JPH09322763A - 細胞壁溶解酵素、その製法及び用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 オーレオバシディウム プルランスの細胞壁
を溶解する酵素、この酵素の製造法及びこの酵素を有効
成分とする除黴剤の提供。 【解決手段】 土壌から分離されたストレプトマイセス
sp TM502 株。この放線菌を好気的に培養して培地中に
該酵素を産生せしめ、培養液から該酵素を回収する細胞
壁溶解酵素の製造方法及びこの細胞壁溶解酵素を有効成
分として含有する除黴剤及びこのようにして得られた細
胞壁溶解酵素除黴剤を使用して居住間で発生した黒黴を
除黴する方法。該除黴剤には粘着性物質を併用してもよ
い。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、オーレオバシディ
ウム プルランス(Aureobasidium pullulans)の細胞壁
の溶解活性 (以下、細胞壁溶解を溶菌ということもあ
る) を示す、新規な微生物及びその産生する細胞壁溶解
酵素、その製造法及びその微生物及び酵素の用途に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】細胞壁溶解酵素は、微生物細胞壁の構造
の生理機能の解析、細胞融合などによる優良株の育種な
どの研究に必要なプロトプラストの調製等に用いられる
酵素である。またこの酵素は、実用面においては食品、
医薬品における殺菌、あるいは微生物細胞内に存在する
有効成分の抽出などの幅広い範囲での応用が考えられ
る。一方、オーレオバシディウム プルランスは我々の
住環境でよく見られる黒色の菌であり、若いうちは乳白
色であるが、次第に黒色となり毛ばってくる、いわゆる
カビと酵母の中間に位置するものと考えられている。

【０００３】モルタル、コンクリート、タイルの目地、
シャワーカーテン、ビニールクロス、冷蔵庫のパッキン
などが黒く汚れるのはこの菌のためであるといわれてい
る。またプラスチックなども変質劣化させることから、
合成高分子材料の成形品、組立品チューブ、シートフィ
ルム製品のカビに対する抵抗性試験の試験菌に制定され
ている。更にエチルアルコールを好んで生育することか
ら醤油、味噌、清酒などの醸造工場で良く生育する性質
があり、この菌が、大気中に蔓延し周辺の住宅の瓦や軒
あるいはブロック塀や庭木等が黒く汚れることもある。
この菌に汚染された壁、瓦、軒の洗浄には一般に次亜塩
素酸ナトリウムなどの化学薬剤による洗浄、除菌が行わ
れているが、特に次亜塩素酸ナトリウムは特異な塩素臭
を発生するだけでなく、目や口腔部等の粘膜や皮膚を強
く刺激する。食品加工工場や醸造工場等においては、作
業環境の観点から高濃度の次亜塩素酸ナトリウムを含有
する除黴剤の使用を余儀なくされている。又近年、住居
の密閉性が向上するに従い、換気不十分な場所、特にマ
ンションの壁面等での結露により黴の発生が問題視され
ている。汚染菌としてはアスペルギルス属、クラドスポ
リウム属、フォーマ属などの黴が知られているが、この
事は単に美観を損なうだけでなく、住居構造体、家具等
の劣化を伴い、健康面での人体の影響も問題視されてい
る。居間以上に湿気の滞留する場所である浴室などで
は、上述の次亜塩素酸ナトリウム及び界面活性剤を主成
分とする除黴剤（黴取り剤）が効果的で、比較的安価に
市販されている。しかしながら、水で洗い流せず、又生
活時間の長い居住区内でのこのような薬剤の使用は、健
康面を配慮すると制限される。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、このよ
うな事情に鑑み、新規で有用な細胞壁溶解酵素を得るべ
く検討したところストレプトマイセス属(Streptomyces
sp.) に属する放線菌、特に本発明者等の見出したスト
レプトマイセス sp TM 502株が高い細胞壁溶解活性をも
つ酵素を産生することを見出した。また、この細胞壁溶
解酵素がオーレオバシディウム プルランスの細胞壁に
速早く作用し、この菌を効率よく除去しうることを見出
し、これを除黴剤として使用したところきわめて優れた
除黴効果があることを見出した。本発明は、これらの知
見に基づいてなされたものである。

【０００５】従って、本発明は、新規で活性の優れた細
胞壁溶解酵素及びその製造法を提供することを課題とす
る。また、本発明は、このような活性の優れた細胞壁溶
解酵素を産生することのできる微生物を提供することを
課題とする。さらに、本発明は、このような細胞壁溶解
酵素を有効成分とする除黴剤及びその使用方法を提供す
ることを課題とする。

