PT714284E

PT714284E - Utilizacao de oligossacaridos na prevencao e no tratamento do envelhecimento dos tecidos

Info

Publication number: PT714284E
Application number: PT94925512T
Authority: PT
Inventors: Alexandre Robert; Ladislas Robert; Elemer Moczar
Original assignee: Johnson & Johnson Consumer Fr
Priority date: 1993-08-17
Filing date: 1994-08-16
Publication date: 2001-08-30
Also published as: EP0714284A1; HUT75337A; JPH09501672A; DE69426932D1; PL179432B1; DK0714284T3; GR3035907T3; DE69426932T2; PL313036A1; KR100273389B1; BR9407305A; WO1995005155A1; ATE199827T1; CZ45196A3; US5910490A; AU699585B2; NZ271685A; AU7539394A; CA2169621C; ES2155478T3

Description

DESCRIÇÃO "UTILIZAÇÃO DE OLIGOSSACÁRIDOS NA PREVENÇÃO E NO TRATAMENTO DO ENVELHECIMENTO DOS TECIDOS" A presente invenção refere-se a uma composição para o tratamento ou para a prevenção das manifestações do envelhecimento compreendendo oligossacáridos ou derivados de oligossacáridos tendo D-galactose na posição terminal· não redutora, agindo esses derivados como moduladores da síntese e/ou da secreção da elastase de fibroblastos.

Sabe-se que o tecido conjuntivo ao nível da derme resulta da actividade bio-sintética dos fibroblastos que elaboram a matriz extracelular (Labat-Robert J. e col., Elsevier Science Publisher B.V. 248:386-393, 1990). A matriz extracelular é constituída por quatro famílias de macromoléculas. Trata-se de colagénios e da elastina que constituem o material fibroso da derme, as glicoproteínas da estrutura que asseguram a coesão entre as células e a matriz extracelular e fornecem o material microfibrilar do tecido elástico; os proteoglicanos que asseguram a hidratação dos tecidos e o controle do trânsito molecular. A elastina possui um receptor complexo na membrana das células fibroblásticas que contém uma subunidade de 67 kD que compreende um local de ligação aos hidratos de carbono. A. Hinek e col. (Science 239:1539-1541, 1988) mostraram que, quando a subunidade 67 kD do receptor da elastina estava 1 r L-Cj t imobilizada sobre uma coluna de afinidade em que o ligante era constituído pela elastina ou por péptidos da elastina, a lactose (1 mM) era capaz de eluir essa proteína de 67 kD, e que a galactose era igualmente eficaz na deslocação da ligação da proteína de 67 kD à elastina.

Pelo contrário, os oligossacáridos que não contêm galactose são incapazes de permitir a eluição da proteína de 67 kD ligada na coluna de afinidade de elastina.

Os autores concluíram assim que o receptor da elastina era uma proteína tendo propriedades de ligação aos galactósidos. É igualmente conhecido que as elastinas, no estado solúvel ou insolúvel, são incapazes de ser hidrolisadas por endoproteases e nomeadamente as elastases.

Foram descritas diferentes classes de proteases e de endopeptidases e foi publicada uma revisão dessas diferentes endopeptidases e das suas propriedades por Barrett e col., 1977 (Barrett A.J. Eds., North Holland, Amesterdão).

As elastases são proteases e endopeptidases em que as propriedades começam a ser bem estudadas. Os artigos seguintes, cujo conteúdo é incorporado na presente invenção por referência, descrevem essas propriedades, nomeadamente:

Bieth J. (1978) "Elastase: structure, function and pathological role". Front. Of Matrix Biol. Cis.: 1-82 e - Homsy R. e col. (1988) "Characterization of human skin fibroblasts elastase activity". Journ. Invest. Dermatol. 91:472-477. 2 t Γ A designação de uma enzima sob a denominação de elastase não implica que essa protease seja especifica da elastina. Com efeito, as elastases hidrolisam uma grande variedade de substratos protéicos e a elastase leucocitária, por exemplo, é capaz de clivar praticamente todas as macromoléculas do tecido conjuntivo (Robert L. 1988, Path. Biol.; 36:1101-1107).

Essas proteases do tipo elastase são capazes de degradar as fibras elásticas dos tecidos bem como outros constituintes tal como as fibras do colagénio ou as glicoproteínas, por exemplo, a fibronectina. Este tipo de fenómeno foi descrito nos fenómenos de envelhecimento celular; numerosos trabalhos mostraram que a síntese e a acumulação deste tipo de enzimam aumenta no decurso do envelhecimento, podendo citar-se nomeadamente: - Labat-Robert J. e col., New York Acad. Sei. (1992), 673:16- 22, - Robert J. Sang Thrombose Vaisseaux (1991), 3:267-330, - Robert L. Pathol. Biol. (1988), 36:1101-1107.

