JPH09501672A

JPH09501672A - 組織老化の防止と治療におけるオリゴ糖の使用

Info

Publication number: JPH09501672A
Application number: JP7506788A
Authority: JP
Inventors: ロベール，ラディスラ; ロベール，アレクサンドル; モックザール，エルメール
Original assignee: ロック、ソシエテ、アノニム
Priority date: 1993-08-17
Filing date: 1994-08-16
Publication date: 1997-02-18
Also published as: NZ271685A; ES2155478T3; HU9600347D0; FI960585A0; DE69426932T2; CZ45196A3; AU7539394A; CA2169621C; SK18296A3; PL313036A1; BR9407305A; FR2709061B1; DE69426932D1; CA2169621A1; ATE199827T1; KR100273389B1; AU699585B2; PL179432B1; EP0714284B1; DK0714284T3

Abstract

(57)【要約】２〜５のオリゴ糖残基を有する１又は数ヶのオリゴ糖又は疎水性基を有する前記オリゴ糖の誘導体、但し前記オリゴ糖の非還元性末端位置に１つのガラクトース残基が存在するオリゴ糖を含むことを特徴とする、結合組織老化の症状を治療又は予防するための組成物。

Description

【発明の詳細な説明】組織老化の予防と治療におけるオリゴ糖の使用本発明は、オリゴ糖、または、Ｄガラクトースを非還元性末端位置に有するオリゴ糖誘導体（これらの誘導体は線維芽細胞のエラスターゼの合成および／または排泄の調節物として作用する）を含む、老化発現の治療と予防のための組成物に関する。皮膚の結合組織は、細胞外基質を作る線維芽細胞の生合成活動の結果であるということは、知られている（Ｌａｂａｔ−Ｒｏｂｅｒｔ，Ｊ，ｅｔａｌ．，ＥｌｓｅｖｉｅｒＳｃｉｅｎｃｅＰｕｂｌｉｓｈｅｒＢ．Ｖ．，２４８：３８６−３９３，１９９０）。細胞外基質は４つの族の巨大分子から成っている。これらは、皮膚の線維質物質を構成するコラーゲンとエラスチン、細胞と細胞外基質の間の凝集力を与え弾力性組織の微細原線維を供給する構造性糖蛋白、および、組織の水和と分子の流動および相互作用の制御を与えるプロテオグリカンである。エラスチンは、６７ｋＤサブユニットを含み炭水化物に対する結合箇所を含む線維芽細胞の膜中に複合受容体を有する。Ａ．Ｈｉｎｅｋら（Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９）：１５３９−１５４１１９８８）らは、エラスチン受容体の６７ｋＤサブユニットが、配位子がエラスチン、または、エラスチンのペプチドからなるアフィニテイカラム上へ固定されるとき、ラクトース（１ｍＭ）はこの６７ｋＤ蛋白を溶離する能力があり、ガラクトースは、６７ｋＤ蛋白のエラスチンへの結合を解くのに同様に効果があったことを示した。一方、ガラクトースを含まないオリゴ糖は、エラスチンアフィニテイカラムに結合された６７ｋＤ蛋白の溶離を許容する能力はない。それ故、著者は、このことから、エラスチン受容体がガラクトシドへ結合する性質を持つ蛋白であるとの結論を下した。可溶性または不溶性の状態にあるエラスチンは、エンドロプロテーゼ、特にエラスターゼによって加水分解され易いことも、また知られている。プロテアーゼとエンドペプチダーゼの異なる級が詳細に記され、これらの異なるエンドペプチダーゼとそれらの性質についての見解がＢａｒｒｅｔｔら．（Ｂａｒｒｅｔｔ、Ａ．Ｊ．Ｅｄｓ．，ＮｏｒｔｈＨｏｌｌａｎｄ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）により１９７７に出版された。エラスターゼは、その性質が完全に研究されはじめたプロテアーゼとエンドペプチダーゼである。以下の記事（その内容は参考文献として本発明のテキストに挿入される）はそれらの性質を記述する。 −ＢｉｅｔｈＪ．（１９７８）”Ｅｌａｓｔａｓｅ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｒｏｌｅ”．Ｆｒｏｎｔ．ｏｆＭａｔｒｉｘＢｉｏｌ．Ｃｉｓ．：１−８２，−Ｈｏｍｓｙ，Ｒ．ｅｔａｌ．（１９８８）”Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｓｋｉｎｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓｅｌａｓｔａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ”．Ｊｏｕｒｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．９１：４７２ −４７７．指名エラスターゼによる酵素の命名は、このプロテアーゼがエラスチンに特定なものであるということを意味しない。事実、エラスターゼは広範な蛋白基質を加水分解し、例えば、白血球エラスターゼは、結合組織の巨大分子の実際上総てをへき開する能力がある（Ｒｏｂｅｒｔ，Ｌ．１９８８，Ｐａｔｈ．Ｂｉｏｌ．３６：１１０１−１１０７）．エラスターゼタイプのこれらのプロテアーゼは、組織の弾性線維、ならびに、更に、その他の構成成分、例えばコラーゲン線維、糖蛋白、例えばヒブロネクチンを分解する能力を持つ。このようなタイプの現象は細胞老化の現象の中に記述されている。すなはち、多くの研究により、このタイプの酵素の合成と蓄積が老化に間に増大することが示され、次のものが、特に述べられている。 −Ｌａｂａｔ−Ｒｏｂｅｒｔ，Ｊ．ｅｔａｌ．，Ａｎｎ．ＮｅｗＹｏｒｋＡｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９２），６７３：１６−２２， −Ｒｏｂｅｒｔ，Ｊ．ＳａｎｇＴｈｒｏｍｂｏｓｅＶａｉｓｓｅａｕｘ（１９９１），３：２６７−３３０ −Ｒｏｂｅｒｔ，Ｌ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８８），３６：１１０１ −１１０７これらの同一のプロテアーゼとエンドペプチダーゼも他の器官の基質構成要素、例えば、肺のエラスチンを分解し、この結果肺気腫を起こす能力を持ち、または、動脈の弾性板と血管のエラスチンとコラーゲンを分解し、従って脈管疾患、すなはち、動脈と静脈血管のアテローム性動脈硬化症と動脈硬化症の発生を促進させる能力を有する。これらの総ての病状は、年齢と共にその頻度と過酷度が増大する。同種の他のエンドペプチダーゼ（亜鉛金属エンドペプチダーゼ）は不活性のアンギオテンシンIを激しい動脈高血圧症の引き金となりうるアンギオテンシンＩＩへ活性化する能力がある。最後に、エンケハリナーゼ、同種のタイプの他の亜鉛エンドペプチダーゼはエンケハリンの機能と干渉し、どのタイプが過剰にあるかという程度により、脳の機能の障害に導く。異なった基質に作用し非常に多岐な病状に導くこれらのエンドペプチダーゼの共通の特徴は、それらが亜鉛含有活性部位を持ち、それらが細胞膜に総て結合していることである。以下の記述において、皮膚の線維芽細胞のエラスターゼが論じられるが、与えられる身体病理機構と治療原理もまた非限定列挙が上記で与えられたその他のエンドペプチダーゼとその他の病状にも有効である。本発明は結合組織の老化の発現の治療または予防のための組成物で、それらが２乃至５のグリコシド残基を持つ少なくとも１つのオリゴ糖、または、ガラクトースを非還元性末端位置に含むようなオリゴ糖を含むことを特徴とする。本発明は皮膚老化の発現の治療のため、オリゴ糖、または、その誘導体が化粧品、好ましくは局所投薬と両立し得るベヒクルと組み合わせるときに用いられることを特徴とする組成物に関する。本発明はまた、ある種の病状、特に心臓血管病状および肺気腫を伴う結合組織の線維基質に関する加速された老化の発現の治療または予防のための、オリゴ糖、または、ガラクトースを非還元性末端位置に有するその誘導体を含むような組成物に関する。結合組織の線維基質に関する皮膚老化または加速された老化の発現の治療または予防のための組成物に与かるオリゴ糖は、好ましくは、ラクトース、メリビオース、スタキオース（ｓｉｃ），または、これらの糖の一つの誘導体、または、その混合物である。本発明による組成物に関与できるオリゴ糖誘導体は、ガラクトース残基を非還元性末端位置に総て含み、オリゴ糖が以下の一般式に相当する以下に述べられるカテゴリーの中に含まれる。ガラクトース−_n（αまたはβ）−（Ｈｅｘ）_n´、ここで、ｎは位置１、２、３、４または６を表し、Ｈｅｘはαまたはβ構造に組み込まれたペントースまたはヘキソースを表しｎ´は１と５の間の数でありａ）式に相当するグリコシッド（Ｉ）オリゴグリコシッド１−Ｏ−Ｒ、ここでＲは１乃至１８の炭素原子を持つ線状または分枝アルキル残査であり（ＩＩ）オリゴグリコシッド１−Ｏ−Ｒ−Ｏ−１−オリゴグリコシッド、ここでＲ＝（ＣＨ₂）_nで、ｎは２乃至１０である。ｂ）次式の一つによるアシル化グリコシルアミン、ここでオリゴグリコシッドは好ましくはラクトース、メリビオース、スタキオースである。 −次式の一つに相当するアシル化グリコシルアミン（ＩＩＩ）オリゴグリコシッド１−ＮＨ−ＣＯ−Ｒ、ここでＲは１乃至１８の炭素原子を持ち、０、１または２の二重結合を含むアルキル残基であり（ＩＶ）オリゴグリコシッド１−ＮＨ−ＣＯ−Ｒ−ＣＯ−ＮＨ−１−オリゴグリコシッド、ここでＲ＝（ＣＨ₂）_nで、ｎは２乃至８である。