JPH09501831A - 膵臓島細胞におけるインシュリン表現を刺激する新しいホメオボックス因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明によれば、膵臓島ホルモン遺伝子プロモータ内の組織特異性要素（ＴＳＥ）に結合して、インビボとインビトロの両方でホルモン遺伝子表現を調節するのに有用な新しいホメオボックス−タイプの膵臓島転写因子蛋白質が提供される。こうした転写因子蛋白質をコード表現する核酸配列とそれを用いたアッセイも開示されている。本発明による転写因子蛋白質は、例えば、そうした蛋白質および／または抗体などを用いた治療用組成物および方法において、それに対する抗体を生産するためのＲＮＡ転写の調節に用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 膵臓島細胞におけるインシュリン表現を刺激す る新しいホメオボックス因子 発明の分野 本発明は核酸と、それによってコード表現されるレセプター蛋白質に関するも のである。本発明による核酸は新しい組織固有膵臓ホルモン因子蛋白質をコード 表現する。本発明はまた、そうした転写因子をつくる方法と、インビボとインビ トロの両方で、膵臓島ホルモン遺伝子プロモータからのホルモン遺伝子表現を調 節するためにその転写因子蛋白質を用いる方法に関するものである。 発明の背景 内分泌性器官である膵臓は、主にペプチドホルモングルカゴン（Ａ−細胞）、 インシュリン（Ｂ−細胞）、ソマトスタチン（Ｄ−細胞）、および膵臓ポリペブ チド（Ｆ−細胞）を合成し、分泌する。小腸から発生学的手法で取り出したこれ らの膵臓島細胞は、同じペブチドホルモン遺伝子の表現を指令する腸を出発点と する調節経路を有している可能性がある。形成初期の内分泌性膵臓には、ソマト スタチン、インシュリン、およびグルカゴンを共表現する多機能（pluripotent ）細胞が存在している。これらの基幹細胞が成長すると、その内分泌性ホルモン レセプターが単一の遺伝子からの表現に拘束されてしまう傾向が観察され、この ことは、一般の転写因子が当初３つの遺伝子すべてを規制できるのに対して、個 々の核酸転写遺伝子蛋白質は、後で、個々の成熟島細胞タイプ においてグルカゴン組織固有ペプチド生産を指定しなければならないことを示唆 している。 グルカゴンおよびインシュリンの表現に比べて、ソマトスタチンの表現の開始 はやや遅い。マウスでは、ソマトスタチンの表現はインシュリン遺伝子を共表現 する細胞における発生学的発展の17日目に開始され、その後、成長したソマトス タチン生産Ｄ−細胞において抑制される。また、インシュリンおよびソマトスタ チン遺伝子の両方を共表現する細胞の別のサブセットでは、膵臓ポリペプチド遺 伝子は活性化され、その後、インシュリン遺伝子とソマトスタチン遺伝子の両方 が抑制される。この発展調節のパターンはインシュリンおよびソマトスタチン遺 伝子の表現はポジティブ制御メカニズムとネガティブ制御メカニズムの両方の影 響を受けていることを示している。 ラットの膵臓島細胞系Ｔu−６のソマトスタチン遺伝子の表現は、cＡＭＰ反応 要素（ＣＲＥ）と共同して高度の構成的活性をつくりだす組織固有プロモータ要 素（ＴＳＥ）を必要とすることが観察されている。ＴＳＥ状の配列はソマトスタ チンプロモータの500塩基対領域で３度繰り返されており、−300および−100に 位置しているプロモータ近接ＴＳＥが最も高い活性を示す。ソマトスタチンＴＳ Ｅは通常ホメオボックス−タイプの蛋白質によって識別される正統ＴＡＡＴモチ ーフを含んでいる。ホメオボックス因子ＩＳＬ−１は、例えば、ＴＳＥに結合し て、ラットインシュリノーマ細胞系ＲＩ Ｎ ５ＡＨ内のソマトスタチン表現を調節することができる。しかしながら、Ｉ ＳＬ−１はソマトスタチン生産ＴＵ−６細胞の抽出物内のＴＳＥ結合活性のほと んど無視し得る程度の部分だけを含んでいるように思われる。膵臓島細胞に加え て、ソマトスタチン遺伝子はニューロン、甲状腺のＣ−細胞、それに消化腺のＤ −細胞でも表現される。 