JPH08505403A

JPH08505403A - 安定なタンパク質：リン脂質組成物及び方法

Info

Publication number: JPH08505403A
Application number: JP7510908A
Authority: JP
Inventors: コリンズ，デイビツド; チヤ，ヨーンシク
Original assignee: アムジエン・インコーポレーテツド
Priority date: 1993-10-06
Filing date: 1994-09-29
Publication date: 1996-06-11
Anticipated expiration: 2014-01-27
Also published as: IL111170A0; CA2150939C; AU7923994A; KR100372006B1; IL111170A; FI952738L; AU683698B2; ATE222752T1; EP0671905A1; WO1995009611A3; EP0671905B1; HU9502053D0; CN1206982C; NO314064B1; DE69431236D1; RU2119791C1; FI952738A0; NO952210L; NO952210D0; NZ274705A

Abstract

(57)【要約】本発明は、溶融球状態に遷移することが可能なタンパク質を負に帯電した脂質小胞と接触させ、熱誘導凝集、変性及び活性損失に対してタンパク質を安定化させる、安定なタンパク質組成物及び関連方法に関する。タンパク質：リン脂質複合体はタンパク質の二次及び三次構造を直接安定化させ、組成物は高温調合及び新規送達ビヒクルにおいて有用である。

Description

【発明の詳細な説明】安定なタンパク質：リン脂質組成物及び方法発明の背景本発明は、溶融球状態に遷移することが可能なタンパク質の二次及び三次構造を安定化させるために有用なタンパク質：リン脂質構造に関する。より特定的には本発明は、高い安定性を有しており、Ｇ−ＣＳＦ製剤及び新規Ｇ−ＣＳＦ送達ビヒクルで使用することが可能なＧ−ＣＳＦ：リン脂質組成物に関する。数種のタンパク質が溶融球状態（ＭＧＳ）に遷移することは報告されている。ＶａｎｄｅｒＧｏｏｔ，Ｆ．Ｇ．，Ｎａｔｕｒｅ３５４，４０８−４１０（１９９１）。溶融球状態のタンパク質は天然タンパク質と同様の二次構造を示すが、固定した三次構造を欠く。Ｐｉｔｓｙｎら，ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ２６２：１，２０−２４（１９９０）。場合により、この状態への遷移に伴い、それまで隠されていたタンパク質の疎水性領域が露出する。重要な疎水性残基を露出させることにより、ＭＧＳはタンパク質の凝集及び沈殿における中間体となり得る。ＭＧＳコンフォーメーションは、遠ＵＶ領域における円二色性を芳香族側鎖のスペクトル（近ＵＶ円二色性及び蛍光）と比較することにより検出することができる。溶融球状態は遠ＵＶ円二色性変化の不在下で芳香族基のスペクトル変化を示し（Ｂｙｃｈｋｏｖａら，ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ２３８：２３１−２３４（１９８８））、ある種のタンパク質による膜浸透に関与し得る（Ｂｙｃｈｋｏｖａら，ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ２３８：２３１−２３４（１９８８）；ＶａｎｄｅｒＧｏｏｔ，Ｆ．Ｇ．，Ｎａｔｕｒｅ３５４，４０８−４１０（１９９１））。凝集前にＭＧＳに遷移することが知られている２種のタンパク質は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）である。これらの２種のタンパク質は所定の規定条件下で安定化させることができるが、タンパク質の二次及び三次構造を安定化させることによりこれらの材料の貯蔵寿命を延長することが必要とされている。ヒト組換えＧ−ＣＳＦは、感染を防除するために使用される白血球の１種である好中球を選択的に刺激する。現在では、組換えＧ−ＣＳＦであるＦｉｌｇｒａｓｔｉｍが治療用として利用可能である。種々の条件下のＧ−ＣＳＦの構造は広く研究されている（Ｌｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２６７，８７７０−８７７７（１９９２））。Ｇ−ＣＳＦは疎水性であるため、貯蔵寿命を延長するように調合することは困難である。ある種の疎水性タンパク質の調合物は、長期貯蔵中に二量体及び高次凝集物（高分子）を形成するため、活性を失う。貯蔵中に脱アミド化及び酸化等の他の化学変化が生じる恐れもある。更に、Ｇ−ＣＳＦ調合者は変性から保護しなければならず、特にタンパク質の二次及び三次構造の安定性を維持するように注意しなければならない。ヒトＧＭ−ＣＳＦはマクロファージ及び顆粒球祖先細胞のｉｎｖｉｔｒｏ増殖に持続的に必要な２２ｋＤａ糖タンパク質である。ヒトＧＭ−ＣＳＦは更に、顆粒球及びマクロファージを形成するこれらの祖先細胞の不可逆的関与を制御する。その他、成熟細胞型の機能的活性の調節（Ｇｏｕｇｈら，Ｎａｔｕｒｅ，３０９，７６３−７６７（１９８４））や、認識された化学誘引物質に向かう走化性の増加（Ｗｉｌｌｉａｍｓら，Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，第４版（１９９０））等の生物活性もある。ＧＭ−ＣＳＦは更に単球の産生を刺激し、従って単球減少症等の単球疾患の治療に有用であり得る。ヒトＧＭ−ＣＳＦは多くの起源から入手及び精製することができる。組換えヒトＧＭ−ＣＳＦの製造手順はＢｕｒｇｅｓｓら，Ｂｌｏｏｄ，６９：１，４３− ５１（１９８７）により既に記載されている。参考資料として本明細書の一部とする米国特許第５，０４７，５０４号（Ｂｏｏｎｅ）により、商業規模量の非グリコシル化形態のＧＭ−ＣＳＦを原核宿主細胞発現産物として製造することが可能になった。Ｇ−ＣＳＦ及びＧＭ−ＣＳＦ等のタンパク質を操作するために過去に試みられている１つの方法はリポソームの使用である。リポソームは、非水溶性極性脂質、特にリン脂質により形成される完全に閉鎖した脂質二重層膜である。リポソーム小胞は単一膜二重層（単ラメラ）でもよいし、多重膜二重層（多重ラメラ）でもよい。二重層は親水性（極性）「ヘッド」領域と疎水性（非極性）「テール」領域とを有する２つの脂質単分子層から構成され、疎水性テールは二重層の中心に向いており、親水性ヘッドは水相に向いている。リポソームの安定性、剛性及び浸透性は、リン脂質組成の変化、温度変化、ステロールの配合又は帯電両親媒性分子の組込みにより変化し得る。