で冷凍保存した。
【００４５】Ｃ．蛋白質塩析法 (所要時間：約１２．７
５時間） よく混合した臨床便試料の５％溶液を１０００μｌのＰ
ＢＳｕｔで調製し、充分渦動させた。この溶液をエッペ
ンドルフ５４１５Ｃミクロ遠心分離機（米国ニューヨー
ク州ウエストバリー所在の Brinkman Instruments, In
c.)で、１７５０×ｇにて１分間遠心処理して不溶性粒
子物をペレット化した。上澄液を新しいミクロ遠心管に
移し、１６，０００×ｇで５分間遠心し、細菌をペレッ
ト化した。上澄液を除き、ペレットは３００μl のNucl
ei Lysis緩衝溶液（１０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．２、
４００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ)(全化学薬品
はSigma Chemical Co.から入手）中に再懸濁させた。溶
解物を５０μl のDigestionSolution（消化溶液)(１％
のＳＤＳ、２ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍｌのプロテイ
ナーゼＫ）（全化学薬品はSigma Chemical Co.から入
手) および２０μl の１０％ＳＤＳ(Sigma Chemical C
o.)を用いて、３７℃で一晩消化させた。１００μl の
６Ｍ ＮａＣｌを試料に加えチューブを激しく１５秒間
振とうし、次いで１７５０ｘｇで１５分間遠心処理し
た。測定量の上澄液を新しい管に移した。正確に二倍量
の室温の無水エタノール（米国カルフォルニア州ガーデ
ナ所在の Spectrum Chemical Mfg.Corp., Gardena)を加
え、該管を数回転倒した。１６，０００×ｇで１５分間
遠心処理することによりＤＮＡをペレット化した。上澄
液を吸引除去し、３５μl のＴＥ緩衝溶液（１０ｍＭト
リス塩酸、ｐＨ８．０、１．０ｍＭのＥＤＴＡ）を加え
て、ＤＮＡを溶解した。調製した試料は、定量分析、純
度分析およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析を行
うまで、ー２０℃で冷凍保存した。
５時間） よく混合した臨床便試料の５％溶液を１０００μｌのＰ
ＢＳｕｔで調製し、充分渦動させた。この溶液をエッペ
ンドルフ５４１５Ｃミクロ遠心分離機（米国ニューヨー
ク州ウエストバリー所在の Brinkman Instruments, In
c.)で、１７５０×ｇにて１分間遠心処理して不溶性粒
子物をペレット化した。上澄液を新しいミクロ遠心管に
移し、１６，０００×ｇで５分間遠心し、細菌をペレッ
ト化した。上澄液を除き、ペレットは３００μl のNucl
ei Lysis緩衝溶液（１０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．２、
４００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ)(全化学薬品
はSigma Chemical Co.から入手）中に再懸濁させた。溶
解物を５０μl のDigestionSolution（消化溶液)(１％
のＳＤＳ、２ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍｌのプロテイ
ナーゼＫ）（全化学薬品はSigma Chemical Co.から入
手) および２０μl の１０％ＳＤＳ(Sigma Chemical C
o.)を用いて、３７℃で一晩消化させた。１００μl の
６Ｍ ＮａＣｌを試料に加えチューブを激しく１５秒間
振とうし、次いで１７５０ｘｇで１５分間遠心処理し
た。測定量の上澄液を新しい管に移した。正確に二倍量
の室温の無水エタノール（米国カルフォルニア州ガーデ
ナ所在の Spectrum Chemical Mfg.Corp., Gardena)を加
え、該管を数回転倒した。１６，０００×ｇで１５分間
遠心処理することによりＤＮＡをペレット化した。上澄
液を吸引除去し、３５μl のＴＥ緩衝溶液（１０ｍＭト
リス塩酸、ｐＨ８．０、１．０ｍＭのＥＤＴＡ）を加え
て、ＤＮＡを溶解した。調製した試料は、定量分析、純
度分析およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析を行
うまで、ー２０℃で冷凍保存した。
【００４６】III.分光光度計による定量および純度分析 すべてのＤＮＡ抽出物を純水で１：５０に希釈して、日
立Ｕ−３０００分光光度計（東京、日本）を用いて、２
６０ｎｍおよび２８０ｎｍで吸光度を読みとった。試料
の２６０ｎｍでの吸光度を用いて、ＤＮＡの濃度を算出
した。２６０ｎｍと２８０ｎｍでの吸光度読み取りの比
を用いて、試料のＤＮＡの純度を決定した。しかし、Ｐ
ＣＲ生成物の量が少量であったため、検出器の感度限界
に接近した。
立Ｕ−３０００分光光度計（東京、日本）を用いて、２
６０ｎｍおよび２８０ｎｍで吸光度を読みとった。試料
の２６０ｎｍでの吸光度を用いて、ＤＮＡの濃度を算出
した。２６０ｎｍと２８０ｎｍでの吸光度読み取りの比
を用いて、試料のＤＮＡの純度を決定した。しかし、Ｐ
ＣＲ生成物の量が少量であったため、検出器の感度限界
に接近した。
【００４７】IV．ＰＣＲおよびゲル検出 増幅させるために、５μl の１０ＸＰＣＲ緩衝溶液（米
国ウイスコンシン州マディソン所在のPromega Corp.
）、 1μl （ 5.0Ｕ／μl)の Taqポリメラーゼ、１μl
（10 mM)の各ｄＮＴＰ（米国ウイスコンシン州マディ
ソン所在の PromegaCorp.）、５μl （全プライマー濃
度400 ng) のプライマー、３０μl の分子純度の水、お
よび５μl の（全ＤＮＡ濃度が200 ng以下) の試料を用
いて、５０μl の反応混合液を調製した。臨床試料の中
に存在することがわかっている特定の標的核酸配列に特
異的なプライマーオリゴヌクレオチドは、Genosys Biot
echnologies, Inc. （米国テキサス州ウッドランヅ）、
Integrated DNA Technologies,Inc. （米国アイオワ州
コーラルビル）、 Genemed Biotechnologies, Inc.（米
国カリフォルニア州サンフランシスコ）、および Cruac
hem, Inc. （米国バージニア州ダレス）によって合成さ
れていた。
国ウイスコンシン州マディソン所在のPromega Corp.
）、 1μl （ 5.0Ｕ／μl)の Taqポリメラーゼ、１μl
（10 mM)の各ｄＮＴＰ（米国ウイスコンシン州マディ
ソン所在の PromegaCorp.）、５μl （全プライマー濃
度400 ng) のプライマー、３０μl の分子純度の水、お
よび５μl の（全ＤＮＡ濃度が200 ng以下) の試料を用
いて、５０μl の反応混合液を調製した。臨床試料の中
に存在することがわかっている特定の標的核酸配列に特
異的なプライマーオリゴヌクレオチドは、Genosys Biot
echnologies, Inc. （米国テキサス州ウッドランヅ）、
Integrated DNA Technologies,Inc. （米国アイオワ州
コーラルビル）、 Genemed Biotechnologies, Inc.（米
国カリフォルニア州サンフランシスコ）、および Cruac
hem, Inc. （米国バージニア州ダレス）によって合成さ
れていた。
【００４８】ＰＣＲ増幅は、 Perkin Elmer 9600サーモ
・サイクラー（米国コネクチカット州ノルウォーク）を
用いて、９６℃で３分間の一変性サイクルに続いて、次
のような３５サイクルで行った。すなわち、変性に９４
℃で３０秒間、アニーリングに６１℃で２０秒間、伸張
（extension)に７２℃で２０秒間。ＰＣＲ生成物は、４
％ Nu Sieve 3:1 寒天（米国メリーランド州ロックラン
ド所在のFMC ）中で電気泳動後に臭化エチジウム染色す
ることにより可視化した（また、大きさで確認した）。
分子サイズマーカーとして、５０−１０００ｂｐ等間隔
標準物（ladder) （米国テネシー州バーフリースボロ所
在の BioVentures,Inc.）を用いた。
・サイクラー（米国コネクチカット州ノルウォーク）を
用いて、９６℃で３分間の一変性サイクルに続いて、次
のような３５サイクルで行った。すなわち、変性に９４
℃で３０秒間、アニーリングに６１℃で２０秒間、伸張
（extension)に７２℃で２０秒間。ＰＣＲ生成物は、４
％ Nu Sieve 3:1 寒天（米国メリーランド州ロックラン
ド所在のFMC ）中で電気泳動後に臭化エチジウム染色す
ることにより可視化した（また、大きさで確認した）。
分子サイズマーカーとして、５０−１０００ｂｐ等間隔
標準物（ladder) （米国テネシー州バーフリースボロ所
在の BioVentures,Inc.）を用いた。
【００４９】結果 迅速試料処理方法プロトコールの開発 Ａ．マイクロ波処理時間 マイクロ波処理時間は、本発明の好ましい抽出緩衝溶液
２００μl 中で二倍に希釈した（未希釈から１：１０２
４希釈まで）１０％便試料を用いて１０秒から１８０秒
まで調べた。該抽出緩衝溶液は１％のイゲパールＣＡ６
３０、０．５％のツイーン２０、１０ｍＭのトリス塩
酸、ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ、および２ＭのＮａ
Ｃｌ（化学薬品はすべて米国ミズーリ州セントルイス所
在の SigmaChemical Co. から入手）を含んでいた。緩
衝溶液の温度は、マイクロ波処理を完了した後、 Tegam
モデル 821マイクロプロセッサ・サーモメーター（米国
ユタ州ソルトレークシティ）を用いて測定した。以下の
結果が得られた。
２００μl 中で二倍に希釈した（未希釈から１：１０２
４希釈まで）１０％便試料を用いて１０秒から１８０秒
まで調べた。該抽出緩衝溶液は１％のイゲパールＣＡ６
３０、０．５％のツイーン２０、１０ｍＭのトリス塩
酸、ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ、および２ＭのＮａ
Ｃｌ（化学薬品はすべて米国ミズーリ州セントルイス所
在の SigmaChemical Co. から入手）を含んでいた。緩
衝溶液の温度は、マイクロ波処理を完了した後、 Tegam
モデル 821マイクロプロセッサ・サーモメーター（米国
ユタ州ソルトレークシティ）を用いて測定した。以下の
結果が得られた。
【００５０】
【表１】
【００５１】強い電力（〜７５０ワット）におけるマイ
クロ波処理の最適時間を、沸点温度にほぼ達しており、
試料が認められる程失われることのない時点、あるいは
沸騰してこぼれることのない時点において、２０−３０
秒間と決定した。試料処理時にマイクロ波処理時間を分
割して試料温度を最適にし、かつ試料のふきこぼれまた
は爆発的な増大を少なくした。合計１５，０００〜２
２，５００ワット秒が好ましかった。
クロ波処理の最適時間を、沸点温度にほぼ達しており、
試料が認められる程失われることのない時点、あるいは
沸騰してこぼれることのない時点において、２０−３０
秒間と決定した。試料処理時にマイクロ波処理時間を分
割して試料温度を最適にし、かつ試料のふきこぼれまた
は爆発的な増大を少なくした。合計１５，０００〜２
２，５００ワット秒が好ましかった。
【００５２】Ｂ．遠心分離時間 蛋白質の沈殿およびＤＮＡの沈殿中に試料を遠心分離す
るのに用いる時間を、１、３、５、１０および１５分と
した。試料純度またはＤＮＡ収量に著しい差はなかっ
た。
るのに用いる時間を、１、３、５、１０および１５分と
した。試料純度またはＤＮＡ収量に著しい差はなかっ
た。
【００５３】Ｃ．エタノール沈殿対イソプロパノール沈
殿 DNA 沈殿について、無水エタノールをイソプロパノール
と比較した。DNA を沈殿させるためにイソプロパノール
を用いた場合には、臭化エチジウムで染色されたアガロ
ースゲルでみられめるように、増幅中のＰＣＲ生成物の
生成量は、無水エタノール使用の場合と比べて、同量ま
たは多量であることが確認された。イソプロパノールを
用いた場合には、一般に、無水エタノールを用いた場合
と比べて、抽出試料の吸光度比が同等または良好であっ
た。イソプロパノールは無水エタノールより容易に得ら
れる。また、 DNAを沈殿させるために、無水エタノール
の二（試料）容量に対して、イソプロパノールは一（試
料）容量のみが使用される。したがって、本発明におい
て、イソプロパノールはより経済的であり、好ましい。
殿 DNA 沈殿について、無水エタノールをイソプロパノール
と比較した。DNA を沈殿させるためにイソプロパノール
を用いた場合には、臭化エチジウムで染色されたアガロ
ースゲルでみられめるように、増幅中のＰＣＲ生成物の
生成量は、無水エタノール使用の場合と比べて、同量ま
たは多量であることが確認された。イソプロパノールを
用いた場合には、一般に、無水エタノールを用いた場合
と比べて、抽出試料の吸光度比が同等または良好であっ
た。イソプロパノールは無水エタノールより容易に得ら
れる。また、 DNAを沈殿させるために、無水エタノール
の二（試料）容量に対して、イソプロパノールは一（試
料）容量のみが使用される。したがって、本発明におい
て、イソプロパノールはより経済的であり、好ましい。
【００５４】II．臨床試料分析 Ａ．Ａ２６０ｎｍ／Ａ２８０ｎｍの比 本発明の迅速試料処理法（Ａ法）にしたがって抽出され
た９種の臨床試料、および従来の抽出法のフェノール／
クロロホルム抽出法（Ｂ法）と蛋白質塩析法（Ｃ法）の
各々にしたがって調製された９種の試料について、分光
光度計による定量および純度分析を上記のようにして行
った。表２に示すように、本発明の迅速試料処理方法で
抽出した試料は、フェノール／クロロホルムで抽出した
試料に匹敵するＡ２６０／Ａ２８０比を示し、また、蛋
白質塩析法で調製した試料よりも良好な比を示した。
た９種の臨床試料、および従来の抽出法のフェノール／
クロロホルム抽出法（Ｂ法）と蛋白質塩析法（Ｃ法）の
各々にしたがって調製された９種の試料について、分光
光度計による定量および純度分析を上記のようにして行
った。表２に示すように、本発明の迅速試料処理方法で
抽出した試料は、フェノール／クロロホルムで抽出した
試料に匹敵するＡ２６０／Ａ２８０比を示し、また、蛋
白質塩析法で調製した試料よりも良好な比を示した。
【００５５】
【表２】
【００５６】Ｂ．ＤＮＡ増幅およびゲル検出 本発明の迅速試料処理方法（Ａ法）にしたがって抽出し
た９種の臨床試料、および従来の抽出法のフェノール／
クロロホルム抽出法（Ｂ法）と蛋白質塩析法（Ｃ法）の
各々にしたがって調製した９種の試料について、ＰＣＲ
増幅およびゲル検出を上記のようにして行った。本発明
の迅速試料調製法で抽出した試料は、フェノール／クロ
ロホルム抽出を行った試料と比べて同等の増幅効率を示
し、また、蛋白質塩析法で調製した試料よりも良好な増
幅効率を示した。
た９種の臨床試料、および従来の抽出法のフェノール／
クロロホルム抽出法（Ｂ法）と蛋白質塩析法（Ｃ法）の
各々にしたがって調製した９種の試料について、ＰＣＲ
増幅およびゲル検出を上記のようにして行った。本発明
の迅速試料調製法で抽出した試料は、フェノール／クロ
ロホルム抽出を行った試料と比べて同等の増幅効率を示
し、また、蛋白質塩析法で調製した試料よりも良好な増
幅効率を示した。
【００５７】実施例２ 本発明の迅速試料処理方法は、独特な抽出緩衝溶液を用
いて行なわれる蛋白質塩析処理を構成する。好ましい抽
出緩衝溶液は１％のイゲパールＣＡ６３０、０．５％の
ツイーン２０、１０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ８．０、１
ｍＭのＥＤＴＡ、および２ｍＭのＮａＣｌを含む。本発
明の迅速試料処理方法は、核酸増幅のために調製するこ
とが最も困難なタイプの試料の一つとして知られている
便試料を用いるために開発された。便試料の調製するた
めの迅速試料処理方法の効果は実施例１に示した。さら
に、凝固血液試料、異なる抗凝血剤を用いて採取した血
液試料、喀痰試料、組織培養細胞および細菌培養物など
を含む他の種類の試料を調製するための、本発明による
迅速試料処理方法の効果も示した。
いて行なわれる蛋白質塩析処理を構成する。好ましい抽
出緩衝溶液は１％のイゲパールＣＡ６３０、０．５％の
ツイーン２０、１０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ８．０、１
ｍＭのＥＤＴＡ、および２ｍＭのＮａＣｌを含む。本発
明の迅速試料処理方法は、核酸増幅のために調製するこ
とが最も困難なタイプの試料の一つとして知られている
便試料を用いるために開発された。便試料の調製するた
めの迅速試料処理方法の効果は実施例１に示した。さら
に、凝固血液試料、異なる抗凝血剤を用いて採取した血
液試料、喀痰試料、組織培養細胞および細菌培養物など
を含む他の種類の試料を調製するための、本発明による
迅速試料処理方法の効果も示した。
【００５８】例えば、７人の提供者からの血液試料を、
クエン酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、ヘパリンおよびＳＳＴ
（凝固）管中に採取した。すべての試料の抽出は、本発
明の方法を用いて二回実験した。ＰＣＲ増幅およびゲル
検出は、これらの血液試料が、採取のタイプに関係な
く、βグロブリンプライマーで増幅されることを示し
た。喀痰試料でも同様の結果が得られた。米国ユタ州ソ
ルトレークシティ所在のベテランズ・アフェアーズ・メ