Estas mesmas proteases e endopeptidases são igualmente capazes de degradar os constituintes matriciais de outros órgãos, por exemplo, a elastina dos pulmões, induzindo assim um enfizema pulmonàr, ou ainda de degradar as camadas elásticas das artérias, e a elastina e o colagénio das veias, favorecendo assim o desenvolvimento de doenças vasculares: aterosclerose e arteriosclerose das artérias, e varicoses das veias. Todas estas patologias vêm a sua frequência e a sua gravidade aumentar com a idade.

Outras endopeptidases da mesma natureza (metaloendopeptidases com Zn) são capazes de activar a 3 Γ angiotensina I inactiva, em enqiotensina II que pode provocar uma hipertensão arterial severa.

Por fim, as encefalinases, outras endopeptidases com Zn da mesma natureza, interferem com o funcionamento das encefalinas e, de acordo com a importância dos seus excessos, podem induzir perturbações no funcionamento do cérebro. 0 denominador comum de todas estas endopeptidases que actuam sobre os substratos diferentes e induzindo patologias muito diversas é o facto de elas possuírem um local activo com Zn e serem todas ligadas à membrana celular.

Na descrição que se segue, o caso da elastase dos fibroblastos da pele será tratado, mas o mecanismo fisiopatológico e o princípio do tratamento que serão apresentados são igualmente válidos para as outras endopeptidases e as outras patologias uma vez que a enumeração não limitativa foi acima dada. A presente invenção refere-se a composições para o tratamento ou a prevenção de manifestações do envelhecimento do tecido conjuntivo, caracterizadas por conterem pelo menos um oligossacãrido de 2 a 5 resíduos osídicos ou um seu derivado, contendo uma galactose em posição terminal não redutora. A invenção refere-se a uma composição caracterizada por ser utilizada para o tratamento das manifestações do envelhecimento cutâneo, quando os oligossacáridos ou os seus derivados estão associados a um veículo compatível com uma administração cosmética, e de preferência tópica. 4 f~ ^-a. d ' A invenção refere-se igualmente às composições para o tratamento ou a prevenção das manifestações de envelhecimentos acelerados ao nível da trama fibrosa do tecido conjuntivo acompanhando certas patologias, especialmente as patologias cardio-vasculares e o enfisema pulmonar, contendo a referida composição oligossacáridos ou seus derivados tendo uma galactose em posição terminal não redutora.

Os oligossacáridos que entram na composição para o tratamento ou a prevenção das manifestações do envelhecimento cutâneo ou de envelhecimentos acelerados ao nivel da trama fibrosa do tecido conjuntivo são, de preferência, a lactose, a melibiose, a estaquiose ou os derivados de um destes açúcares ou uma mistura dos mesmos.

Os derivados de oligossacáridos que podem entrar numa composição de acordo com a invenção compreendem todos um resíduo da galactose em posição terminal não redutora; eles podem entrar nas categorias a seguir citadas, nas quais o oligósido obedece à seguinte fórmula geral: galactose-n(a ou β)-(Ηβχ)Π' na qual n representa a posição 1, 2, 3, 4 ou 6,

Hex‘representa uma pentose ou'uma hexose em ligação α ou β n' é um número compreendido entre 1 e 5; a) - glicossidos que obeecem às fórmulas: . (I) oligósido 1-0-R, em que R é um resíduo alquilo de 1 a 18 átomos de carbono, linear ou ramificado, (II) oligósido 1-O-R-O-l-oligósido em que R = (CH2)n» estando n compreendido entre 2 e 10, b) - uma osilamina acilada de acordo com uma das seguintes fórmulas, nas quais o oligósido é de preferência a lactose, a melibiose ou a estaquiose: 5 Γ - as osilaminas aciladas que obedecem a uma das seguintes fórmulas: . (III) oligósido 1-NH-CO-R, em que R é um resíduo alquilo de 2 a 18 átomos de carbono, contendo 0, 1 ou 2 duplas ligações, . (IV) oligósido 1-NH-CO-R-CO-NH-l-oligósido, na qual R = (CH2)n' estando n compreendido entre 2 e 8, c) - uma alquimina acilada por uma ácido aldónico obtido por oxidação de um oligósido, . (V) oligósido-CO-NH-R, na qual :>ν.· R tem o mesmo significado que na fórmula (III) . (VI) oligósido CO-NH-R-NH-CO-oligósido, em que R tem o mesmo significado que na fórmula (III), d) - ou um produto de redução das bases de Schiff formado por oligósidos com mono- ou diaminas alifáticas, e obedecendo a uma das seguintes fórmulas: . (VII) Gal-(Hex) n- X-HN-R, . (VIII) Gal-(Hex)n- X-HN-R-NH-X-(Hex) n-Gal, nas quais:

Hex é uma hexose ou uma pentose, n = 0, 1 ou 2, x = l-NH2-hexitol, e R tem o mesmo significado que em (III). O conjunto destes oligossacáridos ou dos seus derivados-· acima descritos têm em comum a característica de diminuírem pelo menos 20% a síntese e/ou a secreção da elastase nos fibroblastos em cultura.