膵臓における個々の遺伝子のキー調節因子として、多数のホメオボックス−タ イプ因子が提案されているが、それらの構造、細胞分布およびそれらが豊富に含 まれている部位に関してはまだ解明されていない問題が多数存在している。 膵臓ホルモンの重要な機能はグルコースの血管流体レベルを制御することであ る。グルカゴンはランゲルハンス島のＡ−細胞によって合成され、低血液グルコ ースレベルに反応して放出される。グルカゴンは主として肝臓細胞に影響を与え 、アデニレートシクラーゼおよびcＡＭＰカスケードを誘発し、グリコーゲンの 劣化と血中グルコースの増大をもたらす。代謝にグルコースがどの程度使えるか どうかは、体循環内のインシュリンおよびグルカゴン濃度の調節によって、（食 事後の）過剰時期と（急激な活動後の）欠乏時期の両方に調節される。 食事後に、血中グルコースが100mlあたり80〜90mgという正常レベル以上に上 昇すると、インシュリンが膵臓のランゲンルハンス島のＢ−細胞内の分泌小胞か らの血液に放出される。島細胞自体はグルコースまたはアミノ酸レベルの上昇に 反応して血液中にインシュリンを放出し、血液がそれを身体中に分配する。細胞 表面レセプターに結合することによって、インシュリンは血液からのグルコース を取り除かせ、それをグリコーゲンとして蓄積させる。グルコースが100mlあた り80mg以下に低下すると、その島のＡ−細胞がグルカゴンの分泌を開始する。グ ルカゴンは肝臓細胞のグルカゴンレセプターと結合し、アデニレートシスラーゼ およびcＡＭＰカスケードを活性化させる（エピネフィリンの反応に類似した反 応）。その結果。グリコーゲンの劣化と循環中へのグルコースの放出をもたらす 。 糖尿病は体内のインシュリン作用の不十分さによって起こされ、インシュリン レベルの調整に関与する種々の欠陥から発生する場合がある。例えば、インシュ リンレセプターの機能あるいは調節における異常は、糖尿病を持つ一部の人々に おいて観察されている。この病気は、構造的に異常なインシュリンの生産、また はプロインシュリンのインシュリンへの転換の不良によって、正常なインシュリ ン合成が行われないことによっても発生する。幼児期、あるいは早い時期の糖尿 病は膵臓島のＢ−細胞による不十分な、あるいは異常なインシュリン合成によっ て引き起こされる。こうした状況のほとんどでは、インシュリンの注射によって 問題を克服することができる。したがって、特定のタイプの糖尿病を持った患者 を措置するためには、糖尿病患者の体内でのインシュリンレベルを増大させる方 法の開発が望ましい。 発明の簡単な説明 本発明によれば、新しいホメオボックス−タイプの転写因子蛋白質が提供され る。本発明による蛋白質は膵臓島細胞から抽出され、インビボとインビトロの両 方でのホルモン遺伝子の調節に有益な役割を果たす。加えて、これらの蛋白質、 あるいはそれらの断片は、抗転写因子抗体をつくりだす免疫源としても有益であ る。 上述の膵臓島転写因子蛋白質をコード表現する分離された核酸分子、およびそ うした分子を含んだ組換え細胞も提供される。ここで述べた分子は当業者には公 知の種々の表現システムに組み込むことができる。加えて、本発明による核酸分 子は任意のサンプル内での膵臓島転写因子遺伝子またはmＲＮＡトランスタリプ トが存在しているかどうか、そして、存在している場合の量に関するアッセイの プローブとしても有用である。上に述べた核酸分子、およびそれらの断片は、膵 臓島転写因予をコード表現する遺伝子の増強のためのＰＣＲ反応におけるプライ マーおよび／またはテンプレートとしても有用である。 本発明による膵臓島ホルモン転写因子蛋白質と免疫反応性のある抗体も提供さ れる。これらの抗体は任意のサンプル、例えば組織サンプルやウェスターンブロ ットなどに存在する膵臓島転写因子蛋白質のレベルを判定するための診断アッセ イにおいて有用である。これらの抗体は、膵臓島転写因子蛋白質を生成するため にも用いることができる。 内分泌性ホルモン遺伝子を制御するプロモータからの転写を形成するための方 法も提供される。また、哺乳動物におけるインシュリンのレベルを調節し、グル コースが存在している場合の哺乳動物における糖尿病を措置する方法も提供して くれる。 