ｃ）オリゴグリコシッドの酸化で得られたアルドン酸でアシル化されたアルキルアミン（Ｖ）オリゴグリコシッド−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ，ここでＲは式（ＩＩＩ）におけると同じ意味を持つ（ＶＩ）オリゴグリコシッドＣＯ−ＮＨ−Ｒ−ＮＨ−ＣＯ−オリゴグリコシッド，ここでＲは式（ＩＩＩ）におけると同じ意味を持つｄ）または、脂肪族モノー、ヂアミンとオリゴグリコシッドで形成される（ｓｉｃ）シッフ塩基の還元生成物で、以下の式の一つに相当する（ＶＩＩ）Ｇａｌ−（Ｈｅｘ）_n−Ｘ−ＨＮ−Ｒ（ＶＩＩＩ）Ｇａｌ−（Ｈｅｘ）_n−Ｘ−ＨＮ−Ｒ−ＮＨ−Ｘ−（Ｈｅｘ）_n−Ｇａｌ，ここでＨｅｘはヘキソースまたはペントース、ｎは０、１または２でありＸ＝１−ＮＨ₂−ヘキシトールであり、Ｒは式（ＩＩＩ）におけると同じ意味を持つ。以上に記述されたこれらのオリゴ糖またはその誘導体は、共通して、培養線維芽細胞中のエラスターゼの合成および／または分泌を少なく２０％減少させるという特徴を持つ。この効果は、これらの細胞の培地、ならびに細胞それ自身の中で、測定可能な酵素活動の減少となって表わされる。・用いられた方法は、標準状態下で人体の皮膚線維芽細胞を培養し、合成基質（Ｎ−スクシニルトリアラニル−パラ−ニトロアニリド（ｓｉｃ））を用い、比色計によって培養のエラスターゼ活性を測定することから成る。この合成基質を用いて、エラスターゼタイプのエンドペプターゼの生合成が線維芽細胞のひき続く通過乃至排泄の間中、増加し、これにより、Ｈａｙｆｌｉｃｋ（１９８０，ＣｅｌｌＡｄｄｉｎｇＩｎ．（ｓｉｃ）ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗｏｆＧｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙａｎｄＧｅｒｉａｔｒｉｃｓ；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ１：２６−６７）；Ｌａｂａｔ−ＲｏｂｅｒｔＪ．ｅｔａｌ．（１９８８，ＥｘｐｅｒｔＧｅｒｏｎｔｏｌ．２３：５−１８）のモデルに従う生体外老化機構を構成することを示すのが可能となった。酵素活性は本質的に細胞膜と関連しており、可溶画分中で線維芽細胞のトリプシン化の後、回収される。全活性の２乃至１０％が培地中で回収でき、残余は細胞残査と関連し、洗剤を用いて可溶化され得る。本発明は、人体線維芽細胞、特に皮膚線維芽細胞に存在するエラスチン受容体により線維芽細胞からエラスターゼタイプのプロテアーゼの生合成と分泌を制御するための上述のオリゴ糖またはその誘導体の使用に関するもので、この制御は皮膚老化、あるいは、特に過剰なエンドペプチダーゼの存在による病状に関連した促進老化の発現の治療と予防の効果を有する。事実、上述のように、６７ｋＤサブユニットのエラスチン受容体は、ガラクトースを末端位置に含むラクトースまたはオリゴ糖または多糖構造と特定的に反応する構造を持っている（Ｌａｂａｔ−Ｒｏｂｅｒｔ，Ｊ．ｅｔａｌ．，以上に引用された、および、Ｍｅｃｈａｍ，Ｒ．Ｐ．ｅｔａｌ．１９８９，Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８：３７１６−３７２２）．本発明の組成物に関与するオリゴ糖誘導体は、後の例で説明されるように、化学的にも合成されるし、また、生物媒体、特にミルク、血液または胎盤から、または、その代替として、本発明の組成物の調製に補足的なガラクトシドを含む蜂蜜のような天然製品から抽出することもできる（Ｒ．Ｓｉｄｄｉｑｕｉ，ｉｎＡｄｖａｎｃｅ（ｓｉｃ）ｉｎＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｅｄ：Ｄ．Ｈｏｒｔｏｎ，ｖｏｌ．４９，ｐｐ．２８５−３０９）．多糖類またはその誘導体はこのように標準的な方法で抽出することができる（ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｏｆＭａｔｒｉｘＢｉｏｌｏｇｙ（１９８５），ｖｏｌ．１０，Ｓ．ＫａｒｇａｒＥｄｉｔｉｏｎ），そして、次に、酵素分解または化学的加水分解のいずれかを受け、最後に、関連する化合物が塩沈殿、または、イオン交換クロマトグラフイーまたはＳｅｐｈａｒｏｓｅゲル上クロマトグラフイー、または、その他の好適な手順のいずれかによって分離される。本発明は、また、皮膚老化の影響の予防と治療とのために意図された組成物を調製する方法に関し、ガラクトースを非還元性末端位置に含む２乃至５のグリコシド残基を持つオリゴ糖、または、このようなオリゴ糖の誘導体を、前記組成物の０．５乃至６重量／容積％で、局所的投薬するために、許容されるベヒクル中へ配合することを含む。この組成物は皮膚老化の影響の予防と治療とのために皮膚病学および／または美容術で有利に使用することができる。