ディカル・センター (Veterans Affairs Medical Cente
r, Salt Lake City, UT)の微生物学研究所にルーチン培
養（routine culture)および／またはグラム染色のため
に提出された７種の喀痰試料は、本発明の方法を用いて
抽出し、全試料をβグロブリンプライマーで増幅させ
た。
クエン酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、ヘパリンおよびＳＳＴ
（凝固）管中に採取した。すべての試料の抽出は、本発
明の方法を用いて二回実験した。ＰＣＲ増幅およびゲル
検出は、これらの血液試料が、採取のタイプに関係な
く、βグロブリンプライマーで増幅されることを示し
た。喀痰試料でも同様の結果が得られた。米国ユタ州ソ
ルトレークシティ所在のベテランズ・アフェアーズ・メ
ディカル・センター (Veterans Affairs Medical Cente
r, Salt Lake City, UT)の微生物学研究所にルーチン培
養（routine culture)および／またはグラム染色のため
に提出された７種の喀痰試料は、本発明の方法を用いて
抽出し、全試料をβグロブリンプライマーで増幅させ
た。
【００５９】２．複数分析対象物の非優先的増幅処理方
法 従来の技術の部分で述べたように、標的核酸配列の増幅
は、検出および識別を容易にするために利用される。核
酸配列増幅の技術として、いくつかの技術が公知である
が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅法が多数の臨
床的使用において特に有用であることが証明されてい
る。試料中に、存在する可能性のある複数分析対象物の
増幅は、一般に試料を分割し、複数の個別のＰＣＲ増幅
処理を別々の分割試料で行い、各々の増幅処理を、異な
った潜在的標的核酸配列の一つに特異的な、異なったプ
ライマー対を用いて行うことにより得られる。複数分析
対象物を同時に増幅することができると有利である。検
査試料中に存在する、または存在する可能性のある複数
の標的核酸配列を同時に検出および識別することが有用
である状況が多々ある。例えば、感染疾患を正確に診断
するためには、臨床試料中に多数の感染可能な病原体が
存在する場合、これを決定する必要がある。
法 従来の技術の部分で述べたように、標的核酸配列の増幅
は、検出および識別を容易にするために利用される。核
酸配列増幅の技術として、いくつかの技術が公知である
が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅法が多数の臨
床的使用において特に有用であることが証明されてい
る。試料中に、存在する可能性のある複数分析対象物の
増幅は、一般に試料を分割し、複数の個別のＰＣＲ増幅
処理を別々の分割試料で行い、各々の増幅処理を、異な
った潜在的標的核酸配列の一つに特異的な、異なったプ
ライマー対を用いて行うことにより得られる。複数分析
対象物を同時に増幅することができると有利である。検
査試料中に存在する、または存在する可能性のある複数
の標的核酸配列を同時に検出および識別することが有用
である状況が多々ある。例えば、感染疾患を正確に診断
するためには、臨床試料中に多数の感染可能な病原体が
存在する場合、これを決定する必要がある。
【００６０】複数の標的核酸配列を同時に増幅させよう
とする際に生じる特定の問題は、優先的増幅の現象であ
る。複数の標的核酸配列を同時増幅しようとする場合、
異なる標的核酸配列の増幅を目的としたプライマー対は
必然的に相互に異なる。異なった物理的性質を有する異
なったプライマーは、選択された同時ＰＣＲ増幅条件下
で、異なった増幅効果を有する。例えば、二重結合より
むしろ三重結合を形成するグアノシンおよびシトシンヌ
クレオチド塩基を多く含むプライマーはＰＣＲ時により
良くアニールする傾向があることが公知である。増幅効
率に影響を与える他の物理的性質はプライマー融解温
度、プライマーの長さ、およびヘアピンループまたは二
量体の存在などである。増幅効率に影響を与える処理条
件には、マグネシウム濃度、使用される特定のポリメラ
ーゼ酵素、酵素濃度、アニーリング温度、およびプライ
マー濃度がある。
とする際に生じる特定の問題は、優先的増幅の現象であ
る。複数の標的核酸配列を同時増幅しようとする場合、
異なる標的核酸配列の増幅を目的としたプライマー対は
必然的に相互に異なる。異なった物理的性質を有する異
なったプライマーは、選択された同時ＰＣＲ増幅条件下
で、異なった増幅効果を有する。例えば、二重結合より
むしろ三重結合を形成するグアノシンおよびシトシンヌ
クレオチド塩基を多く含むプライマーはＰＣＲ時により
良くアニールする傾向があることが公知である。増幅効
率に影響を与える他の物理的性質はプライマー融解温
度、プライマーの長さ、およびヘアピンループまたは二
量体の存在などである。増幅効率に影響を与える処理条
件には、マグネシウム濃度、使用される特定のポリメラ
ーゼ酵素、酵素濃度、アニーリング温度、およびプライ
マー濃度がある。
【００６１】優先的増幅の結果として、優先的に増幅さ
れた配列の量が他の存在する増幅された配列の量を大幅
に越えるような、一つまたは複数の標的核酸配列の不均
一な増幅が生じる。複数の分析対象物の同時増幅時に生
じるもう一つの問題は、プライマー間の交差反応性であ
る。異なるプライマー間の有意な配列マッチは、標的核
酸配列の増幅効率を減少させるか、または疑似陽性増幅
を生じさせることがある。したがって、複数分析対象物
の正確で効率的な同時分析を可能にするために、優先的
増幅および交差反応性を共に防ぎ、最小限度にする必要
がある。
れた配列の量が他の存在する増幅された配列の量を大幅
に越えるような、一つまたは複数の標的核酸配列の不均
一な増幅が生じる。複数の分析対象物の同時増幅時に生
じるもう一つの問題は、プライマー間の交差反応性であ
る。異なるプライマー間の有意な配列マッチは、標的核
酸配列の増幅効率を減少させるか、または疑似陽性増幅
を生じさせることがある。したがって、複数分析対象物
の正確で効率的な同時分析を可能にするために、優先的
増幅および交差反応性を共に防ぎ、最小限度にする必要
がある。
【００６２】本発明の複数分析対象物核酸配列増幅処理
により、試料中の複数分析対象物の非優先的増幅を同時
に処理することができる。複数分析対象物非優先的増幅
処理方法では、確実に、交差反応性が回避され、かつ選
択された処理条件において増幅効率が実質上同等になる
ように最適化されている独特なプライマーオリゴヌクレ
オチドを使用する。複数分析対象物非優先的増幅処理の
時間は約２．０時間以下が好ましい。実施例３で説明さ
れているように、胃腸炎パネルへの適用については、好
ましい６種の可能性のある標的核酸配列がある。５種は
サルモネラ、シゲラ、大腸菌、カンピロバクター、およ
びエルシニア細菌などの潜在的病原体である。６番目
は、コントロールの遺伝子βグロブリンであり、適切に
調製した各試料中に存在する。
により、試料中の複数分析対象物の非優先的増幅を同時
に処理することができる。複数分析対象物非優先的増幅
処理方法では、確実に、交差反応性が回避され、かつ選
択された処理条件において増幅効率が実質上同等になる
ように最適化されている独特なプライマーオリゴヌクレ
オチドを使用する。複数分析対象物非優先的増幅処理の
時間は約２．０時間以下が好ましい。実施例３で説明さ
れているように、胃腸炎パネルへの適用については、好
ましい６種の可能性のある標的核酸配列がある。５種は
サルモネラ、シゲラ、大腸菌、カンピロバクター、およ
びエルシニア細菌などの潜在的病原体である。６番目
は、コントロールの遺伝子βグロブリンであり、適切に
調製した各試料中に存在する。
【００６３】実施例３ 材料および方法 Ｉ．細菌性スタンダード 細菌標準用ＤＮＡは、表３に示す凍結乾燥されたアメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）
培養物から、以下のように抽出した。すなわち、３００
μl の抽出緩衝溶液（１０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ８．
０、１ｍのＭＥＤＴＡ、１％のトリトン（Triton）Ｘ−
１００（商標名）、０．５％のツイーン２０)(全化学薬
品は米国ミズーリ州セントルイス所在のSigma Chemical
Co.から入手）を各凍結乾燥したバイアル（vial) に加
えた。１００μl のアリコートを高電力（〜７５０−７
７５ワット）の設定条件で３分間マイクロ波処理した。
ＤＮＡ濃度を分光光度計で測定し、次いで、約４０μl
／ｍｌの使用濃度に希釈した。
カン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）
培養物から、以下のように抽出した。すなわち、３００
μl の抽出緩衝溶液（１０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ８．
０、１ｍのＭＥＤＴＡ、１％のトリトン（Triton）Ｘ−
１００（商標名）、０．５％のツイーン２０)(全化学薬
品は米国ミズーリ州セントルイス所在のSigma Chemical
Co.から入手）を各凍結乾燥したバイアル（vial) に加
えた。１００μl のアリコートを高電力（〜７５０−７
７５ワット）の設定条件で３分間マイクロ波処理した。
ＤＮＡ濃度を分光光度計で測定し、次いで、約４０μl
／ｍｌの使用濃度に希釈した。
【００６４】
【表３】
【００６５】６種の分析対象物についての増幅の標的領
域のＤＮＡ配列は公知であり、表４に示した核酸配列ア
クセス番号のある遺伝子バンク(Genbank）から入手でき
る。
域のＤＮＡ配列は公知であり、表４に示した核酸配列ア
クセス番号のある遺伝子バンク(Genbank）から入手でき
る。
【００６６】
【表４】
【００６７】II．プライマーオリゴヌクレオチド プライマーオリゴヌクレオチドはGenosys Biotechnolog
ies, Inc. （米国テキサス州ウッドランヅ）, Integrat
ed DNA Technologies, Inc. （米国アイオア州コーラル
ビル）、Genemed Biotechnologies, Inc. （米国カリフ
ォルニア州サンフランシスコ）、およびCruachem, Inc.
（米国バージニア州ダレス）によって合成されていた。
元のプライマーオリゴヌクレオチドは、交差反応の回避
および非優先的増幅を確実にするために、大幅に修飾し
た。現在の好ましい最適化プライマーを表５および６に
示す。
ies, Inc. （米国テキサス州ウッドランヅ）, Integrat
ed DNA Technologies, Inc. （米国アイオア州コーラル
ビル）、Genemed Biotechnologies, Inc. （米国カリフ
ォルニア州サンフランシスコ）、およびCruachem, Inc.
（米国バージニア州ダレス）によって合成されていた。
元のプライマーオリゴヌクレオチドは、交差反応の回避
および非優先的増幅を確実にするために、大幅に修飾し
た。現在の好ましい最適化プライマーを表５および６に
示す。
【００６８】
【表５】 1 Stone, G., Oberst, R, Hays, M, McVey, S., Chenga
ppa, M., Detection ofSalmonella Serovars from Clin
ical Samples by Enrichment Broth Cultivation-PCR P
rocedure, J. Clin. Microbiol.;32: 1742-1749 (199
4).2 Yavzori, M., Cohen, D., Wasserlauf, R., Ambar,
R., Rechavi, G., Ashkenazi, S., Identification of
Shigella Species in Stool Specimens by DNA Amplifi
cation of Different Loci of the Shigella Virulence
Plasmid, Eur. J.Clin. Microbiol. Infect. Dis.;13:
232-237 (1994).3 Wegmuller, B., Luthy, J., Candrian, U., Direct P
olymerase Chain Reaction Detection of Campylobacte
r jejuni and Campylobacter coli in Raw Milkand Dai
ry Products, Applied ad Environmental Microbiolog
y; 59: 2161-2165(1993).4 Nakajima, H., Inoue, M., Mori, T., Itoh, K., Ara
kawa, E., Watanabe, H., Detection and Identificati
on of Yersinia pseudotuberculosis and Pathogenic Y
ersinia enterocolitica by Improved Polymerase Chai
n Reaction Method, J. Clin. Microbiol.; 30: 2484-2
486 (1992)．5 Cebula, T., Payne, W., Feng, P., Simultaneous Id
entification of Strains of Escherichia coli Seroty
pe O157:H7 and Their Shiga-Like Toxin Type by Mism
atch Amplification Mutation Assay-Multiplex PCR,
J. Clin. Microbiol.; 33: 248-250 (1995).6 Bauer, H., Ting, Y., Greer, C., Chambers, J., Ta
shiro, C., Chimera, J., Reingold, A., Monos, M., G
enital Human Papillomavirus Infection in Female Un
iversity Students and Determined by a PCR-Based Me
thod, JAMA; 265:472-477 (1991).
ppa, M., Detection ofSalmonella Serovars from Clin
ical Samples by Enrichment Broth Cultivation-PCR P
rocedure, J. Clin. Microbiol.;32: 1742-1749 (199
4).2 Yavzori, M., Cohen, D., Wasserlauf, R., Ambar,
R., Rechavi, G., Ashkenazi, S., Identification of
Shigella Species in Stool Specimens by DNA Amplifi
cation of Different Loci of the Shigella Virulence
Plasmid, Eur. J.Clin. Microbiol. Infect. Dis.;13:
232-237 (1994).3 Wegmuller, B., Luthy, J., Candrian, U., Direct P
olymerase Chain Reaction Detection of Campylobacte
r jejuni and Campylobacter coli in Raw Milkand Dai
ry Products, Applied ad Environmental Microbiolog
y; 59: 2161-2165(1993).4 Nakajima, H., Inoue, M., Mori, T., Itoh, K., Ara
kawa, E., Watanabe, H., Detection and Identificati
on of Yersinia pseudotuberculosis and Pathogenic Y
ersinia enterocolitica by Improved Polymerase Chai
n Reaction Method, J. Clin. Microbiol.; 30: 2484-2
486 (1992)．5 Cebula, T., Payne, W., Feng, P., Simultaneous Id
entification of Strains of Escherichia coli Seroty
pe O157:H7 and Their Shiga-Like Toxin Type by Mism
atch Amplification Mutation Assay-Multiplex PCR,
J. Clin. Microbiol.; 33: 248-250 (1995).6 Bauer, H., Ting, Y., Greer, C., Chambers, J., Ta
shiro, C., Chimera, J., Reingold, A., Monos, M., G
enital Human Papillomavirus Infection in Female Un
iversity Students and Determined by a PCR-Based Me
thod, JAMA; 265:472-477 (1991).