Este efeito manifesta-se pela diminuição da actividade enzimática doseável no meio da cultura destas células, bem como das suas próprias células. 6 Γ Ο método utilizado consiste em cultivar os fibroblastos de pele humana em condições convencionais e em determinar por um método colorimétrico, com a ajuda de um substrato sintético (o N-succinil-trialanil-paranitroanilido), a actividade elastásica da cultura.

Utilizando este substrato sintético, foi possivel igualmente mostrar que a biossintese das endipeptidases de tipo elastase aumenta durante as passagens sucessivas dos fibroblastos constituindo assim um sistema de envelhecimento in vitro de acordo com o modelo de Hayflick (1980, Cell Adding In. Annual Review of Gerontology and Geriatrics; Springer, new York 1:26-67); Labat-Robert J. e col. (1988, Expert Gerontol. 23:5-18). A actividade enzimática está essencialmente associada com a membrana celular e pode ser recuperada após tripsinisação dos fibroblastos numa fracção solúvel.

Dois a 10% da actividade total podem ser recuperados nos meios de cultura e o resto está associado aos resíduos celulares e podem ser solubilizados com a ajuda de um detergente. A presente invenção refere-se à utilização dos oligossacáridos ou dos seus derivados acima descritos para controlar a biosíntese e a secreção das proteases de tipo elastase a partir de fibroblastos pelo receptor da elastina presente nos fibroblastos humanos, nomeadamente os fibroblastos da pele, tendo este controle por efeito prevenir ou tratar as manifestações do envelhecimento cutâneo, ou as do envelhecimento acelerado ligado às patologias devidas nomeadamente a uma presença excessiva de endopeptidascs. 7 Γ L-Cj

Com efeito, tal como foi acima referido, a subunidade de 67 kD do receptor da elastina possui uma estrutura que reage especificamente com a lactose ou estruturas oligo- ou polissacaridicas contendo galactose em posição terminal (Labat-Robert J. e col., acima citado e Mecham R.P. e col. 1989, Biochem. 28:3716-3722).

Os derivados de oligossacáridos que entram na composição da invenção podem ser ·· sintetisados quer quimicamente, como será explicado mais à frente nos exemplos, quer extraidos a partir de meios biológicos, nomeadamente o leite, o sangue ou a placenta, ou ainda de produtos naturais como o mel que contem galactósidos interessantes para a preparação das composições da invenção (R. Siddiqui, em Advance in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, Ed: D. Horton vol. 49, págs. 285-309).

Os polissacáridos ou os seus derivados podem assim ser extraidos pelos métodos clássicos (Frontiers of Matrix Biology (1985), vol. 10, S. Kargar Edition), e em seguida sofrer quer uma degradação enzimática, quer uma hidrólise quimica e, por fim, o composto desejado é separado quer por precipitação salina, quer por cromatografia de permuta de iões, quer por cromatografia em gel de Cepharose, ou por qualquer outro processo adequado. A presente invenção refere-se igualmente ao processo de preparação de uma composição destinada à prevenção ou ao tratamento dos efeitos do envelhecimento cutâneo caracterizado por compreender a incorporação num veiculo aceitável para uma administração local de um oligossacárido de 2 a 5 resíduos osidicos compreendendo uma galactose em posição terminal não 8 Γ redutora ou de um derivado de um tal oligossacárido, o qual representa 0,5 a 6% em peso do volume da referida composição.

Esta composição pode ser vantajosamente utilizada em dermatologia e/ou cosmética para o tratamento ou a prevenção dos efeitos do envelhecimento cutâneo.

Da mesma forma, a invenção refere-se a um processo de preparação de uma composição destinada à prevenção ou ao tratamento das manifestações de envelhecimento acelerado ao nivel da trama fibrosa do tecido conjuntivo que > acompanha certas patologias ligadas a uma síntese anormal de elastase, nomeadamente o enfisema pulmonar, a aterosclerose e a arteriosclerose das artérias e varicoses das veias, ou por fim, no tratamento ou na prevenção da hipertensão arterial quando as endopeptidases de tipo elastase são responsáveis pela activação da antigiotensina I em antigiotensina II; esta utilização é caracterizada pela incorporação numa composição, em associação com um veículo farmacêutico aceitável, de um oligossacárido ou de um derivado de oligossacárido compreendendo um galactósido em posição terminal não redutora.