【０００６】特に本発明者らは、より安全に且つ環境汚
染の伴わない、又人体に対して安全性の極めて高いオー
レオバシディウム プルランスの洗浄、除菌方法の確立
を目的として、鋭意研究を重ねた結果、微生物の生産す
るオーレオバシディウム プルランス細胞壁溶解酵素を
用いることにより、高い洗浄、除菌効果が認められた。
この細胞壁溶解酵素は、住居内に発生する黴にも除黴効
果が認められた。又該オーレオバシディウム プルラン
ス細胞壁溶解酵素含有液に天然ゴム等の粘着性物質を添
加することによりその除黴作用が増大することを見出し
本発明を完成するに至った。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、このような課
題を解決するためになされたものであって、ストレプト
マイセス属の放線菌から産生され、オーレオバシディウ
ム プルランスの細胞壁を溶解することのできる細胞壁
溶解酵素に関する。本発明の細胞壁溶解酵素は、ストレ
プトマイセス属に属し、オーレオバシディウム プルラ
ンスの細胞壁溶解能のある放線菌を培地に好気的に培養
し、培養上澄液に硫酸アンモニウムを約80％飽和になる
ように加えて沈澱せしめ、この沈澱から硫酸アンモニウ
ムを除くことによって得ることができる。

【０００８】この酵素は、次のような酵素化学的性質を
もつ。 1) 次の酵素活性を示す:プロテアーゼ活性、β-1, 3-
グルカナーゼ活性、キチナーゼ活性、アミラーゼ活性、
β-N- アセチルグルコサミニダーゼ活性、セルラーゼ活
性。 2) 至適 pH: pH5〜6 3) 安定 pH: pH4〜9 4) 至適温度: 50℃ 5) 安定温度: 45℃まで安定。70℃、10分間の加熱で完
全に失活する。 6) 阻害剤: 1 mMの硫酸第一鉄、塩化水銀、塩化第二鉄
により活性が阻害される。 7) 還元剤: 1 mMの2-メルカプトエタノール (還元剤)
に対し安定である。 8) 糸状菌体及び酵母菌体を溶解する。 本発明における酵素は、純粋な酵素ばかりではなく粗酵
素をも含むものである。

【０００９】また、本発明は、ストレプトマイセス属に
属し、オーレオバシディウム プルランスの細胞壁溶解
能のある細胞壁溶解酵素を産生することのできる放線菌
を培地中で好気的に培養して細胞壁溶解酵素を産生せし
め、培養液からこの細胞壁溶解酵素を回収することより
なる細胞壁溶解酵素の製造法に関する。本発明におい
て、前記放線菌培養のさい、オーレオバシディウム プ
ルランスの菌体を誘導基質として培地に添加することが
好ましい。

【００１０】さらに、本発明はオーレオバシディウム
プルランスの細胞壁溶解能のある細胞壁溶解酵素を産生
することのできるストレプトマイセス属に属する放線菌
に関する。このような放線菌には、本発明者らによって
鳥取県鳥取市の土壌から見出された、ストレプトマイセ
ス(Streptomyces) sp TM 502株(FERM P-15627)またはそ
の変異株がある。従って、本発明は、ストレプトマイセ
スsp TM 502 株(FERMP-15627)またはその変異株に関す
る。本発明における変異株には物理化学的に変異誘発さ
れた菌株や遺伝子組換えにより育種された菌株が包含さ
れる。

【００１１】さらに本発明は、上記の放線菌または細胞
壁溶解酵素を有効成分とする除黴剤及びそれを用いる除
黴方法に関する。本発明の除黴剤には、粘着性物質を併
用して配合し、その除黴効果を高めてもよい。

【００１２】

【発明の実施の形態】本発明のストレプトマイセス属に
属し、オーレオバシディウム プルランスの細胞壁を溶
解することのできる細胞壁溶解酵素を産生する放線菌、
特にストレプトマイセスsp TM 502 株は、本発明者らに
よって、鳥取県鳥取市の土壌からオーレオバシディウム
プルランス菌体を唯一の栄養源とした平板寒天培地で
強い溶菌ハローを形成する菌として分離された。このス
トレプトマイセス sp TM 502株は、平成８年５月16日に
工業技術院生命工学技術研究所に、受託番号 FERM P-15
627 として寄託されている (以下、本菌を TM 502 株と
いう) 。

【００１３】次に TM502株の性質を述べる。 (a) 形 態 胞子形成菌糸の分枝法は単純分枝であるが、疑似輪生糸
を形成する。形態はかぎ状〜環状〜不完全な螺旋状であ
る。胞子は10個以上螺旋状に連鎖し、表面は平滑で楕円
状、大きさは 1.1〜1.3 ×1.1〜2.2 μm 程度。鞭毛胞
子胞子嚢、菌核、分生子殻、不定型の粘塊は形成しな
い。基生菌糸は分裂しない。