【００６９】
【表６】
【００７０】III.プローブオリゴヌクレオチド 表６に記載のプライマーで行ったＰＣＲ反応増幅の生成
物の一本の鎖に相補的なインターナル（internal) プロ
ーブオリゴヌクレオチドをGenosys Biotechnologies, I
nc. （米国テキサス州ウッドランド）、 Integrated DN
A Technologies, Inc.（米国アイオア州コーラルビ
ル）、 Genemed Biotechnologies, Inc.（米国カリフォ
ルニア州サンフランシスコおよび Cruachem, Inc. （米
国バージニア州ダレス）から得た。プローブの名称およ
び配列は表７に表記する。
物の一本の鎖に相補的なインターナル（internal) プロ
ーブオリゴヌクレオチドをGenosys Biotechnologies, I
nc. （米国テキサス州ウッドランド）、 Integrated DN
A Technologies, Inc.（米国アイオア州コーラルビ
ル）、 Genemed Biotechnologies, Inc.（米国カリフォ
ルニア州サンフランシスコおよび Cruachem, Inc. （米
国バージニア州ダレス）から得た。プローブの名称およ
び配列は表７に表記する。
【００７１】
【表７】
【００７２】IV. 臨床試料 臨床便試料は上記の迅速試料処理方法にしたがって調製
した。
した。
【００７３】V.ＰＣＲ増幅 増幅のために、５μl の１０ＸＰＣＲ緩衝溶液（米国ウ
イスコンシン州アディソン所在の Promega Corp.）、１
μl （５．０Ｕ／μl ）のＴａｑポリメラーゼ、１μl
（１０ｍＭ）の各ｄＮＴＰ（米国ウイスコンシン州アデ
ィソン所在の Promega Corp.) 、５μl の混合プライマ
ー（後述するように、８９０ｎｇの総プライマー濃度、
表８を参照のこと）、３０μl の分子グレード純水、お
よび５μl (２００ｎｇ以下の総ＤＮＡ濃度）のＡＴＣ
Ｃ菌株ＤＮＡまたは臨床便試料ＤＮＡを用いて、５０μ
l の反応混合物を調製した。臨床便試料中のβグロブリ
ンＤＮＡが変動しているため、コントロールＤＮＡをヒ
ト細胞系（ＭＯＬＴー４、ＨＦＦ）から抽出し、プライ
マー混合物とともに、０．１μｇ／反応の濃度で各増幅
反応に加えた。
イスコンシン州アディソン所在の Promega Corp.）、１
μl （５．０Ｕ／μl ）のＴａｑポリメラーゼ、１μl
（１０ｍＭ）の各ｄＮＴＰ（米国ウイスコンシン州アデ
ィソン所在の Promega Corp.) 、５μl の混合プライマ
ー（後述するように、８９０ｎｇの総プライマー濃度、
表８を参照のこと）、３０μl の分子グレード純水、お
よび５μl (２００ｎｇ以下の総ＤＮＡ濃度）のＡＴＣ
Ｃ菌株ＤＮＡまたは臨床便試料ＤＮＡを用いて、５０μ
l の反応混合物を調製した。臨床便試料中のβグロブリ
ンＤＮＡが変動しているため、コントロールＤＮＡをヒ
ト細胞系（ＭＯＬＴー４、ＨＦＦ）から抽出し、プライ
マー混合物とともに、０．１μｇ／反応の濃度で各増幅
反応に加えた。
【００７４】ＰＣＲは、パーキンエルマ（Perkin Elme
r）９６００サーモサイクラー（米国コネクチカット州
ノールウォーク）を用いて、９６℃で３分間一変性サイ
クルで行い、続いて、以下のように、３５サイクル行っ
た。すなわち変性に９４℃で３０秒、アニーリングに６
１℃で２０秒、伸張に７２℃で２０秒。
r）９６００サーモサイクラー（米国コネクチカット州
ノールウォーク）を用いて、９６℃で３分間一変性サイ
クルで行い、続いて、以下のように、３５サイクル行っ
た。すなわち変性に９４℃で３０秒、アニーリングに６
１℃で２０秒、伸張に７２℃で２０秒。
【００７５】VI. ゲルの検出 ４％ Nu Sieve ３：１寒天（米国メリーランド州ロック
ランド所在のFMC ）で電気泳動後、エチジウムブロマイ
ド染色によりＰＣＲ生成物を可視化した（サイズで確
認）。分子サイズマーカーとして、５０ー１０００ｂｐ
等間隔標準物（米国テネシー州マーフリースボロ所在の
BioVentures, Inc. ）を用いた。
ランド所在のFMC ）で電気泳動後、エチジウムブロマイ
ド染色によりＰＣＲ生成物を可視化した（サイズで確
認）。分子サイズマーカーとして、５０ー１０００ｂｐ
等間隔標準物（米国テネシー州マーフリースボロ所在の
BioVentures, Inc. ）を用いた。
【００７６】VII.核酸プローブの共有結合 すべてのプローブは５' 末端第一アミンを用いて合成さ
れた。Ｎーオキシスクシンイミドアミン結合のマイクロ
タイタープレート（米国マサチュセッツ州ケンブリッジ
所在のCorning Costar Corporation）を核酸プローブの
固相付着支持体として用いた。各プローブを燐酸緩衝溶
液（ＰＢＳ）、ｐＨ９．０で１μg ／ｍｌに希釈し、１
００μl の各プローブを別々のウエルに入れた。このプ
レートを室温で１時間インキュベートした。インキュベ
ーションの後、溶液を吸引し、プレートを３００μl の
洗浄緩衝溶液／ウエル（２．０ｍＭイミダゾール緩衝化
生理的食塩水、０．０２％のツイーン−２０)(米国ミズ
ーリ州セントルイス所在の全化学薬品Sigma Chemical C
o.から入手）で５回洗浄した。残存する活性部位を、St
abilcoat（米国ミネソタ州エデンプレイリー所在のBSI
Corporation ）で室温にて３０分間ブロックした。ウエ
ルを吸引処理し、直接ハイブリダイゼーションに用い
た。
れた。Ｎーオキシスクシンイミドアミン結合のマイクロ
タイタープレート（米国マサチュセッツ州ケンブリッジ
所在のCorning Costar Corporation）を核酸プローブの
固相付着支持体として用いた。各プローブを燐酸緩衝溶
液（ＰＢＳ）、ｐＨ９．０で１μg ／ｍｌに希釈し、１
００μl の各プローブを別々のウエルに入れた。このプ
レートを室温で１時間インキュベートした。インキュベ
ーションの後、溶液を吸引し、プレートを３００μl の
洗浄緩衝溶液／ウエル（２．０ｍＭイミダゾール緩衝化
生理的食塩水、０．０２％のツイーン−２０)(米国ミズ
ーリ州セントルイス所在の全化学薬品Sigma Chemical C
o.から入手）で５回洗浄した。残存する活性部位を、St
abilcoat（米国ミネソタ州エデンプレイリー所在のBSI
Corporation ）で室温にて３０分間ブロックした。ウエ
ルを吸引処理し、直接ハイブリダイゼーションに用い
た。
【００７７】VIII．ＤＮＡハイブリダイゼーション／比
色検出 増幅生成物（１Ｘ１０12分子）を２５μl のＰＢＳ、ｐ
Ｈ７．２５で希釈し、２５μl の変性溶液（０．８Ｎ
ＮａＯＨ）とともにプローブを結合させたウエルに加え
た。室温で１０分間インキュベーションした後、２５μ
l の４Ｘハイブリダイゼーション溶液（ＰＢＳ、ｐＨ
７．２５、８％ＢＳＡ）および２５μl の中和溶液（４
Ｍ酢酸アンモニウム)(米国ミズーリ州セントルイス所在
のSigma Chemical Co.）を加えて、室温でさらに５分間
インキュベートした。次いで、プレートを５５℃で４５
分間インキュベートした。インキュベーションの後、プ
レートを室温の洗浄緩衝溶液（１Ｍトリス緩衝化生理的
食塩水、ｐＨ７．５、１．０％のツイーン２０）で５回
洗浄した。
色検出 増幅生成物（１Ｘ１０12分子）を２５μl のＰＢＳ、ｐ
Ｈ７．２５で希釈し、２５μl の変性溶液（０．８Ｎ
ＮａＯＨ）とともにプローブを結合させたウエルに加え
た。室温で１０分間インキュベーションした後、２５μ
l の４Ｘハイブリダイゼーション溶液（ＰＢＳ、ｐＨ
７．２５、８％ＢＳＡ）および２５μl の中和溶液（４
Ｍ酢酸アンモニウム)(米国ミズーリ州セントルイス所在
のSigma Chemical Co.）を加えて、室温でさらに５分間
インキュベートした。次いで、プレートを５５℃で４５
分間インキュベートした。インキュベーションの後、プ
レートを室温の洗浄緩衝溶液（１Ｍトリス緩衝化生理的
食塩水、ｐＨ７．５、１．０％のツイーン２０）で５回
洗浄した。
【００７８】ハイブリダイゼーションされウエルに結合
した生成物の比色定量を行うために、１００μl のスト
レプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼ抱合体（イ
タリア国ミラノ所在のSPA ）を加えて、３７℃で３０分
間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝溶液で５回
洗浄し、さらに３７℃で３０分間、１００μl のｐーＮ
ＰＰ溶液（０．５Ｍトリス、ｐＨ９．５中１ｍｇ／ｍｌ
の燐酸ｐ−ニトロフェニール）中でインキュベートし
た。 反応を、１．５ＮNaOHを加えて、停止させた。吸
光度値をＳＬＴ Labinstruments Model ＃１６ー８８６
マイクロプレートリーダー（オーストリア国ザルツブル
ク所在の SLT) で４０５ｎｍで分析した。
した生成物の比色定量を行うために、１００μl のスト
レプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼ抱合体（イ
タリア国ミラノ所在のSPA ）を加えて、３７℃で３０分
間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝溶液で５回
洗浄し、さらに３７℃で３０分間、１００μl のｐーＮ
ＰＰ溶液（０．５Ｍトリス、ｐＨ９．５中１ｍｇ／ｍｌ
の燐酸ｐ−ニトロフェニール）中でインキュベートし
た。 反応を、１．５ＮNaOHを加えて、停止させた。吸
光度値をＳＬＴ Labinstruments Model ＃１６ー８８６
マイクロプレートリーダー（オーストリア国ザルツブル
ク所在の SLT) で４０５ｎｍで分析した。
【００７９】結果 プライマーの最適化 オリゴヌクレオチドプライマーを、一本のＰＣＲ反応管
内の５種の分析対象物のすべておよびβーグロブリンの
インターナルコントロールを増幅させるように設計し
た。オリジナルのプライマーの分析および修飾を、各プ
ライマーの増幅効率を改善し、プライマー対間の交差反
応を低減する目的で行った。プライマー間の物理的性質
の相異を最小限にするために、いくつかのパラメーター
を操作した。各プライマーは、ほぼ同じ長さ、例えば、
１９−２４ｂｐに修飾した。短いプライマーが非特異的
生成物を増幅するのに対して、この長さのプライマーオ
リゴヌクレオチドは、増幅反応における特異性が高くな
る。プライマー対の効率もまたヘアピンループおよび二
量体によって影響を受けるので、ＯＬＩＧＯ５．０ソフ
トウエア（米国ミネソタ州プライマウス所在の）を用い
て可能性のあるプライマーを分析した。ヘアピンループ
および二量体が見つかった場合、プライマーの配列を修
飾し、これらを取り除くか、または、少なくともその影
響を減少させた。
内の５種の分析対象物のすべておよびβーグロブリンの
インターナルコントロールを増幅させるように設計し
た。オリジナルのプライマーの分析および修飾を、各プ
ライマーの増幅効率を改善し、プライマー対間の交差反
応を低減する目的で行った。プライマー間の物理的性質
の相異を最小限にするために、いくつかのパラメーター
を操作した。各プライマーは、ほぼ同じ長さ、例えば、
１９−２４ｂｐに修飾した。短いプライマーが非特異的
生成物を増幅するのに対して、この長さのプライマーオ
リゴヌクレオチドは、増幅反応における特異性が高くな
る。プライマー対の効率もまたヘアピンループおよび二
量体によって影響を受けるので、ＯＬＩＧＯ５．０ソフ
トウエア（米国ミネソタ州プライマウス所在の）を用い
て可能性のあるプライマーを分析した。ヘアピンループ
および二量体が見つかった場合、プライマーの配列を修
飾し、これらを取り除くか、または、少なくともその影
響を減少させた。
【００８０】また、複数のプライマー反応における交差
反応性は、増幅効率を下げるか、または疑似陽性増幅を
生じさせる。交差反応性を分析するために、遺伝子バン
ク(Genbank）のBioS CANデータベース検索を用いて、各
プライマーの配列の整合調節を行った。コンピュータ検
索は、米国ノースカロライナ州チャペルヒル所在のノー
スカロライナ大学において、BioS CANネットワークサー
バーを用いて行った。有意の配列マッチは報告されなか
った。交差反応性をさらに検査するために、各プライマ
ー対を６種の分析対象物の各々からのＤＮＡで増幅し
た。サルモネラ・プライマーはMolt４またはＨＦＦ Ｄ
ＮＡとの反応において非特異的生成物を増幅し、これら
はβグロブリンＤＮＡのソースであることが明らかにな
った。交差反応性を除去するために、オリジナルのプラ
イマー配列から配列のいくつかの塩基を上流または下流
に移すことにより、新しいサルモネラ・プライマーを作
成した。この移し変えによって、プライマーとβグロブ
リンＤＮＡ間の交差反応性が除去された。
反応性は、増幅効率を下げるか、または疑似陽性増幅を
生じさせる。交差反応性を分析するために、遺伝子バン
ク(Genbank）のBioS CANデータベース検索を用いて、各
プライマーの配列の整合調節を行った。コンピュータ検
索は、米国ノースカロライナ州チャペルヒル所在のノー
スカロライナ大学において、BioS CANネットワークサー
バーを用いて行った。有意の配列マッチは報告されなか
った。交差反応性をさらに検査するために、各プライマ
ー対を６種の分析対象物の各々からのＤＮＡで増幅し
た。サルモネラ・プライマーはMolt４またはＨＦＦ Ｄ
ＮＡとの反応において非特異的生成物を増幅し、これら
はβグロブリンＤＮＡのソースであることが明らかにな
った。交差反応性を除去するために、オリジナルのプラ
イマー配列から配列のいくつかの塩基を上流または下流
に移すことにより、新しいサルモネラ・プライマーを作
成した。この移し変えによって、プライマーとβグロブ
リンＤＮＡ間の交差反応性が除去された。
【００８１】プライマーの同時アニーリングを確実にす
るためには、融解温度（Ｔｍ）は同じでなければならな
い。各プライマーの融解温度は、フィジカル・プロパテ
ィ・プレディクション ソフトウエア (Synthetic Gene
tics, Inc.）を用いて決定し、配列は５９ー６０℃の融
解温度になるように修飾した。
るためには、融解温度（Ｔｍ）は同じでなければならな
