JPH09328435A - 組換えコロニー刺激因子−１を含んで成る医薬組成物 - Google Patents

組換えコロニー刺激因子−１を含んで成る医薬組成物

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JPH09328435A
JPH09328435A JP9063495A JP6349597A JPH09328435A JP H09328435 A JPH09328435 A JP H09328435A JP 9063495 A JP9063495 A JP 9063495A JP 6349597 A JP6349597 A JP 6349597A JP H09328435 A JPH09328435 A JP H09328435A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規な創傷治療剤の提供。 【解決手段】 対象における創傷の治療のための、コロ
ニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１）を含んで成る組成物。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は組換生産されたヒト
コロニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１）の種々の使用に関
する。
【０００２】
【従来の技術】種々の組織中で非常に低濃度で生産され
るある種の因子の、骨髄原細胞の増殖並びに顆粒球及び
／又はマクロファージへの発達を刺激する能力はここ１
５年の間知られている。血清、尿サンプル及び多くの種
からの組織抽出物中のこれらの因子の存在は、半固形培
地にプレートされた骨髄細胞によるコロニーの形成の刺
激を測定するインビトロアッセイを用いて証明される。
インビボアッセイは知られていない。これらの因子はこ
の様なコロニーの形成を誘導するので、これらの因子は
コロニー刺激因子(Colony Stimulating Factor;CSF）と
総称されている。
【０００３】さらに最近、生ずるコロニー中に見出され
る細胞のタイプに従って定義することができる少なくと
も４つのサブクラスのヒトＣＳＦ蛋白質が存在すること
が示された。１つのサブクラスであるＣＳＦ−１は主と
してマクロファージを含有するコロニーをもたらす。他
のサブクラスは、好中顆粒球及びマクロファージの両者
を含有するコロニー、主として好中顆粒球を含有するコ
ロニー、並びに好中顆粒球、好酸顆粒球及びマクロファ
ージを含有するコロニーを生じさせる。
【０００４】上記のヒトＣＳＦに類似するネズミ因子が
存在し、これにはこれらすべての細胞形に加えて巨核
球、赤血球及びマスト細胞を種々の組合わせで含有する
コロニーを骨髄細胞から誘導するＩＬ−３と称されるネ
ズミ因子が含まれる。これらのＣＳＦはDexter,T.M.,Na
ture(1984)309:746;Vadas,M.A.らJ.Immunol.(1983)130:
793;Clark,S.C.Science(1987)236:1229;及びSachs,L.Sc
ience(1987)238:1374 に総説されている。
【０００５】本発明は、これらのサブクラスの内の第一
のものの構成員である蛋白質ＣＳＦ−１の組換生産に関
する。このサブクラスは特異的ラジオイムノアッセイ及
びラジオレセプターアッセイによりさらに特徴付けられ
そして描写されている。例えば、精製されたＣＳＦ−１
に対して生じた抗体は他のサブクラスの生物学的活性に
影響を与えることなくＣＳＦ−１活性を特異的に抑制
し、そしてマクロファージ細胞系Ｊ７７４はＣＳＦ−１
に特異的に結合するレセプターを含有する。これらのア
ッセイの記載はDas,S.K.らBlood(1981)58:630 により公
表された。
【０００６】一般にＣＳＦ蛋白質にそして特にＣＳＦ−
１になんらかの有用な機能を行わせる場合の有意な困難
性は、それらが分類された且つ特徴付けることができる
形態で、実際に又は可能性として療法的用途において使
用するのに十分な量で得ることができなかったことであ
る。本発明は、精製されたヒト及びネズミＣＳＦ−１を
組換技法により有用な量で提供することによりこれらの
困難を除去する。
【０００７】〔異るサブクラスのＣＳＦ蛋白質であるネ
ズミ及びヒトのＧＭ−ＣＳＦは精製されており、そして
そのｃＤＮＡはクローニングされている。この蛋白質が
他のＣＳＦ、例えばＣＳＦ−１と異ることがGough ら、
Nature(1984)309:763-767 により示された。このＧＭ−
ＣＳＦ蛋白質は、１９８７年４月９日に公開されたＷＯ
８７／０２０６０において、伝統的な癌治療の後に白
血球を再生させるために癌患者を治療するため、並びに
ウイルス性、細菌性、真菌性及び寄生性感染、例えば後
天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の可能性を減少させる
ために有用なものとしてさらに記載されている。
【０００８】ネズミＩＬ−３はFung,M.C. ら、Nature(1
984)307:233 によりクローニングされている。さらに、
Yokota,T. ら、Proc.Natl.Acad. Sci.(USA)(1984)81:10
70-1074;Wong,G.G. ら、Science(1985)228:810-815;Le
e,F. ら、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(1985)82:4360-436
4; 及びCantrell,M.A. ら、Proc.Natl.Acad.Sci(USA)(1
985)82:6250-6254 を参照のこと〕。
【０００９】ＣＳＦ−１単独、あるいはエリスロポイエ
チン及び／又は抗ウイルス剤及び／又はＩＬ−２との組
合わせによるＡＩＤＳ患者の治療が１９８７年６月４日
に公開されたＷＯ ８７／０３２０４に報告されてい
る。１９８４年１１月１３日発行の米国特許Ｎｏ．４，
４８２，４８５は、ＣＳＦが癌の治療における支持の役
割のために使用し得ることを記載している。さらに、１
９８４年９月１９日に公開されたＥＰ １１８，９１５
は癌治療を受ける患者における顆粒球減少症及びマクロ
ファージ減少症の予防及び治療のため、感染予防のた
め、並びに骨髄が移植された患者の治療のためのＣＳＦ
の生産を報告している。
【００１０】さらに、ＣＳＦ−１は非特異的殺腫瘍活性
を刺激することが報告されている〔Ralph ら、Immunobi
ol.(1986)172:194-204〕。Ralph ら、Cell Immunol.(19
83)76:10-21 は、ＣＳＦが繊維肉腫１０２３、リンパ腫
１８−８及びＬ．トロピカ（L. tropica）無鞭毛期（ａ
ｍａｓｔｉｇｏｔｅｓ）に対する殺腫瘍活性及び殺微生
物活性のためのマクロファージの活性化において迅速且
つ直接的な役割を有しないことを報告した。Ralph ら、
Cell Immunol.(1987)105:270-279は、ネズミ肉腫ＴＵ５
標的に対するＣＳＦ−１とリンホカインとの組合せの相
加的効果を報告している。
【００１１】さらに、Warrenら、J.Immunol.(1986)137:
2281-2285 は、ＣＳＦ−１がインターフェロンの単球生
産、ＴＮＦ及びコロニー刺激活性を刺激することを開示
している。Lee らJ.Immunol.(1987)138:3019-3033 は、
ネズミマクロファージにおけるウイルス感染に対するＣ
ＳＦ−１により誘導される耐性を開示している。
【００１２】
【本発明の概要】１つの観点において、本発明は、幹細
胞からの好中球を含めての白血球の生産を増強するた
め、哺乳類における細菌性及びウイルス性の両方の感染
性疾患の予防的又は治療的処置のため、哺乳類における
腫瘍の治療のため、腫瘍細胞に対するマクロファージの
抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）の刺激を増強するた
め、並びに創傷の治癒を促進するための組換ＣＳＦ−１
の組成物及び使用に関する。さらに、本発明は賦形剤、
サイトカイン又はリンホカインと混合してＣＳＦ−１を
含んで成るこれらの医薬組成物の使用に関する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
Ａ．定義 「コロニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１）」はＣＳＦ−１
について当業界において理解されている活性のスペクト
ルを示す蛋白質を意味する。すなわち、Metcalf,D.J.Ce
ll Physiol.(1970)76:89の標準的インビトロコロニー刺
激アッセイにかけられた場合、このものは主としてマク
ロファージコロニーの形成をもたらす。生来のＣＳＦ−
１はグリコシル化された二量体であり、二量体化は活性
のために必要であろう。二量体形及び単量体形の両者が
本発明の範囲及びＣＳＦ−１の定義内に入ると理解され
る。単量体形は細胞内条件を試験管内で与えることによ
り二量体に転換することができ、そして単量体はそれ自
体抗ＣＳＦ−１抗体を生産するための抗原として有用で
ある。
【００１４】幾分の種特異性が存在するようである。ヒ
トＣＳＦ−１はヒト及びネズミの両者の骨髄細胞に対し
て機能し、ネズミＣＳＦ−１はヒト細胞に活性を示さな
い。従って、「ヒト」ＣＳＦ−１は、完全な相関が存在
するという必然性はないが、Das,S.K.ら、Blood(1981)5
8:630 の特異的ネズミ・ラジオレセプターアッセイにお
いて陽性であるはずである。この蛋白質の生物学的活性
はまた一般にヒト尿ＣＳＦ−１に対する中和抗血清によ
り阻害される（Das,S.K.ら、前掲）。しかしながら、あ
る特定の状況下で（例えば、特定の抗体調製物が生物学
的機能のために必須でないＣＳＦ−１エピトープを認識
し、このエピトープが試験される特定のＣＳＦ−１ミュ
ーテイン中に存在しない場合）、この基準は適合しない
であろう。
【００１５】ＣＳＦ−１の幾つかの他の性質が、一連の
プラスタグランジン、インターロイキン−１及び成熟マ
クロファージからのインターフェロンの分泌を刺激する
該蛋白質の能力を含めて、さらに最近になって認識され
ている〔Moore,R.ら、Science(1984)223:178〕。これら
の活性の機構は現在理解されておらず、そして本明細書
において定義の目的で、定義を満たす基準は出発材料と
しての適切な種からの骨髄細胞を用いる単球／マクロフ
ァージコロニーの形成を刺激する能力に存在し、ほとん
どの場合において（前記参照のこと）精製されたヒト尿
ＣＳＦ−１に対する中和抗体によるこの活性の阻害、及
び種タイプについて適切な場合、ラジオレセプターアッ
セイに対する陽性応答。
【００１６】〔ＣＳＦ−１の増殖効果が単核貧食系の細