【００１４】(b) 各培地における生育状態は表１に示さ
れるとおりである。

【００１５】

【表１】 ──────────────────────────────────── 培 地 生 育 集落表面の菌叢色 可溶性色素 ──────────────────────────────────── イースト−麦芽 良 好 茶褐色 生産せず オートミール 弱 い 茶褐色 生産せず スターチ−無機塩 良 好 褐 色 生産せず グリセリンーアスパラギン 中程度 白 色 生産せず チロシン 中程度 褐 色 生産せず シュークロース−硝酸塩 貧 弱 茶褐色 生産せず グルコース−アスパラギン 弱 い 茶褐色 生産せず 栄 養 弱 い 白 色 生産せず ────────────────────────────────────

【００１６】(c) 生理的性質 生育温度範囲 15〜37℃ ゼラチン液化性 ＋ スターチの加水分解 ＋ 脱脂牛乳の凝固 − 脱脂牛乳のペプトン化 ＋ メラニン様色素の生成 − （＋は前記生理活性を有することを、−は有さないこと
をそれぞれ示す。）

【００１７】(d) 各炭素源の資化性 Ｌ−アラビノース ＋＋ Ｄ−キシロース ＋＋ Ｄ−グルコース ＋＋ Ｄ−フラクトース ＋ シュークロース ± イノシトール ± Ｌ−ラムノース ± ラフィノース ± Ｄ−マンニット ＋＋ （＋＋は資化性が非常に高いことを、＋は資化性を有す
ることを、±はどちらともいえないことをそれぞれ示
す。）

【００１８】(e) 細胞壁 Hasegawaらの開発した簡易法（J. Gen. Appl. Microbio
l., 29, 319 (1983)）により全菌体のジアミノピメリン
酸の有無とその異性体、糖組成の測定を行ったところ、
細胞壁タイプＩ、全菌体糖タイプは特徴なしであった。

【００１９】(a)〜(e) の結果から本発明の微生物はバ
ージェイズ．マニュアル．オブ．システマティック．バ
クテリオロジー第４版によってストレプトマイセス属に
属する株と同定された。本菌株は、ストレプトマイセス
sp TM502 株と命名され、FERM P-15627として工業技術
院生命工学工業技術研究所に寄託されている。

【００２０】本発明の細胞壁溶解酵素は、前記放線菌、
特に TM502株から次のようにして得ることができる。ま
ず、TM502 株を酵素生産用培地（例えば、オーレオバシ
ディウム プルランス菌体0.5 ％、酵母エキス 0.5％、
リン酸１カリウム 0.1％、硫酸マグネシウム0.05％から
なる pH7.1の液体培地) を用い、振とう培養又は通気攪
拌培養等の好気培養を行なう。ここでオーレオバシディ
ウム プルランス菌体は誘導基質として用いられ、この
菌体は、生菌体もしくは死菌体であってもよい。またオ
ーレオバシディウム プルランス以外のカビ、酵母菌体
を培地に添加しても活性が得られる。なおTM 502株はか
かる誘導基質を培地に添加しなくても細胞壁溶解酵素を
培地に分泌しうるが、誘導基質を添加した培地での培養
が酵素活性の上昇の点から好ましく、オーレオバシディ
ウム プルランス菌体が誘導基質として特に好ましい。
また例えば、細胞壁溶解酵素の分泌生産を増大させるよ
うに、TM 502株に変異処理又は遺伝子組換えを施しても
よい。

【００２１】上記のごとくし得られた培養液から、遠心
分離又は濾過等公知の方法により上清を分離しこの上清
を、排除分子量5000又は 10000の濾過膜を用いた限外濾
過膜又は硫安により濃縮し、或いは濃縮せずに、凍結乾
燥等の公知の乾燥方法を用いて乾燥粉末とし、酵素標品
とすることができる。また乾燥前に濃縮液を透析しても
よい。このようにして得られた酵素標品は、乾燥粉末状
態であれば低温で長期保存に耐える。また、乾燥粉末と
しなくても酵素の使用には何ら支障をきたさない。よっ
て、本発明の細胞壁溶解酵素は、乾燥粉末又は濃縮液の
いずれの形態であってもよい。また、本発明では、この
ようにして得られる酵素を酵素精製に用いられる通常の
手段でさらに精製してもよい。

【００２２】本発明の細胞壁溶解酵素の製造法をさらに
具体的に述べると次のとおりである。本発明の細胞壁溶
解酵素の製造方法においては、通常表2 に示した培地に
最初オーレオバシディウム プルランスを植菌し30℃で
96時間培養する。ついで予め24時間前培養したストレプ
トマイセスsp TM502株を先のオーレオバシディウムプル
ランスを生育させた培地に接種し培養温度は20〜37℃、
好ましくは25〜30℃、培養時間は48〜168 時間、好まし
くは96〜120 時間培養を行う。培養液は遠心分離、濾過
などにより除菌した後、限外濾過或いは透析により脱塩
処理を行い凍結乾燥して酵素粉末を得る。また、凍結乾
燥に代えて噴霧乾燥等をその活性が損なわれない限り用
いることができる。この状態では粗酵素であるので、さ
らに塩析、イオン交換体などで適宜精製して用いること
も可能である。このようにして得られた細胞壁溶解酵素
の酵素化学的性質は前記したとおりである。