い。各プライマーの融解温度は、フィジカル・プロパテ
ィ・プレディクション ソフトウエア (Synthetic Gene
tics, Inc.）を用いて決定し、配列は５９ー６０℃の融
解温度になるように修飾した。
【００８２】複数プライマーのＰＣＲにおける優先的増
幅は、反応中の限られた試薬の競合および各プライマー
の標的核酸配列へのアニール効率によって生じると考え
られる。プライマーの各組み合わせにより反応動力学が
異なるので、経験的に至適条件を決めることが必要であ
る。６種の分析対象物を同時にＰＣＲ増幅するために、
マグネシウム濃度（緩衝溶液中のＭｇＣｌ２濃度）、Ｔ
ａｑポリメラーゼ酵素濃度、アニーリング温度およびプ
ライマー濃度を最適化した。これらのパラメータの各々
を変える度に、ＰＣＲおよびゲル検出を行った。Ｔａｑ
ポリメラーゼは、２．０Ｕ−５．５Ｕ／反応で適定さ
れ、このプライマー混合物の至適濃度は５．０Ｕ／反応
とした。マグネシウム濃度は１．０ｍＭから６．０ｍＭ
まで調べて、至適濃度を１．５ｍＭと決定された。増幅
のためのアニーリング温度は５３℃から６３℃までの範
囲でテストした。これらの条件下で、６種の分析対象物
すべての最適増幅効率は６１℃で達成された。同等の効
率を得るために各プライマー対について、プライマー濃
度を修飾した。これらの選択された至適条件下で、各Ｐ
ＣＲ反応の修飾プライマー対（配列ＩＤ番号：１−１
２）の好ましい濃度を表８に示す。
幅は、反応中の限られた試薬の競合および各プライマー
の標的核酸配列へのアニール効率によって生じると考え
られる。プライマーの各組み合わせにより反応動力学が
異なるので、経験的に至適条件を決めることが必要であ
る。６種の分析対象物を同時にＰＣＲ増幅するために、
マグネシウム濃度（緩衝溶液中のＭｇＣｌ２濃度）、Ｔ
ａｑポリメラーゼ酵素濃度、アニーリング温度およびプ
ライマー濃度を最適化した。これらのパラメータの各々
を変える度に、ＰＣＲおよびゲル検出を行った。Ｔａｑ
ポリメラーゼは、２．０Ｕ−５．５Ｕ／反応で適定さ
れ、このプライマー混合物の至適濃度は５．０Ｕ／反応
とした。マグネシウム濃度は１．０ｍＭから６．０ｍＭ
まで調べて、至適濃度を１．５ｍＭと決定された。増幅
のためのアニーリング温度は５３℃から６３℃までの範
囲でテストした。これらの条件下で、６種の分析対象物
すべての最適増幅効率は６１℃で達成された。同等の効
率を得るために各プライマー対について、プライマー濃
度を修飾した。これらの選択された至適条件下で、各Ｐ
ＣＲ反応の修飾プライマー対（配列ＩＤ番号：１−１
２）の好ましい濃度を表８に示す。
【００８３】
【表８】
【００８４】各々のプライマー対は、２００ｎｇのＡＴ
ＣＣ菌株ＤＮＡ（表３）および２００ｎｇの適切なプラ
イマーを用いて各々増幅させ、増幅産物が予測されたフ
ラグメントサイズであることを確認した。同時の複数の
増幅については、２００ｎｇ総濃度 (４０．０ｎｇの各
細菌分析対象物) のＡＴＣＣ菌株ＤＮＡ、０．１μgの
コントロール (βグロブリン) ＤＮＡ、および、８９０
ｎｇ総濃度のプライマー混合物 (表８) を陽性コントロ
ールとして用いた。臨床的便試料は２００ｎｇ総（試
料) ＤＮＡ濃度、０．１μｇのコントロール (βグロブ
リン) ＤＮＡ、および８９０ｎｇ総濃度のプライマー混
合物 (表８）で増幅させた。
ＣＣ菌株ＤＮＡ（表３）および２００ｎｇの適切なプラ
イマーを用いて各々増幅させ、増幅産物が予測されたフ
ラグメントサイズであることを確認した。同時の複数の
増幅については、２００ｎｇ総濃度 (４０．０ｎｇの各
細菌分析対象物) のＡＴＣＣ菌株ＤＮＡ、０．１μgの
コントロール (βグロブリン) ＤＮＡ、および、８９０
ｎｇ総濃度のプライマー混合物 (表８) を陽性コントロ
ールとして用いた。臨床的便試料は２００ｎｇ総（試
料) ＤＮＡ濃度、０．１μｇのコントロール (βグロブ
リン) ＤＮＡ、および８９０ｎｇ総濃度のプライマー混
合物 (表８）で増幅させた。
【００８５】３．複数分析対象物認識処理方法／核酸配
列ミスマッチ検出方法 従来の技術の部分で述べたように、オリゴヌクレオチド
プローブ、すなわちＰＣＲ増幅生成物に相補的であるプ
ローブを用いて、核酸配列を検出および識別する多くの
方法が既知である。プローブまたはＰＣＲ生成物のいず
れかを、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的また
は化学的方法によって検出できるように、ある種の標識
成分で標識する。標識成分の例としては、蛍光染料、高
電子密度試薬、セイヨウワサビペルオキシダーゼまたは
アルカリホスファターゼのような不溶性反応生成物の析
出または色よる検出を可能にする酵素、32Ｐまたはビオ
チンなどの放射性標識などがある。ハイブリダイゼーシ
ョンが、互いに十分相補的であるＰＣＲ生成物およびプ
ローブ間に生じるようなハイブリダイゼーション条件
で、ＰＣＲ生成物およびプローブを混合する。ハイブリ
ダイゼーションの後、ハイブリダイゼーションされてい
ない分子を除く処理は、残存標識成分の検出によって、
プローブ／標的核酸配列ハイブリッドの存在が示される
ように行う。
列ミスマッチ検出方法 従来の技術の部分で述べたように、オリゴヌクレオチド
プローブ、すなわちＰＣＲ増幅生成物に相補的であるプ
ローブを用いて、核酸配列を検出および識別する多くの
方法が既知である。プローブまたはＰＣＲ生成物のいず
れかを、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的また
は化学的方法によって検出できるように、ある種の標識
成分で標識する。標識成分の例としては、蛍光染料、高
電子密度試薬、セイヨウワサビペルオキシダーゼまたは
アルカリホスファターゼのような不溶性反応生成物の析
出または色よる検出を可能にする酵素、32Ｐまたはビオ
チンなどの放射性標識などがある。ハイブリダイゼーシ
ョンが、互いに十分相補的であるＰＣＲ生成物およびプ
ローブ間に生じるようなハイブリダイゼーション条件
で、ＰＣＲ生成物およびプローブを混合する。ハイブリ
ダイゼーションの後、ハイブリダイゼーションされてい
ない分子を除く処理は、残存標識成分の検出によって、
プローブ／標的核酸配列ハイブリッドの存在が示される
ように行う。
【００８６】通常、例えば、プローブで被覆されたウエ
ルを有するマイクロタイタープレートのような固相シス
テムが用いられる。固相システムにおいて検出処理の効
果に影響を及ぼす重要な要因は、プローブまたはＰＣＲ
生成物のいずれかである所望の成分を固体マトリックス
上に固定するために用いられる結合方法の効率である。
最近、共有結合による結合（linging)化学を使用する
と、プローブオリゴヌクレオチドがマイクロプレートの
プラスチック表面に一層効率よく、また一層しっかりと
結合することが分った。この技術では、オリゴヌクレオ
チドのプローブは、プローブの５' 末端に付着したアミ
ンまたは酸基などの反応成分を介してプラスチック表面
の化学的リンカーに共有結合によって結合する。
ルを有するマイクロタイタープレートのような固相シス
テムが用いられる。固相システムにおいて検出処理の効
果に影響を及ぼす重要な要因は、プローブまたはＰＣＲ
生成物のいずれかである所望の成分を固体マトリックス
上に固定するために用いられる結合方法の効率である。
最近、共有結合による結合（linging)化学を使用する
と、プローブオリゴヌクレオチドがマイクロプレートの
プラスチック表面に一層効率よく、また一層しっかりと
結合することが分った。この技術では、オリゴヌクレオ
チドのプローブは、プローブの５' 末端に付着したアミ
ンまたは酸基などの反応成分を介してプラスチック表面
の化学的リンカーに共有結合によって結合する。
【００８７】また、従来の技術の部分で述べたように、
ある目的のためには、ヌクレオチドオチド置換、挿入ま
たは欠失などの増幅核酸配列間の僅かな相異を識別する
ことが必要である。これらのヌクレオチドの変化は突然
変異または多形の対立遺伝子の変異である。特に注目す
べき点は、一塩基がミスマッチしている核酸配列の識別
である。配列特異的オリゴヌクレオチドプローブ、すな
わち標的核酸配列の適切な領域に完全に相補的であるプ
ローブが通常用いられる。しかし、すべてのプライマー
およびプローブは、完全に相補的である核酸配列領域、
および、充分ではあるが完全には相補的でない配列、す
なわち、ミスマッチしている少なくとも一つの塩基を含
む領域の両方にハイブリダイゼーションする。したがっ
て、特異的プローブは、完全な標的核酸配列ならびに増
幅処理後にも存在する実質的類似しているが標的でない
核酸配列と、ハイブリダイゼーションする。
ある目的のためには、ヌクレオチドオチド置換、挿入ま
たは欠失などの増幅核酸配列間の僅かな相異を識別する
ことが必要である。これらのヌクレオチドの変化は突然
変異または多形の対立遺伝子の変異である。特に注目す
べき点は、一塩基がミスマッチしている核酸配列の識別
である。配列特異的オリゴヌクレオチドプローブ、すな
わち標的核酸配列の適切な領域に完全に相補的であるプ
ローブが通常用いられる。しかし、すべてのプライマー
およびプローブは、完全に相補的である核酸配列領域、
および、充分ではあるが完全には相補的でない配列、す
なわち、ミスマッチしている少なくとも一つの塩基を含
む領域の両方にハイブリダイゼーションする。したがっ
て、特異的プローブは、完全な標的核酸配列ならびに増
幅処理後にも存在する実質的類似しているが標的でない
核酸配列と、ハイブリダイゼーションする。
【００８８】これらの類似のハイブリッドを他のものか
ら識別するには、例えば、厳しい洗浄条件および／また
はハイブリッド複合体の物理的性質に影響を与える毒性
化学薬品による処理を含む種々の方法が用いられてい
る。しかし、核酸配列塩基のミスマッチを検出するこれ
らの既知方法は、一般に、検査室で日常的に使用するに
は、困難すぎ、苛酷で不便すぎるものであった。
ら識別するには、例えば、厳しい洗浄条件および／また
はハイブリッド複合体の物理的性質に影響を与える毒性
化学薬品による処理を含む種々の方法が用いられてい
る。しかし、核酸配列塩基のミスマッチを検出するこれ
らの既知方法は、一般に、検査室で日常的に使用するに
は、困難すぎ、苛酷で不便すぎるものであった。
【００８９】本発明の複数分析対象物認識処理方法は、
適切なプローブオリゴヌクレオチドを使用して行われ、
好ましくは、プローブ／核酸配列ハイブリッドの結合効
率を高める共有結合による結合技術を組み入れてマイク
ロタイタープレート上で行う。さらに、核酸配列ミスマ
ッチ検出法により、一塩基ミスマッチのみを含む小さな
ミスマッチを有する増幅された核酸配列間の識別が可能
になる。核酸配列ミスマッチ検出法は、目的の塩基の相
異を識別するような位置に中性塩基置換分子を有する配
列特異的プローブオリゴヌクレオチドを利用して、ミス
マッチしている核酸配列とプローブとの間のハイブリダ
イゼーションの強さを低減させる。それによって、ミス
マッチしている配列のハイブリッドはマッチしている配
列のハイブリッドより有意に弱くなるので、マッチして
いるハイブリッドとミスマッチしているハイブリッドと
の区別が、厳しく苛酷な条件を使用しなくても、可能に
なる。
適切なプローブオリゴヌクレオチドを使用して行われ、
好ましくは、プローブ／核酸配列ハイブリッドの結合効
率を高める共有結合による結合技術を組み入れてマイク
ロタイタープレート上で行う。さらに、核酸配列ミスマ
ッチ検出法により、一塩基ミスマッチのみを含む小さな
ミスマッチを有する増幅された核酸配列間の識別が可能
になる。核酸配列ミスマッチ検出法は、目的の塩基の相
異を識別するような位置に中性塩基置換分子を有する配
列特異的プローブオリゴヌクレオチドを利用して、ミス
マッチしている核酸配列とプローブとの間のハイブリダ
イゼーションの強さを低減させる。それによって、ミス
マッチしている配列のハイブリッドはマッチしている配
列のハイブリッドより有意に弱くなるので、マッチして
いるハイブリッドとミスマッチしているハイブリッドと
の区別が、厳しく苛酷な条件を使用しなくても、可能に
なる。
【００９０】胃腸炎パネルへの適用に関し、Ｏ１５７：
Ｈ７として知られている極めて劇毒性の腸管出血性大腸
菌株の存在の検出を可能にすることが重要である。この
劇毒性菌株は、大腸菌Ｏ２５：Ｋ９８：ＮＭとされる他
の大腸菌株とはｕｉｄＡ遺伝子中の一つの塩基対のみで
異なる。これらの両菌株が存在する場合には、これらの
両菌株は、核酸配列が実質的に類似しているため、プラ
イマーを用いたＰＣＲ増幅処理中に、ｕｉｄＡ遺伝子を
含む核酸配列を目標にして増幅する。したがって、劇毒
性Ｏ１５７：Ｈ７株がＰＣＲ増幅生成物内に存在するか
どうかを区別できることが必要である。
Ｈ７として知られている極めて劇毒性の腸管出血性大腸
菌株の存在の検出を可能にすることが重要である。この
劇毒性菌株は、大腸菌Ｏ２５：Ｋ９８：ＮＭとされる他
の大腸菌株とはｕｉｄＡ遺伝子中の一つの塩基対のみで
異なる。これらの両菌株が存在する場合には、これらの
両菌株は、核酸配列が実質的に類似しているため、プラ
イマーを用いたＰＣＲ増幅処理中に、ｕｉｄＡ遺伝子を
含む核酸配列を目標にして増幅する。したがって、劇毒
性Ｏ１５７：Ｈ７株がＰＣＲ増幅生成物内に存在するか
どうかを区別できることが必要である。
【００９１】本発明によれば、この問題は、中性塩基置
換分子を組み入れた修飾配列特異的プローブを用いるこ
とによって解決される。特に、実施例４に示すように、
大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７に配列特異的なプローブにおい
て、既存の一塩基ミスマッチ以外の位置で、少なくとも
一つのイノシン分子が置換される。これらの修飾プロー
ブにより、プローブ／Ｏ１５７：Ｈ７株核酸配列ハイブ
リッドは、イノシン部位を除いては確実に完全にマッチ
し、一方、プローブ／Ｏ２５：Ｋ９８：ＮＭ株核酸配列
ハイブリッドは、一塩基ミスマッチ部位でさらにミスマ
ッチする。したがって、プローブ／Ｏ２５：Ｋ９８：Ｎ
Ｍ株核酸配列ハイブリッドは、一層弱くなり、これによ
って、苛酷で不便な処理または毒性化学薬品を使用せず
に、充分に除去できることになり、一塩基ミスマッチ大
腸菌株相互間の識別を正確に行うことができる。