Quando o derivado de oligossacáridos compreende um resíduo hidrõfobo, um veículo vantajoso pode ser constituído de liposomas, que permitem "apresentar a fracção osídica do derivado à sua superfície.

Nos exemplos detalhados que se seguem, é mostrado o efeito da lactose, da melibiose, da estaquiose e dos seus derivados na síntese e na secreção de elastase a partir de fibroblastos humanos tendo-se sofrido de 15 a 25 passagens: as celuloses assim tratadas são células que entram numa fase de senescência de acordo com o modelo de Hayflick (referência acima) e constituem assim o modelo de envelhecimento in vitro. 9

V

Lc, A diminuição observada da síntese e da secreção de elastase num tal sistema pela administração dos derivados de oligossacáridos da invenção, é um índice do efeito destes compostos anti-envelhecimento pois, como foi visto mãis acima, o aumento da síntese e da secreção de elastase são fenómenos ligados ao envelhecimento destes fibroblastos.

Estes exemplos não são limitativos de um efeito sobre os fibroblastos da pele, mas podem ser generalizados a todo o tipo de células fibriblásticas e outras células endoteliais, células musculares lisas, leucócitos possuindo na sua membrana um receptor de elastina, compreendendo o receptor uma sub-unidade de 67 kD com uma afinidade para os galactósidos. - Material e métodos:

Os fibroblastos da pele humana foram obtidos por biópsias de pele retiradas durante uma cirurgia plástica mamária de uma mulher com idade compreendida entre 16 e 24 anos.

As células são cultivadas num meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com 10% de soro de feto de bezerro, 200 pg/ml de penicilina e 200 unidades/ml de estreptomicina numa atmosfera de 90/10% de oxigénio/azoto em garrafas de plástico NUNCLON-DELTA de 35x10 mm.

As experiências são realizadas entre a 18a e a 21a passagem, na medida em que é a este nível que a actividade elástica aumenta e reflecte o estado de senescência das células. 10 r L·, ^

Vinte e quatro horas após as experiências, o meio é retirado e foi adicionado 1 ml do meio DMEM fresco com lactose à concentração final de 10 mM.

Após intervalos de tempo determinados, o meio é retirado, a camada de células enxaguada duas vezes com 1 ml de PBS (Solução Salina Tamponada com fosfato) que foi adicionado ao meio. A camada de células foi em seguida tratada com uma solução fresca de tripsina (Worthingthon) a 20 pg em 1 ml de PBS durante 5 min a 37°C, seguida por uma centrifugação a 100 g durante 5 min a 4°C.

Após decantação e enxaguamento com 1 ml de PBS, os resíduos celulares são suspensos em 1 ml de tampão Tris-HCl 0,1 M pH 7,4, contendo 0,1% de Triton x-100 e homogeneisados num homogeneisador Potter. 0 sobrenadante desta suspensão é utilizado para a determinação da actividade enzimática ligada às células. A determinação da actividade enzimática de tipo elastase foi feita por adição do substrato (N-succinil-trialanil-paratroanilido ou N-suc-ala3p-Na) a uma concentração de 125 mM em dimetilformamida a uma alíquota de extractos celulares de acordo com a técnica descrita em Bieth. J. 1978 (ver acima).

Para obter o meio de cultura, foram adicionados 56 μΐ a 890 μΐ de tampão Tris-HCl 0,1 M pH 7,8 e 10 μΐ as solução de substrato. 11 Γ u

Foram adicionados cinquenta ul de tripsinato ou de resíduos celulares a 940 μΐ de tampão Tris e a 10 μΐ de substrato.

As incubações são realizadas a 37°C durante 3 h para o meio de cultura, 1 h para o tripsinato e para o resíduo celular. A densidade óptica da cor amarela que se desenvolve por acção da enzima no substrato é lida a 410 · nanometros num espectrofotómetro.

Todas as experiências são realizadas em 4 a 6 culturas em paralelo, e os valores médios são comparados estatisticamente com o teste-t de Student. A actividade enzimática (AE) é expressa em nM de substrato hidrolisado por hora e por 10° células, calculada da seguinte forma: DO x v total AE= _ x 106

8,8 xv amostra x N x T na qual: DO é a densidade óptica, - N é o número de células no volume reaccional, - T é o tempo de incubação, e - 8,8 é o coeficiente de extinção molar correspondente à DO da solução molar de substrato numa cuba de 1 cm de espessura.