【００２３】

【表２】 ────────────────── 成 分 使用量 ────────────────── グルコース 20.0ｇ 酵母エキス 5.0 ポリペプトン 2.0 燐酸１カリウム 1.0 硫酸マグネシウム 0.5 水 道 水 1000ml （pH 7.1) ──────────────────

【００２４】溶菌酵素活性の測定は、次の方法により行
った。予め表２の組成の培地で30℃、14日間静置培養し
たオーレオバシディウム プルランス菌体を遠心分離に
より集菌し10000rpm、５分間ホモゲナイズし、遠心、生
理食塩水で洗浄した菌体を酵素測定用基質とした。上記
の方法で調製した菌体を20mM酢酸緩衝液 (pH 5.5) 1.0m
l に懸濁させ、この基質細胞懸濁液に粗酵素液0.5ml、2
0mM酢酸緩衝液 (pH 5.5) 1.5ml を加え37℃で反応さ
せ、濁度の減少を610nmで測定した。初発 (対照) の 61
0nmにおける吸光度は 1.0から 1.1とした。被試験菌懸
濁液の初発濁度を30分間で１％減少させる活性を１単位
とした。

【００２５】本発明の細胞壁溶解酵素は、プロテアーゼ
活性、β-1, 3 グルカナーゼ活性、キチナーゼ活性、セ
ルラーゼ活性、アミラーゼ活性、β-N- アセチルグルコ
サミニダーゼ活性を含有しているため、オーレオバシデ
ィウム プルランスのみならず、カビ、酵母等の細胞壁
に対して顕著な溶解作用を示す。従って、本発明の細胞
壁溶解酵素は、オーレオバシディウム プルランス細胞
壁を溶解して除菌することのみならず、各種カビ、酵母
のプロトプラストの調製にも使用することが出来産業上
ならびに研究上の利用性が極めて高い。

【００２６】また、本発明においてこのような微生物あ
るいは微生物の産生する酵素を除黴剤の有効成分として
使用する場合は、この微生物または酵素の濃度は通常
0.1から10％、好ましくは 0.5から２％である。このよ
うな微生物またはオーレオバシディウム プルランス細
胞壁溶解酵素に粘着性物質を併用して配合してもよい。
この酵素に併用される粘着性物質には、食品の増粘剤と
して用いられているキサンタンガム、アラビアゴム、グ
アーガムなどがある。粘着性物質の添加濃度は0.05％〜
２％、好ましくは 0.1％〜１％である。粘着性物質を含
む放線菌またはその産生する細胞壁溶解酵素液には所望
により常套の添加剤、例えば界面活性剤（アニオン系界
面活性剤、ノニオン系界面活性剤、カチオン系界面活性
剤、両性界面活性剤）、殺菌剤、除黴剤等を適宜添加し
てもよい。粘着性物質を含む細胞壁溶解酵素液のpHは通
常４〜９、好ましくは５〜７である。本発明を実施する
場合には、被除黴処理面へ粘着性物質含有細胞壁溶解酵
素液を塗布、散布又は噴霧した後、 0.5〜５時間好まし
くは１〜３時間放置し酵素反応を行った後、水洗の後処
理を行なうことが望ましい。

【００２７】次に実施例により本発明を具体的に説明す
るが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。

【実施例１】 （ストレプトマイセス spTM502株の単離及び性質）鳥取
県鳥取市の土壌及び腐葉土からオーレオバシディウム
プルランス細胞壁溶解酵素生産菌のスクリーニングを行
い、その中で最もこの細胞壁溶解活性が高く、カビ、酵
母をも溶菌する溶菌スペクトルの広い放線菌ストレプト
マイセス属に属する一菌株を選抜し、TM502 株と命名し
た。この菌株は、前記した性質を有していた。また工業
技術院生命工学技術研究所に、受託番号FERM P-15627と
して寄託されている。

【００２８】

【実施例２】 （酵素の調製法）表２に示した液体培地にオーレオバシ
ディウム プルランスを植菌して30℃で72時間振とう培
養を行った。予め30℃で48時間培養したストレプトマイ
セス spTM502株を前記オーレオバシディウム プルラン
スの生育した培地に植菌した。30℃で 120時間培養した
培養液を遠心分離により除菌した（この酵素液は本発明
のオーレオバシディウム プルランス細胞壁溶解酵素と
して使用出来る）。以下の操作は全て４℃以下で行っ
た。得られた培養上澄液に対して固形硫酸アンモニウム
を80％飽和になるように加え一晩放置した。生成した沈
殿を遠心分離により集め水に対して一晩透析を行い、不
要物を遠心分離により除き得られた上澄液を凍結乾燥を
行い酵素粉末とした。収率は１L の培養液から 0.5〜0.
6gであった。特に示さない限り、溶菌反応は酵素の終濃
度が0.05％となるようにして活性を測定した（以下、本
発明の酵素を本酵素という）。