胞に限定されること（Stanley,E.R.The Lymphakines, 1
981;Stewart,W.E.,II ら、編集、Hummana Press, Clift
on,NJ,102-132 頁）並びにＣＳＦ−１のレセプターがこ
れらの細胞系（Byrne,P.V.,らCell Biol.(1984)91:84
8）及び胎盤に限定されることが知られている。〕すべ
ての蛋白質についてそうであるように、精密な化学構造
は多くの因子に依存する。分子中にイオン化可能なアミ
ノ基及びカルボキシル基が存在するので、特定の蛋白質
は酸性塩もしくは中性塩又は中性の形で得られるであろ
う。適当な環境条件下におかれた場合にそれらの活性を
維持するこのようなすべての調製物が定義内に含まれ
る。さらに、一次アミノ酸配列に対して糖成分を用いる
誘導体化により、又は他の補完分子、例えば脂質、リン
酸基、アセチル基等により、さらに一般的にはサッカラ
イドとの接合により増加が行われるであろう。
【００１７】一次アミノ酸構造はまた凝集して複合体、
最もしばしば二量体を形成するであろう。確かに、生来
のヒト尿ＣＳＦ−１は高度にグリコシル化されたダイマ
ーとして単離される。この様な増加の幾つかの観点は生
産宿主の翻訳後プロセシング系を通して達成され、他の
この様な修飾は試験管内で導入され得る。ともかく、上
に定義した蛋白質の活性が破壊されない限り、この様な
修飾は前記定義に含まれる。言うまでもなく、この様な
修飾は種々のアッセイにおいて蛋白質の活性を増強又は
低下により量的又は質的に活性に影響を与えることが予
想される。
【００１８】さらに、鎖中の個々のアミノ酸残基は酸
化、還元又は他の誘導体化により修飾することができ、
そして蛋白質を開裂させることにより活性を保持してい
る断片を得ることができる。活性を破壊しないこの様な
変更はその蛋白質配列から前記定義から排除しない。翻
訳中の配列へのアミノ酸の除去、付加又は変更の導入に
よる一次構造自体の修飾は蛋白質の活性を破壊すること
なく行われ得る。この様な置換又は他の変更は、「ＣＳ
Ｆ−１のアミノ酸配列と実質的に同等なアミノ酸配列を
有する」蛋白質の定義に属する。確かに、ヒト由来ＣＳ
Ｆ−１蛋白質及びネズミ由来ＣＳＦ−１蛋白質は同一で
はないがしかし高度な相同性を示す類似のアミノ酸配列
を示す。
【００１９】便宜上、本明細書において例示されるｃＤ
ＮＡクローンから推定される図１〜図３に示される二量
体蛋白質の一量体部分の成熟アミノ酸配列をｍＣＳＦ−
１（成熟ＣＳＦ−１）と称する。図１は、哺乳類細胞か
らの分泌の際におそらく開裂されるであろう３２残基の
推定上のシグナル配列の存在を示し、ｍＣＳＦ−１はこ
の図中でアミノ酸１−２２４により示される。その単量
体及び二量体がｍＣＳＦ−１であるミューテイン及びｍ
ＣＳＦ−１からの相違により命名されるｍＣＳＦ−１の
関連形が特にヒトＣＳＦ−１の定義に含まれる。他の種
に由来するＣＳＦ−１が、ヒト基質について前に記載し
た活性の必要なパターンを示すことにより「ヒト」ＣＳ
Ｆ−１の定義に合致するであろう。
【００２０】さらに、便宜上、ｍＣＳＦ−１のアミノ酸
配列が参照として使用され、そしてＣＳＦ−１活性に関
してこれと実質的に同等な他の配列が図１〜図３に示さ
れる配列に言及することによって命名されるであろう。
特定のアミノ酸の置換はそれを置換するアミノ酸残基へ
の言及によって示されるであろう。従って、例えば、ｓ
ｅｒ90ＣＳＦ−１は、９０位のアミノ酸がシステインで
はなくセリンである点を除き図１〜図３に示される配列
を有する蛋白質を含む。除去はΔとこれに続くＮ−末端
配列から除去されるアミノ酸の数により、又は残基がＣ
−末端配列から除去される場合に残るアミノ酸の数によ
り示され、この場合はこの数の後にマイナス記号が付さ
れる。
【００２１】すなわち、▽４ＣＳＦ−１は最初の４個の
アミノ酸がＮ−末端から除去されている図１〜図３のＣ
ＳＦ−１を含み、▽１３０−はアミノ酸１３０続く最後
の９４個のアミノ酸が除去されているＣＳＦ−１に関す
る。後に、多数のＣＳＦ−１蛋白質、例えばｃＤＮＡに
よりコードされるチロシン残基の代りに５９位において
遺伝子（図１）によりコードされるアスパラギン酸残基
を含むａｓｐ59ＣＳＦ−１、及びｍＣＳＦ−１のアミノ
酸１−１５８のみから成る▽−１５８−ＣＳＦ−１（以
後１５８）、が例示される。
【００２２】「作用可能に連結された」とは、複数の成
分の正常な機能が達成され得るような並置を意味する。
従って、制御配列に「作用可能に連結された」コード配
列は、これらの配列の制御の下でコード配列が発現され
得るような配置を意味する。「制御配列」は、特定の宿
主生物において作用可能に連結されたコード配列の発現
のために必要なＤＮＡ配列を意味する。原核生物のため
に適当な制御配列は、例えはポロモーター、場合によっ
てはホペレーター配列、ルボゾーム結合部位、そしてお
そらくまだ十分に理解されていない他の配列を包含す
る。真核細胞はプロモーター、ポリアデニレーションシ
グナル、及びエンハンサーを用いることが知られてい
る。
【００２３】「有効量」とは、特定された機能を達成す
るため、例えば腫瘍を移しもしくは腫瘍負荷を減少せし
め又は感染性疾患を予防もしくは治療せしめるために効
果的な量を意味する。「治療的処置」は病気に罹った後
の処置を意味し、他方「予防的」処置は病気に罹る前の
処置を意味する。「哺乳類」は任意の哺乳類種を示し、
そしてラビット、マウス、イヌ、ネコ、霊長類及びヒト
を含み、好ましくはヒトである。
【００２４】「発現系」は、作用可能に連結された所望
のコード配列及び制御配列を含み、これらの配列によっ
て形質転換された宿主がコードされた蛋白質を生産する
ことができるようなＤＮＡ配列を意味する。形質転換を
行うため、発現系がベクター上に含まれることができる
が、しかしながら当該ＤＮＡはまた宿主の染色体に組込
まれる場合がある。
【００２５】この明細書において使用される場合、「細
胞」、「細胞系」、及び「細胞培養物」は相互交換可能
に使用され、そしてこの様な名称のすべてが子孫を包含
する。従って「形質転換体」又は「形質転換された細
胞」は一次対象細胞、及び経代数には無関係にそれらに
由来する培養物を包含する。さらに、意図的な又は意図
的でない変異のためにすべての子孫がＤＮＡ含有におい
て正確に同一ではない場合がある。最初に形質転換され
た細胞においてスクリーニングされたのと同じ機能を有
する変異子孫が含まれる。別個の命名が意図される場
合、それは文脈から明らかであろう。
【００２６】Ｂ．一般的記載 本発明のＣＳＦ−１蛋白質は原骨髄細胞からの単球前駆
体／マクロファージ細胞生産を刺激して免疫系の有効性
を増強することができ、そして同時に成熟マクロファー
ジにおけるリンホカインの分泌のごときこれらの分化細
胞の機能を刺激することができる。１つの用途におい
て、これらの蛋白質は化学療法のための補助薬として有
用である。化学療法処置が免疫系の抑制をもたらすこと
がよく理解される。しばしば、化学療法処置は、それら
が向けられている腫瘍細胞を破壊するのには有効である
が、免疫系の細胞に対する化学毒性剤の副作用のため、
化学療法処置は対象者の死をもたらす。
【００２７】骨髄由来前駆体のマクロファージ及び単球
への増殖及び分化中介し且つ増強しそしてこれらの成熟
細胞の機能を刺激するＣＳＦ−１の能力のため、前記の
ような患者へのＣＳＦ−１の投与は免疫系を再刺激して
前記副作用を予防しそしてそれ故に二次感染に負ける患
者の傾向を防止する。このような処置により助けられる
であろう他の患者には、骨髄移植により白血病の治療を
受けた者が含まれる。これらはしばしば拒絶を回避する
ために免疫抑制状態にある。これらの患者についてはま
た、免疫抑制がＣＳＦ−１の投与により逆転され得るで
あろう。
【００２８】一般に、化学療法によるものであれ、骨髄
移植によるものであれ、又はその他の、疾患（例えば後
天性免疫不全症候群）及び創傷のごとき免疫抑制の不慮
の形態によるものであれ、免疫抑制に罹っているすべて
の対象者は薬学的用途のためのＣＳＦ−１の入手可能性
により利益を得るであろう。さらに、骨髄又は他の適当
な調製物の試験管内培養及びこれに続くＣＳＦ−１によ
る処理により生産されたすでに分化したマクロファージ
の増強された量を対象者に提供することができ、これに
より生来の系のそれを補完することができよう。前記の
調製物には患者自身の血液単球のそれが含まれ、これは
前記のように培養しそして局所療法又は全身療法のため
にもどすことができる。
【００２９】マクロファージによるリンホカインの生産
を刺激しそして標的細胞を殺すそれらの能力を増強する
ＣＳＦ−１能力はまた、ＣＳＦ−１を新生物及び感染の
治療において直接的に有用なものとする。ＣＳＦ−１は
ネズミ由来のマクロファージによるインターフェロンの
生産を刺激し〔Fleit,H.B.ら、J.Cell Physiol.(1981)1
08:347〕、そしてＭＩＡＰａＣａ細胞由来のヒトの特に
精製されたＣＳＦ−１は、１９８６年８月１４日に公開
された本発明者に係るＰＣＴ公開ＷＯ ８６／０４６０
７に記載されているように、ヒト単球からのインターフ
ェロン及びＴＮＦのｐｏｌｙ（Ｉ）：ｐｏｌｙ（Ｃ）に
誘導される生産を刺激する。さらに、ＣＳＦ−１はヒト
血液単球による骨髄性ＣＳＦの生産を刺激する。
【００３０】さらに、ＣＳＦ−１は腫瘍の処置のため
に、例えばα−ＩＦＮ，β−ＩＦＮ，γ−ＩＦＮ，ＩＬ
−２又はＴＮＦのごときリンホカイン類又はサイトカイ
ン類を含めての他の効果的な薬剤と組合わせて使用する
ことができる。さらに、正常Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウス末梢
マクロファージを刺激してネズミ肉腫ＴＵ５標的を殺す
ＣＳＦ−１（ネズミＬ−細胞条件化培地から、及び大腸
菌により生産されるヒト組換ＣＳＦ−１）の能力の証明
を後に示す。この活性は、ＣＳＦ−１が前処置として及
びエフェクター期の間に使用される場合に全く効果的で
ある。これを行うＣＳＦ−１の能力は、図７に後で示す
ように、他のコロニー刺激因子により示されるそれより
も非常に大である。
【００３１】ＣＳＦ−１はまた、腫瘍細胞に対するマク
ロファージのリンホカインにより誘導される抗体依存性
の細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を増強するためにも使用
され得る。この活性は特に、ＣＳＦ−１がＩＬ−２，Ｉ
ＦＮ−α，ＩＦＮ−β，ＩＦＮ−γと組合わせて使用さ
れる場合に特に効果的である。
【００３２】さらに、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）
のごときウイルス、真菌、及びグラム陰性敗血症を惹起
する細菌を含めての感染性生物を攻撃するネズミ細胞の
能力はＣＳＦ−１により増強される。〔ネズミＣＳＦ−
１は、ネズミマクロファージを刺激してＰ８１５腫瘍細
胞に対して静細胞的であるようにし（Wing,E.J. ら、J.