同様に、本発明は、異常なエラスターゼの合成を伴うある種の病状、特に、肺気腫、動脈と静脈血管のアテローム性動脈硬化症と動脈硬化症と関連する結合組織の線維支質に関し促進された老化の発現の予防または治療のため、あるいは最終的に、エラスターゼタイプのエンドペプチダーゼがアンギオテンシンＩからアンギオテンシンＩＩへの活性化に責任がある場合、動脈高血圧の治療と予防において意図される組成物を調製する方法に関し、この使用は、許容される医学ベヒクルと組み合せて、ガラクトシドを非還元性末端位置に含むオリゴ糖、または、オリゴ糖誘導体を組成物中へ配合することを特徴とするものである。オリゴ糖誘導体が疎水性残基を含むとき、有利なベヒクルは、誘導体のグリコシド画分をその表面に現はさすリポゾームから成る。以下の詳細な例では、１５乃至２５の通過乃至排泄（ｐａｓｓａｇｅ）をする人体線維芽細胞からエラスターゼの合成と分泌に及ぼすラクトース、メリビオース、スタキオースおよびそれらの誘導体の影響が示される。このようにして処理される細胞はＨａｙｆｌｉｃｋ（上記の文献）のモデルに従えば老化期に入り、そして生体外の老化モデルを構成する細胞である。本発明のオリゴ糖誘導体投薬によりこのような系におけるエラスターゼの合成と分泌で観察される減少はこれらの抗老化化合物の影響の指標である。何故ならば、以上でみたように、エラスターゼの合成および分泌における増大はこれらの線維芽細胞の老化に伴う現象であるからである。これらの例は皮膚の線維芽細胞に対する影響に限られないが、どんなタイプの線維芽細胞とその他の内皮細胞に一般化され、平滑筋細胞と白血球はエラスチン受容体をその膜に持ち、この受容体は６７ｋＤサブユニットを含み、ガラクトシドに対する親和性を持つ。材料と方法人体の皮膚線維芽細胞を１６乃至２４才の女性の哺乳器官のプラスチック手術の過程で取った皮膚生検から得た。細胞を３５ｘ１０ｍｍのＮＵＮＣＬＯＮ−ＤＥＬＴＡプラスチック瓶中で９０／１０％の酸素／窒素の雰囲気中で、胎児段階の子牛の１０％の血清、２００μｇ／ｍｌのペニシリンン、２００単位／ｍｌのストレプトマイシンを持つＤｕｌｂｅｃｃｏ変性のＥａｇｌｅ媒地（ＤＭＥＭ）中で培養する。実験をエラスターゼ活性が増加し細胞の老衰を反映する水準であるかぎり、１８番目と２１番目の通過乃至排泄の間に行う。実験前２４時間で、培地を取り除き、１ｍｌの新鮮なＤＭＥＭ培地を、１０ｍＭの最終濃度でラクトースと共に加えた。特定な時間間隔の後、培地を除き、培地に加えた１ｍｌのＰＢＳ（燐酸塩で緩衝された塩水）で２回細胞の層を洗浄した。細胞層を次に１ｍｌのＰＢＳ中２０μｇの濃度の、３７℃でトリプシン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）の新鮮な溶液で処理し、次に１００ｇで４℃で５分間遠心分離した。１ｍｌのＰＢＳで静かに注ぎ濯いだ後、細胞残査をｐＨ７．４，０．１％のＴｒｉｔｏｎｘ−１００を含む０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ中に懸濁し、Ｐｏｔｔｅｒホモジナイザーで均一化する。この懸濁液の上澄液を細胞と関連する酵素活性の測定に用いた。エラスターゼタイプの活性の測定は、基質Ｎ−スクシニル−トリアラニル−パラ−ニトロアニリド、または、Ｎ−ｓｕｃ−ａｌａ₃ｐ−Ｎａ）をジメチルホルムアミド中で１２５ｍＭの濃度で、Ｂｉｅｔｈ，Ｊ，１９７８（上記参照）に記載された技術で、一定量の細胞抽出物へ加えることで行った。培地には、５６μｌをｐＨ７．８、８９０μｌの０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌの緩衝液、および、１０μｌの基質溶液に加えた。トリプシネイトまたは細胞残査の５０μｌを９４０ｍｌのＴｒｉｓ緩衝液と１０μｌの基質に加えた。培地には３７℃で３時間、トリプシネイトと細胞残査に対しては１時間培養を行なう。基質に対する酵素の活動を通じて現われる黄色の光学的密度を分光計で４１０ナノメーターで読む。総ての実験を４乃至６の培地で平行して行い、平均値をＳｔｕｄｅｎｔｔ− ｔｅｓtを用いて統計的に比較する。酵素活性（ＥＡ）を、時間当たりおよび１０⁶の細胞当たりで加水分解された基質のｎＭで表し、以下のようにして計算する。ＥＡ＝ＯＤｘｖ総計／８．８ｘｖ試料ｘＮｘＴＸ１０⁶ ここで −ＯＤは光学的密度、 −Ｎは反応容積中の細胞の数、 −Ｔは培養時間、 −８．８は厚さ１ｃｍの細胞中の基質のモル溶液のＯＤに相当するモル吸光係数である。以下の異なる例で、ガラクトースとその誘導体の線維芽細胞のエラスターゼ活性度の変化に及ぼす影響を，エラスチンペプタイド、すなはち、カッパーエラスチン（ＫＥ）によるこの活性の変化を測定することによって研究した。このペプチドは牛の後頭部の靭帯からエラスチンの加水分解により、水性エタノール中のアルカリ加水分解により、ＲｏｂｅｒｔＬ．