Nos diferentes exemplos que se seguem, foi estudado o efeito da galactose e dos seus derivados sobre a actividade elastásica medindo a modificação desta actividade por um péptido da elastina: a kapa-elastina (KE); esLe péptido é 12 | -(à. obtido por uma hidrólise de elastina do ligamento nuqual do boi, por hidrólise alcalina em etanol aquoso de acordo com a técnica descrita em Robert L. e Poullain N. (Études sur la structure de 1'élastine et le mode d'action de 1'elastase. I. Nouvelle méthode de préparation de dérivés solubles de l,elatine. Buli. Soc. Chim. Biol. 4_5:1317-1326 (1963)).

Este péptido tem com efeito a propriedade de ser um . agonista do receptor da elastina, isto é a sua presença conduz a um aumento da actividade de elastase dos fibroblastos em cultura. O quadro 1 abaixo mostra a cinética de acções da kapa-elastina a 1 mg/lâmina na actividade elastásica dos fibroblastos humanos na vigésima passagem em função do tempo de incubação. QUADRO 1

TEMPO DE INCUBAÇÃO COM A KE

Oh 2h 6h 24h 4 8h AE DMEM 0,04 0,04 0,03 0,21 · 0,99 AE TRYPS 0,267 0,2 0,207 0,190 0,123

Nota-se um forte aumento da actividade elastásica no meio de cultura (secreção) após um tempo de latência de 24 h. Ao mesmo tempo, a actividade da membrana no tripsinate baixa. Parece assim que o aumento da actividade no meio pode estar ligado à libertação da enzima da membrana no meio. 13 - EXEMPLO 1; Estudo da accão da lactose A concentração utilizada de lactose é de 10 mM ou de 3,6 mg/ml. O quadro 2 abaixo mostra o efeito da lactose a 10 mM na actividade de elastase dos fibroblastos humanos na 21a passagem e na sua distribuição entre a forma livre, da membrana (tripsinato) e ligação à célula (após efeito do Triton). A actividade está indicada em densidade óptica,· do substrato hidrolisado, multiplicada por 103/h para 106 células.

Foi calculada uma média de 4 medidas paralelas em culturas diferentes. A distribuição da actividade entre os três compartimentos é indicada como percentagem do total, da mesma forma que a inibição pela lactose é indicada em percentagem da actividade equivalente na ausência da lactose. QUADRO 2

Lactose

Controle

Actividade % do Actividade % do % total total

Actividade total 5888.1 100 262.2 100 55 Meio de Cultura 56,1+7,6 10 18,8+1,1 7 66 Tripsinato 359,5+41,7 61 91,9+31,1* 35 74 Celular 172,5+16,8 29 151,5+28,8 58 12 14

* ρ < 0,05 comparando ο controle com a lactose.

Este quadro mostra uma redução de 55% da actividade total, bem como uma alteração da distribuição da actividade enzimática nas três fracções. A enzima livre medida no meio de cultura diminui de 66% comparada com a cultura de controle e a enzima associada à membrana libertável pela tripsina baixa' de 74% ao passo que a actividade residual (celular) não apresenta diferença significativa com o controle.

Esta inibição selectiva das actividades ligadas à membrana e libertadas no meio modifica a distribuição da actividade total.

Nas culturas de controle, a maior parte da actividade total está associada à membrana celular (61%) e libertável pela tripsina; nas culturas tratadas com lactose, apenas 35% da actividade total são libertadas pela tripsina; 58% estão associados aos resíduos celulares.

Parece assim que a lactose tem por efeito diminuir a síntese da enzima e a libertação. - EXEMPLO 2: Estudo da acção da melibiose na síntese da elastase: A melibiose é adicionada ao meio da cultura à concentração de 10 mM, ou seja 3,4 mg/ml e isto nas mesmas condições de cultura que a lactose. 15 A melibiose provoca uma diminuição da actividade enzimática no meio de 60% em relação ao testemunho e uma diminuição no tripsinato de 80%, bem como uma pequena diminuição no resíduo celular. A actividade enzimática total é diminuída de 50%. - EXEMPLO 3: Acção da estaquiose: A estaquiose é um tetrassacárido que foi preparado de acordo com a técnica de M.L. Wolfrom e A. Thompson descrita em Methods of Carbohydrate Chemistry I págs. 368-369, Academic Press, 1962. A estaquiose é adicionada ao meio de cultura à concentração de 10 mM, ou seja 6,6 mg/ml.

Ela tem por efeito diminuir a actividade enzimática no tripsinato de 30% em relação ao testemunho, enquanto aumenta ligeiramente no meio.

Na presença de kapa-elastina à concentração de 1 mg/ml, diminui a actividade enzimática significativamente no meio (52%) em relação ao efeito da kapa-elastina sozinha.