リポソームの基本構造は当業者に公知の種々の方法により形成することができる。リポソームはその形成プロセスにおいて水性チャンネルに水溶質をトラップし、可変速度で放出することができる。リポソームが酵素を細胞に導入してその代謝を変化させ得ることが発見されて以来（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，ＮｅｗＥｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２９５，７０４−７１０，７６５−７７０（１９７６））、リポソームは目的薬剤送達という課題に対する解答として期待された。その結果、リポソームの疎水性層又は疎水性コアの内側に封鎖された薬剤、ビタミン及びタンパク質の遅放性デポー製剤としてリポソームを使用する開発研究に医薬業界で関心が高まっている。リポソームを薬剤キャリヤーとして使用するように試みた研究者はいくつかの問題に遭遇したため、その使用成果は限られていた。例えば、リポソームはトラップした抗原への強力な免疫付加物として作用することが知られており、異種発生起源の酵素又は他のタンパク質をリポソームにトラップする場合には注意が必要である。更に、薬剤の拡散速度を制御することは困難である。これは、リポソームの固有の不安定性と、所定の薬剤の拡散を助長する所定の血液成分の存在とに起因する。更に、その性質によりリポソームにトラップしにくい物質もあり、従って、このような物質は循環中に迅速に拡散する。最後に、細胞又は肝臓もしくは脾臓以外の臓器に標的するという問題もあった。リポソーム、リポソームに組込まれた物質及び薬剤キャリヤーとしてのリポソームの使用に関連する問題の優れた論文は、ＤｒｕｇＣａｒｒｉｅｒｓｉｎＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＭｅｄｉｃｉｎｅ，第１４章，２８７−３４１（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｎ．Ｔ．，１９７９）に所収のＧｒｅｇｏｒｙＧｒｅｇｏｒｉａｉｄｉｓ著“Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ”に報告されている。リポソームを薬剤キャリヤーとして使用する試みについては多数のものが報告されているが、ペプチド及び／又はタンパク質の構造を安定化させることにより治療用ペプチド又はタンパク質の貯蔵寿命を延長することを目的としたリポソームの使用については殆ど開示されていない。国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９０／０５１６３号（発明の名称“ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＰｅｐｔｉｄｅｓａｎｄＰｒｏｔｅｉｎｓ”，Ｈｏｓｔｅｔｌｅｒら）には、空気／水界面におけるポリペプチド及び／又はタンパク質の蓄積を阻止し、容器表面へのポリペプチド及び／又はタンパク質の吸着を阻止するために、ポリペプチド及び／又はタンパク質を可溶化する医薬的に許容可能な希釈剤としての空のリポソームの使用が開示されている。Ｈｏｓｔｅｔｌｅｒらは、負に帯電したリン脂質を約５０モル％まで添加し得ること、及び天然リン脂質であるホスファチジルコリンが好適リポソームであることを開示している。しかしながら、Ｈｏｓｔｅｔｌｅｒらは、ポリペプチド及び／又はタンパク質の構造を安定化させる希釈剤については報告していない。国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９１／０７６９４号（発明の名称“ＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＬｉｐｏｓｏｍａｌＦｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓｏｆＴｕｍｏｒＮｅｃｒｏｓｉｓＦａｃｔｏｒ”，Ｈｕｎｇら）には、表面と会合するか又はリポソーム内に閉じ込められた親脂性修飾腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）分子が記載されている。リポソーム親脂性ＴＮＦ分子は高いｉｎｖｉｖｏ安定性を有することが報告されている。安定性とは、ＴＮＦ−リポソームから系統へのＴＮＦのｉｎｖｉｖｏ漏出の減少又は減少傾向の意であった。好適リポソームは中性脂質であった。Ｈｕｎｇらは、賦形剤がタンパク質の構造に安定化効果を有するようなＴＮＦ組成物については開示していない。タンパク質（例えばＧ−ＣＳＦ）を負に帯電した脂質小胞と接触させ、熱誘導凝集、変性、活性損失及び二次構造の変性に対してタンパク質を直接安定化させることについては文献から何ら予想することができない。高温を要する調剤手順で有用であり且つ新規送達ビヒクル（例えばＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦの経口投与）として使用可能な組成物が必要とされている。本発明はこのような組成物を提供する。発明の要約本発明は、疎水性賦形剤（例えばリゾリン脂質又は他のリポソーム）を溶融球状態のタンパク質に付加し、タンパク質の二次及び三次構造を直接安定化させてタンパク質を熱誘導凝集、変性及び活性損失から保護することに関する。特に、本発明は安定なＧ−ＣＳＦ：リン脂質組成物に関する。驚くべきことに、好適Ｇ−ＣＳＦ組成物は１０〜９５℃で数回循環させることができ、冷却すると、タンパク質二次構造を完全に回復する。組成物は、高温を要する調剤手順に有用であると共に、新規Ｇ−ＣＳＦ送達ビヒクルで使用できるという二重の利点を有する。好適態様によると、タンパク質：リン脂質複合体は、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、卵ホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＩ）、卵ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジン酸（ＤＯＰＡ）、ジミリストイルホスファチジン酸（ＤＭＰＡ）、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、ジミリストイルホスファチジルセリン（ＤＭＰＳ）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ）、卵ホスファチジルセリン、リゾホスファチジルグリセロール、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルセリンから選択される負に帯電したリポソームを含む。