ａｎｄＰｏｌｌａｉｎＮ．（Ｅｔｕｄｅｓｓｕｒｌａｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄｅｌ´ｅｓｌａｓｔｉｎｅｅｔｌｅｍｏｄｅｄ´ａｃｔｉｏｎｄｅｌ´ｓｌａｓｔａｓｅ．Ｉ．Ｎｏｕｖｅｌｌｅｍｅｔｈｏｄｅｄｅｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｄｅｒｉｖｅｓｓｏｌｕｂｌｅｓｄｅｌ´ｅｌａｓｔｉｎｅ．（Ｓｔｕｄｉｅｓｏｎｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｅｌａｓｔｉｎａｎｄｔｈｅｍｏｄｅｏｆａｃｔｉｏｎｏｆｅｌａｓｔａｓｅ．Ｉ．Ｎｅｗｍｅｔｈｏｄｏｆｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｓｏｌｕｂｌｅｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓｏｆｅｌａｓｔｉｎ．）Ｂｕｌｌ．Ｓｏｃ．Ｃｈｉｍ．Ｂｉｏｌ．４５：１３１７−１３２６（１９６３））に記された技術により、得られた。このペプチドは、実際上、エラスチン受容体の主働薬である、すなはち、その存在は、培地中のエラスターゼ活性の増加に導く。以下の表１は、培養時間の関数として２０回目の通過（ｐａｓｓａｇｅ）での人体線維芽細胞のエラスターゼ活性に及ぼす１ｍｇ／ラメラでのカッパーエラスチンの作用の動力学を示す。エラスターゼ活性における大きな増加が、２４時間の潜伏期間の後に、培地（分泌物）中で認められる。同時に、トリプシネート中の膜活性が減少する。培地中の活性の増加が培地中への膜酵素の放出と関連付けられるのがみられる。例１ラクトースの作用の研究用いられたラクトースの濃度は１０ｍＭ，または３．６ｍｇ／ｍｌである。以下の表２は１０ｍＭのラクトースが、２１回目の通過（ｐａｓｓａｇｅ）で人体線維芽細胞のエラスターゼ活性に及ぼす影響と、自由形、膜形（トリプシネート）および細胞に関連する形（Ｔｒｉｔｏｎ効果後）の間の分布に及ぼす影響とを示している。活性は、加水分解基質の光学的密度として１０⁶の細胞に１０³／時間を掛けて示される。異なる培地についての４つの平行測定の平均値を計算した。３つの区画の間の活性の分布を全体の％として示し、同様に、ラクトースによる抑制をラクトース不在での同等な活性の％として示す。この表は全活性度における５５％の減少と３つの画分における酵素活性度の分布の変化を示す。培地で測定された遊離の酵素は対照培地と比べると６６％減少し、トリプシンで放出され得る膜と関連した酵素は７４％減少する。一方、残査（細胞）活性は対照からの著しい変化を示さない。この膜と関連し、培地に放出される活性の選択的抑制は全活性度の分布を修正する。対照培地では、全活性度の大部分は細胞膜（６１％）と関連しており、トリプシンで放出される。ラクトースで処理された培地では、全活性度の３５％のみがトリプシンで放出され、５８％が細胞残査と関連している。ラクトースが、酵素の合成と放出を減少させる効果を持つことを、このようにして、見ることが出来る。例２：エラスターゼの合成に及ぼすメリビオースの作用の研究メリビオースを１０ｍＭ、すなはち、３．４ｍｇ／ｍｌの濃度で，ラクトースと同じ培養状態で培地に加える。メリビオースは対照に関して培地中で酵素活性に６０％の減少を、トリプシネートに８０％の減少、同時に、細胞ペレットに若干の減少をもたらす。全酵素活性度は５０％減少する。例３：スタキオースの作用スタキオースは、ＭｅｔｈｏｄｓｏｆＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＣｈｅｍｉｓｔｒｙＩ，ｐ．３６８−３６９，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，１９６２に記載されたＭ．Ｌ．ＷｏｌｆｒｏｍとＡ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎの技術によって調製されるテトラサッカリドである。スタキオースを１０ｍＭ、すなはち、６．６ｍｇ／ｍｌの濃度で培地に加えた。スタキオースは対照に関してトリプシネートに酵素活性を６０％減少させる効果を持ち、培地に若干の増加をもたらす。１ｍｇ／ｍｌの濃度でカッパーエラスチンの存在下では、カッパーエラスチン単独の効果に関し培地（５２％）中で著しく酵素活性を減少させる。トリプシネートでは、再びカッパーエラスチン単独の効果に関し、３２％の増加が観察される。ペレットの酵素活性は著しくは変わらない。例４：オレオイルラクトシルアミンの作用オレオイルラクトシルアミンは式Ｘに相当する化合物である。その合成は新しい。ａ）オレオイルラクトシルアミンの合成１−アミノラクトースをオレオイルクロリドと反応させ以下の式のラクトビオニル−オレオイルアミンを作る。