Clin.Invest.(1982)69:270）、あるいは他の白血病標的
を殺さない（Ralph,P.ら、Cell Immunol.(1983)76:10）
と、一貫性なく報告されている。Nogawa,R.T.ら、Cell
Immunol.(1980)53:116 は、酵母を摂取しそして殺すよ
うにマクロファージを刺激することができると報告して
いる。〕
【００３３】従って、免疫抑制それ自体を克服するのに
加えて、ＣＳＦ−１はマクロファージの分泌及び活性の
刺激により間接的に侵入生物及び悪性細胞を破壊するた
めに使用することができる。ＣＳＦ−１はまた白血球細
胞の総数の不足を含む疾患である白血球減少症の救済の
ために用いることができる。好中球減少症は主として多
形核白血球（好中球、顆粒球）に影響を与える欠陥を反
映しており、そして種々の感染、ある種の薬剤（例え
ば、細胞毒性剤）又はイオン化照射によるであろう。従
って、好中球を含めての白血球細胞の数を増加させるよ
うに幹細胞を誘導するためにＣＳＦ−１の生体内投与を
用いることができる。
【００３４】最後に、ＣＳＦ−１は、局所的又は全身的
に投与した場合に創傷の治癒を促進するために使用する
ことができ、そしてマクロファージを回復させそして腫
瘍壊死因子（ＴＮＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧ
Ｆ）及び他の結合組織成長因子を生産するようにそれら
を誘導することができる。本発明のＣＳＦ−１は、蛋白
質基質の投与のために当業界において標準的な常法によ
り製剤することができる。注射による投与が好ましく、
製剤には溶液又は懸濁液、乳剤、あるいは注射できるよ
うに再溶解するための固体組成物が包含される。適当な
賦形剤には例えばリンゲル溶液、ハンク溶液、水、塩
水、グリセロール、デキストロース溶液等が包含され
る。
【００３５】さらに、本発明のＣＳＦ−１は、適切な応
答を刺激するために細胞の調製物と共に前インキュベー
トすることができ、そして全体調製物又はそれからの上
清を対象者に導入することができる。後に記載するよう
に、ＣＳＦ−１刺激に応答して種々のタイプの血液細胞
により生産される物質は所望の標的に対して効果的であ
り、そして侵入ウイルス又は新生物を攻撃するこれらの
血液細胞自体の性質が増強され得る。対象者自身の細胞
が取り出されそしてこの方法において使用され、あるい
は例えば、他の適合性個体からの単球又はリンパ球が前
記インキュベーションにおいて用いられる。
【００３６】ヒトＣＳＦ−１の完全なコード配列が今や
入手可能であり、そして種々の宿主系に適用可能な発現
ベクターが作製され、そしてコード配列が発現されてい
る。例えば、ＰＣＴ公開（前掲）；Kawasaki,E.S. らSc
ience(1985)230:291-296;Ladner ら(1987)EMBO J. 6
(9) :2693-2698; １９８８年５月５日に公開されたＷＯ
８８／０３１７３；及び１９８８年６月２９日に公開さ
れたＥＰ ０，２７２，７７９を参照のこと。これらの
参照文献のすべてを引用により本明細書に組入れる。利
用可能な宿主の多様はこの様な宿主のために適当なベク
ターと相俟って、翻訳後プロセシング系及びこうして生
産された蛋白質のコンホーメーション抑制を提供する環
境因子の選択を可能にする。従って、この情報の入手可
能性が本明細書において検討する種々の療法において利
用するための十分な量のＣＳＦ−１蛋白質を提供する。
【００３７】ヒトＣＳＦ−１の特定の例において、現在
蓄積しつつある証拠が示すところによれば、組換条件下
及び生来的条件下の両方において蛋白質のＣ−末端にお
けるかなりの欠失が生ずることができそしてその蛋白質
の活性はなお保持されている。単離された生来の蛋白質
はある種の末端切除形又はその混合物として存在するこ
とができ、そして多様なＣ−末端プロセシングを示すよ
うである。これらの「末端切除された」形の活性はそれ
らの意図的な製造により明瞭に確立されている。
【００３８】例えば、ＳＣＳＦ／Ｃ▽１５０（以後、１
５０と称する）をコードするＤＮＡから生産されたミュ
ーテインはＣＳＦ−１のためのアッセイにおいて、ＬＣ
ＳＦ／Ｃ▽１９０（以後、１９０と称する）、ＳＣＳＦ
／Ｃ▽２２１（以後、２２１と称する）、又はａｓｐ59
ＬＣＳＦ／Ｎ▽２２１（以後、Ｎ▽３Ｃ▽２２１と称す
る）をコードするｃＤＮＡから生産されたそれと同様に
十分な活性を有する。これらのミューテインは１９８８
年６月２９日に公開された係属中のヨーロッパ公開Ｎ
ｏ．２７２，７７９、及び１９８８年５月５日に公開さ
れたＰＣＴ公開ＷＯ ８８／０３１７３に記載されてお
り、この両者を引用によりこの明細書に組入れる。
【００３９】Ｃ．好ましい態様 本発明の組換ＣＳＦ−１は、類似するがしかし必ずしも
同一ではない一次アミノ酸配列を有する一連のミューテ
インであって、そのすべてがＣＳＦ−１に特徴的な活性
パターンを示すか又はそれを示すミューテインに特異的
に開裂され得るものであると理解することができる。す
なわちそれらは単球に圧倒的に分化するように骨髄細胞
を刺激することができ、そして上記の定義の範囲内で生
来のＣＳＦ−１に対して生じた抗体及びＣＳＦ−１活性
と関連するレセプターと免疫反応性である。しかしなが
ら、これらのミューテインのある種の具体例が好まし
い。
【００４０】成熟ＣＳＦ−１についてLadnerら、前掲、
の図１〜図６に示される一次配列は必要とされる活性を
有し、そして言うまでもなく好ましい具体例に属する。
配列の幾つかの部分が成熟ＣＳＦ−１中の１個又は複数
個のアミノ酸の欠失又は保存的置換により変化している
ミューテインも好ましい。「保存的」アミノ酸置換と
は、蛋白質の活性特性を変えず、そして一般に２個の相
互交換された残基の側鎖の化学的類似性により特徴付け
られる置換を意味する。
【００４１】例えば、酸性残基は他の酸性残基により、
塩基性残基は塩基性残基により、疎水性残基は疎水性残
基により、バルキーな残基はバルキーな残基により、等
々…、保存的に置換される。言うまでもなく、要求され
る類似の程度は置換が行われるアミノ酸の必須性、及び
その性質に依存する。従って、一般に、システイン残基
の好ましい置換はセリン及びアラニンであり、アスパラ
ギン酸残基のためにはグルタミン酸であり、リジン又は
アルギニン残基のためにはヒスチジンであり、ロイシン
残基のためにはイソロイシン又はバリンであり、トリプ
トファン残基のためにはフェニルアラニン又はチロシン
である等々、である。
【００４２】変更に対して最も耐性なＣＳＦ−１蛋白質
の領域は、ヒト及びマウス種の間での既知の低相同性領
域（残基１５−２０及び７５−８４）、蛋白質分解的開
裂に対する感受性を提供する領域（残基５１及び５２並
びに残基１９１−１９３）、ジスルフィド結合に関与し
ないシステイン残基、又は活性のために絶対的に必須で
ない他の領域（残基１５９−２２４）を包含する。残基
１５１−２２４も必須でない様である。
【００４３】従って、ｍＣＳＦ−１の１５９位と２２４
位（これらを含む）の間、又は１５１−２２４位（これ
らを含む）の間の１個もしくは複数個のアミノ酸及び／
又は１個もしくは複数個のアミノ酸配列の欠失又は保存
的置換により特徴付けられるＣＳＦ−１ミューティンが
特に好ましい。特に、▽１５８ＣＳＦ−１は切除された
Ｃ−末端に限定された数のＣＳＦ−１に関係のない追加
のアミノ酸残基が含まれていても生来の蛋白質のＣＳＦ
活性に匹敵するＣＳＦ活性を有し、▽１５０ＣＳＦ−１
は類似の活性を有する。
【００４４】確かに、生来の蛋白質は１４〜１５kd（ｃ
ＤＮＡ配列から推定される２６kdとは異る）の分子量を
有し、そして組換（推定）アミノ酸配列から予想される
疎水性は開裂に対して通常感受性の膜貫通領域に対応す
る。従って、末端切除された変形体はおよそ、単離され
たＣＳＦ−１に対応するようである。さらに、ＳＣＳＦ
又はＬＣＳＦの最初の３〜１５０又は４〜１５０アミノ
酸配列を含むアミノ酸配列を含んで成り、そしてＣ−末
端欠失を含むＣＳＦ−１蛋白質、例えばＬＣＳＦ／Ｃ▽
２２１及びａｓｐ59ＬＣＳＦ／Ｎ▽３Ｃ▽２２１も好ま
しい。
【００４５】さらに、ｍＣＳＦ−１の位置５１及び５２
及び／又は位置１９１，１９２及び１９３の１個又は複
数個のアミノ酸の欠失又は保存的置換により特徴付けら
れるミューテインも好ましい。特にｇｌｎ52ＣＳＦ−１
が好ましく、対応するプロリン置換は保存的ではなく、
そして活性なＣＳＦをもたらさない。これらが見かけ上
低い相同性を示すため、他の一連の好ましい具体例はｍ
ＣＳＦ−１の位置１５−２０及び／又は位置７５−８４
の１個又は複数個の欠失又は保存的置換により特微付け
られるものである。さらに、ジスルフィド結合の形成の
ために必須でない任意の位置におけるシステインの欠失
又は保存的置換により特徴付けられるミューテインが好
ましい。さらに、ｍＣＳＦ−１の位置５９のチロシン残
基の欠失又は置換、特にアスパラギン酸残基による置換
により特徴付けられるミューテインが好ましい。
【００４６】Ｄ．ヒトＣＳＦ−１のクローニング及び発
現 ＰＣＴ公開ＷＯ ８６／０４６０７（前掲）は、ヒトＣ
ＳＦ−１のコード配列を得、この配列を発現ベクターに
配置し、そして所望の蛋白質の発現を得るための方法を
例示している。この公開の教示を特に引用により本明細
書に組み入れる。十分な長さのｃＤＮＡは１．６４kdで
あり、そして２２４アミノ酸の成熟ＣＳＦ−１蛋白質を
コードしている。このクローンをＣＳＦ−１７と称し、
これはシタス寄託番号ＣＭＣＣ ２３４７を有し、そし
て１９８５年６月１４日にＡＴＣＣに寄託された（ＡＴ
ＣＣ ５３１４９）。ＣＳＦ−１コードＤＮＡを担持す
るこのプラスミドはｐｃＣＳＦ−１７と称される。
【００４７】Ｄ．１ ミューテインをコードする配列 ｐｃＣＳＦ−１７の挿入部に修飾を行ってｍＣＳＦ−１
蛋白質のミューテインをコードする対応するプラスミド