No tripsinato, observa-se um aumento de 32% sempre em relação ao efeito da kapa-elastina sozinha. A actividade enzimática nos resíduos não varia de uma forma significativa. EXEMPLO 4: Acção da oleoil-lactosilamina: 16

X

[~ Lc \l * A oleoil-lactosilamina é um composto que obedece à fórmula e a sua síntese é nova. a) Síntese da oleoil-lactosilamina: A 1-amino lactose reage com o cloreto de oleoilo para dar a lactobionil-oleilamina com a fórmula seguinte:

Dissolvem-sè 3,3 g de lactossilamina em 30 ml de metanol a 80°C e adicionam-se 1,2 g de dietilamina. Adicionam-se a esta solução 4 g de cloreto de oleoilo, sob agitação, a uma temperatura que não ultrapassa 30°C. O pH da mistura é levado a 3 por adição de HC1. O ácido oleico é eliminado por extracção com heptano. Faz-se passar a fase metanólica-aquosa sucessivamente pelas colunas do permutador de iões ácidos e básicos e eliminam-se os solventes em vazio. 0 produto obtido contém ainda cerca de 20% de lactose. A oleoil-lactosilamina pode ser purificada numa coluna de octil-Sepharose.

Rf = em sílica (MeOH camada fina), 0,8 (clorofórmio-metanol 1:1, v/v). b) Efeito nas culturas senescentes de fibxoblastos: A oleoil-lactosilamina é adicionada à concentração de 0,5 mM. 17 \ A esta concentração, ele provoca um pequeno aumento da actividade no tripsinato e uma baixa nos resíduos celulares de cerca de 20%. EXEMPLO 5: Acção do dimelibionitil-diaminohexano: a) Preparação do dimelibionitil-diaminohexano:

Este produto foi sintetisado por uma técnica nova abaixo descrita.

Dissolvem-se 374 mg de melibiose (1,1 mM) e 116 mg (0,5 mM) de diaminohexano em 5 ml de tampão fosfato 0,2 M pH 8, e dicionam-se 270 mg de ciano-boro-hidreto de sódio (4,4 mM). Deixa-se a mistura 11 dias à temperatura ambiente, e aquece-se a 37°C durante 2 dias. Faz-se passar a solução num permutador de iões ácidos (H+) e lava-se a coluna com água. A substância é eluida de seguida por uma solução de 0,5 M de amoníaco, e lifolisa-se a solução. O rendimento é de 200 mg de di-melibionitil-diaminohexano.

Rf em sílica = (Butanol-ácido acético-água, h = 1:1) 0,2. A figura 1 representa o esquema reaccional que conduz aos derivados de dimelibionitil-diaminohexano. b) Acção do dimelibionitil-diaminohexano na actividade enzimática das culturas de fibroblastos humanos:

Observa-se um aumento da actividade enzimática no meio, bem como uma diminuição de 40% no tripsinato em relação ao testemunho. 18 ρ

Na presença de kapa-elastina, a actividade diminui em 71% no meio, sem aumento no tripsinato.

Por outro lado, a actividade recuperada nos resíduos celulares aumenta ligeiramente em relação à acção da kapa-elastina sozinha, mas não ultrapassa o valor do testemunho. C) Comparação dos diferentes efeitos: O quadro 3 seguinte resume o conjunto dos resultados obtidos com os diferentes derivados galactósidos na actividade elastásica dos fibroblastos humanos:

QUADRO IV: ACÇÃO NA ACTIVIDADE ELASTÁSICA SUBSTANCIA TOTAL DMEM TRIPSINATO RESÍDUOS LACTOSE Ψ27% Ψ30% Ψ70% Φ30% LACTOSE+KE tl3,5% Ϊ20% Φ50% Ψ30% MELIBIOSE 4-58% ΦβΟ% Ψ80% Φ30% MELIBIOSE+KE ^15% Φ27% 1^31% Φ9% ESTAQUIOSE Ψΐ7% Φΐ4% Ψ35% - ESTAQUIOSE+KE Ψΐ7% 4-56% Φ32% - CARRAGENINA Φ28% - 1"66% 1^30% CARRAGENINA+KE - Ψ28% φ29% - L.O.AMINA Φΐ5% Φ44% ^61% Ψΐ9% L.O.AMINA+KE Ψ27% - 1Μ1% Φ32% M.L.AMINA 1Ί3% Ψιο% Φΐ5% Φ50% M.L.AMINA+KE Φ40% Φιι% Φΐ7% ^50% AMB Ψ23% ^67% - Φ35% AMB+KE Ψ7% Φ60% Ψ20% Φ23% DM D AH - Ή7% Ψ53% - DMDAH+KE Φ23% ^70% Ψΐ8% Φ34% MDH Ϊ58% ΦβΟ% 1*37% Φ60% MDH+KE Φ54% ΦδΟ% 19 Φΐ4% Φ50%