【００２９】（１）本酵素の細胞壁溶解活性の至適pH及
び安定pH 溶菌活性の測定に用いる緩衝液のpHを変え、その他は全
て同様にして活性を測定したところ、本酵素の至適pHは
5.5〜6.5 付近であった。又pH安定性を調べるため、各
pHの緩衝液 0.5mlに 1.8％の酵素水溶液を0.25ml加えて
５℃で24時間静置した後、それぞれの酵素液を20mM酢酸
緩衝液 (pH 5.5) で２倍に希釈し、このうち 0.5mlを酵
素液として溶菌活性を測定したところ、酵素はpH 5〜10
で安定であった。なお、ここで使用した緩衝液は、20mM
の酢酸緩衝液 (pH４〜６）、リン酸緩衝液（pH６〜
７）、トリス塩酸緩衝液（pH７〜9.5)、グリシン−水酸
化ナトリウム緩衝液（pH９〜13）である。

【００３０】（２）本酵素の溶菌活性の至適温度及び熱
安定性 前述の溶菌反応（pH5.5)を20〜80℃の各温度で行い、活
性を測定したところ、至適温度は50℃付近であった。ま
た、20mM酢酸緩衝液 (pH5.5)に溶解させた酵素溶液を20
〜80℃の各温度で10、30分間それぞれ処理した後、溶菌
活性を前述の方法で測定したところ、45℃までは安定で
あるが70℃、10分間の処理で完全に失活した。

【００３１】（３）本酵素の溶菌活性への金属塩、還元
剤の影響 溶菌反応液中に金属塩、還元剤を添加し活性を測定し
た。この結果、本酵素の溶菌活性は鉄、水銀により阻害
を受けるが還元剤であるL-システイン、2-メルカプトエ
タノールに対して安定である。

【００３２】（４）本酵素の基質特異性 溶解反応のメカニズムを解明するため、種々の酵素活性
測定を行ったところ、表３に示すように本酵素は、プロ
テアーゼ、β1, 3- グルカナーゼ、キチナーゼ、β-N-
アセチルグルコサミニダーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ
の各種酵素活性を有していた。以上の結果から、各種酵
素活性が溶菌反応に複合的に作用していることが示唆さ
れる。このことで本酵素が広い溶菌スペクトルを有して
いることが理解できる。又プロテアーゼ活性はアルカリ
側でより高い活性を示した。

【００３３】

【表３】 ──────────────────────────────── 酵素名 基 質 活性値 ──────────────────────────────── プロテアーゼ カゼイン 20.541 β-1, 3-グルカナーゼ ラミナリン 0.161 キチナーゼ コロイダルキチン 0.225 アミラーゼ 可溶性デンプン 0.274 セルラーゼ 粉末セルロース 0.027 β-N- グルコサミニダーゼ p-ニトロフェニル− 0.084 2-アセトアミド-2 デオキシ−β−グルタ ピラノシド ────────────────────────────────

【００３４】（５）本酵素の溶菌スペクトル 酵素の溶菌スペトクルを市販品の酵素８種と比較した結
果を表４に示す。本発明の酵素は市販品の酵素と比較し
て糸状菌、酵母に対して広い溶菌スペクトルを示した。
基質となる微生物の調製法は次のとおりである。酵母と
してオーレオバシディウム プルランス、サッカロミセ
ス セレビシエ、シゾサッカロミセスポンベ、ハンゼヌ
ラ アノマラ、ロドトルラ ルペラ、糸状菌としては、
アスペルギルス ニガー、フォーマ sp、ペニシリウム
クリソゲナム、クラドスポリウム spを用いて酵母の
場合は振とう培養した培養液から集菌し、滅菌水で数回
洗った後少量の滅菌水に懸濁し、糸状菌の場合は振とう
培養した培養液から集菌した後ホモジナイザーにかけて
菌体を破砕し、菌体破砕片を酵母と同様に処理したもの
を基質として使用した。また、市販品の酵素としては、
ザイモリエイス100T（生化学工業）、ノボザイム234(ノ
ボ バイオラボ）、ファンガーゼ（ナガセ生化学工
業）、ウスキザイム（協和発酵）、キチナーゼ（生化学
工業）、セルラーゼ（和光純薬）、ドリセラーゼ（協和
発酵）、キトサナーゼ（和光純薬）を用いた。溶菌活性
は、細胞懸濁液の濁度減少と見なし、次の方法で濁度減
少率を測定した。各種微生物細胞懸濁液の初発の濁度を
１から 1.1に調整し酵素濃度は0.05％になるように20mM
酢酸緩衝液 (pH5.5)で調整し反応溶液の濁度を測定し
た。コントロールとして酵素液の代わりに20mM酢酸緩衝
液を加えたものの濁度も同様に測定した。溶解率は下式
により求めた。