発明の詳細な説明 本発明によれば、分離された哺乳動物のホメオボックス−タイプの転写因子蛋 白質が提供される。“ホメオボックス−タイプの転写因子蛋白質”あるいは“転 写因子蛋白質”という表現は膵臓島ホルモン遺伝子の天然のプロモータ領域に結 合して、mＲＮＡ転写を調節することができる蛋白質を意味している。 本明細書および特許請求の範囲における、ＤＮＡ，ＲＮＡ、ポリペプチド、ま たは蛋白質の形容詞として“分離された”または“精製された”という用語が使 用されている場合、そのように限定されたＤＮＡ，ＲＮＡ、ポリペプチド、また は蛋白質が人の手によって生産され、したがって、インビボ細胞環境におけるそ の天然の状態からは分離されていることを意味している、こうした人為的操作の 結果として、本発明による組換えＤＮＡ，ＲＮＡ、ポリペプチド、および蛋白質 は、天然のままのＤＮＡ，ＲＮＡ、ポリペプチド、および蛋白質では果たすこと ができない役割を果たすことができる。 ここで用いられている“哺乳動物の”という用語は、例えば、ヒト、ラット、 マウス、ウサギ、サル、ヒヒ、ニワトリ、 ブタ、ヒツジ類、イヌ類、ネコ類など、そこから本発明による転写因子蛋白質が 抽出される種々の種を意味している。 ここで用いられている“ホメオボックス”という用語は任意のプロモータ領域 内の特定のヌクレオチド配列に結合する本発明による転写因子内部の約60〜65の アミノ酸によって構成される領域を意味している。ホメオボックス領域に関する 一般的な検討については、Gehring，W.，ＴＩＢＳ，17：277−280（August/1992 ）参照。本発明によるホメオボックス領域は、好ましくは、それそれＴＳＥ−Ｉ およびＴＳＥ−IIに対応したＳＥＱ ＩＤ NO：３およびNO：４に規定される“ 組織固有要素”のいずれか、あるいは両方に結合する。典型的なホメオボックス 領域は、ＳＥＱ ＩＤ NO：２のアミノ酸146〜205と同じアミノ酸配列を有して いる。 ホメオボックス領域内に、“認識ヘリックス”と呼ばれるＤＮＡ−結合特性に 関与するα−ヘリックスが存在している。この認識ヘリックスは、通常、本発明 による蛋白質ホメオボックス領域の約42〜52アミノ酸で発生する（例えばＳＥＱ ＩＤ NO：２のアミノ酸187〜197）。好ましい実施例においては、本発明によ る転写因子蛋白質はホメオボックス領域の位置44、例えば、ＳＥＱ ＩＤ NO： ２のアミノ酸位置189にヒスチジンアミノ酸残基を含んでいる。 “プロモータに結合する”という表現、あるいはそれが文法的に変化した表現 は、ＤＮＡ−結合転写因子（例えば、クロレセプター、ラムダレセプターなど） の核酸の特定の領域 との、ＲＮＡ転写を調節するための結合を意味している〔例えば、Freifelder， D.，Molecular Biology，188−194（第２版、1987）参照〕。本発明による転写 因子は少なくとも、哺乳動物のインシュリンまたはソマトスタチン遺伝子から選 択されたプロモータ領域に結合する。典型的な組織固有要素としては、ラットイ ンシュリン“Ｐ−ボックス”（ＳＥＱ ＩＤ NO：８）（例えば、Ohlssonおよ びEdlund，1986，Cell，45：35−44、本明細書に引例）に述べられているラット インシュリン遺伝子の−82から−64のヌクレオチド位置）；ラットインシュリン −１“ＦＬＡＴ”または“Ｅ２”応答要素（ＳＥＱ ＩＤ NO：９）（例えば、 上述のOhlssonおよびEdlundに述べられているラットインシュリンの−222から− 208ヌクレオチド位置）；ＴＳＥ−Ｉ（ＳＥＱ ＩＤ NO：３）；ＴＳＥ−II（ ＳＥＱ ＩＤ NO：４）などがある。特に好ましい実施例においては、本発明に よる転写因子は上に述べた応答要素のそれぞれを結合させる能力を有している。 “膵臓島ホルモン遺伝子”という表現は内分泌性膵臓島細胞にとって内発性の ホルモンをコード表現する遺伝子を示している。“膵臓島”という用語は内分泌 性膵臓島細胞に対して内発性の、ホルモンコード表現遺伝子を示している。