I.OAMINA-LACTOBIONIL-OLEILAMINA MLAMINA-MIRISTOIL-LACTOSILAMINA AMB-ÁCIDO-MELIBIÓNICO DMDAH-DIMELIBIONITOIL-DIAMINOHEXANO MDH-DIMELIBITIL-DIAMINOHEXANO

Os derivados sublinhados são os que estão indicados nos exemplos precedentes. - EXEMPLO 6: Efeito no rato qlabro da lactose e da melibiose: São tratados e comparados dois grupos de ratos, um com a lactose ou a melibiose, o outro com um placebo.

Depois, os ratos são irradiados com uma dose de 3 MED (para dose mínima de eritematose). A dosagem da actividade elastásica é medida ao nível de biópsias retiradas nos ratos irradiados, pelo método descrito em Materiais e método.

Lisboa, 28 de Maio de 2001

O AGENTE OFICIAI. DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

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Claims

U

t REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de pelo menos um oligossacárido compreendendo de 2 a 5 resíduos osídicos ou de um seu derivado contendo um resíduo hidrofóbico, compreendendo o referido oligossacárido um resíduo de galactose em posição terminal não redutora, para a preparação de um medicamento útil para o tratamento ou a prevenção do envelhecimento do tecido conjuntivo.
2. Utilização de acordo com a reivindicação 1 de um oligossacárido compreendendo de 2 a 5 resíduos osídicos ou de um seu derivado contendo um resíduo hidrofóbico, compreendendo o referido oligossacárido um resíduo de galactose em posição terminal não redutora, para a preparação de um medicamento capaz de inibir o receptor da membrana da elastina envolvido na degradação da trama fibrosa do tecido conjuntivo.
3. Utilização de pelo menos um oligossacárido compreendendo de 2 a 5 resíduos osídicos, ou de um seu derivado contendo um resíduo hidrofóbico, desde que esteja presente um resíduo de galactose em posição terminal não redutora do oligossacárido, para o tratamento cosmético das manifestações do envelhecimento do tecido conjuntivo.
4. Utilização de um oligossacárido de acordo com uma das reivindicações 1 e 2, caracterizada por o oligossacárido ou os seus derivados estarem associados a um veículo compatível com uma administração tópica, para a preparação de um medicamento útil para a prevenção ou tratamento das manifestações do envelhecimento cutâneo. 1