を得た。部位特定変異誘発のため、ｐｃＣＳＦ−１７及
びＭ１３ｍｐ１８を、ＣＳＦ−１コード配列の適当な領
域を切り出す同一の制限酵素により消化し、そして切り
出された配列をＭ１３ベクターに連結した。第二鎖の合
成及び所望の変異したＤＮＡの回収のため次のオリゴヌ
クレオチドプライマーを使用した。
【００４８】ｐｒｏ52ＣＳＦ−１のため、 5′-TACCTTA
AACCGGCATTTCTC-3′、これはコドン５２−５３に新たな
Ｈｐａ II部位を形成する；ｇｌｎ52ＣＳＦ−１のた
め、 5′-TACCTTAAACAGGCCTTTCTC-3′、これはコドン５
２−５３に新たなＳｔｕ Ｉ部位を形成する；ａｓｐ59
ＣＳＦ−１のため、 5′-GGTACAAGATATCATGGAG-3′、こ
れはコドン５９−６０に新たなＥｃｏＲＶ部位を形成す
る。Ｋｌｅｎｏｗを用いる第二鎖の延長の後、ファージ
を大腸菌ＤＧ９８に形質転換し、そして生ずるプラーク
をキナーゼ処理されラベルされたプローブによりスクリ
ーニングする。プラーク精製の後、所望の変異した挿入
部をｐｃＣＳＦ−１にもどしてそれぞれｐＣＳＦ−ｐｒ
ｏ52，ｐＣＳＦ−ｇｌｎ52及びｐＣＳＦ−ａｓｐ59を得
る。
【００４９】▽１５８ＣＳＦ−１をコードする３個の欠
失変異体を含むプラスミド：ｐＣＳＦ−Ｂａｍ，ｐＣＳ
Ｆ−ＢａｍＢｃｌ及びｐＣＳＦ−ＢａｍＴＧＡも調製さ
れた。ｐＣＳＦ−Ｂａｍのためには、ｐｃＣＳＦ−１７
をＢａｍＨＩにより消化し、そしてコード領域の上流Ｂ
ａｍＨＩ／ＢａｍＨＩ断片を単離し、そしてベクター断
片に再連結した。この連結混合物を大腸菌ＭＭ２９４に
形質転換し、そして正しい方向付けを有するプラスミド
を単離した。得られるｐＣＳＦ−Ｂａｍは、Ｃ−末端で
ベクター由来の６残基：Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｌｙ
ｓ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓに融合したＣＳＦ−１蛋白質の１５
８アミノ酸をコードしている。
【００５０】１５９位のセリンが終止コドンに変異して
いる点を除き完全なＣＳＦ−１コード配列を含有するｐ
ＣＳＦ−ＢａｍＢｃｌのため、ｐｃＣＳＦ−１７からコ
ード配列を切り出し、そしてプライマー：５′−GAGGGA
TCCTGATCACCGCAGCTCC −３′を用いる部位特定変異誘導
のためＭ１３に連結した。これはコドン１５９−１６０
に新たなＢｃｌＩ部位をもたらす。変位したＤＮＡをＢ
ｓｔＸＩ／ＥｃｏＲＩにより切り出し、そしてＢｓｔＸ
Ｉ／ＥｃｏＲＩで消化したｐｃＣＳＦ−１７に連結し、
そしてこの連結混合物を大腸菌ＤＧ１０５ｄａｍ- 宿主
に形質転換し、そしてプラスミドＤＮＡを単離した。
【００５１】１５９−終止の下流のコドンが除去されて
いるｐＣＳＦ−ＢａｍＴＧＡのため、ｐＣＳＦ−Ｂａｍ
ＢｃｌをＸｈｏＩ及びＢｃｌＩにより消化し、そして挿
入部をＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ消化ｐｃＣＳＦ−１７に連
結した。さらに、１５１位のヒスチジンの代りにＴＧＡ
終止コドンを含有するｐＣＳＦ−Ｇｌｙ１５０をｐｃＣ
ＳＦ−１７挿入部から、上記のようにて適切なプライマ
ーを用いる部位特定変異誘発により調製した。
【００５２】Ｄ．２ ＣＳＦ−１の発現及び殺生物アッ
セイ ＣＯＳ−７細胞でのＣＳＦ−１７からのプラスミドＤＮ
Ａ（ｐｃＣＳＦ−１７）の発現が骨髄増殖アッセイ、コ
ロニー刺激アッセイ及びラジオレセプターアッセイによ
り、ＷＯ８６／０４６０７（前掲）に教示されているよ
うに確認されそして定量された。ＣＳＦ−１についての
骨髄増殖の特異性は活性を妨害するＣＳＦ−１抗血清の
能力にのみ存在し、コロニー刺激アッセイについては得
られるコロニーの性質に存在することが思い出されよ
う。両アッセイはml当り数千ユニットのオーダーのＣＳ
Ｆ−１生産を示した。
【００５３】Ｄ．３ ミューテインの発現 ｐｃＣＳＦ−１７について教示したのと類似する方法
で、ミューテインをコードするプラスミドをＣＯＳ−Ａ
２細胞にトランスフェクトし、そしてＣＳＦ−１活性の
一時的発現を骨髄増殖アッセイ及び抗−ＣＳＦ抗体を用
いるラジオイムノアッセイにより測定した。ｐＣＳＦ−
ｐｒｏ５２の発現生成物は不活性であり、予想されたよ
うにプロリンによる置換が非保存的であることが示され
た。他のすべてのミューテインは両アッセイにおいて下
記の結果により示されるように活性を示した。
【００５４】
【表１】
【００５５】Ｄ．４ ネズミＣＳＦ−１ ネズミＣＳＦ−１をコードするイントロン不含有ＤＮＡ
配列がＷＯ８６／０４６０７に教示されており、そして
引用によりこの明細書に組入れる。このネズミＣＳＦ−
１を、多量のＣＳＦ−１を生産するネズミ繊維芽細胞系
を用いて調製する。ＡＴＣＣから入手できるＬ−９２９
細胞系を、ｃＤＮＡライブラリーを作るためのｍＲＮＡ
源として用いる。既知のネズミのＮ−末端及びＣＮＢｒ
−開裂中間ペプチド配列に基いて構成されたオリゴマー
プローブを用いて、このｃＤＮＡライブラリーをプロー
ブしてネズミ形蛋白質の完全なコード配列を回収する。
【００５６】ネズミＣＳＦ−１はヒトの材料と約８０％
の相同性を有すると信じられ、その由来は、Ｎ−末端配
列の相同性、骨髄細胞からマクロファージコロニーを刺
激するヒト及びネズミの両ＣＳＦ−１調製物の能力、及
びラジオレセプターアッセイ及びラジオイムノアッセイ
に関しての限定された交叉反応性による（Das, S.K.らB
lood (1981) 58 : 610)。ネズミＣＳＦ−１のｃＤＮＡ
の調製、クローニング及び発現はＷＯ８６／０４６０７
（前掲）に記載されている。
【００５７】Ｅ．ＣＳＦ−１の活性 部分精製されたＭＩＡＰａＣａ ＣＳＦ−１、ネズミＬ
細胞ＣＳＦ−１，ＣＶ−１により生産された組換物質又
は大腸菌により生産されたヒトＣＳＦ−１を用いて、Ｃ
ＳＦ−１の活性を次の実施例において決定した。ＣＳＦ
−１は、誘導されたヒト単球によるインターフェロン及
び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の生産を１０〜３０倍増強す
ることが示された。ＣＳＦ−１はまた、マクロファージ
の抗腫瘍毒性をインビトロで刺激し、腫瘍の増殖をイン
ビボで阻害し、マウスを致命的な細菌感染から保護し、
そしてマウスにおけるサイトメガロウイルスの増殖を阻
害することが証明された。次の実施例は、請求の範囲に
記載された治療的及び予防的使用を限定的にではなく例
示するものである。
【００５８】
【実施例】ヒト単球によるＴＮＦ生産の刺激 ＭＩＡＰａＣａ ＣＳＦ−１を上清からリン酸カルシウ
ムゲル濾過及びレンチルレシチンクロマトグラフィーに
より精製した。リンホカイン生産のアッセイのため、末
梢血付着細胞をそれぞれ１０7 細胞を含有する２本のフ
ラスコ中でインキュベートした。一方のフラスコは上記
のようにして精製された１０００Ｕ／mlのＣＳＦ−１で
処理した。
【００５９】３日後、細胞を収得し、そして洗浄し、そ
して５×１０5 ／mlの細胞濃度で再懸濁しそして２４−
ウエルプレート中で０．５ml／ウエルでプレートした。
ウエルを１０μｇ／mlのリポポリサッカライド（ＬＰ
Ｓ）及び２０ng／mlのＰＭＡで４８時間処理し、そして
上清をＴＮＦアッセイのために収得した。ＣＳＦにより
処理された細胞は未処理細胞より約９倍高いＴＮＦの分
泌を示した（１６２Ｕ／mlに対して１５００Ｕ／ml）。
【００６０】ヒト単球によるインターフェロン生産の刺
激 インターフェロン生産に対するＣＳＦ−１の効果を決定
するための類似の実験において、末梢血付着細胞を１０
００Ｕ／mlのＳＦＦ−１の存在下又は非存在下で３日
間、上記のようにしてインキュベートし、取得し、５×
１０5 ／mlで再懸濁し、そして前記のようにして２４−
ウエルプレートにプレートした。細胞をインターフェロ
ン生産のために種々の量のｐｏｌｙ（Ｉ）：ｐｏｌｙ
（Ｃ）の添加により誘導した。
【００６１】上清を、ＶＳＶが感染したＧＭ２５０４細
胞に対するその細胞変性効果によりインターフェロン生
産についてアッセイした。ＣＳＦ−１により刺激された
細胞は５０μｇ／mlのｐｏｌｙ（Ｉ）：ｐｏｌｙ（Ｃ）
により誘導された場合に１００Ｕ／mlの生産を示し、他
方同様に誘導された未処理細胞は３Ｕ／ml未満の生産を
示した。
【００６２】ヒト単球による骨髄性ＣＳＦ生産の刺激 単球をＣＳＦ−１の存在下及び非存在下で３日間インキ
ュベートし、そして第２表に示すように骨髄性ＣＳＦの
生産について誘導した。示されている３つの代表的な実
験は異る提供者からの血液を使用した。
【００６３】
【表２】 従って、ＣＳＦ−１は骨髄性ＣＳＦ又はコロニー刺激活
性の生産を刺激する。
【００６４】ネズミマクロファージによる殺腫瘍細胞の
刺激：他のコロニー刺激因子との比較 マクロファージの刺激を測定するため、Ｌ−細胞条件化
（conditioned)培地から得られたネズミＣＳＦ−１をｐ
ｃＣＳＦ−１７からの組換生産ＣＳＦ−１のためのモデ
ルとして、肉腫標的を殺すネズミマクロファージの能力
を示す測定において用いた。
【００６５】この測定においては、２時間の付着Ｃ３Ｈ
／ＨｅＮマウス末梢マクロファージをＣＳＦ−１と共
に、又はそれを伴わないで試験管内で１日インキュベー
トし、そして次にγ−インターフェロンを含有する１０
％ｖ／ｖＣｏｎＡ誘導（１０μｇ／ml）脾臓リンホカイ
ン（ＬＫ）と共に、 3Ｈ−チミジン標識マウス肉腫ＴＵ
５細胞と２０：１の比率で混合した。この測定において
ＬＫ調製物を精製γ−インターフェロンで代替すること
ができる。その後４８時間にわたる標識されたチミジン
の放出を殺腫瘍細胞の測定値として用いた。１２００Ｕ
／mlのＣＳＬ−１を含有するネズミＬ−細胞条件化培地
としてＣＳＦ−１を添加する効果を次の表に示す。精製
されたネズミＣＳＦ−１並びにＣＶ−１及び大腸菌（２