“膵 臓島”とは、哺乳動物の内分泌性膵臓（島細胞）から取り出した細胞のグループ を意味している。こうした細胞はペプチドホルモングルアカゴン（膵臓Ａ−細胞 ）、インシュリン（膵臓Ｂ−細胞）、ソマトスタチン（膵臓Ｄ−細胞）、およ び膵臓ポリペプチド（膵臓Ｆ−細胞）を合成し、分泌する。 本発明による転写因子は、膵臓島細胞におけるホルモン遺伝子表現を制御する 複数のプロモータに結合する能力（つまり、２つ以上のホルモン遺伝子プロモー タに結合する能力）を有していることを特徴とする。好ましくは、本発明による 転写因子は少なくともインシュリンおよびソマトスタチン遺伝子からのＲＮＡ転 写を調節する。本発明による転写因子はトランス活性化、またはトランス抑制Ｒ ＮＡ転写のいずれかで転写を調節する。 特殊な実施例においては、本発明による転写因子はさらに膵臓ホルモン遺伝子 をトランス活性化する能力、例えば、膵臓および小腸内部でのインシュリン、グ ルカゴン、およびソマトスタチンの表現を活性化する能力を有していることを特 徴とする。“トランス活性化”という表現、またはそれが文法的に変化した表現 は、それがホルモン遺伝子表現に関する場合、膵臓島ホルモン遺伝子のプロモー タ領域への結合とmＲＮＡ転写開始における共同作業における本発明による転写 因子の作用を示している。 別の実施例で、本発明による転写因子は、さらに、膵臓ホルモン遺伝子表現を トランス抑制する能力、例えば、膵臓および小腸内部でのインシュリン、グルカ ゴン、およびソマトスタチンの表現を抑制する能力を有していることを特徴とし ている。“トランス抑制”という表現、またはその文法的に変化した表現は、そ れがホルモン遺伝子表現に関する場合、 膵臓島ホルモン遺伝子のプロモータ領域への結合と、mＲＮＡ転写の開始（つま り、プロモータからのＲＮＡ転写活性の除去）の開始の抑止における本発明によ る転写因子、またはそのポリペブチド断片の作用によるものである。 別の側面で、本発明による転写因子は、特に小腸および膵臓における、インシ ュリンおよびソマトスタチン転写の組織固有レギュレータである。自然に発生す る本発明による蛋白質の表現はそれがインシュリンおよびソマトスタチンプロモ ータ上での機能的に重要なcis要素での主要な結合活性を構成している膵臓およ び小腸内部での内分泌細胞タイプに高度に限定されている。本発明による蛋白質 は、同じcis要素を通じてインビトロとインビボの両方で転写を刺激（つまり、 トランス活性化）することが認められている。 顕著な点は、本発明による転写因子はインシュリンおよびソマトスタチン生産 膵臓島細胞からの核酸抽出物における圧倒的なＴＳＥ結合活性の原因となってお り、この蛋白質がペプチドホルモン表現の調節と成長中の腸組織内の内分泌性細 胞の指定において重要な役割を果たしているという仮説を裏づけるものである。 ＣＲＥＢはＴu−６細胞におけるＣＲＥ結合活性の主要な役割を果たしている ので、インビボで観察される共作用性はＣＲＥＢと本発明による膵臓転写因子と の間の相互作用から生じているかもしれないと考えられている。ホルモン性刺激 がない場合、ＣＲＥＢ活性はcＡＭＰ調節ＰＫ−Ａ部位から 発生するものではなく、Ｑ２と呼ばれるグルタミンを豊富に含んだ領域から発生 しているように思われる。したがって、ＣＲＥＢは本発明による細胞固有転写因 子と相乗作用してインシュリンおよびソマトスタチン遺伝子などの膵臓ホルモン 遺伝子の高レベル表現を提供する役割を果たすホスホリル化依存または構成的活 性化領域を交互に採用することによっていくつかの機能を副次的に果たしている のかもしれない。 本発明のさらに別の実施例において、本発明による転写因子は、内分泌性膵臓 のＢ−細胞とＤ−細胞では均一に表現されるのに外分泌性細胞では表現されない ことを特徴としている。 ここで用いられている“均一に表現される”という表現は本発明による転写因 子をコード表現する自然発生的なＲＮＡがインシュリンおよびソマトスタチンを つくりだす膵臓島細胞タイプのそれぞれに検出することができることを意味して いる。好ましくは、表現のレベルはこれらの膵臓島細胞タイプのそれぞれにおい て基本的には均等である。 