【００３５】

【数１】溶解率（％）＝〔（do−dt) − (Do−Dt) 〕／
do ×100

【００３６】do＝ｏ時間後の反応液の濁度 dt＝ｔ時間後の反応液の濁度 Do＝ｏ時間後のコントロールの濁度 Dt＝ｔ時間後のコントロールの濁度

【００３７】

【表４】

【００３８】（６）その他の性質 実施例２で培養した培養上清（酵素液）と、キチン分解
能を有する微生物の培養上清を併用することにより、溶
菌活性は上昇し、特に糸状菌に対して顕著に認められ溶
菌活性は約２倍に増大した。

【００３９】

【実施例３】オーレオバシディウム プルランスを、グ
ルコース 2.0％、酵母エキス 0.5％、燐酸１カリウム
0.1％及び硫酸マグネシウム0.05％から成る液体培地に
植菌し30℃で72時間培養を行った。ついで予め前培養を
行ったストレプトマイセスsp TM 502 株を上記のオーレ
オバシディウム プルランスの生育した培地に植菌し、
30℃で 120時間培養を継続した。培養液を遠心分離を行
うことにより上澄液を得、固形硫酸アンモニウムを80％
飽和となるよう添加し一晩放置した。得られた沈殿を遠
心分離により集め、緩衝液又は純水に溶解し透析した
後、凍結乾燥を行いオーレオバシディウム プルランス
細胞壁溶解酵素を得た。収率は、１Ｌの培養液から 0.5
〜0.6gであった。 (1) 得られたオーレオバシディウム プルランス細胞
壁溶解酵素(502エンザイム) １％を酢酸緩衝液(pH5.5)
に溶解して除黴剤(A) を調製した。また、比較として各
種の市販酵素剤１％を酢酸緩衝液（pH6.0)に溶解して除
黴剤を調製し、対照とした。さらに 1.0％次亜塩素酸ナ
トリウムを除黴剤として用いた。 (2) また、同様に得られたオーレオバシディウム プ
ルランス細胞壁溶解酵素を１％、増粘剤としてキサンタ
ンガムを 0.5％、及び両性界面活性剤 アンフォレック
スＬＢ−２（ミヨシ油脂株式会社製）を 0.5％となるよ
うに酢酸緩衝液（pH5.5)に溶解し除黴剤(B) を調製し
た。また、比較として各種市販酵素剤１％ (pH5.5 酢酸
緩衝液）にキサンタンガム 0.5％、両性界面活性剤 0.5
％添加したもの、及び 1.0％次亜塩素酸ナトリウムを用
いた。予めオーレオバシディウム プルランスを接種し
培養を行ったガラス板、又は素焼き板をテストプレート
として用い、上記の方法で調整した除黴剤(A) 及び(B)
を塗布し１時間反応を行った後水洗し、除黴率を測定し
た。結果を表５及び表６に示す。表５及び表６に示すよ
うに、ストレプトマイセスsp TM 502 株の生産する溶解
酵素で処理することにより、オーレオバシディウム プ
ルランスは容易に除黴されることが分かる。更に次亜塩
素酸ナトリウムなどの化学薬剤処理で必ず伴う刺激臭の
発生も起こらず、健康面での人体に対する影響も問題と
ならないなどの有利な点も備えている。

【００４０】なお、除黴率は次の方法で算出した。上述
の液体培地で培養したオーレオバシディウム プルラン
スを接種したガラス板、素焼き板に30℃で14日間培養す
ることによって調製したテストプレートに、前記配合処
方によって調製した酵素処理液を塗布し、１時間反応さ
せた後水洗を行った。除黴効果を次式によって除黴率と
して求めた。

【００４１】

【数２】除黴率（％）＝（RW-RS)／(RO-RS) ×100 （式中、ＲＯは黴を接種する前のガラス板、素焼き板な
どのテストプレートの反射率、ＲＳは除黴剤を用いて処
理する前のテストプレートの反射率、及びＲＷは除黴剤
を用いて処理した後のテストプレートの反射率をそれぞ
れ示す。） また、反射率は測色素コンピューターＳＺ−Σ８０（日
本電色工業株式会社製）を用いて測定した。