換分子を組み入れた修飾配列特異的プローブを用いるこ
とによって解決される。特に、実施例４に示すように、
大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７に配列特異的なプローブにおい
て、既存の一塩基ミスマッチ以外の位置で、少なくとも
一つのイノシン分子が置換される。これらの修飾プロー
ブにより、プローブ／Ｏ１５７：Ｈ７株核酸配列ハイブ
リッドは、イノシン部位を除いては確実に完全にマッチ
し、一方、プローブ／Ｏ２５：Ｋ９８：ＮＭ株核酸配列
ハイブリッドは、一塩基ミスマッチ部位でさらにミスマ
ッチする。したがって、プローブ／Ｏ２５：Ｋ９８：Ｎ
Ｍ株核酸配列ハイブリッドは、一層弱くなり、これによ
って、苛酷で不便な処理または毒性化学薬品を使用せず
に、充分に除去できることになり、一塩基ミスマッチ大
腸菌株相互間の識別を正確に行うことができる。
【００９２】実施例４材料および方法 I.オリゴヌクレオチドプローブ 核酸プローブは、Genosys Biotechnologies, Inc（米国
テキサス州ウッドランヅ）によって合成されていた。Ｏ
２５：Ｋ９８：ＮＭ大腸菌株の一塩基ミスマッチ配列特
異的プローブおよび劇毒Ｏ１５７：Ｈ７大腸菌株の一塩
基ミスマッチ配列特異的プローブを表９に示す。
テキサス州ウッドランヅ）によって合成されていた。Ｏ
２５：Ｋ９８：ＮＭ大腸菌株の一塩基ミスマッチ配列特
異的プローブおよび劇毒Ｏ１５７：Ｈ７大腸菌株の一塩
基ミスマッチ配列特異的プローブを表９に示す。
【００９３】
【表９】
【００９４】少なくとも一つのイノシン（ｉ）置換を有
する修飾プローブの配列を表１０に示す。
する修飾プローブの配列を表１０に示す。
【００９５】
【表１０】
【００９６】II. 核酸プローブの共有結合による結合 すべてのプローブは、５' 末端第一アミンを用いて合成
した。核酸プローブのための固相結合支持体としてＮ−
オキシスクシンイミドアミン結合マイクロタイタープレ
ート（米国マサチュセッツ州ケンブリッジ所在のCornin
g Costar Corporation）を用いた。各プローブは燐酸緩
衝溶液 (PBS)、ｐＨ９．０で１μｇ／mlに希釈し、各プ
ローブの１００μｌを別々のウエルに入れた。プレート
は室温で一時間インキュベートした。インキュベーショ
ンの後、溶液を吸引し、プレートを３０μｌの洗浄緩衝
溶液／ウエル（２．０ｍＭのイミダゾールで緩衝されて
いる生理的食塩水、０．０２％のツイーン−２０)(全化
学薬品は米国ミズーリ州セントルイス所在のSigma Chem
ical Co.から入手）で５回洗浄した。残存活性部位をSt
abilcoat（米国ミネソタ州エデンプレイリー所在のBSI
Corporation ）によって室温で３０分間ブロックした。
ウエルを吸引処理し、直接ハイブリダイゼーションに用
いた。
した。核酸プローブのための固相結合支持体としてＮ−
オキシスクシンイミドアミン結合マイクロタイタープレ
ート（米国マサチュセッツ州ケンブリッジ所在のCornin
g Costar Corporation）を用いた。各プローブは燐酸緩
衝溶液 (PBS)、ｐＨ９．０で１μｇ／mlに希釈し、各プ
ローブの１００μｌを別々のウエルに入れた。プレート
は室温で一時間インキュベートした。インキュベーショ
ンの後、溶液を吸引し、プレートを３０μｌの洗浄緩衝
溶液／ウエル（２．０ｍＭのイミダゾールで緩衝されて
いる生理的食塩水、０．０２％のツイーン−２０)(全化
学薬品は米国ミズーリ州セントルイス所在のSigma Chem
ical Co.から入手）で５回洗浄した。残存活性部位をSt
abilcoat（米国ミネソタ州エデンプレイリー所在のBSI
Corporation ）によって室温で３０分間ブロックした。
ウエルを吸引処理し、直接ハイブリダイゼーションに用
いた。
【００９７】III.ＰＣＲ増幅 増幅のために、５０μl の反応混合物を５μl の１０Ｘ
ＰＣＲ緩衝溶液（米国ウイスコンシン州マディソン所在
の Promega Corp.）、０．５ユニットのＴａｑＤＮＡポ
リメラーゼ、２００μＭの各ｄＮＴＰ（デオキシヌクレ
オチド三燐酸）（米国ウイスコンシン州マディソン所在
のPromega Corp. ）、２００ｎｇの大腸菌（配列 ID 番
号：９および１０、表６参照）の uidＡ遺伝子特異的各
プライマー、および大腸菌Ｏ２５：Ｋ９８：ＮＭ（ＡＴ
ＣＣ＃43886 表３参照) ＤＮＡまたは大腸菌Ｏ１５７：
Ｈ７（ＡＴＣＣ＃ 3515 、表３参照) ＤＮＡのどちらか
を２００ｎｇ用いて調製した。一つのプライマー、配列
ID番号：１０を、５' 末端でビオチン化した。
ＰＣＲ緩衝溶液（米国ウイスコンシン州マディソン所在
の Promega Corp.）、０．５ユニットのＴａｑＤＮＡポ
リメラーゼ、２００μＭの各ｄＮＴＰ（デオキシヌクレ
オチド三燐酸）（米国ウイスコンシン州マディソン所在
のPromega Corp. ）、２００ｎｇの大腸菌（配列 ID 番
号：９および１０、表６参照）の uidＡ遺伝子特異的各
プライマー、および大腸菌Ｏ２５：Ｋ９８：ＮＭ（ＡＴ
ＣＣ＃43886 表３参照) ＤＮＡまたは大腸菌Ｏ１５７：
Ｈ７（ＡＴＣＣ＃ 3515 、表３参照) ＤＮＡのどちらか
を２００ｎｇ用いて調製した。一つのプライマー、配列
ID番号：１０を、５' 末端でビオチン化した。
【００９８】パーキンエルマー（Perkin Elmer）９６０
０サーモサイクラー（米国コネクチカット州ノールウォ
ーク）を用いて、９６℃で３分間、１変性サイクル、続
いて、以下のように、３５サイクル行った。すなわち変
性に９４℃で３０秒、アニーリングに６１℃で２０秒、
伸張に７２℃で２０秒。
０サーモサイクラー（米国コネクチカット州ノールウォ
ーク）を用いて、９６℃で３分間、１変性サイクル、続
いて、以下のように、３５サイクル行った。すなわち変
性に９４℃で３０秒、アニーリングに６１℃で２０秒、
伸張に７２℃で２０秒。
【００９９】IV．ゲルの検出 ＰＣＲ生成物を４％ Nu Sieve ３：１寒天（米国メリー
ランド州ロックランド所在のFMC)中で電気泳動させた後
に、臭化エチジウム染色により可視化した (また、大き
さにより確認した）。分子サイズマーカーとして、５０
−１０００ｂｐ等間隔標準物（米国テネシー州マーフリ
ーボロ所在のBioVentures, Inc. ）を用いた。
ランド州ロックランド所在のFMC)中で電気泳動させた後
に、臭化エチジウム染色により可視化した (また、大き
さにより確認した）。分子サイズマーカーとして、５０
−１０００ｂｐ等間隔標準物（米国テネシー州マーフリ
ーボロ所在のBioVentures, Inc. ）を用いた。
【０１００】VIII．ＤＮＡハイブリダイゼーション／比
色検出 増幅された生成物（１Ｘ１０12分子）を、２５μｌのＰ
ＢＳ、ｐＨ７．２５で希釈し、２５μｌの変性溶液
（０．８Ｎ ＮａＯＨ）とともに、プローブで被覆され
ているウエルに加えた。室温で１０分間インキュベーシ
ョンした後、２５μｌの４Ｘハイブリダイゼーション溶
液（ＰＢＳ、ｐＨ７．２５、８％ＢＳＡ）および２５μ
ｌの中和溶液（４Ｍ酢酸アンモニウム)(米国ミズーリ州
セントルイス所在の Sigma Chemical Co.）を加えて、
室温でさらに５分間インキュベートした。次いで、プレ
ートを５５℃で４５分間インキュベートした。インキュ
ベーションの後、プレートは室温の洗浄緩衝溶液 (１Ｍ
トリスで緩衝されている生理的食塩水、ｐＨ７．５、
１．０％のツイーン２０) で５回洗浄した。ウエルに結
合しているハイブリダイゼーションされた生成物の比色
計分析を行うために、１００μｌのストレプトアビジン
ーアルカリ性ホスファターゼ複合体（coniugate)（イタ
リア国ミラノ所在の SPA）を加え、３７℃で３０分間イ
ンキュベートした。プレートは洗浄緩衝溶液で５回洗浄
し、さらに３７℃で３０分間１００μｌのｐーＮＰＰ溶
液（０．５Ｍトリス、ｐＨ９．５中１ｍｇ／ｍｌの燐酸
ｐ−ニトロフェニール）中でインキュベートした。反応
を１．５NaOHを加えて停止させた。吸光度値をＳＬＴLa
binstruments Model＃１６ー８８６マイクロプレートリ
ーダー（オーストリア国ザルツブルク所在の SLT）で４
０５ｎｍで分析した。
色検出 増幅された生成物（１Ｘ１０12分子）を、２５μｌのＰ
ＢＳ、ｐＨ７．２５で希釈し、２５μｌの変性溶液
（０．８Ｎ ＮａＯＨ）とともに、プローブで被覆され
ているウエルに加えた。室温で１０分間インキュベーシ
ョンした後、２５μｌの４Ｘハイブリダイゼーション溶
液（ＰＢＳ、ｐＨ７．２５、８％ＢＳＡ）および２５μ
ｌの中和溶液（４Ｍ酢酸アンモニウム)(米国ミズーリ州
セントルイス所在の Sigma Chemical Co.）を加えて、
室温でさらに５分間インキュベートした。次いで、プレ
ートを５５℃で４５分間インキュベートした。インキュ
ベーションの後、プレートは室温の洗浄緩衝溶液 (１Ｍ
トリスで緩衝されている生理的食塩水、ｐＨ７．５、
１．０％のツイーン２０) で５回洗浄した。ウエルに結
合しているハイブリダイゼーションされた生成物の比色
計分析を行うために、１００μｌのストレプトアビジン
ーアルカリ性ホスファターゼ複合体（coniugate)（イタ
リア国ミラノ所在の SPA）を加え、３７℃で３０分間イ
ンキュベートした。プレートは洗浄緩衝溶液で５回洗浄
し、さらに３７℃で３０分間１００μｌのｐーＮＰＰ溶
液（０．５Ｍトリス、ｐＨ９．５中１ｍｇ／ｍｌの燐酸
ｐ−ニトロフェニール）中でインキュベートした。反応
を１．５NaOHを加えて停止させた。吸光度値をＳＬＴLa
binstruments Model＃１６ー８８６マイクロプレートリ
ーダー（オーストリア国ザルツブルク所在の SLT）で４
０５ｎｍで分析した。
【０１０１】結果 表１１に示すように、Ｏ１５７：Ｈ７大腸菌のｕｉｄＡ
対立遺伝子とＯ２５：Ｋ９８：ＮＭ大腸菌株との間の識
別に用いた修飾プローブは、種々の部位においてグアノ
シンおよびシトシンをイノシン分子で置換する。グアノ
シンおよびシトシンは強い三重結合に影響を与えるの
で、これらの塩基を中性塩基であるイノシンで置換する
ことは、最も効果があることが予期される。プローブは
任意のＤＮＡ配列において、イノシンの配置および数を
変えることにより設計した。プローブの長さもまた識別
を最大限にできるように修飾した。
対立遺伝子とＯ２５：Ｋ９８：ＮＭ大腸菌株との間の識
別に用いた修飾プローブは、種々の部位においてグアノ
シンおよびシトシンをイノシン分子で置換する。グアノ
シンおよびシトシンは強い三重結合に影響を与えるの
で、これらの塩基を中性塩基であるイノシンで置換する
ことは、最も効果があることが予期される。プローブは
任意のＤＮＡ配列において、イノシンの配置および数を
変えることにより設計した。プローブの長さもまた識別
を最大限にできるように修飾した。
【０１０２】上記のように、各プローブを共有結合によ
って９６−ウエルのマイクロクロタイタープレートに結
合させ、直ちにハイブリダイゼーション定量に用いた。
プローブのウエルへの共有結合による結合に生じること
のある変動を最小にするために、測定は各々のプレート
について３回行った。そして、全部で６枚のプレートを
ハイブリダイゼーションの研究に用いた。ハイブリダイ
ゼーションに用いるＤＮＡを、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７ま
たは大腸菌Ｏ２５：Ｋ９８：ＮＭから増幅させた。増幅
した４２３ｂｐ領域は uidA 遺伝子のヌクレオチド 198
-621に対応していた。増幅したＤＮＡ配列を、４％アガ
ロースゲル上で移動させることによって分析した。生成
物の一連の希釈液を、ゲル上の既知の対照と比較するこ
とにより定量した。プレートを同量の増幅生成物（約１
×１０12分子／ウエル) とハイブリダイゼーションさせ
た。時間経過実験によって、ハイブリダイゼーション・
シグナルが55℃で４５分間で飽和に達したことがわかっ
た。したがって、すべての実験は 55 ℃で４５分間のハ
イブリダイゼーションによって分析した。
って９６−ウエルのマイクロクロタイタープレートに結
合させ、直ちにハイブリダイゼーション定量に用いた。
プローブのウエルへの共有結合による結合に生じること
のある変動を最小にするために、測定は各々のプレート
について３回行った。そして、全部で６枚のプレートを
ハイブリダイゼーションの研究に用いた。ハイブリダイ
ゼーションに用いるＤＮＡを、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７ま
たは大腸菌Ｏ２５：Ｋ９８：ＮＭから増幅させた。増幅
した４２３ｂｐ領域は uidA 遺伝子のヌクレオチド 198
-621に対応していた。増幅したＤＮＡ配列を、４％アガ
ロースゲル上で移動させることによって分析した。生成
物の一連の希釈液を、ゲル上の既知の対照と比較するこ
とにより定量した。プレートを同量の増幅生成物（約１
×１０12分子／ウエル) とハイブリダイゼーションさせ
た。時間経過実験によって、ハイブリダイゼーション・
シグナルが55℃で４５分間で飽和に達したことがわかっ
た。したがって、すべての実験は 55 ℃で４５分間のハ
イブリダイゼーションによって分析した。
【０１０３】所定のプローブの識別効果を判断するため
に、二つのパラメータを決めた。プローブの識別能力を
確立するために、各プローブについてＯ２５：Ｋ９８：
ＮＭシグナルに対するＯ１５７：Ｈ７シグナルの比を決
定した。配列特異的Ｏ１５７：Ｈ７プローブ（１００
％）、識別ＩＤ番号：２０で得られたシグナルを各プロ
ーブによって保持されているＯ１５７：Ｈ７シグナルと
比較し、パーセント値を計算し、病原体株を同定するた
めのマーカーとしての各プローブの感度を明確にした。
６つの実験すべての計算結果を表１１に示す。
に、二つのパラメータを決めた。プローブの識別能力を
確立するために、各プローブについてＯ２５：Ｋ９８：
ＮＭシグナルに対するＯ１５７：Ｈ７シグナルの比を決
定した。配列特異的Ｏ１５７：Ｈ７プローブ（１００
％）、識別ＩＤ番号：２０で得られたシグナルを各プロ
ーブによって保持されているＯ１５７：Ｈ７シグナルと
比較し、パーセント値を計算し、病原体株を同定するた
めのマーカーとしての各プローブの感度を明確にした。
６つの実験すべての計算結果を表１１に示す。