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5. Utilização de um oligossacárido de reivindicação 3, caracterizada por o oligossacárido ou os seus derivados estarem associados a um veiculo compatível com uma administração tópica, para o tratamento cosmético das manifestações do envelhecimento cutâneo.
6. Utilização de um oligossacárido de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada por o oligossacárido apresentar a seguinte fórmula: galactose-n(ot ou β) - (Χ)η' na qual n representa a posição 1, 2, 3, 4 ou 6, X representa uma pentose ou uma hexose em ligação α ou β, n' é um número compreendido entre 1 e 5.
7. Utilização de uma oligossacárido de acordo com a reivindicação 6, caracterizada por o oligossacárido ser a melibiose.
8. Composição farmacêutica caracterizada por compreender a titulo de princípio activo um oligossacárido ou um derivado de oligossacárido no qual é enxertado um radical hidrofóbico, em mistura com um excipiente farmaceuticamente aceitável, obedecendo o oligossacárido à seguinte fórmula geral: galactose-n (o: ou β) - (Χ)η' (A) na qual n representa a posição 1, 2, 3, 4 ou 6, X representa uma pentose ou uma hexose em ligação α ou β, n' é um número compreendido entre 1 e 5, na condição de que se o oligossacárido não for substituído, ele ser diferente da lactose, 2 V f— t e por o derivado de oligossacárido ser escolhido de entre uma das seguintes classes: a) - um glicósido de acordo com uma das seguintes fórmulas, nas quais o oligossacárido é um oligósido de preferência a lactose, a melibiose ou a estaquiose: - (I) oligósido 1-0-R, em que R é um resíduo alquilo com 1 a 18 átomos de carbono, linear ou ramificado, na condição de que . se na fórmula geral (A) , X representar gal e n for 1, R ser diferente de etilo ou metilo, . se o oligossacárido for a lactose, R ser diferente de um resíduo alquilo com 1 a 6 átomos de carbono, . (II) oligósido 1-O-R-O-l-oligósido em que R = (CH2) n, estando n compreendido entre 2 e 10, b) - uma osilamina acilada de acordo com uma das seguintes fórmulas, nas quais o oligósido é de preferência a lactose, a melibiose ou a estaquiose: . (III) oligósido 1-NH-CO-R em que R é um resíduo alquilo com 2 a 18 átomos de carbono, contendo 0, 1 ou 2 ligações duplas, . (IV) oligósido 1-NH-CO-R-CO-NH-l-oligósido, em que R = (CH2) n, estando n compreendido entre 2 e 8, c) - uma ‘alquilamina acilada com "um ácido aldónico obtido por oxidação de um oligósido, . (V) oligósido-CO-NH-R, em que R possui o mesmo significado que na fórmula (III), . (VI) oligósido CO-NH-R-NH-CO-oligósido, em que R possui o mesmo significado que na fórmula (III) . d) - quer um produto de redução das bases de Schiff formados pelos oligósidos com as mono- ou diaminas alifáticas, e que obedecem a uma das seguintes fórmulas: 3 . (VII) Gal-(Hex)n-X-NH-R, . (VIII) Gal-(Hex)n-X-NH-R-NH-X-(Hex)n-Gal, nas quais: Hex é um resíduo de um hexano (ou pentose), n = 0, 1 ou 2, X = resíduo de um hexitol (ou pentitol), e R possui o mesmo significado que em (III).
9. Composição de acordo com a reivindicação 8, caracterizada por compreender a título de princípio activo pelo menos um oligossacárido " escolhido de entre a melibiose, a estaquiose ou as suas misturas.
10. Composição cosmética, caracterizada por cpmpreender, a título de agente activo sobre o envelhecimento do tecido conjuntivo, um composto escolhido de entre o grupo constituído por melibiose, e derivados de oligossacáridos compreendendo 2 a 5 resíduos osídicos e uma galactose em posição terminal não redutora, substituídos por um radical hidrofóbico, sendo os derivados escolhidos de entre: aj- um glicósido de acordo com uma das seguintes fórmulas, nas quais o oligossacárido é um oligósido de preferência a lactose, a melibiose ou a estaquiose: . (I) oligósido 1-0—R, em que R é um resíduo alquilo com 1 a 18 átomos de carbono, linear ou ramificado, . (II) oligósido 1-O-R-O-l-oligósido em que R = (CH2)n, estando n compreendido entre 2 e 10, b)- uma osilamina acilada de acordo com uma das seguintes fórmulas, nas quais o oligósido é de preferência a lactose, a melibiose ou a estaquiose: . (III) oligósido 1-NH-CO-R em que R é um resíduo alquilo com 2 a 18 átomos de carbono, contendo 0, 1 ou 2 ligações dupla3, 4 ι— L·, ^^ . (IV) oligósido 1-NH-CO-R-CO-NH-l-oligósido, em que R = (CH2) nr estando n compreendido entre 2 e 8, c) - uma alquilamina acilada com um ácido aldónico obtido por oxidação de um oligósido, . (V) oligósido-CO-NH-R, em que R possui o mesmo significado que na fórmula (III), (VI) CO-NH-R-NH-CO-oligósido, em que R possui o mesmo significado que na fórmula (III) . d) - ou um produto de redução das bases de Schiff formadas por oligósidos com as mono- ou diaminas alifáticas, e que obedecem a uma das seguintes fórmulas: . (VII) Gal- (Hex)n-X-NH-R, . (VIII) Gal-(Hex)n-X-NH-R-NH-X-(Hex)n-Gal, nas quais: Hex é um resíduo de uma hexose (ou pentose), n = 0, 1 ou 2, X = resíduo de um hexitol (ou pentitol), e R possui o. mesmo significado que em (III) .
11. Composição dermo-cosmética, caracterizada por compreender melibiose.
12. Processo de preparação de uma composição de acordo com uma das reivindicações '8 a 10, caracterizado poi' os derivados dos oligossacáridos serem obtidos por síntese química.
13. Processo de preparação de composição de acordo com uma das reivindicações 8 a 11, caracterizado por compreender as seguintes fases: a) extracção dos açúcares a partir de um meio biológico, nomeadamente o leite, o sangue ou a placenta; b) degradação enzimática dos açúcares extraídos ou hidrólise química; 5 c) separação do oligossacárido desejado.
14. Processo de preparação de uma composição de acordo com uma das reivindicações 8 a 11 destinada à prevenção ou ao tratamento dos efeitos de envelhecimento, caracterizado por compreender a incorporação num veiculo aceitável para uma administração local de um oligossacárido contendo de 2 a 5 resíduos . osídicos compreendendo uma galactose em posição terminal não redutora ou de um derivado desse oligossacárido, o qual - representa 0,5% a 6%, de preferência 1% a 4%, em peso do volume da referida composição. Lisboa, 28 de Maio de 2001 0 AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

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