【００４２】

【表５】

【００４３】

【表６】

【００４４】

【実施例４】 （除黴効果）実施例３で得られた除黴剤(A) 及び(B) を
用いて生活環境汚染黴に対する除黴効果を検討した。居
住環境を汚染する黴としては、フォーマ属、クラドスポ
リウム属、アスペルギルス属黴を用いて行った。結果を
表７及び表８に示す。これらの表に示すように、ストレ
プトマイセス sp TM 502株の生産するオーレオバシディ
ウム プルランス細胞壁溶解酵素は、生活環境汚染黴に
対しても優れた除黴効果を示し、化学薬剤を使用した時
に伴う刺激臭発生の問題もなく、又成分が蛋白質及び糖
類であることから水で洗い流すことが出来、又易分解性
であることから環境に対しても非常に安全であることが
分かる。

【００４５】

【表７】

【００４６】

【表８】

【００４７】

【実施例５】次の組成の培地１〜５に、予め前培養を行
なったストレプトマイセス sp TM 502株を接種し、30℃
で 120時間振とう培養し、遠心分離してストレプトマイ
セスSP TM 502株を除き、培養上澄液の溶菌酵素活性を
測定した。その結果を、表９に示す。表９にみられるよ
うにオーレオバシディウム プルランス菌体を添加して
培養する (培地4)と培養上澄の溶菌酵素活性は無添加
(培地1)のそれにくらべて約４倍高められた。 （培地の組成） 培地１：グルコース 2.0％、酵母エキス 0.5％、燐酸１
カリウム 0.1％、硫酸マグネシウム0.05％(pH7.1) 培地２：グルコース 1.0％、肉エキス 1.0％、ポリペプ
トン 1.0％、食塩 0.3％(pH7.1) 培地３：ラミナリン 0.5％、酵母エキス 0.5％、ポリペ
プトン 0.3％、燐酸１カリウム 0.1％、硫酸マグネシウ
ム0.05％(pH7.1) 培地４：オーレオバシディウム プルランス菌体 0.5
％、酵母エキス 0.5％、燐酸１カリウム 0.1％、硫酸マ
グネシウム0.05％(pH7.1) 培地５：アスペルギルス ニガー菌体 0.5％、酵母エキ
ス 0.5％、燐酸１カリウム 0.1％、硫酸マグネシウム0.
05％、(pH7.1)

【００４８】

【表９】 ───────────────────── 培地 溶菌酵素活性(unit/ml) ───────────────────── 培地 １ 10.3 培地 ２ 15.2 培地 ３ 22.8 培地 ４ 41.5 培地 ５ 35.1 ─────────────────────

【００４９】

【実施例６】オーレオバシディウム プルランスをグル
コース 2.0％、酵母エキス 0.5％、燐酸１カリウム 0.1
％、及び硫酸マグネシウム0.05％からなる液体培地に植
菌し30℃で72時間培養を行った。次いで、予め前培養を
行ったストレプトマイセスspTM 502 株を上記のオーレ
オバシディウム プルランスの生育した培地に植菌し、
30℃で120 時間培養を継続した。培養液を遠心分離を行
うことによりストレプトマイセスsp TM 502 株の菌体を
獲得した。得られた菌体は、生理食塩水での洗浄を繰り
返し行い、夾雑物を除去した。 (1) 得られたストレプトマイセスsp TM 502 株の培養
菌体(0.5％) を純水に懸濁し除黴剤(C) を調製した。又
比較は純水のみとした（対照(A))。また、 (2) 同様に
得られたストレプトマイセスsp TM 502 株の培養菌体
(0.5％) を水に懸濁し増粘剤としてキサンタンガムを0.
5 ％、及び両面界面活性剤アンフォレックスＬＢ−２
（ミヨシ油脂株式会社製）を0.5 ％となるように酢酸緩
衝液に溶解し除黴剤(D) を調製した。また、比較として
純水にキサンタンガム0.5％、両面界面活性剤0.5 ％添
加したものを用いた（対照(B))。

【００５０】予めオーレオバシティウム プルランスを
接種し培養を行ったガラス板、又は素焼き板をテストプ
レートとして用い、上記の方法で調製した除黴剤(C) 及
び(D) を塗布し20時間反応を行った後水洗した。水洗
後、テストプレートの一定面積中に存在するオーレオバ
シディウム プルランスの菌体を顕微鏡下で計測し、除
黴率を算出した。結果を表10に示す。表10に示すよう
に、ストレプトマイセスspTM 502 株の培養菌体を用い
て処理することにより、オーレオバシディウム プルラ
ンスは容易に除黴されることが判る。