別の側面で、本発明による転写因子蛋白質は、さらに、グルコース濃度の変動 に反応を示すことを特徴としている。ここで用いられている“グルコース濃度の 変動に反応を示す”という表現は、本発明による転写因子の表現が存在している グルコース濃度に対応して変動することを意味している。例えば、本発明による 蛋白質をコード表現するmＲＮＡのレベルは、膵臓島細胞が20mM程度のグルコー スにおいて培養され た場合、膵臓島細胞が２mM程度のグルコース内部で培養する場合よりかなり高い 。 現在の段階で好ましい本発明による膵臓島ホルモン転写因子蛋白質は、ＳＥＱ ＩＤ NO：２に示されている蛋白質配列と基本的には同じアミノ酸配列、およ び、アクセス番号69385に基づいてＡＴＣＣに寄託されたプラスミドpＩＴＦ−１ および生物学的な活性を有し、その修正された形態の転写因子コード表現部分に よってコード表現されるアミノ酸配列と基本的には同じアミノ酸配列を有してい る。当業者なら、結果としてもたらされるレセプター種の生物学的活性を変えず に、上に述べた配列の多数の残基を他の、化学的、立体構造的および／または電 子的に同様の残基と取り替えることができることが分かるであろう。 大腸菌ＸＬ１−ブルー細胞（ストラタジーン）内で形質変換されたプラスミド ｐＩＴＦ−１は、本条約によって布告された規制を目的とする微生物の寄託の国 際識別に関するブタペスト条約の条件に基づいて、12301 Parklawn Drive，Rock ville，Maryland，U．S．A．20852のAmerican Type Culture Collection（ＡＴ ＣＣ）に、1993年８月12日に寄託された。寄託された素材のサンプルは工業所有 権事務局あるいは条約および規制の諸条件、あるいは米国および他のすべての国 、あるいは本出願、または本出願の優先性を主張する出願が申請されている、あ るいは該出願に基づくいずれかの特許が認められている国際的の特許法やその他 の規制に基づ いてそれらを受けとる資格を持った個人に対して使用が認められているし、将来 においても使用が認められる。特に、本出願に基づいた、あるいは本願に対する 優先性を主張する、あるいは参照によってそれを組み込んだすべての出願に基づ く米国特許が発行された場合、寄託された素材の利用可能性に関するすべての制 限は撤廃され、その制限解除は撤回されない。 ここで使われている“基本的には同じアミノ酸配列”という表現は、基準とな るアミノ酸配列に対して少なくとも70％程度の同一性を有しており、そして、基 準アミノ酸配列によって定義される蛋白質と同様の機能的、および生物学的特性 を保持しているアミノ酸配列を示している。好ましくは、“基本的に同じアミノ 酸配列”を有している蛋白質は、基準アミノ酸配列に対して少なくとも80％、よ り好ましくは90％のアミノ酸同一性を有している。そして、95％以上のアミノ酸 同一性を有するものが最も好ましい。 “生物学的な活性を有する”または“機能的”という用語は、本明細書中で本 発明による転写因子蛋白質、またはそのポリペプチド断片の形容詞として用いら れた場合、ここで述べられているホメオボックス−タイプの転写因子のいずれか と類似した機能的特性を示すポリペプチドを意味している。例えば、ひとつの実 施例において、生物学的な活性を有する蛋白質はＴＳＥ−Ｉ，ＴＳＥ−II，“Ｐ −ＢＯＸ”，“ＦＬＡＴ”のいずれかと結合してそれらからのＲＮＡの転写を調 節するものである。こうした活性は、ゲルシフトおよび実施例５に述べるＤＮＡ se Ｉ保護アッセイなど、当業者に公知のいずれの方法によってでも評価するこ とができる。 本発明による転写因子蛋白質は、実施例１〜３に述べられている方法、以下に 述べる組換え表現システムなど、当業者に公知の種々の方法で分離することがで きる。 本発明の別の実施例によれば、本発明による転写因子蛋白質をコード表現する 分離された核酸が提供される。ここに述ベられている核酸分子は、こうした核酸 を当業者に公知の種々の蛋白質表現システムに組み込んだ場合、本発明による転 写因子蛋白質をつくりだすのに有益である。