負に帯電した不飽和リン脂質であるＤＯＰＧが特に好適である。更に本発明によると、ｐＨは３．０〜７．５に維持され、脂質：タンパク質比は少なくとも１０：１である。本発明の好適態様は更に、タンパク質：リン脂質複合体における化学的に修飾されたタンパク質の使用、並びに等張性調節剤、緩衝剤及びｐＨ調節剤の１種以上の使用を含む。当業者に理解されるように、本発明はこれらの付加的要素を種々に組み合わせた安定なタンパク質：リン脂質組成物を包含する。図面の簡単な説明図１は、ＤＯＰＧ小胞の存在下（曲線１）及び不在下（曲線２）におけるｒｈＧ−ＣＳＦの蛍光発光スペクトルを示す。ｒｈＧ−ＣＳＦの濃度は０．２ｍｇ／ｍｌとした。ＤＯＰＧ：ｒｈＧ−ＣＳＦ比（曲線１）は１００：１（モル：モル）とした。図２は、ｒｈＧ−ＣＳＦ蛍光に及ぼす脂質：タンパク質比の増加の作用を示す。Ｆ₀は初期蛍光（脂質なし）であり、Ｆは指定モル比の脂質：ｒｈＧ−ＣＳＦに達するために脂質を添加した後の蛍光を表す。図２（ａ）はＤＯＰＧ：ｒｈＧ −ＣＳＦの混合物のＦ／Ｆ₀（ｎ）及び最大発光波長（Δ）を示す。図２（ｂ）はＤＯＰＣ：ｒｈＧ−ＣＳＦの混合物のＦ／Ｆ₀（ｎ）及び最大発光波長（Δ）を示す。図３は、ＤＯＰＧ小胞の不在下（●）及び存在下（○）でＫＩによるｒｈＧ− ＣＳＦ蛍光の消光のＳｔｅｒｎ−Ｖｏｌｍｅｒプロットを示す。消光実験は、ＫＩのアリコートをｒｈＧ−ＣＳＦ（０．２ｍｇ／ｍｌ）及びＤＯＰＧ：ｒｈＧ− ＣＳＦ（１００：１モル）に加えることにより実施した。図４は、ピレンデカン酸の添加後のｒｈＧ−ＣＳＦトリプトファン蛍光の消光を示す。発光波長は３２７ｎｍであった。ＤＯＰＧ：ｒｈＧ−ＣＳＦ比は１００：１（モル）とした。図５は、種々の脂質の不在下及び存在下におけるｒｈＧ−ＣＳＦのＦ強度変化の比較を示すグラフである。各場合に脂質：タンパク質比は１００：１（モル）とした。図６は、種々の脂質の不在下及び存在下におけるｒｈＧ−ＣＳＦの発光最大のシフトの比較を示すグラフである。各場合に脂質：タンパク質比は１００：１（モル）とした。図７は、ｒｈＧ−ＣＳＦのＣＤ（曲線１）に及ぼすＤＭＰＣ（曲線２）、ＤＭＰＧ（曲線３）及びＤＭＰＡ（曲線４）の効果を示す。各場合に脂質：タンパク質比は水中、５０：１（モル）（ｐＨ６．０）とした。図８は、ｒｈＧ−ＣＳＦ（曲線１）又はＤＯＰＧ：ｒｈＧ−ＣＳＦ（１４０：１モル）（曲線２）のＣＤに及ぼす温度増加の効果を示す。ｒｈＧ−ＣＳＦ濃度は水中、８０μｇ／ｍｌ（ｐＨ６．０）とした。温度は１０〜９０℃を１００℃ ／時の速度で走査した。図９は、ｒｈＧ−ＣＳＦ（曲線１）及びＤＯＰＧ：ｒｈＧ−ＣＳＦ（４５：１モル）（曲線２）の示差走査熱量測定サーモグラムを示す。サンプル中のｒｈＧ −ＣＳＦの濃度は１ｍｇ／ｍｌ（ｐＨ７．０、水中）とした。走査速度は９０℃ ／時とした。図１０は、ｒｈＧ−ＣＳＦ（曲線１）及びＤＯＰＧ：ｒｈＧ−ＣＳＦ（１４０：１モル）（曲線２）のＣＤに及ぼす温度サイクルの効果を示す。サンプルは、矢印により示すように９５℃に迅速に加熱し、１０℃に冷却した。サンプル中のｒｈＧ−ＣＳＦ濃度は８０μｇ／ｍｌ（ｐＨ６．０）とした。図１１は、ｒｈＧ−ＣＳＦ（曲線１）及びＤＭＰＧ：ｒｈＧ−ＣＳＦ（１５０：１モル）（曲線２）のＣＤに及ぼす温度サイクルの効果を示す。サンプルは、９５℃に加熱し、１０℃に冷却した。サンプル中のｒｈＧ−ＣＳＦ濃度は８０μｇ／ｍｌ（ｐＨ６．０）とした。図１２は、ｒｈＧ−ＣＳＦ（曲線１）及びＤＰＰＧ：ｒｈＧ−ＣＳＦ（１５０：１モル）（曲線２）のＣＤに及ぼす温度サイクルの効果を示す。サンプルは、９５℃に加熱し、１０℃に冷却した。サンプル中のｒｈＧ−ＣＳＦ濃度は８０μ ｇ／ｍｌ（ｐＨ６．０）とした。図１３は、凍結乾燥中に種々の脂質がｒｈＧ−ＣＳＦを安定化させる能力を示すグラフである。脂質：タンパク質比は各場合に１００：１とした。骨髄アッセイにおけるｉｎｖｉｔｒｏ活性の保持に基づいて安定性を判定した。ｒｈＧ− ＣＳＦ単独では凍結乾燥プロセスに耐えられないので、脂質の不在下の未処理ｒｈＧ−ＣＳＦを対照として使用した。図１４は、ｒｈＧ−ＣＳＦのｉｎｖｉｖｏ活性に及ぼす種々の脂質の効果を示す。ハムスターの皮下注射後に活性（ＷＢＣカウント）を測定した。ｒｈＧ− ＣＳＦ用量は１００μｇ／ｋｇとし、脂質：タンパク質比は１００：１とした。図１５は、ｒｈＧ−ＣＳＦのｉｎｖｉｖｏ活性に及ぼす種々の脂質の効果を示す。ハムスターの皮下注射後に活性（ＷＢＣカウント）を測定した。ｒｈＧ−ＣＳＦ用量は１００μｇ／ｋｇとし、脂質：タンパク質比は５０：１とした。図１６は、種々のｐＨのＤＯＰＧの不在下及び存在下におけるＣＨＯ−Ｇ−ＣＳＦのＦ強度変化の比較を示すグラフである。各場合に脂質：タンパク質比は１００：１（モル）とした。図１７は、種々のｐＨのＤＯＰＧの不在下及び存在下におけるＣＨＯ−Ｇ−ＣＳＦの発光最大のシフトの比較を示すグラフである。各場合に脂質：タンパク質比は１００：１（モル）とした。図１８は、ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ（−）及びＤＭＰＧ：ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ（１７：１モル）（---）のＣＤに及ぼす温度サイクルの効果を示す。サンプルは９０℃に加熱し、１０℃に冷却した。図１９（ａ）は、ＰＢＳ（ｐＨ７．０）中のＧＭ−ＣＳＦのＣＤに及ぼす温度サイクルの効果を示す。１０℃のＧＭ−ＣＳＦ（−）と、９０℃に加熱した後に１０℃に冷却したＧＭ−ＣＳＦ（---）とを比較した。図１９（ｂ）は、ＤＰＰＧ：ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ（１７：１モル）のＣＤに及ぼす温度サイクルの効果を示す。１０℃のＤＰＰＧ：ＭＧ−ＣＳＦ（−）と、９０℃に加熱した後に１０℃に冷却したＤＰＰＧ：ＭＧ−ＣＳＦ（---）とを比較した。詳細な説明本発明の組成物は以下の説明で詳細に説明し、後記実施例に具体的に説明する。実施例は本発明の種々の態様を示し、種々のタンパク質：リン脂質組成物の安定性及び生物活性試験の結果を報告する。驚くべきことに、タンパク質と脂質小胞の相互作用はタンパク質のタンパク質構造を直接安定化させ、脂質の不在下ではタンパク質の変性をもたらすような条件下であってもタンパク質に安定化効果を及ぼした。本発明の実施においては、溶融球状態に遷移することが可能な種々のタンパク質を使用できる。