３．３ｇのラクトシルアミンを３０ｍｌのメタノールに８０℃で溶かし、１．２ｇのジエチルアミンを加える。この溶液に４ｇのオレオイルクロリドを、攪拌しながら３０℃を超えない温度で加える。混合物のｐＨはＨＣｌを加えることによって３になる。オレイン酸をヘプタンで抽出して除く。水性メタノール相を酸、塩基イオン交換カラムを通じて、順次通過させ、溶剤を真空下で追い出す。得られた製品はまだ約２０％のラクトースを含んでいる。オレオイルラクトシルアミンは、オクチル−セハロ−ゼカラム上で精製される。Ｒｆ＝シリカ上（ＭｅＯＨ薄層），０．８（クロロフォルム／メタノール１：１，ｖ／ｖ）．ｂ）線繊芽細胞の老化培養に及ぼす影響：オレオイルラクトシルアミンを０．５ｍＭの濃度で加える。この濃度で、トリプシネートの活性に僅かな増加と細胞ペッレトに約２０％の減少を生ずる。例５：ジメリビオニチルジアミノヘキサンの作用ａ）ジメリビオニチルジアミノヘキサン（ｓｉｃ）の調製この製品を以下に述べる新しい技術で合成した。３７４ｍｇのメリビオーズ（１．１ｍＭ（ｓｉｃ））と１１６ｍｇ（０．５ｍＭ（ｓｉｃ））のジアミノヘキサンを５ｍｌの０．２Ｍの燐酸塩緩衝液にｐＨ８で溶解する。これに２７０ｍｇのナトリウムシアノボロハイドライド（４．４ｍＭ（ｓｉｃ））を溶かす。混合物を室温で１１日間放置し、次に、２日間３７℃ で加熱する。溶液を酸性イオン交換器（Ｈ⁺）を通過させカラムを水洗する。物質を次に、０．５Ｍのアンモニア溶液で溶離し溶液を凍結乾燥する。収量は２００ｍｇのジメリビオニチルジアミノヘキサンである。シリカ上のＲｆ＝０．２（ブタノール／酢酸／水、ｈ＝１：１（ｓｉｃ））．図１はジメリビオニチルジアミノヘキサン誘導体に導く反応略図を示す。ｂ）人体線維芽細胞の培養の酵素活性に及ぼすジメリビオニチルジアミノヘキサンの作用：媒体の酵素活性の増大が観察され、また、対照に関してトリプシネートの４０％の減少が観察される。カッパーエラスチンの存在下で、活性が媒体中で７１％減少し、トリプシネートには増加がなかった。反面、細胞ペレットに回収される活性は、カッパーエラスチン単独の作用に関しては僅かに増加するが、対照の値を変化させない。ｃ）種々な影響の比較表３は、人体線維芽細胞のエラスターゼ活性において種々なガラクトシド誘導体で得られた全体の結果を総括する。下線の誘導体は上記の例に述べられるものである。例６：ヌードラットにおけるラクトースとメリビオースの影響２群のラットを、１群はラクトース、または、メリビオースで、他群は気休め薬で処理し比べる。ラットを、次に、３ＭＥＤ（最小紅疹投与量）の投与量で照射する。エラスターゼ活性の分析を、ＭａｔｅｒｉａｌａｎｄＭｅｔｈｏｄ（ｓｉｃ）に記された方法によって照射されたラットからとった生検で測定する。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年１１月２日【補正内容】請求の範囲１．結合組織の老化の発現の治療または予防のために有効な医薬製品の調製のため、２乃至５のグリコシド残基を持つオリゴ糖、または、疎水性残基を含むオリゴ糖誘導体で、前記オリゴ糖がガラクトース残基を非還元性末端位置に含む少なくとも１つのオリゴ糖の使用。２．結合組織の線維支質の分解に含まれるエラスチンに対する膜受容体を抑制する能力がある組成物の調製のため、２乃至５のグリコシド残基を持つオリゴ糖、または、疎水性残基を含むオリゴ糖誘導体で、前記オリゴ糖がガラクトース残基を非還元性末端位置に含むオリゴ糖の請求の範囲第１項に記載の使用。３．結合組織の老化の発現の化粧的治療または予防のための、２乃至５のグリコシド残基を持つオリゴ糖、または、疎水性残基を含むオリゴ糖誘導体で、ガラクトース残基が非還元性末端位置に存在する、少なくとも１つのオリゴ糖の使用。４．結合組織の老化の発現の治療または予防のために有効な皮膚化粧的組成物の調製のため、オリゴ糖、または、その誘導体が局所投薬と両立し得るベヒクルと組み合わされている請求の範囲第１項乃至第３項のいずれかに記載のオリゴ糖の使用。５．オリゴ糖が以下の一般式を有し、ガラクトース−_n（αまたはβ）−（ｘ）_n´、ここで、ｎは位置１、２、３、４または６を表し、ｘはαまたはβ構造に組み込まれたペントースまたはヘキソースを表しｎ´は１と５の間の数である、請求の範囲第１項乃至第４項のいずれかに記載の使用。６．オリゴ糖がメリビオースである請求の範囲第５項に記載の使用。７．活性本体としてオリゴ糖、または、疎水性残基がグラフトされているその誘導体を含み、医薬的に許容される賦形剤と混合され、次の一般式に相当するオリゴ糖を持つ医薬組成物。