【０１０４】
【表１１】
【０１０５】選択されたパラメータに基づいて、Ｍ１プ
ローブが最良の識別(3.17 ＋／−.37)を示し、シグナル
も最良である（８６％）。他のプローブ、例えば、プロ
ーブＭ２、Ｍ８およびＭ９は優れた識別を示している
が、変動性が増加し、シグナルが減少している。部位１
１および１３におけるイノシン置換（プローブＭ２、Ｍ
９、Ｍ１１、Ｍ１２およびＭ３の各々）は、識別の高い
変動性または低下および全体的なシグナル強さの減少を
示した。プローブＭ２およびＭ９は一塩基ミスマッチの
すぐ下流にイノシン置換を有し、両者ともシグナルの強
さの減少および識別の高度の変動性を示した。プロー
ブ、例えば、プローブＭ１１およびＭ１２の長さを増加
することによって、変動性は減少したが、シグナルの強
さは部分的に回復した。部位１３にイノシン置換を有す
るプローブＭ３は、シグナルの強さへの影響は小さかっ
たが、識別が低下した。プローブＭ４、Ｍ５およびＭ１
０のプローブにおけるように、複数のイノシン置換によ
り、識別は良くなったが、シグナルが減少した。プロー
ブＭ９およびＭ２とＭ１１およびＭ１２との比較および
プローブＭ８とＭ１との比較により、プローブの長さが
増加すると、シグナルの強さは増加するが、識別の変動
性が安定化することがわかった。
ローブが最良の識別(3.17 ＋／−.37)を示し、シグナル
も最良である（８６％）。他のプローブ、例えば、プロ
ーブＭ２、Ｍ８およびＭ９は優れた識別を示している
が、変動性が増加し、シグナルが減少している。部位１
１および１３におけるイノシン置換（プローブＭ２、Ｍ
９、Ｍ１１、Ｍ１２およびＭ３の各々）は、識別の高い
変動性または低下および全体的なシグナル強さの減少を
示した。プローブＭ２およびＭ９は一塩基ミスマッチの
すぐ下流にイノシン置換を有し、両者ともシグナルの強
さの減少および識別の高度の変動性を示した。プロー
ブ、例えば、プローブＭ１１およびＭ１２の長さを増加
することによって、変動性は減少したが、シグナルの強
さは部分的に回復した。部位１３にイノシン置換を有す
るプローブＭ３は、シグナルの強さへの影響は小さかっ
たが、識別が低下した。プローブＭ４、Ｍ５およびＭ１
０のプローブにおけるように、複数のイノシン置換によ
り、識別は良くなったが、シグナルが減少した。プロー
ブＭ９およびＭ２とＭ１１およびＭ１２との比較および
プローブＭ８とＭ１との比較により、プローブの長さが
増加すると、シグナルの強さは増加するが、識別の変動
性が安定化することがわかった。
【０１０６】上記の結果から、配列特異的プローブに中
性塩基置換を組み込むことにより、増幅された核酸配列
間の一塩基ミスマッチさえも識別できる感受性および効
率を得られることが認められる。
性塩基置換を組み込むことにより、増幅された核酸配列
間の一塩基ミスマッチさえも識別できる感受性および効
率を得られることが認められる。
【０１０７】本発明は、他の特定の形式または様式で、
本発明の精神あるいは本質的特徴から逸脱することな
く、実施および利用することができる。上記の実施態様
および方法は限定的なものではなく、もっぱら例示する
ものであると解されるべきである。したがって、本発明
の範囲は、上記の説明によってではなく、請求の範囲に
よって示される。請求の範囲の意味するところおよび同
等な範囲内にあるすべての変更は、本発明の請求の範囲
内に包含される。
本発明の精神あるいは本質的特徴から逸脱することな
く、実施および利用することができる。上記の実施態様
および方法は限定的なものではなく、もっぱら例示する
ものであると解されるべきである。したがって、本発明
の範囲は、上記の説明によってではなく、請求の範囲に
よって示される。請求の範囲の意味するところおよび同
等な範囲内にあるすべての変更は、本発明の請求の範囲
内に包含される。
【０１０８】配列表 (1) 一般情報： (i) 出願人：リンクシアン・ウー(Wu, Linxian) ジャナ・クームズ(Coombs, Jana) シャーロン・L ・モールストロム(Malstrom, Sharon
L.) マイクル・J ・グラース(Glass, Michael J.) (ii)発明の名称：複数分析対象物の調製、増幅および識
別法と装置 (iii) 配列の数：30 (iv) 連絡先： (A) 受信人：デイビッド・オー・シーリー(David O. Se
eley弁理士 )ワークマン、ナイデッガー・アンド・シー
リー(Workman, Nydegger & Seeley ） (B）番地：イーストサウステンプル60番地、イーグルゲ
ートタワー1000 (C）市：ソルトレークシティ (D) 州：ユタ (E) 国：アメリカ合衆国 (F) 郵便番号：8411 (v）コンピュータ読取り可能形式： (A）媒体タイプ：フロッピー、3.5 インチ(5cm) 、1.44
Ｍｂ容量 (B）コンピュータ：IBM 互換性 (C) オペレーティングシステム：MS-DOS (D) ソフトウエア：ウインドウズ用ワードパーフェクト
6.0a (vi)現在の出願データ： (A) 出願番号： (B）出願日：1996年１月16日 (C）分類：
L.) マイクル・J ・グラース(Glass, Michael J.) (ii)発明の名称：複数分析対象物の調製、増幅および識
別法と装置 (iii) 配列の数：30 (iv) 連絡先： (A) 受信人：デイビッド・オー・シーリー(David O. Se
eley弁理士 )ワークマン、ナイデッガー・アンド・シー
リー(Workman, Nydegger & Seeley ） (B）番地：イーストサウステンプル60番地、イーグルゲ
ートタワー1000 (C）市：ソルトレークシティ (D) 州：ユタ (E) 国：アメリカ合衆国 (F) 郵便番号：8411 (v）コンピュータ読取り可能形式： (A）媒体タイプ：フロッピー、3.5 インチ(5cm) 、1.44
Ｍｂ容量 (B）コンピュータ：IBM 互換性 (C) オペレーティングシステム：MS-DOS (D) ソフトウエア：ウインドウズ用ワードパーフェクト
6.0a (vi)現在の出願データ： (A) 出願番号： (B）出願日：1996年１月16日 (C）分類：
【０１０９】(2）配列ID番号１の情報： (i) 配列の特徴 (A) 長さ：20塩基対 (B）型：核酸 (C）鎖：一本鎖 (D）トポロジー：直鎖状 (ii)分子型：DNA (xi)配列ID番号１の情報： TGAAATGGCA GAACAGCGTC 20
【０１１０】(2) 配列ID番号２の情報 (i) 配列の特徴： (A) 長さ：23塩基対 (B）型：核酸 (C）鎖：一本鎖 (D）トポロジー：直鎖状 (ii)分子型：DNA (xi)配列情報：配列ID番号２： CGTTCTGAAC CTTTGGTAAT AAC 23
【０１１１】(2) 配列ID番号３の情報： (i) 配列の特徴： (A) 長さ：24塩基対 (B）型：核酸 (C）鎖：一本鎖 (D）トポロジー：直鎖状 (ii)分子型：DNA (xi)配列情報：配列ID番号３： GATGAGGAAG CTTTATATAC TTCG 24
【０１１２】(2) 配列ID番号４の情報： (i) 配列の特徴： (A) 長さ：23塩基対 (B）型：核酸 (C）鎖：一本鎖 (D）トポロジー：直鎖状 (ii)分子型：DNA (xi)配列情報：配列ID番号４： TGCATGATGC ATGCGAATAT CAA 23
【０１１３】(2) 配列ID番号５の情報： (i) 配列の特徴： (A) 長さ：23塩基対 (B）型：核酸 (C）鎖：一本鎖 (D）トポロジー：直鎖状 (ii)分子型：DNA (xi)配列情報：配列ＩＤ番号５： CAAAGTGGTT CTTATGCAAT GGC 23
【０１１４】(2) 配列ID番号６の情報： (i) 配列の特徴： (A) 長さ：24塩基対 (B）型：核酸 (C）鎖：一本鎖 (D）トポロジー：直鎖状 (ii)分子型：DNA (xi)配列情報：配列ID番号６： TGCTGCTGAG TTAATTCTAA GACC 24
【０１１５】(2) 配列ID番号７の情報： (i) 配列の特徴： (A) 長さ：20塩基対 (B）型：核酸 (C）鎖：一本鎖 (D）トポロジー：直鎖状 (ii)分子型：DNA (xi)配列情報：配列ID番号７： TGTGTACGCT GCGAGTGAAA 20
【０１１６】(2) 配列ID番号８の情報： (i) 配列の特徴： (A) 長さ：20塩基対 (B）型：核酸 (C）鎖：一本鎖 (D）トポロジー：直鎖状 (ii)分子型：DNA (xi)配列情報：配列ID番号８： GCCCCCAGTA ATCCATAAAG 20
【０１１７】(2) 配列ID番号９の情報： (i) 配列の特徴： (A) 長さ：20塩基対 (B）型：核酸 (C）鎖：一本鎖 (D）トポロジー：直鎖状 (ii)分子型：DNA (xi)配列情報：配列ID番号９： CTCTTCCATG GGTTTCTCAC 20
【０１１８】(2) 配列ID番号10の情報： (i) 配列の特徴： (A) 長さ：21塩基対 (B）型：核酸 (C）鎖：一本鎖 (D）トポロジー：直鎖状 (ii)分子型：DNA (xi)配列情報：配列ID番号10： GATGCTCCAT CACTTCCTGA T 21
【０１１９】(2) 配列ID番号11の情報： (i) 配列の特徴： (A) 長さ：20塩基対 (B）型：核酸 (C）鎖：一本鎖 (D）トポロジー：直鎖状 (ii)分子型：DNA (xi)配列情報：配列ID番号11： CAACTTCATC CACGTTCACC 20
【０１２０】(2) 配列ID番号12の情報： (i) 配列の特徴： (A) 長さ：19塩基対 (B）型：核酸 (C）鎖：一本鎖 (D）トポロジー：直鎖状 (ii)分子型：DNA (xi)配列情報：配列ID番号12： AAGAGCCAAG GACAGGTAC 19
【０１２１】(2) 配列ID番号13の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：19塩基対 (B）型：核酸 (C）鎖：一本鎖 (D）トポロジー：直鎖状 (ii)分子型：DNA (xi)配列ID番号13の情報： TGGTTGATTT CCTGATCGC 19
【０１２２】(2) 配列ID番号14の情報： (i) 配列の特徴： (A) 長さ：21塩基対 (B）型：核酸 (C）鎖：一本鎖 (D）トポロジー：直鎖状 (ii)分子型：DNA (xi)配列情報：配列ID番号14： CTGATCAGAT AAGGAAGATT G 21
【０１２３】(2) 配列ID番号15の情報： (i) 配列の特徴： (A) 長さ：21塩基対 (B）型：核酸 (C）鎖：一本鎖 (D）トポロジー：直鎖状 (ii)分子型：DNA (xi)配列情報：配列ID番号15： AAACTTGGAA CACTTCTTGC T 21
【０１２４】(2) 配列ID番号16の情報： (i) 配列の特徴： (A) 長さ：21塩基対 (B）型：核酸 (C）鎖：一本鎖 (D）トポロジー：直鎖状 (ii)分子型：DNA (xi)配列情報：配列ID番号16： GGCAGTAATA AGTTTGGTCA T 21
【０１２５】(2) 配列ID番号17の情報： (i) 配列の特徴： (A) 長さ：18塩基対 (B）型：核酸 (C）鎖：一本鎖 (D）トポロジー：直鎖状 (ii)分子型：DNA (xi)配列情報：配列ID番号17： GGAATTGATC AGCGTTGG 18
【０１２６】(2) 配列ID番号18の情報： (i) 配列の特徴： (A) 長さ：19塩基対 (B）型：核酸 (C）鎖：一本鎖 (D）トポロジー：直鎖状 (ii)分子型：DNA (xi)配列情報：配列ID番号18： CACAACTGTG TTCACTAGC 19
【０１２７】(2) 配列ID番号19の情報： (i) 配列の特徴： (A) 長さ：18塩基対 (B）型：核酸 (C）鎖：一本鎖 (D）トポロジー：直鎖状 (ii)分子型：DNA (xi)配列情報：配列ID番号19： GGAATTGATC AGCGTTGG 18
【０１２８】(2) 配列ID番号20の情報： (i) 配列の特徴： (A) 長さ：18塩基対 (B）型：核酸 (C）鎖：一本鎖 (D）トポロジー：直鎖状 (ii)分子型：DNA (xi)配列情報：配列ID番号20： TGGAATTGAG CAGCGTTG 18
【０１２９】(2) 配列ID番号21の情報： (i) 配列の特徴： (A) 長さ：19塩基対 (B）型：核酸 (C）鎖：一本鎖 (D）トポロジー：直鎖状 (ii)分子型：DNA (ix)他の情報： (A) 名称／キー:N＝イノシン (xi) 配列情報：配列ID番号21： GTGGAATTNA GCAGCGTTG 19
【０１３０】(2) 配列ID番号22の情報： (i) 配列の特徴： (A) 長さ：19塩基対 (B）型：核酸 (C）鎖：一本鎖 (D）トポロジー：直鎖状 (ii)分子型：DNA (ix)他の情報： (A）名称／キー：Ｎ＝イノシン (xi)配列情報：配列ID番号22： GTGGAATTGA GNAGCGTTG 19
【０１３１】(2) 配列ID番号23の情報： (i) 配列の特徴： (A) 長さ：19塩基対 (B）型：核酸 (C）鎖：一本鎖 (D）トポロジー：直鎖状 (ii)分子型：DNA (ix)他の情報： (A) 名称／キー:N＝イノシン (xi)配列情報：配列ID番号23： GTGGAATTGA GCANCGTTG 19
【０１３２】(2) 配列ID番号24の情報： (i) 配列の特徴： (A) 長さ：22塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii)分子型：DNA (ix)他の情報： (A) 名称／キー:N＝イノシン (xi) 配列情報：配列ID番号24： TGTGNAATTN AGCANCGTTG GT 22
【０１３３】(2) 配列ID番号25の情報： (i) 配列の特徴： (A) 長さ：22塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii)分子型：DNA (ix)他の情報： (A) 名称／キー:N＝イノシン (xi)配列情報：配列ID番号25： TGTGGAATTN AGNANCGTTG GT 22