使用し得るタンパク質の例としては種々の造血因子を含むサイトカインを挙げることができ、例えば上記Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、インターフェロン（α、β及びγ）、インターロイキン（１−１１）、エリトロポエチン（ＥＰＯ）、繊維芽細胞成長因子、幹細胞因子、神経成長因子、ＢＤＮＦ、ＮＴ３、結晶板由来成長因子及び腫瘍成長因子（α、β）が挙げられる。他のタンパク質もＭＧＳに遷移することが可能である。該当タンパク質がＭＧＳに遷移することが可能な場合には、該当タンパク質を負に帯電したリポソーム小胞と接触させると、安定化効果が得られる。一般に、本発明の実施において有用なＧ−ＣＳＦは哺乳動物から純粋単離された天然種でもよいし、化学的合成産物でもよいし、ゲノムもしくはｃＤＮＡクローニング又は遺伝子合成により得られる外来ＤＮＡ配列の原核又は真核宿主発現産物でもよい。適切な原核宿主としては、種々の細菌（例えば大腸菌）細胞が挙げられる。適切な真核宿主としては、酵母（例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及び哺乳動物（例えばチャイニーズハムスター卵巣、サル）細胞が挙げられる。使用する宿主に依存して、Ｇ−ＣＳＦ発現産物を哺乳動物又は他の真核炭水化物でグリコシル化してもよいし、グリコシル化しなくてもよい。本発明によると、このような形態のＧ−ＣＳＦのいずれをも任意に使用することができるが、商業的実用性が最大であるという理由で特に大腸菌に由来する組換えＧ−ＣＳＦが好適である。本発明で使用するために化学的に修飾するＧ−ＣＳＦも同様に、天然ヒトＧ−ＣＳＦ（ｎｈＧ−ＣＳＦ）でもよいし、組換え核酸プロセス（例えば原核又は真核宿主細胞発現）の産物でもよい。一般に、予想される化学的修飾はＧ−ＣＳＦ分子自体に化学的部分を結合することである。タンパク質修飾及び融合タンパク質に関する研究論文の１例は、Ｆｒａｎｃｉｓ，ＦｏｃｕｓｏｎＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒｓ３：４−１０（Ｍａｙ１９９２）（Ｍｅｄｉｓｃｒｉｐｔ，ＭｏｕｎｔｖｉｅｗＣｏｕｒｔ，ＦｒｉｅｒｎＢａｒｎｅｔＬａｎｅ，ＬｏｎｄｏｎＮ２０ＯＬＤ，英国刊）である。例えば、ポリエチレングリコール分子と結合したＧ−ＣＳＦを製造するための材料及び方法を記載したヨーロッパ特許出願明細書第０４０１３８４号（発明の名称“ ＣｈｅｍｉｃａｌｌｙＭｏｄｉｆｉｅｄＧｒａｎｕｌｏｃｙｔｅＣｏｌｏｎｙＳｔｉｍｕｌａｔｉｎｇＦａｃｔｏｒ”）を参照されたい。結合は、タンパク質との直接結合でもよいし、活性物質への橋として機能する部分と結合してもよい。結合に最も安定であるという理由で共有結合が好適である。化学的修飾により、Ｇ−ＣＳＦの効果を制御、抑制又は延長することができる。これは例えば、化学的に修飾されたＧ− ＣＳＦが循環に達するまでに要する時間を制御する効果を有する。化学的修飾物質の１例はポリエチレングリコール組成物及びその誘導体である。本発明の実施においては、投与後に効力を発揮する任意の化学的に修飾されたＧ−ＣＳＦ調製物を使用することができる。効力は当業者に認められるように、公知方法により決定することができる。ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ、特に大腸菌に由来するＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ、より特定的には大腸菌に由来するトリ−テトラＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦが好適である。Ｇ−ＣＳＦは、２．５〜５．０のｐＨ範囲では三次構造が緩んだり、α螺旋含有量が増加するなどのコンフォーメーション変化が生じるという事実にも拘わらず、酸性条件下で最も安定であると報告されている。Ｎａｒｈｉら，Ｊ．ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｅｍ．１０，３５９−３６７（１９９１）。このコンフォーメーション変化は溶融球状態（ＭＧＳ）の特徴である。従って、ＭＧＳに遷移することが可能な他のタンパク質を取り扱う際と同様に、Ｇ−ＣＳＦを取り扱う調合者は凝集及び変性が生じないように二次及び三次構造の熱誘導変性から保護しなければならない。本発明で有用なＧＭ−ＣＳＦは、哺乳動物から純粋単離された天然形態でもよいし、ゲノムもしくはｃＤＮＡクローニング又は遺伝子合成により得られた外来ＤＮＡ配列の原核又は真核宿主発現産物でもよい。適切な原核宿主としては種々の細菌（例えば大腸菌）細胞が挙げられる。適切な真核宿主としては酵母（例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及び哺乳動物（例えばチャイニーズハムスター卵巣、サル）細胞が挙げられる。使用する宿主に依存して、ＧＭ−ＣＳＦ発現産物を哺乳動物又は他の真核炭水化物でグリコシル化してもよいし、グリコシル化しなくてもよい。本発明によると、このような形態のＧＭ− ＣＳＦのいずれをも任意に使用することができるが、商業的実用性が最大であるという理由で特に大腸菌に由来する組換えＧＭ−ＣＳＦが好適である。本発明の組成物で有用な脂質小胞は該当タンパク質と相互作用することが可能な負に帯電したリポソームである。使用可能な特定リポソームとしては、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、卵ホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、卵ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジン酸（ＤＯＰＡ）、ジミリストイルホスファチジン酸（ＤＭＰＡ）、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、ジミリストイルホスファチジルセリン（ＤＭＰＳ）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ）、卵ホスファチジルセリン、リゾホスファチジルグリセロール、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルセリンが挙げられる。使用する特定リポソームに依存してリポソームの量は異なる。タンパク質：リン脂質組成物は好ましくは、溶液のｐＨを所望の範囲に維持するために緩衝剤を含有する。好適緩衝剤としては、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、及びクエン酸ナトリウムが挙げられる。これらの緩衝剤の混合物も使用し得る。組成物中で有用な緩衝剤の量は使用する特定緩衝剤及び溶液のｐＨに大幅に依存する。