ガラクトース−_n（αまたはβ）−（Ｘ）_n´、ここで、ｎは位置１、２、３、４または６を表し、ｘはαまたはβ構造に組み込まれたペントースまたはヘキソースを表しｎ´は１と５の間の数であるここで、オリゴ糖が置換されていないならば、ラクトース以外であり、オリゴ糖誘導体が以下のカテゴリーの一つから選ばれ、ａ）オリゴ糖はオリゴグリコシド、好ましくは、ラクトース、メリビオース、スタキオースである以下の式の一つによるグリコシド（Ｉ）オリゴグリコシッド１−Ｏ−Ｒ（ｓｉｃ）、ここでＲは１乃至１８の炭素原子を持つ線状または分枝アルキル残基でありもし一般式（Ａ）において、Ｘがｇａｌを表し、ｎが１に等しいならば、Ｒがエチルまたはメチル以外であるもしオリゴ糖がラクトースであれば、Ｒは１乃至６の炭素原子を持つアルキル残基以外である。（ＩＩ）オリゴグリコシッド１−Ｏ−Ｒ−Ｏ−１−オリゴグリコシッド（ｓｉｃ）、ここでＲ＝（ＣＨ₂）_n´で、ｎは２乃至１０であるｂ）次式の一つによるアシル化グリコシルアミン、ここでオリゴグリコシッドは好ましくはラクトース、メリビオース、スタキオースである（ＩＩＩ）オリゴグリコシッド１−ＮＨ−ＣＯ−Ｒ、ここでＲは１乃至１８の炭素原子を持ち、０、１または２の二重結合を含むアルキル残基であり（ＩＶ）オリゴグリコシッド１−ＮＨ−ＣＯ−Ｒ−ＣＯ−ＮＨ−１−オリゴグリコシッド、ここでＲ＝（ＣＨ₂）_nで、ｎは２乃至８である。ｃ）オリゴグリコシッドの酸化で得られたアルドン酸でアシル化されたアルキルアミン（Ｖ）オリゴグリコシッド−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ，ここでＲは式（ＩＩＩ）におけると同じ意味を持つ（ＶＩ）オリゴグリコシッドＣＯ−ＮＨ−Ｒ−ＮＨ−ＣＯ−オリゴグリコシッド，ここでＲは式（ＩＩＩ）におけると同じ意味を持つｄ）または、脂肪族モノー、ヂアミンとオリゴグリコシッドで形成される（ｓｉ c）シッフ塩基の還元生成物で、以下の式の一つに相当する（ＶＩＩ）Ｇａｌ−（Ｈｅｘ）_n−Ｘ−ＨＮ−Ｒ（ＶＩＩＩ）Ｇａｌ−（Ｈｅｘ）_n−Ｘ−ＨＮ−Ｒ−ＮＨ−Ｘ−（Ｈｅｘ）_n−Ｇａｌ，ここでＨｅｘはヘキソース（またはペントース）の残基、ｎは０、１または２でありＸはヘキシトール（又はペンチトール）の残基であり、Ｒは式（ＩＩＩ）におけると同じ意味を持つ。８．活性本体として、メリビオース、スタキオース、および、その混合物から選ばれる少なくとも一つのオリゴ糖を含む請求の範囲第７項に記載の組成物。９．結合組織の老化に対し活性である薬剤として、メリビオース、２乃至５のグリコシッド残基とガラクトースを非還元性末端位置に含むオリゴ糖誘導体から成る群から選ばれる化合物を含み、このような誘導体は疎水性基で置換され、前記誘導体は以下から選ばれることを特徴とする化粧用組成物。ａ）オリゴ糖がオリゴグリコシド、好ましくは、ラクトース、メリビオース、またはスタキオースである以下の式の一つによるグリコシド。（Ｉ）オリゴグリコシッド１−Ｏ−Ｒ（ｓｉｃ）、ここでＲは１乃至１８の炭素原子を持つ線状または分枝アルキル残基であり（ＩＩ）オリゴグリコシッド１−Ｏ−Ｒ−Ｏ−１−オリゴグリコシッド（ｓｉｃ）、ここでＲ＝（ＣＨ₂）_nで、ｎは２乃至１０であるｂ）次式の一つによるアシル化グリコシルアミン、ここでオリゴグリコシッドは好ましくはラクトース、メリビオース、スタキオースである（ＩＩＩ）オリゴグリコシッド１−ＮＨ−ＣＯ−Ｒ、ここでＲは１乃至１８の炭素原子を持ち、０、１または２の二重結合を含むアルキル残基であり（ＩＶ）オリゴグリコシッド１−ＮＨ−ＣＯ−Ｒ−ＣＯ−ＮＨ−１−オリゴグリコシッド、ここでＲ＝（ＣＨ₂）_nで、ｎは２乃至８であるｃ）オリゴグリコシッドの酸化で得られたアルドン酸でアシル化されたアルキルアミン（Ｖ）オリゴグリコシッド−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ，ここでＲは式（ＩＩＩ）におけると同じ意味を持つ（ＶＩ）オリゴグリコシッドＣＯ−ＮＨ−Ｒ−ＮＨ−ＣＯ−オリゴグリコシッド，ここでＲは式（ＩＩＩ）におけると同じ意味を持つｄ）または、脂肪族モノー、ヂアミンとオリゴグリコシッドで形成される（ｓｉｃ）シッフ塩基の還元生成物で、以下の式の一つに相当する（ＶＩＩ）Ｇａｌ−（Ｈｅｘ）_n−Ｘ−ＨＮ−Ｒ（ＶＩＩＩ）Ｇａｌ−（Ｈｅｘ）_n−Ｘ−ＮＨ−Ｒ−ＮＨ−Ｘ−（Ｈｅｘ）_n−Ｇａｌ，ここでＨｅｘはヘキソース（またはペントース）の残基、ｎは０、１または２でありＸはヘキシトール（またはペンチトール）の残基であり、Ｒは式（ＩＩＩ）におけると同じ意味を持つ。１０．メリビオースを含むことを特徴とする皮膚科学的組成物。１１．オリゴ糖誘導体が化学的合成で得られる、請求の範囲第７項乃至第９項に記載の組成物を調製する方法。１２．ａ）生物媒体、特にミルク、血液または胎盤からの糖の抽出ｂ）抽出された糖の酵素分解、または化学的加水分解、およびｃ）好ましい化合物の分離、の工程を含むことを特徴とする請求の範囲第７項乃至第１０項のいずれかに記載の組成物を調製する方法。１３．