２１）からのｒｈＣＳＦ−１もこの測定において有効で
あった。
【００６６】
【表３】
【００６７】標的細胞を殺す能力の増加は、ＣＳＦ−が
増殖の予備的１日の間に添加され又は誘導の期間の間に
添加された場合に認められたが、しかしながら、ＣＳＦ
−１が両期間にわたって添加された場合に最も劇的な効
果が観察された。マクロファージ及び単球の刺激の原因
としての細菌性ＬＰＳ汚染の可能性は排除された。適用
されたＣＳＦ−１のＬＰＳ含量は低く〔リムラス試験
（Limulusamoebocyte lysate (LAL) assay)により＜
０．３ng／３０００Ｕ ＣＳＦ−１〕、抗−ＣＳＦ−１
カラムへの適用により活性は除去され；ＬＰＳを中和す
るためにポリメキシンＢが使用され；Ｃ３Ｈ／ＨｅＪか
らのマクロファージはＣＳＦ−１に応答するがしかしＬ
ＰＳに応答しない。
【００６８】他の骨髄性ＣＳＦの効果 ５μｇのＬＰＳのIV投与の後５時間目に得た６個のマウ
スの肺からＣＳＦ−ＧＭを調製した。この肺を切りきざ
み、無血清培地中で３日間インキュベートし、ＹＹＧ１
０６アフィニティーカラムを用いて上清からＣＳＦ−１
を除去した（ＣＳＦ−１含量は２７０Ｕ／mlから７８Ｕ
／mlに低下した。同様に処理したＬＤＩ無血清培地から
ＣＳＦ−Ｇを調製した。ＣＳＦ−ＧＭ含量及びＣＳＦ−
Ｇ含量の両者を２０００Ｕ／mlにおいてコロニー刺激ア
ッセイにより測定した。
【００６９】末梢マクロファージを４０％の上記の培地
のいずれかと共に又は２０００Ｕ／ml ＣＳＦ−１で測
定されたＬ−細胞培地と共に１日インキュベートし、そ
して次に追加の培地と共に又はＬＫと共に４８時間イン
キュベートし、そして上記のようにして殺ＴＵ５につい
て測定した。結果を図７に示す。ＣＳＦ−１はＴＵ５に
対する毒性の顕著な増強を示したが、ＣＳＦ−Ｇ及びＣ
ＳＦ−ＧＭはいずれもなんらの効果も示さなかった。
【００７０】ＡＤＣＣの刺激剤としてのＣＳＦ−１の試
験管内試験 ＭＩＡＰａＣａ細胞系から精製されたＣＳＦ−１（〜４
０％純度、比活性〜２×１０7 Ｕ／mg）、ネズミＬ−細
胞条件化培地（比活性〜２．３×１０5 Ｕ／ml）、及び
ＣＶ−１からの組換ヒト（ｒｈ）ＣＳＦ−１（＞９５％
純度、比活性〜５×１０7 Ｕ／mg）は、ＩＬ−２又はＩ
ＦＮ−α、−βもしくは−γとの組合わせにおいて腫瘍
標的に対するネズミマクロファージＡＤＣＣを刺激する
ことが見出された。
【００７１】ＡＤＣＣ測定において、雌性Ｃ３Ｈ／Ｈｅ
Ｎ又はＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスに１．５mlのプロテアーゼ
ペプトン（デイフコ・ラボラトリーズ、デトロイト、Ｍ
Ｉ）をｉ．ｐ．注射した。３日後、末梢滲出細胞を３×
１０5 大細胞／０．５mlαＭＥＭ培地＋１０％熱不活性
化ウシ胎児血清で２個の１mlウエルに並行して付着させ
た。２時間後、ウエルをＰＢＳにより３回十分に洗浄
し、そしてＣＳＦ−１又はリンホカインを添加し、そし
て３７℃にて２日間インキュベートした。
【００７２】細胞集団は形態的に＞９５％マクロファー
ジであり、そして並行ウエルで２日目に回収された細胞
数は異る処理について類似していた。２日目に、熱不活
性化された抗血清（抗Ｔｈｙ−１、ラビット抗−マウス
脳、アキャレートケミカルス、ウエストバレイ、ＮＹ）
を並行セットの一方に種々の稀釈で加えた。Ｔ−リンパ
腫細胞系である標的Ｒ１．１をマクロファージウエル
に、及びマクロファージを伴わない並行ウエルに加えた
（±ＣＳＦ−１、リンホカイン、又は抗血清）。
【００７３】高濃度（１μｇ／ml）の細胞ＬＰＳがマク
ロファージＡＤＣＣを刺激するので、ネズミ及びヒトＣ
ＳＦ−１調製物をＬＡＬ測定を用いて試験し、０．２ng
／ml未満のＬＰＳを有していた。マクロファージを３：
１のエフェクター：標的比率においてＡＤＣＣについ
て、抗血清の存在下又は非存在下で１０5 Ｒ１．１標的
を導入し、そして生きている標的細胞を９，２４，４８
及び９６時間目に計数することにより試験した。対照マ
クロファージ＋抗体を伴うＲ１．１の増殖は、抗体の非
存在下での対照マクロファージ又はサイトカイン処理マ
クロファージを伴うそれ、あるいはＲ１．１のみ±抗体
±サイトカインのそれと同一であった。
【００７４】
【表４】 ５０Ｕ／mlのＩＦＮ−α及びＩＦＮ−βは５Ｕ／mlのＩ
ＦＮ−γとおよそ同じＡＤＣＣ刺激活性を有していた。
５Ｕ／mlのＩＦＮ−α及びＩＦＮ−βはＡＤＣＣに対す
る効果を本質上有しなかったが、しかしＣＳＦ−１の存
在下で５０Ｕ／mlのいずれかのＩＦＮのみを用いて見ら
れるレベルに刺激された殺腫瘍を有していた。同様の効
果がｒｈＩＬ−２について見られ、５Ｕ／mlのＩＬ−２
のみによる２日間のマクロファージの処理がマクロファ
ージＡＤＣＣを実質的に補助した。ＣＳＦ−１はこの強
いＩＬ−２により誘導された活性を中程度に増強した。
しかしなから、ＩＬ−２が１Ｕ／ml又は０．２Ｕ／mlの
低い非有効濃度で使用された場合、ＣＳＦ−１の添加は
殺腫瘍活性に対する強い増強効果を示した。
【００７５】他のリンホカインをＡＤＣＣの一次刺激剤
として試験した。１．１０もしくは１００Ｕ／mlのｒｈ
ＴＮＦのみ又は１０００Ｕ／mlのＣＳＦ−１を伴う２日
間のマクロファージのインキュベーションはＡＤＣＣ活
性を有意に誘導しなかった。０．２〜５０Ｕ／mlのｒｈ
ＩＬ−１α又はβ及び１〜１００Ｕ／mlのネズミｒＩＬ
４も単独で又はＣＳＦ−１を伴ってＡＤＣＣを刺激しな
かった。ＣＳＦ−１の代りに使用できるかもしれない他
の補助因子を見出すための試みが行われた。１０，１０
０又は１０００ｕ／mlで試験されたネズミｒＧＭ−ＣＳ
Ｆ及びｒＩＬ−３は、ＣＳＦ−１とは対照的に、マクロ
ファージの標準的２日前処理において、単独で又はＩＦ
Ｎγと共にＡＤＣＣを補助しなかった。これらのサイト
カインは培地中で２日間のインキュベーションの後、マ
クロファージの非存在下でＲ１．１の標的の増殖に対す
る効果を有しなかった。
【００７６】抗腫瘍効果についてのＣＳＦ−１の生体内
試験 Ａ．Ｍｅｔｈ Ａ肉腫モデル ＣＶ−１細胞系からの組換生産されたＣＳＦ−１（１５
８）２×１０7 ユニット／mg（ＬＡＬアッセイ：２ngＬ
ＰＳ／ml：８ngＬＰＳ／mlＣＳＦ）を５０μｇ／一投与
で１日２回５日間にわたり、７日前にＭｅｔｈ Ａ肉腫
を皮下移植された２０ｇのマウス（群当り３マウス）に
服腔内注射した。ＣＳＦ−１処置の開始の後６日間にわ
たり、３匹の未処置マウス及び３匹の処置マウスを体重
及び腫瘍体積について評価した。体重の変化により測定
される毒性の証拠はなかった。７日目に、各群からの一
匹のマウスを病理形態学的比較分析のために殺した（顕
著な兆候はなかった）。残り４匹のマウスをＭｅｔｈ
Ａモデルにおいて通常の１４日間にわたり評価した。結
果を次の表に示す。
【００７７】
【表５】 結果が示すところによれば、特に６日目の腫瘍体積測定
においてＣＳＦ−１介在活性の証拠が存在した。ＣＳＦ
−１群と対照群との間の差は処理の開始後数日から始ま
りその後数日の間で最大であり、その後腫瘍はその通常
の増殖速度にもどった。これらのデーターが示唆すると
ころによれば、１日多数回の投与（この投与量において
長時間にわたり有効性を改善するための連続注入）又は
より高い投与レベル及び薬剤を投与しない日を含めるた
めの変化したスケジュールが有効性を高めることができ
る。
【００７８】大腸菌からのＣＳＦ−１（１５０）、ＣＳ
Ｆ−１（１９０）、及びＣＳＦ−１（２２１）を用いて
類似の結果が見られた。５匹のマウスから成る群を用い
てこの方法を行った。５０μｇ／投与の各生成物を用
い、そして計画が１０日に延長されそして投与が７〜８
日隔てて行われた大腸菌１５０物質及び１９０物質の場
合の除き、投与（１日２回で５日間）は類似していた。
次の表は、各ＣＳＦ−１由来物質について、処理動物の
ΔＴＶを対照のΔＴＶで除した％として結果を示してい
る。
【００７９】
【表６】 Ｂ．Ｂ１６転移モデル Ｂ１６ネズミ黒色腫細胞系における転移を回避するため
にＣＳＦ−１を用いる第二の生体内腫瘍モデルも検討し
た。０．２mlのＣｕ+2及びＭｇ+2不含有ＨＢＳＳ中に懸
濁した腫瘍細胞１×１０5を麻酔してないマウスの側尾
静脈に接種した。腫瘍細胞の接種の２１日後、マウスを
殺しそして死体解剖した。解剖の間、肺及び脳を摘出
し、水ですすぎ、そして秤量した。次に、肺をボーイン
（Ｂｏｕｉｎ）の溶液中に固定し、そして一対の肺当た
りの表面腫瘍小結節の数を拡大鏡により決定した。
【００８０】組換ヒトＣＳＦ−１（９×１０7 Ｕ／mlの
力価及び０．８２ng／mgＣＳＦ−１のエキソトキシンレ
ベルを有する）をすべての実験のために使用した。各実
験の前にＣＳＦ−１を凍結ストックから新たに得、そし
て注射の直前にＵＳＰ０．９％塩水中に稀釈した。ＣＳ
Ｆ−１を１日１回（ＱＧ）×１０日間のスケジュールで
静脈内投与した。使用した投与レベルを下記の表に示
す。非特異的且つ非療法的蛋白質から成る負対照として
ＵＳＰヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）又は煮沸したＣＳ
Ｆ−１を使用した。ＣＳＦ−１を３０分間煮沸してＣＳ
Ｆ−１活性を不活性化した。
【００８１】力価データーが示すところによれば、１×
１０5 個の腫瘍細胞の静脈内接種の３日から初めてＱＤ
×１０で静脈内投与されたＣＳＦ−１は肺転移の中央値
の有意な低下を示した。この投与レベル（２．５〜５．
０mg／kg）において致死によって測定される明確な毒性
は観察されなかった。
【００８２】
【表７】 抗腫瘍効果についてのＣＳＦ−１単独又はＩＦＮ−γと
組合わせての試験管内試験 下記の方法はＡ３７５ヒト異性黒色腫細胞系標的細胞に
対するＣＳＦ−１のみ及びＩＦＮ−γとの組合わせにお
ける試験管内細胞毒性効果を示す。この例は、腫瘍細胞
に対する細胞毒性の増強について、ＣＳＦ−１及びＩＦ