【０１３４】(2) 配列ID番号26の情報： (i) 配列の特徴 (A) 長さ：18塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii)分子型：DNA (ix)他の情報： (A) 名称／キー:N＝イノシン (xi)配列ID番号26の情報： GGAATTNAGC AGCGTTGG 18
【０１３５】(2) 配列ID番号27の情報： (i) 配列の特徴： (A) 長さ：18塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii)分子型：DNA (ix)他の情報： (A) 名称／キー:N＝イノシン (xi)配列情報：配列ID番号27： GGAATTGAGN AGCGTTGG 18
【０１３６】(2) 配列ID番号28の情報： (i) 配列の特徴： (A) 長さ：18塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii)分子型：DNA (ix)他の情報： (A) 名称／キー:N＝イノシン (xi)配列情報：配列ID番号28： GGAATTNAGN AGCGTTGG 18
【０１３７】(2) 配列ID番号29の情報： (i) 配列の特徴： (A) 長さ：20塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii)分子型：DNA (ix)他の情報： (A) 名称／キー：Ｎ＝イノシン (xi)配列情報：配列ID番号29： TGTGGAATTG AGNAGCGTTG 20
【０１３８】(2) 配列ID番号30の情報： (i) 配列の特徴： (A) 長さ：20塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii)分子型：DNA (ix)他の情報： (A) 名称／キー：Ｎ＝イノシン (xi)配列情報：配列ID番号30： GTGGAATTGA GNAGCGTTGG 20
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成９年１月１６日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の名称
【補正方法】変更
【補正内容】
【発明の名称】 核酸増幅のための試料材料の調製方
法
法
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４０】本発明の迅速試料処理方法は、独特な抽出
緩衝溶液を使用して、事実上あらゆるタイプの試料材料
において、核酸抽出を行う。既知の抽出緩衝溶液は、通
常トリス塩酸（米国ミズリー州セントルイス所在の Sig
ma Chemical Co. から入手可能) のような緩衝溶液、Ｅ
ＤＴＡ( エチレンジアミン四酢酸) 、および少なくとも
一種の界面活性剤組成物を含む。これに対して、本発明
の抽出緩衝溶液は、トリス塩酸、EDTA、、少なくとも一
種の界面活性剤、および好ましくはそのモル濃度が１Ｍ
から６Ｍまでの範囲にある少なくとも一種の塩を含む。
本発明の抽出緩衝溶液は、好ましくは、例えばイゲパー
ル（Igepal) ＣＡ６３０（商標名）（ｐ−tert−オクチ
ルフェノキシポリエトキシエタノール）およびツイーン
（Tween)２０（商標名）（モノラウリン酸ポリオキシエ
チレンソルビタン）（共に米国ミズリー州セントルイス
所在のSigma Chemical Co.から入手可能) のような２種
の界面活性剤およびＮａＣｌ約２．０Ｍを含むものであ
る。
緩衝溶液を使用して、事実上あらゆるタイプの試料材料
において、核酸抽出を行う。既知の抽出緩衝溶液は、通
常トリス塩酸（米国ミズリー州セントルイス所在の Sig
ma Chemical Co. から入手可能) のような緩衝溶液、Ｅ
ＤＴＡ( エチレンジアミン四酢酸) 、および少なくとも
一種の界面活性剤組成物を含む。これに対して、本発明
の抽出緩衝溶液は、トリス塩酸、EDTA、、少なくとも一
種の界面活性剤、および好ましくはそのモル濃度が１Ｍ
から６Ｍまでの範囲にある少なくとも一種の塩を含む。
本発明の抽出緩衝溶液は、好ましくは、例えばイゲパー
ル（Igepal) ＣＡ６３０（商標名）（ｐ−tert−オクチ
ルフェノキシポリエトキシエタノール）およびツイーン
（Tween)２０（商標名）（モノラウリン酸ポリオキシエ
チレンソルビタン）（共に米国ミズリー州セントルイス
所在のSigma Chemical Co.から入手可能) のような２種
の界面活性剤およびＮａＣｌ約２．０Ｍを含むものであ
る。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００６３】実施例３材料および方法 Ｉ．細菌性スタンダード 細菌標準用ＤＮＡは、表３に示す凍結乾燥されたアメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）
培養物から、以下のように抽出した。すなわち、３００
μl の抽出緩衝溶液（１０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ８．
０、１ｍのＭＥＤＴＡ、１％のトリトン（Triton）Ｘ−
１００（商標名）（ｔ−オクチルフェノキシポリエトキ
シエタノール）、０．５％のツイーン２０)(米国ミズー
リ州セントルイス所在の全化学薬品はSigma Chemical C
o.から入手）を各凍結乾燥したバイアル（vial) に加え
た。１００μl のアリコートを高電力（〜７５０−７７
５ワット）の設定条件で３分間マイクロ波処理した。Ｄ
ＮＡ濃度を分光光度計で測定し、次いで、約４０μｇ／
ｍｌの使用濃度に希釈した。
カン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）
培養物から、以下のように抽出した。すなわち、３００
μl の抽出緩衝溶液（１０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ８．
０、１ｍのＭＥＤＴＡ、１％のトリトン（Triton）Ｘ−
１００（商標名）（ｔ−オクチルフェノキシポリエトキ
シエタノール）、０．５％のツイーン２０)(米国ミズー
リ州セントルイス所在の全化学薬品はSigma Chemical C
o.から入手）を各凍結乾燥したバイアル（vial) に加え
た。１００μl のアリコートを高電力（〜７５０−７７
５ワット）の設定条件で３分間マイクロ波処理した。Ｄ
ＮＡ濃度を分光光度計で測定し、次いで、約４０μｇ／
ｍｌの使用濃度に希釈した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジャナ コームス アメリカ合衆国 ユタ州 84104 ソルト レイク シティ サウス 600 ウエス ト 1266 (72)発明者 シャロン エル マルムストローム アメリカ合衆国 ユタ州 84121 ソルト レイク シティ ダイナスティ ウェイ サウス 8425 (72)発明者 マイケル ジェイ グラス アメリカ合衆国 ユタ州 84014 センタ ーヴィル イースト 200 サウス 275
Claims (75)
- 【請求項１】 試料材料中に含まれる一つまたは複数の
選択した標的核酸配列を増幅させるための試料材料の処
理方法であって、 標的核酸配列を含む可能性のある材料の試料を得、 該試料を抽出緩衝溶液と混合し、該抽出緩衝溶液には少
なくとも一種の界面活性剤組成物および少なくとも一種
の塩組成物を含有させ、該塩組成物を１モルより大きい
濃度で存在させ、 該混合液を遠心分離して第一上澄液分画を得、 該第一上澄液分画を加熱し、 該第一上澄液分画を遠心分離して蛋白質を沈殿させ、第
二上澄液分画を得、 第第二上澄液分画中の核酸を沈殿させ、該核酸を溶解す
ることを特徴とする試料材料の処理方法。 - 【請求項２】 該抽出緩衝溶液がIgepalＣＡ６３０界面
活性剤を含むことを特徴とする請求項１に記載の処理方
法。 - 【請求項３】 該抽出緩衝溶液がさらにTween ２０界面
活性剤を含むことを特徴とする請求項３に記載の処理方
法。 - 【請求項４】 該抽出緩衝溶液がさらに最大６モルまで
の塩濃度を有することを特徴とする請求項３に記載の処
理方法。 - 【請求項５】 該抽出緩衝溶液がIgepalＣＡ６３０界面
活性剤１％、Tween２０界面活性剤０．５％およびNaCl
２．０Ｍを含むことを特徴とする請求項１に記載の処理
方法。 - 【請求項６】 該試料材料が便を含む溶液からなること
を特徴とする請求項１に記載の処理方法。 - 【請求項７】 該試料材料が血液からなることを特徴と
する請求項１に記載の処理方法。 - 【請求項８】 該試料材料が凝固血液からなることを特
徴とする請求項１に記載の処理方法。 - 【請求項９】 該試料材料が抗凝固剤を含む血液からな
ることを特徴とする請求項１に記載の処理方法。 - 【請求項１０】 該試料材料が喀痰からなることを特徴
とする請求項１に記載の処理方法。 - 【請求項１１】 該試料材料が組織培養細胞からなるこ
とを特徴とする請求項１に記載の処理方法。 - 【請求項１２】 該試料材料が細菌培養物からなること
を特徴とする請求項１に記載の処理方法。 - 【請求項１３】 該第一上澄液分画を得るための該遠心
分離を１６，０００×ｇで５秒間行うことを特徴とする
請求項１に記載の処理方法。 - 【請求項１４】 蛋白質を沈殿させて該第二上澄液分画
を得るための該遠心分離を１６，０００×ｇで最高１分
間まで行うことを特徴とする請求項１に記載の処理方
法。 - 【請求項１５】 該加熱工程では合計１５，０００〜２
２，５００ワット秒のマイクロ波加熱をすることを特徴
とする請求項１に記載の処理方法。 - 【請求項１６】 該核酸沈殿工程では該第二上澄液の量
を測定し、同容積の室温のイソプロパノールと混合する
ことを特徴とする請求項１に記載の処理方法。 - 【請求項１７】 該イソプロパノール混合物を遠心分離
して核酸をペレット化し、生じた上澄液をデカンテーシ
ョンし、７０％エタノールを該核酸ペレットに加え、該
７０％エタノール混合物を遠心分離し、生じた上澄液を
捨て、次いで核酸ペレットを溶解することを特徴とする
請求項１６に記載の処理方法。 - 【請求項１８】 該イソプロノール混合物の該遠心分離
を、１６，０００×ｇで最高１分間行うことを特徴とす
る請求項１７に記載の処理方法。 - 【請求項１９】 該７０％エタノール混合物の該遠心分
離を１６，０００×ｇで最高１分間行うことを特徴とす
る請求項１８に記載の処理方法。 - 【請求項２０】 核酸を含む試料内に存在する可能性の
ある複数の標的核酸配列を同時かつ非優先的に増幅させ
る方法であって、 標的核酸配列の一本の鎖の一部分と相補的である複数の
プライマーオリゴヌクレオチドを得、 選択された処理条件下で、各標的核酸配列について実質
的に同様な増幅効率が達成されるような種々の濃度で該
複数のプライマーオリゴヌクレオチドを用いて選択した
処理条件下で試料にポリメラーゼ連鎖反応増幅処理を施
すことを特徴とする標的核酸配列の増幅方法。 - 【請求項２１】 複数のプライマーオリゴヌクレオチド
を得る該工程では、実質的に同じ長さを有するようにし
たオリゴヌクレオチドを選択することを特徴とする請求
項２０に記載の増幅方法。 - 【請求項２２】 複数のプライマーオリゴヌクレオチド
を得る該工程では、実質的に同じ融解温度を有するよう
にしたオリゴヌクレオチドを選択することを特徴とする
請求項２０に記載の増幅方法。 - 【請求項２３】 複数のプライマーオリゴヌクレオチド
を得る該工程では、非標的核酸配列との交差反応が最小
になように適合させたオリゴヌクレオチドを選択するこ
とを特徴とする請求項２０に記載の増幅方法。 - 【請求項２４】 核酸を含む試料内に存在する可能性の
ある複数の標的核酸配列の同時かつ非優先的ポリメラー
ゼ連鎖反応増幅処理が可能になるように複数のプライマ
ーオリゴヌクレオチドを適合させる方法であって、 標的核酸配列の一本の鎖の一部分と相補的である複数の
プライマーオリゴヌクレオチドを選択し、 該複数のプライマーオリゴヌクレオチドの物理的性質お
よび種々の処理条件下での増幅効率を分析し、 該複数のプライマーオリゴヌクレオチドを修飾して実質
的な物理的類似性を得ると共に交差反応性を最小にし、 ポリメラーゼ連鎖反応同時増幅の処理条件を選選択し、 選択された処理条件下で各標的核酸配列について実質的
に同様な増幅効率が達成される各プライマーオリゴヌク
レオチドの濃度を決定することを特徴とするプライマー
オリゴヌクレオチドの適合方法。 - 【請求項２５】 該修飾工程では、該複数のプライマー
オリゴヌクレオチドを実質上同じ長さを有するように適
合させることを特徴とする請求項２４に記載の適合方
法。 - 【請求項２６】 該修飾工程では、該複数のプライマー
オリゴヌクレオチドを実質上同じ温度を有するように適
合させることを特徴とする請求項２４に記載の適合方
法。 - 【請求項２７】 核酸を含む試料内に存在する可能性が
あり、かつサルモネラ、シゲラ、カンピロバクター、エ
ルシニアおよび大腸菌種の微生物を含む複数の標的核酸
配列を同時かつ非優先的に増幅させる方法であって、 標的核酸配列の一本の鎖の一部と相補的である複数のプ
ライマーオリゴヌクレオチドを得、 ポリメラーゼ連鎖反応同時増幅の処理条件を選択し、 選択された処理条件下で各標的核酸配列について実質的
に同様な増幅効率が達成されるように選択された濃度
で、該試料を該複数のプライマーオリゴヌクレオチドと
混合し、 該混合物にポリメラーゼ連鎖反応増幅を行うことを特徴
とする標的核酸配列の増幅方法。 - 【請求項２８】 複数のプライマーオリゴヌクレオチド
を得る工程では、サルモネラ菌種の微生物からの標的核
酸配列の検出に用いるための配列ＩＤ番号：１および配
列ＩＤ番号：２を得ることを特徴とする請求項２７に記
載の増幅方法。 - 【請求項２９】 複数のプライマーオリゴヌクレオチド
を得る工程では、シゲラ菌種の微生物からの標的核酸配
列の検出に用いるための配列ＩＤ番号：３および配列Ｉ
Ｄ番号：４を得ることを特徴とする請求項２７に記載の
増幅方法。 - 【請求項３０】 複数のプライマーオリゴヌクレオチド
を得る工程では、カンピロバクター菌種の微生物の標的
核酸配列の検出に用いるための配列ＩＤ番号：５および
配列ＩＤ番号：６を得ることを特徴とする請求項２７に
記載の増幅方法。 - 【請求項３１】 複数のプライマーオリゴヌクレオチド
を得る工程では、エルシニア菌種の微生物の標的核酸配