加えて、こうした核酸分子またはそ の断片を簡単に検出可能な置換基とラベルすることができ、任意のサンプルにお ける膵臓ホルモン転写因子遺伝子またはmＲＮＡ転写の存在および／またはその 量の評価のためのハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。 ここに述べられる核酸分子、およびその断片は、ここで述べられている本発明に よる転写因子蛋白質をコード表現する遺伝子を増幅するためのＰＣＲ反応におい てプライマーおよび／またはテンプレートとしても有益である。 内分泌性転写因子をコード表現する典型的な核酸は以下のものから選択するこ とができる。 (a) ＳＥＱ ＩＤ NO：２に示されるアミノ酸配列をコード表現するＤＮＡ、 または、アクセス番号69385に基づ いてＡＴＣＣに寄託された、プラスミドpＩＴＦ−１の転写因子コード表現部分 、 (b) やや厳格な条件下で(ａ)のＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡにおいて、 該ＤＮＡが生物学的な活性を有する内分泌性転写因子をコード表現することを特 徴とするＤＮＡ、 (c) (ａ)か(ｂ)のＤＮＡで変性したもの、該ＤＮＡが生物学的な活性を有する 内分泌性ホルモン転写因子をコード表現するＤＮＡ。 ここで使われている“核酸”という用語は、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキ シリボ核酸（ＤＮＡ）を意味している。ＤＮＡは相補ＤＮＡ（cＤＮＡ）であっ ても、内分泌性転写因子を表現する遺伝子など、ゲノム性ＤＮＡであっても、い ずれでもよい。 ハイブリダイゼーションとは、染色体ＤＮＡにおいて自然に発生する結合と類 似した水素結合を通じて核酸の相補ストランド（つまり、センス：アンチセンス ストランド、またはプローブ：標的−ＤＮＡ）が相互に結合することを意味して いる。任意のプローブを標的−ＤＮＡとハイブリダイズさせるのに用いられる厳 しさのレベルは当業者なら容易に変更できるであろう。 “厳格なハイブリダイゼーション”という用語は、ここでは、ポリ核酸ハイブ リッドが安定的に存在できる状態を意味している。当業者にはよく知られている ように、ハイブリッ ドの選択性はそのハイブリッドの溶解温度（Ｔ_m）に関連している。一般的に、 ハイブリッドの安定性はナトリウムイオン濃度および温度の関数である。通常、 ハイブリダイゼーション反応は厳格さがより低い条件下で行われ、その後厳格さ を変えて、より高い厳格さで洗浄する。ハイブリダイゼーションの厳格さとは、 その洗浄条件に関連している。 ここで用いられている“やや厳格なハイブリダイゼーション”とは、標的−Ｄ ＮＡが、その標的−ＤＮＡに対して60％程度、好ましくは75％程度、そしてより 好ましくは85％程度、そして最も好ましくは90％以上の相同性を有する相補核酸 に結合できるようにする状態を意味している。好ましくは、やや厳格な条件とは 50％ホルムアミド、５Ｘデンハート溶液、５Ｘ ＳＳＰＥ，0.2％ＳＤＳ内で42 ℃の温度下でハイブリダイゼーションを行い、その後、65℃の温度下で0.2Ｘ ＳＳＰＥ，0.2％ＳＤＳで洗浄する場合と同等の条件である。 “高厳格なハイブリダイゼーション”とは、その核酸配列が65℃で0.018Ｍ ＮａＣｌで安定にハイブリッドする許容条件である（即ち、もしハイブリッドが 65℃で0.018Ｍ ＮａＣｌで不安定であれば、ここでいう、高厳格な条件下で安 定ではない）。高厳格な条件は例えば、42℃で50％ホルムアミド、５Ｘデンハー ト溶液、５Ｘ ＳＳＰＥ，0.2％ＳＤＳ内でハイブリダイゼーションし、後65℃ で0.1Ｘ ＳＳＰＥおよび0.1％ＳＤＳ洗浄する条件である。 “低厳格度ハイブリダイゼーション”という表現は、10％ ホルムアミド、５Ｘデンハート溶液、６Ｘ ＳＳＰＥ，0.2％ＳＤＳ内で42℃の 温度下でハイブリダイゼーションを行い、その後、１Ｘ ＳＳＰＥ，0.2％ＳＤ Ｓ内で50℃の温度下で洗浄を行う場合と同様の条件を意味する。