Ｎ−γのほかに多くのサイトカインを試験した。
【００８３】単核細胞（ＭＮＣ）をヘパリン処理した静
脈細胞又は健康な正常志願者のバフィーコートから、リ
ンパ球分離媒体（ＬＳＭ−オオルガノンテクニカ社、ダ
ルハム、Ｎ．Ｃ）上での密度勾配遠心により分離した。
次に、ＭＮＣをＰＢＳで２回洗浄し、そして４９．２％
等張Ｐｅｒｃｏｌｌ（ファルマシヤ）上に重層しそして
１５００ＸＧにて２５分間遠心した。界面の単球バンド
（細胞遠心調製物の形態学的分析により＞８０％純度の
単球）を収得し、そして３７℃でのプラスチック付着に
よりさらに精製した。付着は９６ウエルプレート中で
１．２×１０5 細胞／ウエルの密度にて行った。１時間
後、非付着細胞を激しい洗浄により除去し、〜１×１０
5 細胞／ウエルが残した。
【００８４】精製された単球を、３日間にわたり、ＣＳ
Ｆ−１（大腸菌Ｎ▽３Ｃ▽２２１）、ＩＬ−２，ＩＬ−
３，ＩＬ−４，ＧＭ−ＣＳＦ（すべてGenzyme Corp. よ
り）、ＩＬ−２（シタス社）、又は培地のみを含有する
０．１％ＦＣＳ中で培養した（１°誘導）。３日後、単
球を洗浄し、そして次に２°の誘導剤と共にさらに２日
間インキュベートした。ＣＳＦ−１を伴う又は伴わない
１°の誘導も幾つかの実験においてフラスコ中で行っ
た。単球は組織培養フラスコ中で直接付着し、非付着細
胞を除去し、そして１°の誘導剤を加えた。１°の誘導
の後、単球をトリプシン処理及びおだやかなかきとりに
より収得し、ハリパンブルー排除により生存細胞の計数
を行い、そしてウエル当り１×１０5 細胞を９６ウエル
プレート中にプレートしさらに２日間置いた。
【００８５】ＷＥＨＩ１６４殺腫瘍アッセイ〔Colotta
ら（1984)J. Immunol. 132 : 936〕を用いてサイカイニ
ンの細胞毒性を試験した。要約すれば、活性な対数期の
ＷＥＨＩ１６４標的細胞を１μｇ／mlのアクチノマイシ
ンＤ（ａｃｔ Ｄ）により３時間前処理しそして２００
μＣｉの51Ｃｒにより１時間標識するか、又はａｃｔＤ
と51Ｃｒとで同時に１時間３７℃にて５％ＣＯ2 中で処
理した。
【００８６】特にことわらない限り、単球から１００μ
ｌの培養上清を除去した後、標識された標的細胞を１０
０μｌの容量でエフェクター細胞に加えてエフェクター
対標的の比率を１０：１とした。２００μｌの容量の細
胞を３７℃にて５％ＣＯ2 中で６時間インキュベートし
た。次に、プレートを机上回転バケット遠心機中で１２
００rpm にて５分間遠心した。１００μｌの上清を各ウ
エルから取り出し、そしてγカウンターで計数した。ア
クチノマイシンＤによる前処理を略したほか、Ｐ８１５
標的細胞を同様な処理し、そして標的細胞とエフェクタ
ー細胞とを１８時間同時インキュベートした。誘導され
た細胞毒性を次の式を用いて計算した。
【００８７】
【数１】 ここで、実験cpm ＝エフェクター細胞＋標的細胞＋誘導
剤 自然cpm ＝エフェクター細胞＋標的細胞＋培地 最大cpm ＝１％ＳＤＳで細胞溶解された標的細胞のみ 結果を次の表に示す。
【００８８】
【表８】
【００８９】ＣＳＦ−１により誘導される活性化レベル
は可変であるが、４０のこの様な提供者の内１６がＣＳ
Ｆ−１のみによる刺激に対して１０％と４９％の間の増
強された殺腫瘍活性を示した。次の表において、種々の
２°の誘導剤の添加に先立って１°の誘導剤としてＣＳ
Ｆ−１を用いた。
【００９０】
【表９】 ２°の誘導剤として試験されそしてＣＳＦ−１の存在下
又は非存在下で効果を有しないことが見出された他の因
子には５００Ｕ／mlまでのＩＬ−１，ＩＬ−３，ＩＬ−
４及びＧＭ−ＣＳＦが含まれた。
【００９１】ネズミ抗ウイルス活性の試験管内刺激 チオグリコレートで誘導されたネズミ付着マクロファー
ジをＣＳＦ−１と共に３日間インキュベートし、そして
ＶＳＶを一夜感染させた〔Lee, M.T. ら（1987)J. Immu
nol. 138 : 3019 −3022〕。次の表は付着したままの細
胞の５５０nmでの吸光度により測定したクリスタルバイ
オレット染色を示す。
【００９２】
【表１０】 従って、ＣＳＦ−１で処理された細胞はＶＳＶに対する
マクロファージの保護を示した。
【００９３】ＣＳＦ−１によＣＭＶ感染の生体内処理 異系交配ＣＤ−１を、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）
の致死量より少い量での感染の２日前から始めて１日１
回５日間にわたり、ＣＶ−１細胞系から生産されたＣＳ
Ｆ−１（１５８）により腹腔内処理した。マウスを感染
の３日後に殺しそして脾臓のごとき標的器官でのウイル
スの増殖の程度をプラークアッセイにより評価した。そ
の結果が示すところによれば、ＣＳＦ−1 により処理さ
れたマウスは食塩水で処理された対照マウスと比べて有
意に低い（５７．８％低い）脾臓でのウイルス力価を示
し、ＣＭＶ感染がＣＳＦ−１で処理されたマウスにとっ
てあまり深刻でないことが示された。
【００９４】別途、大腸菌（Ｎ▽３Ｃ▽２２１）で生産
されたＣＳＦ−１を異系交配ＣＤ−１マウスでの致死的
ネズミＣＭＶ感染モデルにおいて試験した（これは、器
官のウイルス力価がモニターされた、致死量より少い投
与量を用いる上記の実験と対象的である）。ＣＳＦ−１
がウイルスチャレンジの２４時間前に３〜４mg／kg（マ
ウス当りの単位投与量）でマウスに腹腔内投与された場
合、食塩水で処理された対照に比べて生存の有意な増加
が存在した。従って、ＣＳＦ−１は単独で又は他のリン
ホカインと組合わせて一般にウイルス感染の治療のため
に使用することができ、そして特に免疫抑制ウイルス感
染、例えば後天性免疫不全症候群（ＡＴＤＳ）において
有効である。好ましい投与量はマウス１日当り約０．４
〜４mg／kgのＣＳＦ−１である。
【００９５】ＣＳＦ−１により細胞感染の生体内予防処
置 異系交配ＣＤ−１マウスに、宿主への導入の後にグラム
陰性敗血症の原因となる細菌である臨床単離大腸菌の致
死量（ＬＤ100 ＝６×１０7 ＣＦＭ）によるチャレンジ
の１日前に、ＣＶ−１細胞系から生産されたＣＳＦ−１
の一投与量（１０μｇ／kg）を個々に投与した。次に、
注射後７日間マウスを生存についてモニターした。ＣＳ
Ｆ−１による前処置が、致死量の大腸菌によりチャレン
ジされたマウスの生存を有意に増加させた。
【００９６】この実験はまたＮ▽３Ｃ▽２２１Ａ ＣＳ
Ｆ−１を用いても行われた。ＣＳＦ−１の各ロットを、
４倍の稀釈で、３×１０6 〜２．７×１０8 ユニット／
kg体重の投与量で試験した。最少保護投与量は、食塩水
又は煮沸ＣＳＦ−１対照と比べて統計的に有意な（Ｆｉ
ｓｈｅｒのＥｘａｃｔ検定において０．０５未満のＰ
値）生存の増加を示す単位投与量（１日１回、５日間
ｉ．ｐ．投与）として定義された。
【００９７】
【表１１】
【００９８】白血球減少感染モデル ５０mg／kgのサイクロホスファミド（ＣＹ）により前処
置されたマウスにおける大腸菌感染のＣＳＦ−１により
誘導される保護の結果。マウスについてのＣＹのＬＤ50
は約４００mg／kgであり、本発明者らが用いたより低い
ＣＹ投与量はＬＤ50の１／８であった。この投与量は、
３日速くｉｐ注射された場合、全白血球細胞及び好中球
の減少を誘導し、そしてマウスを大腸菌感染に対してよ
り一層感染性にした（例えば、３×１０7 cfu ／マウス
での感染はＣＹ処理されたマウスの１００％を殺した
が、この投与量のＣＹを与えられなかったマウスのわず
か２０％を殺した。ＣＳＦ−１がＣＹ処理マウスに与え
られた場合（０．８９mg／kgのＣＳＦ−１、１日１回４
日間ｉｐ）、食塩水を与えられマウスにおいて３０％で
あるのに対して１００％の生存が存在した。
【００９９】白血球細胞数の生体内刺激 異系交配ＣＤ−１マウスに精製組換ヒトＣＳＦ−１を２
mg／kg／投与で１日３回５日間続けて投与した。合計白
血球細胞数は食塩水処理された対照マウスにおける６．
８２１／μｌからＣＳＦ−１で処理されたマウスにおい
て１２，０００〜１３，０００／μｌに増加した。さら
に、好中球数は食塩水で処理された対照マウスにおける
１，０７８／μｌに比べてＣＳＦ−１で処理されたマウ
スにおける６，８２１／μｌに増加した。この効果はＣ
ＳＦ−１の投与量及び投与スケジュールに依存する。末
梢血好中球の増加はＣＳＦ−１の腹腔内単位投与の後２
〜４時間で検出できた。これらの結果が示すところによ
れば、顆粒球生産の刺激剤及び白血球数の増強剤として
ＣＳＦ−１の投与は臨床医学及び獣医学において有用で
あろう。
【０１００】創傷の治癒におけるＣＳＦ−１ ＣＳＦ−１を創傷の治癒について、動物モデル及び方
法、例えばＧｏｏｄｓｏｎ及びＨｕｎｔのＧｏｒｅｔｅ
ｘミニチュアー創傷治癒モデル〔 (1982) J. Sug. Res.
33 : 394 〕を用いて測定する。この方法においては、
移殖されたＧｏｒｅｔｅｘチューブが侵入マクロファー
ジ、繊維芽細胞及び他の結合組織細胞、並びにコラーゲ
ン及びフィブリンの沈着により満たされる。治癒はチュ
ーブの中味を顕微鏡検査することにより測定される。
【０１０１】第二のモデルはEisengerら〔（1988) Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 1937〕の切開創傷治癒
モデルであり、この場合は創傷が視覚観察され、そして
治癒、細胞密度、及びのう毛から生ずる上皮細胞層の数
をモニターするためにパンチ生検体が採取される。第三
のモデルは漿液モデル、例えばFotev ら〔（1987) J. P
athol. 151 : 209〕の熱傷睾丸漿膜モデルであり、この
方法においては治癒が傷ついた部位の中皮表面形成の程
度により測定される。これらのモデルのそれぞれの教示
を引用によりこの明細書に組み入れる。
【０１０２】一般に、ＣＳＦ−１は、局所投与のための
上皮由来因子（ＥＤＦ）を用いる切開創傷治癒モデル参
照に記載されているように塩水中１０，０００〜１，０