例えば酢酸塩はｐＨ６よりもｐＨ５のほうが有効な緩衝剤であるので、ｐＨ５の溶液中ではｐＨ６の場合よりも少量の酢酸塩を使用する。本発明の組成物の好適ｐＨ範囲はｐＨ３．０〜７．５である。本発明の組成物は更に、溶液を等張にし、注射適合性を増すように等張性調節剤を含有し得る。最適な等張性調節剤は０〜１５０ｍＭの濃度範囲の塩化ナトリウムである。本発明は、医薬的に許容可能な希釈剤、防腐剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント及び／又はキャリヤーと共に有効量の本発明のポリペプチド生成物を含有する医薬組成物も包含する。このような組成物はタンパク質の物理的状態、安定性及び生体利用性に影響を与える。例えば、参考資料として本明細書の一部とするＲｅｍｉｎｇｔｏｎｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版，１４３５−１７１２（ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ．，１９９０）を参照されたい。特定例におけるタンパク質の有効量は、必要な治療効果、治療する症状又は疾病の重篤度、被験者の健康状態等を含めて当業者が考慮する種々の因子に依存する。大腸菌に由来するｒｈＧ−ＣＳＦを使用する好適態様によると、使用するリポソーム小胞は、１０ｍＭの酢酸ナトリウムを含有するｐＨ４．５でＤＯＰＧ：Ｇ −ＣＳＦ比５０：１のＤＯＰＧである。大腸菌に由来するｒｈＧＭ−ＣＳＦを使用する好適態様によると、使用するリポソーム小胞は、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中ｐＨ７．０でＤＭＰＧ：ＧＭ−ＣＳＦ比１７：１のＤＭＰＧである。化学的に修飾（ＰＥＧ化）された大腸菌由来ｒｈＧ−ＣＳＦを使用する好適態様によると、ｒｈＧ−ＣＳＦをトリ−テトラＰＥＧ化し、使用するリポソーム小胞は、ｐＨ４．５でＤＭＰＧ：ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ比１７：１のＤＭＰＧである。特定のタンパク質：脂質組成物及び治療方法について本発明を記載したが、本発明の範囲から逸脱することなく種々の関連組成物及び治療方法が存在し得ることは当業者に自明である。以下、実施例により本発明の種々の態様を詳細に説明する。実施例１組換えヒトＧ−ＣＳＦ（ｒｈＧ−ＣＳＦ）を脂質小胞に組み込む可能性を試験するために初期実験を実施した。ｒｈＧ−ＣＳＦは組換えＤＮＡ技術を使用して製造し、Ｓｏｕｚａの米国特許第４，８１０，６４３号に記載されているようにヒトＧ−ＣＳＦをコードするＤＮＡ配列で大腸菌をトランスフェクトした。ｒｈＧ−ＣＳＦは希塩酸中の４ｍｇ／ｍｌ溶液（ｐＨ４．０）として調製した。全脂質はＡｖａｎｔｉＰｏｌａｒＬｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，Ａｌａ）から入手し、クロロホルム中１００ｍｇ／ｍｌの最終濃度で窒素下に−２０℃で貯蔵した。Ｇ−ＣＳＦ：リン脂質複合体の調製Ｇ−ＣＳＦと組み合わせるための脂質小胞を調製するために、適当な脂質３０ μモルをガラス管に分配し、窒素ガス流を使用して乾燥し、薄膜を形成した。脂質膜を少なくとも２時間減圧脱水し、クロロホルムを完全に除去した。脂質膜を１ｍｌの蒸留脱イオン水（ｄｄＨ₂Ｏ）、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２，Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ“Ｄ−ＰＧＳ”）又は１５０ｍＭＮａＣｌで水和した。次にサンプルを浴型音波処理装置（ｌａｂｏｒａｔｏｒｙＳｕｐｐｌｉｅｓ，Ｈｉｃｋｓｖｉｌｌｅ，Ｎ．Ｙ．）で音波処理した。サンプルが透明になるまで（通常１０〜１５分間）音波処理を続けた。サンプルを使用時まで窒素下に４℃で貯蔵した。最終脂質濃度は３０ｍＭとした。あるいは、脂質３００μモルを窒素下に乾燥し、上述のように脱水することにより脂質小胞を調製してもよい。乾燥脂質膜は上述のような適当な水溶液１０ｍｌで水和した。次に、卓上乳化機（ＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓＭｏｄｅｌ１１０Ｓ，Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｉｎｃ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を１０，０００ｐｓｉで運転してサンプルを微細流動化した。サンプルを乳化機で１０サイクル循環させた。微細流動化したサンプルをその後、上述のように４℃で貯蔵した。（上述のような）Ｇ−ＣＳＦを（上述のような）特定脂質と混合することにより、Ｇ−ＣＳＦ：リン脂質複合体を調製した。混合は、渦形成、撹拌又は温和な振盪により行った。種々の脂質：Ｇ−ＣＳＦモル比のサンプルを調製してタンパク質の膜挿入及び安定化を評価した。例えば、脂質：Ｇ−ＣＳＦモル比４０：１で濃度０．２ｍｇ／ｍｌＧ−ＣＳＦの３ｍｌサンプル（水中）を調製するには、Ｇ−ＣＳＦストック１５０μｌに脂質（音波処理により水中で調製した３０ｍＭストック）４４μｌを加え、水を加えて最終サンプル容量３ｍｌとする。（必ずしも必要ではないが）５分間のインキュベーションが推奨され、本実施例ではサンプルの使用又はアッセイ前にこれを使用した。微量流動化前にＧ−ＣＳＦに水和脂質を加えてもよい。その後、上述のように混合物を微量流動化し、Ｇ−ＣＳＦを脂質膜に組込む。Ｇ−ＣＳＦ：リン脂質複合体の分析１．トリプトファン発光スペクトルｒｈＧ−ＣＳＦには局所環境条件に易感受性の２つのトリプトファン残基が存在する。従って、ｒｈＧ−ＣＳＦをリポソームと接触させる際のｒｈＧ−ＣＳＦトリプトファン蛍光を決定する分析を実施した。蛍光発光最大のブルーシフトは、トリプトファンがより疎水性の環境にあり、従ってｒｈＧ−ＣＳＦが脂質膜に包埋されたことを示す。トリプトファン蛍光分析の優れた研究報告の１例は、Ｌａｋｏｗｉｃｚ著ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＭｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，第１１章（ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８３）である。サンプルを２８０ｎｍで励起し、１ｎｍ／秒の速度で１ｎｍの増分で発光を２８５ｎｍから４２０ｎｍまで走査することにより、（上述のような）Ｇ−ＣＳＦ：脂質複合体のトリプトファン蛍光をアッセイした。