列の検出に用いるための配列ＩＤ番号：７および配列Ｉ
Ｄ番号：８を得ることを特徴とする請求項２７に記載の
増幅方法。 - 【請求項３２】 複数のプライマーオリゴヌクレオチド
を得る工程では、大腸菌菌種の微生物の標的核酸配列の
検出に用いるための配列ＩＤ番号：９および配列ＩＤ番
号：１０を得ることを特徴とする請求項２７に記載の増
幅方法。 - 【請求項３３】 複数のプライマーオリゴヌクレオチド
を得る工程では、コントロールとしてのヒトβグロブリ
ンの標的核酸配列の検出に用いるための配列ＩＤ番号：
１１および配列ＩＤ番号：１２を得ることを特徴とする
請求項２７に記載の増幅方法。 - 【請求項３４】 処理条件を選択する工程では、アニー
リング温度を選択することを特徴とする請求項２７に記
載の増幅方法。 - 【請求項３５】 処理条件を選択する工程では、マグネ
シウム濃度を選択することを特徴とする請求項２７に記
載の増幅方法。 - 【請求項３６】 処理条件を選択する工程では、ポリメ
ラーゼ酵素および酵素濃度を選択することを特徴とする
請求項２７に記載の増幅方法。 - 【請求項３７】 複数のプライマーオリゴヌクレオチド
を得る工程では、各濃度が２００ｎｇの配列ＩＤ番号：
１および配列ＩＤ番号：２、各濃度が３０ｎｇの配列Ｉ
Ｄ番号：３および配列ＩＤ番号：４、各濃度が５０ｎｇ
の配列ＩＤ番号：５および配列ＩＤ番号：６、各濃度が
７５ｎｇの配列ＩＤ番号：７および配列ＩＤ番号：８、
各濃度が４０ｎｇの配列ＩＤ番号：９および配列ＩＤ番
号：１０を得ることを特徴とする請求項２７に記載の増
幅方法。 - 【請求項３８】 複数のプライマーオリゴヌクレオチド
を得る工程では、更に各濃度が５０ｎｇの配列ＩＤ番
号：１１および配列ＩＤ番号：１２を得ることを特徴と
する請求項２７に記載の増幅方法。 - 【請求項３９】 核酸を含む試料内に存在する可能性が
あり、かつサルモネラ、シゲラ、カンピロバクター、エ
ルシニアおよび大腸菌種の微生物を含む標的核酸配列を
同時かつ非優先的に増幅させ、該増幅した標的核酸配列
を検出する方法であって、 標的核酸配列の一本の鎖の一部と相補的である複数のプ
ライマーオリゴヌクレオチドを得、 ポリメラーゼ連鎖反応同時増幅のための処理条件を選択
し、 選択され処理条件下で実質的に同様な増幅効率が各標的
核酸配列について達成されるように選択された濃度で、
該試料を該複数のプライマーオリゴヌクレオチドと混合
し、 該混合物にポリメラーゼ連鎖反応増幅を行い、 増幅した標的核酸配列の存在を検出することを特徴とす
る標的核酸配列の検出方法。 - 【請求項４０】 複数のプライマーオリゴヌクレオチド
を得る工程では、配列ＩＤ番号：１から配列ＩＤ番号：
１２までからなる群から選択したオリゴヌクレオチド配
列を含むプライマーを得ることを特徴とする請求項３９
に記載の検出方法。 - 【請求項４１】 増幅した標的核酸配列の存在を検出す
る工程では、配列ＩＤ番号：１３から配列ＩＤ番号：１
８までからなる群から選択したオリゴヌクレオチド配列
を含むプローブを得ることを特徴とする請求項３９に記
載の検出方法。 - 【請求項４２】 サルモネラ菌種の微生物からの標的核
酸配列の検出に用いる組成物であって、該組成物が配列
ＩＤ番号：１および２を有することを特徴とする標的核
酸配列検出用組成物。 - 【請求項４３】 サルモネラ菌種の微生物からの標的核
酸配列の検出に用いる組成物であって、該組成物が配列
ＩＤ番号：１３を有することを特徴とする標的核酸配列
検出用組成物。 - 【請求項４４】 シゲラ菌種の微生物からの標的核酸配
列の検出に用いる組成物であって、該組成物が配列ＩＤ
番号：３および４を有することを特徴とする標的核酸配
列検出用組成物。 - 【請求項４５】 シゲラ菌種の微生物からの標的核酸配
列の検出に用いる組成物であって、該組成物が配列ＩＤ
番号：１４を有することを特徴とする標的核酸配列検出
用組成物。 - 【請求項４６】 カンピロバクター菌種の微生物からの
標的核酸配列の検出に用いる組成物であって、該組成物
が配列ＩＤ番号：５および６を有することを特徴とする
標的核酸配列検出用組成物。 - 【請求項４７】 カンピロバクター菌種の微生物からの
標的核酸配列の検出に用いる組成物であって、該組成物
が配列ＩＤ番号：１５を有することを特徴とする標的核
酸配列検出用組成物。 - 【請求項４８】 エルシニア菌種の微生物からの標的核
酸配列の検出に用いる組成物であって、該組成物が配列
ＩＤ番号：７および８を有することを特徴とする標的核
酸配列検出用組成物。 - 【請求項４９】 エルシニア菌種の微生物からの標的核
酸配列の検出に用いる組成物であって、該組成物が配列
ＩＤ番号：１６を有することを特徴とする標的核酸配列
検出用組成物。 - 【請求項５０】 大腸菌微生物からの標的核酸配列の検
出に用いる組成物であって、該組成物が配列ＩＤ番号：
９および１０を有することを特徴とする標的核酸配列検
出用組成物。 - 【請求項５１】 大腸菌微生物からの標的核酸配列の検
出に用いる組成物であって、該組成物が配列ＩＤ番号：
１７を有することを特徴とする標的核酸配列検出用組成
物。 - 【請求項５２】 ヒトβグロブリンからの標的核酸配列
の検出に用いる組成物であって、該組成物が配列ＩＤ番
号：１１および１２を有することを特徴とする標的核酸
配列検出用組成物。 - 【請求項５３】 ヒトβグロブリンからの標的核酸配列
の検出に用いる組成物であって、該組成物が配列ＩＤ番
号：１８を有することを特徴とする標的核酸配列検出用
組成物。 - 【請求項５４】 少なくとも一つの塩基が相違している
第一核酸配列と第二核酸配列との間のミスマッチを検出
する方法であって、 相補的な核酸配列にハイブリダイゼーションした際に、
プローブの検出を可能にする標識で標識されたオリゴヌ
クレオチド配列からなる少なくとも一つのプローブを
得、該オリゴヌクレオチド配列は、該プローブと該第二
核酸配列とのハイブリダイゼーションが該プローブと該
第一核酸配列とのハイブリダイゼーションに比べて弱く
なるように、少なくとも一つの中性塩基分子を有する以
外は、該第一核酸配列に完全に相補的であり、 該プローブと該第一および第二の核酸配列とをハイブリ
ダイゼーション条件下で混合し、 存在する可能性のある該プローブおよび該第二核酸配列
を含むハイブリッドの大部分を解離させ、 該プローブおよび該第一核酸配列を含むハイブリッドを
検出することを特徴とする核酸配列間ミスマッチの検出
方法。 - 【請求項５５】 試料内に存在する可能性のある大腸菌
株Ｏ１５７：Ｈ７微生物を検出する方法であって、 相補的な核酸配列にハイブリダイゼーションした際にプ
ローブの検出を可能にする標識で標識されたオリゴヌク
レオチド配列からなる少なくとも一つのプローブを得、
該相補的な核酸配列は該微生物に特異的な核酸配列の認
識に特異的であり、該オリゴヌクレオチド配列は配列Ｉ
Ｄ番号：２１から配列ＩＤ番号：３０までからなる群か
ら選択され、 該プローブと該試料とをハイブリダイゼーション条件下
で混合し、 該プローブおよび該相補的な核酸配列を含むハイブリッ
ドを検出することを特徴とする大腸菌株Ｏ１５７：Ｈ７
微生物の検出方法。 - 【請求項５６】 該オリゴヌクレオチド配列が配列ＩＤ
番号：２１であることを特徴とする請求項５４に記載の
検出方法。 - 【請求項５７】 大腸菌株Ｏ１５７：Ｈ７微生物の標的
核酸配列の検出に使用する組成物であって、該組成物が
配列ＩＤ番号：２１から配列ＩＤ番号：３０までからな
る群から選択されたオリゴヌクレオチド配列を有するこ
とを特徴とする標的核酸配列検出用組成物。 - 【請求項５８】 該組成物が配列ＩＤ番号：２１である
ことを特徴とする請求項５６に記載の組成物。 - 【請求項５９】 一つまたは複数の選択された標的核酸
配列を増幅させるための試料材料の処理に有用なキット
であって、該キットは抽出緩衝溶液を含み、該抽出緩衝
溶液は少なくとも一種の界面活性剤組成物および少なく
とも一種の塩組成物を含み、該塩組成物は１よりも大き
いモル濃度で存在することを特徴とする試料材料処理用
キット。 - 【請求項６０】 該抽出緩衝溶液がIgepalＣＡ６３０界
面活性剤１％、Tween ２０界面活性剤０．５％およびＮ
ａＣｌ２．０Ｍからなることを特徴とする請求項５９に
記載のキット。 - 【請求項６１】 核酸を含む試料中に存在する可能性の
ある複数の標的核酸配列を同時かつ非優先的に増幅させ
るのに有用なキットであって、該キットは複数のプライ
マーオリゴヌクレオチドを含み、各該プライマーオリゴ
ヌクレオチドは、標的核酸配列の一本の鎖の一部と相補
的であり、選択された処理条件下での増幅中に各標的核
酸配列について実質的に同様な増幅効率が達成されるよ
うな選択された濃度で存在していることを特徴とする標
的核酸配列増幅用キット。 - 【請求項６２】 試料材料中に含まれる一つまたは複数
の選択された標的核酸配列を増幅させるための試料材料
の処理のため、および該処理された試料中に存在する可
能性のある複数の標的核酸配列を同時かつ非優先的に増
幅させるための試料材料の処理に有用なキットであっ
て、 少なくとも一種の界面活性剤組成物および一種の塩組成
物を含み、該塩組成物が１モルより大きい濃度で存在す
る抽出緩衝溶液、および標的核酸配列の一本の鎖の一部
と相補的であり、選択された処理条件での増幅中に各標
的核酸配列について実質的に同様な増幅効率が達成され
るように選択された濃度で存在する複数のプライマーオ
リゴヌクレオチドを有することを特徴とする試料材料処
理用キット。 - 【請求項６３】 該抽出緩衝溶液がIgepalＣＡ６３０界
面活性剤１％、Tween ２０界面活性剤０．５％およびＮ
ａＣｌ２．０Ｍからなることを特徴とする請求項６２に
記載のキット。 - 【請求項６４】 核酸を含む試料中に存在する可能性が
あり、かつサルモネラ、シゲラ、カルピロバクター、エ
ルシニア、および大腸菌菌種の微生物を複数の標的核酸
配列を同時かつ非優先的に増幅させるのに有用なキット
であって、該キットは、複数のプライマーオリゴヌクレ
オチドを含み、各該プライマーオリゴヌクレオチドは、
標的核酸配列の一本の鎖の一部と相補的であり、選択さ
れた処理条件下の増幅中に各標的核酸配列について実質
的に同様な増幅効率が達成されるように選択された濃度
で存在することを特徴とする標的核酸配列増幅用キッ
ト。 - 【請求項６５】 さらに、配列ＩＤ番号：１から配列Ｉ
Ｄ番号：１２までからなる群から選択されたプライマー
オリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項６４
に記載のキット。 - 【請求項６６】 さらに、配列ＩＤ番号：１から配列Ｉ
Ｄ番号：１０までからなる群から選択されたプライマー
オリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項６４
に記載のキット。 - 【請求項６７】 さらに、配列ＩＤ番号：１１および配
列ＩＤ番号：１２からなる群から選択されたプライマー
オリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項６６
に記載のキット。 - 【請求項６８】 各濃度が２００ｎｇの配列ＩＤ番号：
１および配列ＩＤ番号：２、各濃度が３０ｎｇの配列Ｉ
Ｄ番号：３および配列ＩＤ番号：４、各濃度が５０ｎｇ
の配列ＩＤ番号：５および配列ＩＤ番号：６、各濃度が
７５ｎｇの配列ＩＤ番号：７および配列ＩＤ番号：８、
各濃度が４０ｎｇの配列ＩＤ番号：９および配列ＩＤ番
号：１０を有することを特徴とする請求項６６に記載の
キット。 - 【請求項６９】 さらに、各濃度が５０ｎｇの配列ＩＤ
番号：１１および配列ＩＤ番号：１２を有することを特
徴とする請求項６８に記載のキット。 - 【請求項７０】 核酸を含む試料中に存在する可能性が
あり、かつサルモネラ、シゲラ、カンピロバクター、エ
ルシニア、および大腸菌種の微生物を含む複数の標的核
酸配列の同時かつ非優先的な増幅、および該増幅された
標的核酸配列の検出に有用なキットであって、 標的核酸配列の一本の一部と相補的であり、選択された
処理条件下での増幅中に、実質的に同様な増幅効率が各
標的核酸配列について達成されるように選択された濃度
で存在する複数のプライマーオリゴヌクレオチド、およ
び標的核酸配列の一本の鎖の一部と相補的である複数の
プローブオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする標
的核酸配列増幅・検出用キット。 - 【請求項７１】 複数のプライマーオリゴヌクレオチド
が、配列ＩＤ番号：１から配列ＩＤ番号：１２までから
なる群から選択されたオリゴヌクレオチド配列を有する
ことを特徴とする請求項７０に記載のキット。 - 【請求項７２】 複数のプライマーオリゴヌクレオチド
が、配列ＩＤ番号：１３から配列ＩＤ番号：１８までか
らなる群から選択されたオリゴヌクレオチド配列を有す
ることを特徴とする請求項７１に記載のキット。 - 【請求項７３】 少なくとも一つの塩基が相違している
第一核酸配列と第二核酸配列との間のミスマッチの検出
に有用なキットであって、該キットは、相補的な核酸配
列にハイブリダイゼーションした際に、プローブの検出
を可能にする標識で標識されたオリゴヌクレオチド配列
からなる少なくとも一つのプローブを含み、該オリゴヌ
クレオチド配列は、少なくとも一つの中性塩基分子を有
する以外は、該第一核酸配列に完全に相補的であること
を特徴とする核酸配列間ミスマッチ検出用キット。 - 【請求項７４】 試料内に存在する可能性のある大腸菌
株Ｏ１５７：Ｈ７微生物の検出に有用なキットであっ
て、該キットは相補的な核酸配列にハイブリダイゼーシ
ョンした際に、プローブの検出を可能にする標識で標識
されたオリゴヌクレオチド配列からなる少なくとも一つ
のプローブを含み、該相補的核酸配列は該微生物に特異
的な核酸配列を認識することに特異的であり、該オリゴ
ヌクレオチド配列は配列ＩＤ番号：２１から配列ＩＤ番
号：３０までからなる群から選択されていることを特徴
とする大腸菌株Ｏ１５７：Ｈ７微生物検出用キット。 - 【請求項７５】 該オリゴヌクレオチド配列が配列ＩＤ
番号：２１であることを特徴とする請求項７４に記載の
キット。
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