００，０００Ｕ／mlのＣＳＦ−１に非付着性外科包帯を
浸漬することにより創傷の部位に適用される。あるい
は、Ｇｏｏｄｓｏｎ及びＨｕｎｔ（前掲）に記載されて
いるように、類似の量のＣＳＦ−１がＧｏｒｅｔｅｘチ
ューブに移殖の際に導入され、あるいはＣＳＦ−１はま
た、１０〜１，０００μｇ／kg／日の量での１日１〜３
回の全身処置（ｉ．ｖ．，ｉ．ｐ．、又はｓ．ｃ．）に
より、創傷の部位に適用される（Ｇｏｒｅｔｅｘチュー
ブ中で、包帯中又は包帯下で、又は漿膜キャビティーへ
の注射により）。
【０１０３】ＣＳＦ−１の存在下又は非存在下で各モデ
ルの治癒速度が測定され、そして組織の再生が評価され
る。ＣＳＦ−１はまた創傷の治癒を促進するための他の
増殖因子、例えば、ＥＤＦ、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、
繊維芽細胞増殖因子（塩基性又は酸性ＦＧＦ）、血小板
由来増殖因子（ＰＤＧＦ）又は形質転換増殖因子（ＴＧ
Ｆα及びβ）、ＩＬ−１及び他の物質、例えばソマトメ
ジンＣおよびビタミンＣと組合わせて使用することもで
きる。
【０１０４】Ｆ．ＣＳＦ−１の製剤及び投与量 組換生産されたヒトＣＳＦ−１は標準的製剤法を用いて
投与のために製剤化することができる。通常ＣＳＦは注
射可能な形で調製することができ、これは唯一の活性成
分として、又は補完的もしくは類似の活性を有する他の
蛋白質又は他の化合物との組合わせにおいて使用され得
る。この様な他の化合物には他の抗腫瘍剤、例えば化学
療法剤、例えばアドレアマイシン、又はリンホカイン、
例えばＩＬ−１，−２，−３及び−４，α−，β−及び
γ−インターフェロン、ＣＳＦ−ＧＭ及びＣＳＦ−Ｇ、
並びに腫瘍壊死因子が含まれるであろうＣＳＦ−１活性
成分の効果はこの様な追加の成分の存在により増加又は
改善され得る。
【０１０５】上記のように、ＣＳＦ−１は有利な態様で
適切な血液細胞と相互作用することができ、そしてそれ
故に本発明の組成物は、場合によっては追加のリンホカ
イン又はサイトカインの存在下でのＣＳＦ−１とこれら
の細胞のインキュベーション混合物を包含する。この様
なインキュベーション混合物の上清画分、又は細胞を含
有する全体混合物のいずれも使用することができる。あ
る組合わせには時間差、例えばＣＳＦ−１に続き１〜２
日後にγ−インターフェロンを投与するのが好ましい場
合がある。
【０１０６】本明細書に記載されるＣＳＦ−１は一般
に、癌を除くすべての症状のため、例えば感染性疾患の
処置、創傷の治癒、骨髄造血の回復及び免疫のために、
単一ボルス投与で又は２４時間にわたって分けて１日当
り０．００１〜１mg／kgの量で療法的に投与される。血
液好中球及び単球数を回復するため及び感染を予防する
ために用いられるＣＳＦ−１投与とは対照的に、直接マ
クロファージ介在抗腫瘍効果のために１日当り約０．１
〜５mg／kgが癌患者に投与される。下記の寄託が行われ
ている。
【０１０７】
【表１２】
【０１０８】これらの寄託は特許手続のための微生物の
寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定及びそ
の規則（ブダペスト条約）のもとに行われた。これは寄
託の日から３０年間の生存培養物の維持を保証する。こ
れらの寄託物はブダペスト条約の規定のもとに、及び関
連する米国特許の発行の後の永久的且つ無制限の入手可
能性を保証する寄託者とＡＴＣＣとの契約に従ってＡＴ
ＣＣにより入手可能にされる。
【０１０９】この契約は、適当な条件下で培養された場
合において寄託培養物が死滅し又は失われもしくは破壊
された場合に、通知の後速やかに同じ培養物の生存検体
によりそれが置き代えられることに同意する。寄託物の
入手可能性は、いずれかの政府の権威のもとにその特許
法に従って認められた権利に反しての発明の実施の承諾
であると解してはならない。
【０１１０】これらの寄託は関連する公衆の便宜のため
に行われたものであり、記載が発明の実施を可能にする
ために十分でないこと又は本発明がこれらの特定の構成
物に限定されることの自白を構成するものではない。当
業者が寄託された構成物を複製し、ＤＮＡの代替形又は
それを含有する生物体を構造することを可能にし、請求
の範囲に記載されている発明の実施を可能にする完全な
記載が上に記載されている。本発明の範囲は例示された
具体例により制限されると解すべきではなく添付される
請求の範囲に従って決定されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＣＳＦ−１をコードするｃＤＮＡクロ
ーンのＤＮＡ及び推定されるアミノ酸配列を示す。
【図２】図２は、ＣＳＦ−１をコードするｃＤＮＡクロ
ーンのＤＮＡ及び推定されるアミノ酸配列を示す。
【図３】図３は、ＣＳＦ−１をコードするｃＤＮＡクロ
ーンのＤＮＡ及び推定されるアミノ酸配列を示す。
【図４】図４は、ヒトＣＳＦ−１配列をコードする３．
９kb Ｈｉｎｄ III 断片の配列決定された部分及びエ
クソン領域の推定アミノ酸配列を示す。
【図５】図５は、ヒトＣＳＦ−１配列をコードする３．
９kb Ｈｉｎｄ III 断片の配列決定された部分及びエ
クソン領域の推定アミノ酸配列を示す。
【図６】図６は、ヒトＣＳＦ−１配列をコードする３．
９kb Ｈｉｎｄ III 断片の配列決定された部分を示
す。
【図７】図７は、腫瘍細胞を殺すマクロファージの能力
の増強におけるＣＳＦ−１及び他のコロニー刺激因子の
比較を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 チョン，コン テク アメリカ合衆国，カリフォルニア 94587, ユニオン シティ，フェロウズ ストリー ト 4343 (72)発明者 デブリン，ジェームズ ジェイ アメリカ合衆国，カリフォルニア 94549, ラファイエット アッパー バレー ドラ イブ 1146 (72)発明者 ジメルマーン，ロバート アメリカ合衆国，カリフォルニア 94563, オリンダ，ラ クレスタ ロード 64 (72)発明者 クング，アダ エイチ．シー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94569, ウォルナット クリーク，プリークネス ドライブ 640

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 対象における創傷の治癒のための、コロ
    ニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１）を含んで成る組成物。
  2. 【請求項２】 前記組換えＣＳＦ−１が好酸球分化因
    子、酸性又は塩基性繊維芽細胞増殖因子、上皮増殖因
    子、形質転換増殖因子α又はβ、ＩＬ−１及びソマトメ
    ジンＣから成る群から選択された１又は複数の増殖因子
    と共に投与される、請求項１に記載の組成物。
JP9063495A 1987-09-22 1997-03-17 組換えコロニー刺激因子−１を含んで成る医薬組成物 Expired - Fee Related JP2846629B2 (ja)

Applications Claiming Priority (4)

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005515232A (ja) * 2002-01-14 2005-05-26 ザ・ボード・オブ・トラスティーズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・イリノイ 幹細胞の移動および増殖を促進するための修飾されたピリミジン化合物の使用

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5837229A (en) * 1985-02-05 1998-11-17 Chiron Corporation Uses of recombinant colony stimulating factor-1
US5422105A (en) * 1985-02-05 1995-06-06 Cetus Oncology Corporation Use of recombinant colony stimulating factor 1
US5104650A (en) * 1985-02-05 1992-04-14 Cetus Corporation Uses of recombinant colony stimulating factor-1
US5556620A (en) * 1985-02-05 1996-09-17 Cetus Oncology Corporation Use of recombinant colony stimulating factor-1 to enhance wound healing
AU625807B2 (en) * 1987-09-22 1992-07-16 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Uses of recombinant colony stimulating factor-1
WO1990012877A1 (en) * 1989-04-19 1990-11-01 Cetus Corporation Multifunctional m-csf proteins and genes encoding therefor
ES2086526T3 (es) * 1989-12-13 1996-07-01 Otsuka Pharma Co Ltd Aplicacion medicinal de m-csf.
US5714140A (en) * 1989-12-13 1998-02-03 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Method for inhibiting the production of bioactive IL-1 by administering M-CSF