【００５１】なお除黴率は次の方法で算出した。上述の
液体培地で培養したオーレオバシディウム プルランス
を接種したガラス板、素焼き板に30℃で14日間培養する
ことによって調製したテストプレートに、前記配合処方
によって調製した菌体処理液を塗布し、20時間反応させ
た後水洗を行った。除黴効果を次式によって除黴率とし
て求めた。 除黴率 (％) ＝（ＡＳ−ＡＷ）／ＡＳ×100 （式中、ＡＳは除黴剤を用いて処理する前のガラス板、
素焼き板などのテストプレートのオーレオバシディウム
プルランスの菌体数、ＡＷは除黴剤を用いて処理した
後の菌体数をそれぞれ示す。）

【００５２】

【表１０】

【００５３】

【発明の効果】本発明によれば、酵母、糸状菌に対して
広い溶菌スペクトルを有し、特にオーレオバシディウム
プルランス細胞壁に対して高い溶菌活性を示す細胞壁
溶解酵素を提供することができる。この酵素は微生物の
細胞壁構造の研究やプロトプラスト化、細胞融合をはじ
めとして食品、医薬品、洗剤等に広く応用可能である。
特に、オーレオバシディウム プルランス細胞壁を特異
的に溶解する性質を利用して醸造工場周辺のオーレオバ
シディウム プルランスの除黴や居住環境を汚染する黴
の除黴を安全かつ効率的に行なうことができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 9/42 Ｃ１２Ｎ 9/42 9/52 9/52 //(Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｎ 9/24 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｎ 9/52 Ｃ１２Ｒ 1:465）

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ストレプトマイセス属の放線菌から産生
   され、オーレオバシディウム プルランスの細胞壁を溶
   解することのできる細胞壁溶解酵素。
2. 【請求項２】 ストレプトマイセス属に属し、オーレオ
   バシディウム プルランスの細胞壁溶解能のある放線菌
   を培地に好気的に培養し、培養上澄液に硫酸アンモニウ
   ムを約80％飽和になるように加えて沈澱せしめ、この沈
   澱から硫酸アンモニウムを除くことによって得ることの
   できるオーレオバシディウム プルランスの細胞壁を溶
   解する性質をもつ細胞壁溶解酵素。
3. 【請求項３】 次の酵素化学的性質をもつ請求項１又は
   ２記載の細胞壁溶解酵素。 1) 次の酵素活性を示す;プロテアーゼ活性、β-1, 3-
   グルカナーゼ活性、キチナーゼ活性、アミラーゼ活性、
   β-N- アセチルグルコサミニダーゼ活性、セルラーゼ活
   性。 2) 至適 pH: pH 5〜6 3) 安定 pH: pH 4〜9 4) 至適温度: 50℃ 5) 安定温度: 45℃まで安定。70℃、10分間の加熱で完
   全に失活する。 6) 阻害剤: 1 mMの硫酸第一鉄、塩化水銀、塩化第二鉄
   により活性が阻害される。 7) 還元剤: 1 mMの2-メルカプトエタノール (還元剤)
   に対し安定である。 8) 糸状菌体及び酵母菌体を溶解する。
4. 【請求項４】 ストレプトマイセス属の放線菌がストレ
   プトマイセス sp TM502株(FERM P-15627)又はその変異
   株である請求項１〜３のいずれかに記載の細胞壁溶解酵
   素。
5. 【請求項５】 ストレプトマイセス属に属し、オーレオ
   バシディウム プルランスの細胞壁溶解能のある細胞壁
   溶解酵素を産生することのできる放線菌を培地で好気的
   に培養して細胞壁溶解酵素を産生せしめ、培養液からこ
   の細胞壁溶解酵素を回収することを特徴とする細胞壁溶
   解酵素の製造法。
6. 【請求項６】 培地にオーレオバシディウム プルラン
   ス菌体を添加して培養する請求項５記載の細胞壁溶解酵
   素の製造法。
7. 【請求項７】 ストレプトマイセスに属する放線菌がス
   トレプトマイセスspTM 502 株(FERM P-15627)又はその
   変異株である請求項５又は６記載の細胞壁溶解酵素の製
   造法。
8. 【請求項８】 ストレプトマイセス属に属し、オーレオ
   バシディウム プルランスの細胞壁を溶解することので
   きる放線菌。
9. 【請求項９】 放線菌が、ストレプトマイセスsp TM 50
   2 株(FERM P-15627)又はその変異株である請求項８記載
   の放線菌。
10. 【請求項１０】 請求項１〜４、８及び９のいずれかに
    記載の放線菌又はその産生する細胞壁溶解酵素を有効成
    分とする除黴剤。
11. 【請求項１１】 請求項１〜４、８及び９のいずれかに
    記載の放線菌又はその産生する細胞壁溶解酵素と粘着性
    物質とを併用して配合した除黴剤。
12. 【請求項１２】 オーレオバシディウム プルランスそ
    の他の黴の発生した箇所を請求項１０又は１１記載の除
    黴剤を用いて除黴することを特徴とする除黴方法。