サンプル容量は３ｍｌとし、Ｇ−ＣＳＦの最終濃度は全サンプルで０．２ｍｇ／ｍｌとした。脂質：Ｇ−ＣＳＦ比は変化させた。全蛍光測定は、ＰＴＩＡｌｐｈａｓｃａｎ蛍光量計（ＳｏｕｔｈＢｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ）を使用して実施した。全測定は２５℃で実施し、この温度は循環水浴と接続した水ジャケット付きキュベットホルダーを使用することにより維持した。発光スペクトルを集め、ＰＴＩから販売されているデータソフトウェアを使用して分析した。ＤＯＰＧから構成される小さな単ラメラ小胞の存在下及び不在下のｒｈＧ−ＣＳＦの蛍光スペクトルを図１に示す。ｒｈＧ−ＣＳＦはＤＯＰＧ小胞の不在下では３３４ｎｍで発光最大を有する。１００：１脂質：タンパク質比のＤＯＰＧの存在下では、ｒｈＧ−ＣＳＦトリプトファン蛍光は３２７ｎｍへの蛍光発光最大のブルーシフトと、蛍光強度の劇的な増加を示す。ＤＯＰＧの存在下における蛍光発光の低波長は、トリプトファンが天然タンパク質よりも疎水性の環境に存在することを示唆するものである。図２から明らかなように、蛍光シフトはＤＯＰＧ：Ｇ−ＣＳＦのモル比に依存し、ＤＯＰＧ：Ｇ−ＣＳＦ比が１０：１に達すると膜挿入を検出することができる。２．ヨウ化物消光実験ヨウ化物はトリプトファン蛍光の有効な衝突性消光剤であるが、脂質膜に浸透することはできない。従って、残基がバルク水性溶媒に暴露されると、ヨウ化物によりトリプトファン蛍光の有効な消光が起こり、タンパク質トリプトファンが水性溶媒から封鎖されると、ヨウ化物消光からの保護が生じる。これらの実験では、Ｇ−ＣＳＦ及びＤＯＰＧ：Ｇ−ＣＳＦ組成物（脂質：タンパク質比１００：１）を使用した。サンプルの初期読み取り（Ｆ₀）を行って記録した後、添加量を増加しながらヨウ化カリウム（ＫＩ）（５Ｍストック）を加えた後に蛍光強度を測定した。サンプル及びＫＩ溶液はいずれもＬｅｅら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，９８４：１７４−１８２（１９８９）及びＬｅＤｏａｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，８５８：１−５（１９８６）に記載されているように１ｍＭＮａ₂ＳＯ₃（最終濃度）を含有するように調製した。Ｎａ₂ＳＯ₃を加えるのは、Ｉ₂が形成されないようにし、タンパク質及び膜の非極性領域に分割しないようにするためである。Ｓｔｅｒｎ−Ｖｏｌｍｅｒの式（Ｆ₀／Ｆ＝１＋Ｋ_KI［ＫＩ］）（式中、Ｆ₀及びＦは夫々濃度［ＫＩ］のＫＩの不在下及び存在下におけるサンプルの蛍光強度であり、ＫK_IはＧ−ＣＳＦトリプトファン残基のＫＩ消光のためのＳｔｅｒｎ−Ｖｏｌｍｅｒ消光定数である）によりデータを分析した。Ｌｅｈｒｅｒ，Ｓ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１０：３２５４−３２６３（１９７９）。データのＳｔｅｒｎ−Ｖｏｌｍｅｒプロットを図３に示す。ＤＯＰＧ小胞の不在下では、ｒｈＧ−ＣＳＦ蛍光はＫＩにより有効に消光される。ＤＯＰＧの存在下では、データのＳｔｅｒｎ−Ｖｏｌｍｅｒプロットは線形であり、ヨウ化物が２つのトリプトファンに接近しにくいことを示す。データは、ＤＯＰＧの不在下でヨウ化物に接近可能なトリプトファン残基がＤＯＰＧの存在下ではヨウ化物に接近不能になることを示す。従って、このトリプトファンを含むｒｈＧ−ＣＳＦの部分をＤＯＰＧ二重層に包埋しなければならない。３．エネルギー転移測定先に示したように、このプローブの励起スペクトルはトリプトファンの発光スペクトルに有意にオーバーラップするので、トリプトファン供与体とピレンデカン酸等の脂質可溶性蛍光受容体との間にはエネルギー転移が生じ得る。Ｆｒｉｅｒｅら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２２：１６７５−１６８０（１９８３）。タンパク質が脂質膜に挿入するならば、トリプトファンからピレンへのエネルギー転移によりトリプトファン蛍光の消光が生じる。この実験では、種々の量のピレンデカン酸（テトラヒドロフラン中３０μｇ／ｍｌストック）の添加前（Ｆ₀）及び添加後（Ｆ）に種々のＧ−ＣＳＦ：脂質複合体のトリプトファン発光強度を記録した。ピレンデカン酸添加中にサンプルを連続的に撹拌し、ピレンデカン酸とサンプルの混合を助長した。Ｆ／Ｆ₀の比はＧ−ＣＳＦトリプトファンと疎水性エネルギー受容体ピレンデカン酸の間に生じるエネルギー転移の量に比例する。図４は、添加したピレンデカン酸の関数としてＤＯＰＧ（脂質：タンパク質比１００：１）の存在下におけるｒｈＧ−ＣＳＦの消光プロフィルを示す。消光は非常に低いピレンデカン酸濃度（＜１モル％）で生じるので、膜構造及び挙動に及ぼす蛍光プローブの効果は最小である。ピレンデカン酸は脂質二重層に迅速に分割すると予想することができるので、このデータは、ｒｈＧ−ＣＳＦがトリプトファンからピレン受容体への有効なエネルギー転移を可能にするために十分な深さまでＤＯＰＧ膜に包埋されていることを示す。ｒｈＧ−ＣＳＦの存在下及び不在下でピレンデカン酸で標識したＤＯＰＧ小胞の励起スペクトルを試験することにより、エネルギー転移を確認した。上記分析から明らかなように、ｒｈＧ−ＣＳＦはＤＯＰＧ等の不飽和リン脂質と密接に相互作用し得る。ＤＯＰＧ小胞の存在下では、ｒｈＧ−ＣＳＦトリプトファンは水溶性蛍光消光剤から保護されるが、疎水性蛍光プローブへのエネルギー転移を介して消光を受ける可能性がある。データをまとめると、ｒｈＧ−ＣＳＦはＤＯＰＧから構成される膜に挿入することができる。１０：１比（脂質：Ｇ −ＣＳＦ）に達すると、膜挿入を検出可能であるが、この数はタンパク質の挿入部分の周囲の脂質の数に相当し得る。実施例２本実施例では、上述のようなＦ／Ｆ₀強度及び発光最大の比較を使用して、ｒｈＧ−ＣＳＦが他のリン脂質と相互作用する能力を判定した。各場合に、脂質：ｒｈＧ−ＣＳＦのモル比は１００：１とした。図５は、種々の脂質の不在下及び存在下におけるｒｈＧ−ＣＳＦのＦ／Ｆ₀データを示す。図６は同一組成の発光最大データを示す。図５及び図６のデータから明らかなように、ＤＯＰＧ以外に、ｒｈＧ−ＣＳＦはＤＭＰＧ、ＤＰＰＧにも挿入することができ、より低効率ではあるが、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）及びホスファチジルセリン（ＰＳ）にも挿入することができる。更に、ＮＧーＤＯＰＥ（ＰＥヘッド基の負電荷を高めたＤＯＰＥサンプル）はＤＯＰＥよりもｒｈＧ −ＣＳＦの挿入を改善できることが判明した。