皮膚老化の影響の予防と治療とのために意図された請求の範囲第７項乃至第１０項のいずれか記載の組成物を調製する方法において、ガラクトースを非還元性末端位置に含む２乃至５のグリコシド残基を持つオリゴ糖、または、この様なオリゴ糖の誘導体を、前記組成物の０．５乃至６重量／容積％、好ましくは１乃至４重量／容積％で、局所的投薬するために、許容されるベヒクル中へ配合することを含むことを特徴とする方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ // Ｃ０７Ｈ 3/06 8615−4ＣＣ０７Ｈ 3/06 13/06 8615−4Ｃ 13/06 15/04 8615−4Ｃ 15/04 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．結合組織の老化の発現の治療または予防のための組成物で、それが２乃至５のグリコシド残基を持つ少なくとも１つのオリゴ糖、または、疎水性残基を含むかかるオリゴ糖の誘導体を含み、ガラクトース残基が非還元性末端位置に存在することを特徴とする組成物。２．オリゴ糖、または、その誘導体が化粧的、好ましくは局所的投薬と両立し得るベヒクルと組み合わすときに皮膚老化の発現の治療のため用いられることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の組成物。３．オリゴ糖、または、その誘導体が薬学的に許容されるベヒクルと組み合はせられていること特徴とするある種の病状を伴う結合組織の線維支質に関する加速された老化の発現の治療または予防のための請求の範囲第１項に記載の組成物。４．オリゴ糖が以下の一般式に相当し、ガラクトース−_n（αまたはβ）−（Ｘ）_n´、ここで、ｎは位置１、２、３、４または６を表し、ｘはαまたはβ構造に組み込まれたペントースまたはヘキソースを表しｎ´は１と５の間の数でありオリゴ糖が、特にラクトース、メリビオース、スタキオース、またはこれらの混合物であるようなことが可能であることを特徴とする請求の範囲第１項乃至第３項のいずれかに記載の組成物。５．オリゴ糖誘導体が以下のカテゴリーの一つから選ばれることを特徴とする請求の範囲第１項乃至第３項に記載の組成物。ａ）オリゴ糖はオリゴグリコシド、好ましくは、ラクトース、メリビオース、スタキオースである以下の式の一つによるグリコシドｂ）（Ｉ）オリゴグリコシッド１−Ｏ−Ｒ、ここでＲは１乃至１８の炭素原子を持つ線状または分枝アルキル残基であり（ＩＩ）オリゴグリコシッド１−Ｏ−Ｒ−Ｏ−１−オリゴグリコシッド、ここでＲ＝（ＣＨ₂）nで、ｎは２乃至１０である。ｂ）次式の一つによるアシル化グリコシルアミン、ここでオリゴグリコシッドは好ましくはラクトース、メリビオース、スタキオースである。（ＩＩＩ）オリゴグリコシッド１−ＮＨ−ＣＯ−Ｒ、ここでＲは１乃至１８の炭素原子を持ち、０、１または２の二重結合を含むアルキル残基であり（ＩＶ）オリゴグリコシッド１−ＮＨ−ＣＯ−Ｒ−ＣＯ−ＮＨ−１−オリゴグリコシッド、ここでＲ＝（ＣＨ₂）_nで、ｎは２乃至８である。ｃ）オリゴグリコシッドの酸化で得られたアルドン酸でアシル化されたアルキルアミン（Ｖ）オリゴグリコシッド−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ，ここでＲは式（ＩＩＩ）におけると同じ意味を持つ（ＶＩ）オリゴグリコシッドＣＯ−ＮＨ−Ｒ−ＮＨ−ＣＯ−オリゴグリコシッド，ここでＲは式（ＩＩＩ）におけると同じ意味を持つｄ）または、脂肪族モノー、ヂアミンとオリゴグリコシッドで形成される（ｓｉｃ）シッフ塩基の還元生成物で、以下の式の一つに相当する（ＶＩＩ）Ｇａｌ−（Ｈｅｘ）_n−Ｘ−ＨＮ−Ｒ（ＶＩＩＩ）Ｇａｌ−（Ｈｅｘ）_n−Ｘ−ＮＨ−Ｒ−ＮＨ−Ｘ−（Ｈｅｘ）_n−Ｇａｌ，ここでＨｅｘはヘキソース（またはペントースの残基）、ｎは０、１または２でありＸ＝ヘキシトール（又はペンチトール）の残基であり、Ｒは式（ＩＩＩ）におけると同じ意味を持つ。６．オリゴ糖誘導体が化学的合成によって得られることを特徴とする請求の範囲第１項乃至第３項に記載の組成物を調製する方法。７．ａ）生物媒体、特にミルク、血液または胎盤からの糖の抽出ｂ）抽出された糖の酵素分解、または化学的加水分解、およびｃ）好ましい化合物の分離、の工程を含むことを特徴とする請求の範囲第１項乃至第３項に記載の組成物を調製する方法。８．老化の影響の予防と治療とのために意図された組成物を調製する方法において、ガラクトースを非還元性末端位置に含む２乃至５のグリコシド残基を持つオリゴ糖、または、この様なオリゴ糖誘導体を、前記組成物の０．５乃至６重量／容積％、好ましくは１乃至４重量／容積％で、局所的投薬するために許容されるベヒクル中へ配合することを含むことを特徴とする方法。９．皮膚投与を許容されるベヒクルとともにする請求の範囲第１項乃至第４項のいずれかに記載の組成物の皮膚科学上の使用。