EP0955056A1 (en) * 1990-08-23 1999-11-10 Chiron Corporation Recombinant colony stimulating factor-1 for treatment of fungal infection
US5087453A (en) * 1990-11-01 1992-02-11 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Method for the treatment of bacterial caused weight loss and/or hypoglycemia
WO1998039449A1 (en) * 1997-03-04 1998-09-11 Chiron Corporation COMPOSITIONS AND USE OF M-CSF-alpha
RU2256471C1 (ru) * 2003-11-13 2005-07-20 Мориков Дмитрий Дмитриевич Способ лечения лейкопении при химиолучевой терапии
US8231536B2 (en) 2008-09-19 2012-07-31 Medtronic, Inc. Method and apparatus for detecting respiratory effort in a medical device
US9913880B2 (en) 2011-02-18 2018-03-13 Stemdr Inc. Method of treating sepsis or septic shock
BR112019024556A2 (pt) 2017-05-24 2020-06-23 Novartis Ag Proteínas enxertadas com citocina de anticorpo e métodos para uso no tratamento de câncer

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH03501382A (ja) * 1987-09-22 1991-03-28 カイロン　コーポレイション 組換えコロニー刺激因子‐１の使用

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4230697A (en) * 1978-07-03 1980-10-28 Morinaga Milk Industry Co. Ltd. Virus-inactivated HGI-glycoprotein capable of stimulating proliferation and differentiation of human granulocyte, process for preparing same and leukopenia curative containing same
US4342828A (en) * 1979-07-20 1982-08-03 Morinaga Milk Industry Co., Ltd. Method for producing substance capable of stimulating differentiation and proliferation of human granulopoietic stem cells
US4847201A (en) * 1985-02-05 1989-07-11 Cetus Corporation DNA encoding for CSF-1 and accompanying recombinant systems
AU594045B2 (en) * 1985-02-05 1990-03-01 Chiron Corporation Recombinant colony stimulating factor-1
AU590543B2 (en) * 1985-02-05 1989-11-09 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Purification of native colony stimulating factor-1
US4921837A (en) * 1985-11-27 1990-05-01 Genetics Institute Inc. Treatment of AIDS-type disease
JPS62169799A (ja) * 1986-01-22 1987-07-25 Otsuka Pharmaceut Co Ltd マクロフア−ジ分化増殖促進物質
JP2579981B2 (ja) * 1986-05-06 1997-02-12 ジェネティックス・インスチチュート・インコーポレーテッド Ｍ―ｃｓｆの生産方法
JP2583770B2 (ja) * 1986-09-17 1997-02-19 大塚製薬株式会社 遺伝子
AU8313187A (en) * 1986-12-31 1988-07-07 Cetus Corporation Pharmaceutical composition of colony stimulating factor-i and granulocyte colony stimulating factor
WO1988006452A1 (en) * 1987-03-02 1988-09-07 Genetics Institute, Inc. Compositions for enhancing adcc therapy
DK54589A (da) * 1988-02-08 1989-08-09 Otsuka Pharma Co Ltd Humane kolonistmulerende faktorer

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH03501382A (ja) * 1987-09-22 1991-03-28 カイロン　コーポレイション 組換えコロニー刺激因子‐１の使用

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005515232A (ja) * 2002-01-14 2005-05-26 ザ・ボード・オブ・トラスティーズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・イリノイ 幹細胞の移動および増殖を促進するための修飾されたピリミジン化合物の使用
US7618621B2 (en) 2002-01-14 2009-11-17 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Mammalian multipotent neural stem cells and compositions, methods of preparation and methods of administration thereof
US7635467B2 (en) 2002-01-14 2009-12-22 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Mammalian multipotent stem cells and compositions, methods of preparation and methods of administration thereof
US7687505B2 (en) 2002-01-14 2010-03-30 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Use of modified pyrimidine compounds to promote stem cell migration and proliferation
US8192732B2 (en) 2002-01-14 2012-06-05 University Of Central Florida Research Foundation, Inc. Mammalian multipotent stem cells and compositions, methods of preparation and methods of administration thereof
US8273756B2 (en) 2002-01-14 2012-09-25 University Of Central Florida Research Foundation, Inc. Use of modified pyrimidine compounds to promote stem cell migration and proliferation
US9084789B2 (en) 2002-01-14 2015-07-21 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Use of modified pyrimidine compounds to promote stem cell migration and proliferation
US9358234B2 (en) 2002-01-14 2016-06-07 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Mammalian multipotent stem cells and compositions, methods of preparation and methods of administration thereof

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