ＤＯＰＥ、ＤＭＰＣ及びＤＰＰＣは中性脂質であり、これらの小胞はｒｈＧ− ＣＳＦの発光最大にも蛍光強度にも全くではないにしても殆ど影響を与えておらず、これらのリン脂質との間に相互作用は生じなかったと思われる（図５及び６、並びに図７、曲線２参照）。上記データから明らかなように、溶融球状態に遷移することが可能なタンパク質は種々の脂質小胞に挿入することができる。しかしながら、このｒｈＧ−ＣＳＦ：脂質相互作用は負に帯電した脂質小胞を使用した場合にしか生じない。負に帯電した脂質小胞のうちでは負電荷の高い小胞のほうが強いｒｈＧ−ＣＳＦ相互作用を生じると思われる。実施例３本実施例では、タンパク質安定性に関するｒｈＧ−ＣＳＦ：ＤＯＰＧ相互作用の効果を決定した。Ｐｅｌｔｉｅｒ型サーモスタット付きセルホルダー及び磁気撹拌機を備えるＪａｓｃｏＪ−７２０装置で円二色性測定を実施した。８０μｇ／ｍｌの最終ｒｈＧ−ＣＳＦ濃度（ｐＨ６．０）を使用して２２２ｎｍでの円二色性を測定した。ＭｉｃｒｏｃａｌＭＣ−２熱量計を使用して示差走査熱量測定を実施した。ｒｈＧ−ＣＳＦ（水中Ｉｍｇ／ｍｌ）又はＤＯＰＧ：ｒｈＧ−ＣＳＦ（水中４５：１モル／モル）のサンプルを９０℃／時の速度で走査した。データを保存し、Ｍｉｃｒｏｃａｌソフトウェアを使用して分析した。温度増加の関数として円二色性（２２２ｎｍ）を測定することにより、Ｇ−ＣＳＦのα螺旋の温度誘導変化を測定することができる。ｐＨ６．０でのｒｈＧ− ＣＳＦの熱誘導変性を図８に示す。曲線は、〜６０〜７０℃でかなり急な遷移が生じることを示しており、α螺旋の損失が生じると予想される。この遷移後、ｒｈＧ−ＣＳＦは溶液から不可逆的に沈殿する。変性温度範囲は、示差走査熱量測定により決定したｐＨ７．０でのｒｈＧ−ＣＳＦの溶融温度（図９）に類似する。他方、ＤＯＰＧ：ｒｈＧ−ＣＳＦサンプルは温度増加と共にα螺旋の漸次損失を示し、ｒｈＧ−ＣＳＦ単独の場合とは異なり、ＤＯＰＧ：ｒｈＧ−ＣＳＦの温度誘導変性は協同的ではないように思われる（図８参照）。この推論は、示差走査熱量測定により示される溶融遷移の欠如からも立証される（図９）。特筆すべき点として、ＤＯＰＧ：ｒｈＧ−ＣＳＦサンプルは９５℃ に加熱後にα螺旋を回復することができ、９５℃と１０℃の間で繰り返し循環させることができ、冷却後には螺旋を完全に回復する（図１０参照）。同一条件下でｒｈＧ−ＣＳＦ単独では不可逆的に変性し、溶液から沈殿する。Ｇ−ＣＳＦ円二色性に及ぼすＤＭＰＧ及びＤＰＰＧの効果も試験した。１５０：１の脂質：ｒｈＧ−ＣＳＦ比を使用した処、ＤＯＰＧの場合と同様に、ＤＭＰＧ及びＤＰＰＧもｒｈＧ−ＣＳＦの二次構造を安定化させることが判明した（図１１〜１３）。以上のデータから明らかなように、ｒｈＧ−ＣＳＦとＤＯＰＧ、ＤＭＰＧ及びＤＰＰＧとの相互作用の結果として、ｒｈＧ−ＣＳＦ単独では不安定な条件下でタンパク質の安定性を強化することができる。相互作用はｒｈＧ−ＣＳＦの二次及び三次構造を直接安定化させる。実施例４本実施例では、ｒｈＧ−ＣＳＦの生物活性に関するｒｈＧ−ＣＳＦ：ＤＯＰＧ相互作用の効果を判定した。Ｚｓｅｂｏら，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ１７２：１７５−１８４（１９８６）に記載されているようにマウス骨髄細胞によるＧ−ＣＳＦ依存性［³Ｈ］−チミジン取り込みを使用してｒｈＧ−ＣＳＦのｉｎｖｉｔｒｏ活性をアッセイした。全活性アッセイは３回繰り返して実施した。ｉｎｖｉｖｏ活性はハムスターの皮下注射（ｒｈＧ−ＣＳＦ用量１００μｇ／ｋｇ）及び白血球（ＷＢＣ）カウントの測定により定量した。１．ｉｎｖｉｔｒｏ活性Ａ．ＤＯＰＧの不在下及び存在下におけるｒｈＧ−ＣＳＦの比活性を定量した。熱処理したｒｈＧ−ＣＳＦ及びＤＯＰＧ：ｒｈＧ−ＣＳＦサンプルも試験した。結果を表１に要約する。表１に示すように、ＤＯＰＧ二重層への挿入はｒｈＧ−ＣＳＦの生物活性に悪影響を与えない。８５℃に１０分間加熱後、ｒｈＧ−ＣＳＦは検出可能な活性をもたず、タンパク質は沈殿する。同様の処理後、ＤＯＰＧ：ｒｈＧ−ＣＳＦは非加熱ｒｈＧ−ＣＳＦの活性の〜８５％を維持し、冷却後に二次構造を完全に回復する。Ｂ．種々の脂質が凍結乾燥中にｒｈＧ−ＣＳＦを安定化させる能力も試験した。種々の脂質と組み合わせたｒｈＧ−ＣＳＦのサンプルを凍結乾燥しし、（上述のように）活性をアッセイした。ＤＯＰＧ、ＤＭＰＧ及びＤＰＰＧをｒｈＧ−ＣＳＦと混合すると、凍結乾燥後にｒｈＧ−ＣＳＦ生活性の〜１００％を維持することができる（図１４）。ｒｈＧ−ＣＳＦ単独では凍結乾燥プロセスに耐えることができなかった。２．ｉｎｖｉｖｏ活性脂質の不在下及び存在下におけるｒｈＧ−ＣＳＦの活性（ＷＢＣカウント）を定量した。０日目に皮下注射（ｒｈＧ−ＣＳＦ用量１００μｇ／ｋｇ）後に活性を測定した。５種の異なる脂質：ｒｈＧ−ＣＳＦ複合体をアッセイした処、各場合とも脂質：ｒｈＧ−ＣＳＦ複合体はｉｎｖｉｖｏ活性を維持した（図１５及び１６）。以上の試験から明らかなように、負に帯電した脂質二重層への挿入はｒｈＧ− ＣＳＦの生物活性に悪影響を与えない。更に、脂質の保護効果は凍結乾燥プロセス中にｒｈＧ−ＣＳＦを保護すると思われる。実施例５本実施例では、化学的に修飾されたＧ−ＣＳＦ（ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ（ＰＥＧ −Ｇ−ＣＳＦ））及び真核宿主細胞発現産物として得られたＧ−ＣＳＦ（ＣＨＯ −Ｇ−ＣＳＦ）が負に帯電した脂質小胞と相互作用する能力を試験した。ＣＨＯ−Ｇ−ＣＳＦについては、（上記実施例１に記載したような）Ｆ／Ｆ₀強度及び発光最大の比較を使用して判定した。各場合とも脂質：タンパク質のモル比は１００：１とした。ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦでは円二色性分析に基づいて判定した。使用したＣＨＯ−Ｇ−ＣＳＦは組換えＤＮＡ技術を用いて製造し、Ｓｏｕｚａの米国特許第４，８１０，６４３号に記載されているようにチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、ヒトＧ−ＣＳＦをコードするＤＮＡ配列でトランスフェクトした。ＣＨＯ−Ｇ−ＣＳＦはＰＢＳ（ｐＨ７．０）中０．６ｍｇ／ｍｌ溶液として調製した。ＣＨＯ−Ｇ−ＣＳＦはｒｈＧ−ＣＳＦと同様にＤＯＰＧと相互作用することが判明し、各サンプルはＤＯＰＧの存在下で蛍光強度の増加を示すと共に、ＤＯＰＧの存在下で発光最大のブルーシフトを示した（図１７及び１８）。従って、ＤＯＰＧ相互作用はＧ−ＣＳＦの組換え形態の何らかの独自性に起因するものではない。これらの実験で使用したＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦは、大腸菌に由来するトリ−テトラＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ（ＰＥＧ６０００を使用）であった。上記手順を使用してＤＭＰＧ：ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ（１７：１モル／モル）サンプルを調製した。ＤＭＰＧ：ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦサンプルは加熱後に二次構造を完全に回復することが判明した（図１９）。ＰＥＧ分子の存在にも拘わらず、誘導体化タンパク質は天然タンパク質と同様に脂質と相互作用することが可能であった。以上のデータから明らかなように、Ｇ−ＣＳＦと負に帯電した脂質小胞との相互作用に関連する安定化効果は、原核宿主細胞発現産物として得られるｒｈＧ− ＣＳＦのみに固有ではない。ＭＧＳに遷移することが可能な化学的に修飾されたタンパク質でも、リポソーム小胞（ここではＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ：ＤＭＰＧ）と接触すると、同様に安定化効果を示した。実施例６本実施例では、ＧＭ−ＣＳＦに及ぼすＤＭＰＧ及びＤＰＰＧの効果を試験した。ＧＭ−ＣＳＦはＢｏｏｎｅの米国特許第５，０４７，５０４号に記載されているような組換えヒトＧＭ−ＣＳＦを用い、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ，ｐＨ７．０）中１ｍｇ／ｍｌ溶液として調製した。１７：１の脂質：ＧＭ−ＣＳＦ比を使用し、上述のような円二色性分析を使用して熱安定性を測定した。ＤＭＰＧ及びＤＰＰＧはＧＭ−ＣＳＦの良好な熱安定性をもたらし、即ち加熱後に二次構造を回復した（図２０ａ及び２０ｂ）。以上のデータは、溶融球状態に遷移することができ、負に帯電した脂質小胞と相互作用してタンパク質に良好な熱安定性を与えることが可能なタンパク質の別の例を提供するものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者チヤ，ヨーンシクアメリカ合衆国、カリフオルニア・91360、サウザンド・オークス、キヤル・オルモ・ 1267

Claims

【特許請求の範囲】１．溶融球状態に遷移することが可能なタンパク質を、負に帯電したリポソーム小胞と接触させてなる組成物。２．ｐＨ３．０〜７．５と、少なくとも１０：１の脂質：タンパク質比を有する請求項１に記載の組成物。３．前記リポソーム小胞が、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、卵ホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、卵ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジン酸（ＤＯＰＡ）、ジミリストイルホスファチジン酸（ＤＭＰＡ）、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、ジミリストイルホスファチジルセリン（ＤＭＰＳ）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ）、卵ホスファチジルセリン、リゾホスファチジルグリセロール、リゾホスファチジルエタノールアミン及びリゾホスファチジルセリンからなる群から選択される請求項１に記載の組成物。４．前記タンパク質がサイトカインである請求項１に記載の組成物。５．前記サイトカインが造血因子である請求項４に記載の組成物。６．前記造血因子がＧ−ＣＳＦ及びＧＭ−ＣＳＦからなる群から選択される請求項５に記載の組成物。７．前記造血因子がＧ−ＣＳＦである請求項５に記載の組成物。８．Ｇ−ＣＳＦが天然ヒトＧ−ＣＳＦであるか又は、原核もしくは真核宿主細胞発現産物として得られる請求項７に記載の組成物。９．Ｇ−ＣＳＦが化学的に修飾されたＧ−ＣＳＦである請求項７に記載の組成物。１０．化学的に修飾されたＧ−ＣＳＦがＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦである請求項９に記載の組成物。１１．医薬的に許容可能なキャリヤーを含有する請求項１に記載の組成物。１２．前記タンパク質が大腸菌に由来するｒｈＧ−ＣＳＦであり、前記リポソーム小胞がＤＯＰＧであり、前記組成物が５０：１のＤＯＰＧ：ｒｈＧ−ＣＳＦ比を有しており、ｐＨ４．５を有しており、１０ｍＭ酢酸ナトリウムを含有する請求項１に記載の組成物。１３．溶融球状態に遷移することが可能なタンパク質を、負に帯電したリポソーム小胞と接触させることからなる、タンパク質組成物の製造方法。１４．前記組成物がｐＨ３．０〜７．５と、少なくとも１０：１の脂質：タンパク質比を有する請求項１２に記載の方法。１５．前記リポソーム小胞が、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、卵ホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、卵ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジン酸（ＤＯＰＡ）、ジミリストイルホスファチジン酸（ＤＭＰＡ）、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、ジミリストイルホスファチジルセリン（ＤＭＰＳ）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ）、卵ホスファチジルセリン、リゾホスファチジルグリセロール、リゾホスファチジルエタノールアミン及びリゾホスファチジルセリンからなる群から選択される請求項１２に記載の方法。１６．前記タンパク質がサイトカインである請求項１２に記載の方法。１７．前記サイトカインが造血因子である請求項１５に記載の方法。１８．前記造血因子がＧ−ＣＳＦ及びＧＭ−ＣＳＦからなる群から選択される請求項１６に記載の方法。１９．前記造血因子がＧ−ＣＳＦである請求項１７に記載の方法。２０．Ｇ−ＣＳＦが天然ヒトＧ−ＣＳＦであるか又は、原核もしくは真核宿主細胞発現産物として得られる請求項１８に記載の方法。２１．Ｇ−ＣＳＦが化学的に修飾されたＧ−ＣＳＦである請求項１８に記載の方法。２２．化学的に修飾されたＧ−ＣＳＦがＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦである請求項２０に記載の方法。２３．前記組成物が医薬的に許容可能なキャリヤーを含有する請求項１２に記載の方法。