デンハート溶液 およびＳＳＰＥ（Sambrookら、Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989）は、他の適切なハイブリダイゼーシ ョン緩衝液と同様、当業者にはよく知られている。 ここで用いられている“変性したもの”とは、少なくともひとつのヌクレオチ ドが基準核酸、例えばＳＥＱ ＩＤ NO：１と違っているが、基準アミノ酸と同 じアミノ酸をコード表現するコドンを意味している。例えば、“ＵＣＵ”，“Ｕ ＣＣ”，“ＵＣＡ”および“ＵＣＧ”などの３文字で示されるコドンは、これら ４つのコドンがすべてアミノ酸セリンをコード表現するので、変性物である。 好ましい実施例においては、ここで開示されている内分泌性ホルモン低蛋白質 をコード表現するｃＤＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ NO：１のヌクレオチド331−1182 、あるいはアクセス番号69385に基づいてＡＴＣＣに寄託されたプラスミドpＩＴ Ｆ−１の転写因子コード表現部分と基本的には同じヌクレオチド配列を有してい る。内分泌性ホルモン転写因子蛋白質をコード表現する現在の段階で最も好まし いcＤＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ NO：１のヌクレオチド331−1182、またはアクセス 番号69385に基づいてＡＴＣＣに寄託されたプラスミドpＩ ＴＦ−１の転写因子コード表現部分と同じヌクレオチド配列を有している。 ここで用いられている“基本的に同じヌクレオチド配列”という用語は、基準 ポリヌクレオチドに対して十分な相同性を有しており、やや厳格なハイブリダイ ゼーション条件に基づいてハイブリダイズするＤＮＡを意味している。ひとつの 実施例において、基準となるヌクレオチド配列と同じヌクレオチド配列は、ＳＥ Ｑ ＩＤ NO：２に指定されているのと基本的に同じアミノ酸配列をコード表現 する。別の実施例で、基準ヌクレオチド配列と“基本的に同じヌクレオチド配列 ”を有しているＤＮＡは、基準となるヌクレオチド配列に対して少なくとも60％ の相同性を有している。基準ヌクレオチド配列に対して少なくとも70％、好まし くは90％、そして、より好ましくは95％以上の相同性を有するＤＮＡが好ましい 。 本発明による核酸は、例えば、ＳＥＱ ＩＤ NO：１などの種々の領域からの オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行う実施例１および２に述 べられている方法など、先行技術において公知の種々の方法によってつくること ができる。 本発明のさらに別の実施例によれば、任意にラベルされた転写因子コード表現 cＤＮＡあるいはその断片を用いて新しい哺乳動物の膵臓島ホルモン転写因子を コード表現するさらに別の核酸配列のライブラリー（例えば、cＤＮＡ、ゲノム 性など）をプローブすることができる。実施例１および２に 述べられているように、哺乳動物の膵臓島cＤＮＡライブラリー、好ましくはヒ トの膵臓島cＤＮＡライブラリーの構造は先行技術において公知である。こうし たcＤＮＡライブラリーのスクリーニングは、当初、約42℃以下の温度、約50％ 以下のホルムアミド濃度、そして、低塩分濃度を内容とする厳格さの低い条件で 行われる。 現在の段階で好ましいプローブに基づいたスクリーニング条件は約37℃の温度 、約20％のホルムアミド濃度、そして５Ｘ標準くえん酸食塩水（ＳＳＣ：20Ｘ ＳＳＣは３Ｍ塩化ナトリウム、0.3Ｍくえん酸ナトリウム、pH7.0を含んでいる） を内容としている。こうした条件は、完全な相同性がなくても、プローブ配列と かなりの程度の類似性を有する配列を確認できるようにしてくれる。“かなりの 類似性”という表現は少なくとも50％の相同性を有している配列を意味している 。好ましくは、プローブと少なくとも70％の相同性を有する配列が可能となり、 プローブとより低い相同性を有する配列を区別できるようにするハイブリダイゼ ーション条件が指定される。その結果、ＳＥＱ ＩＤ NO：１のヌクレオチド33 1−1182と基本的には同じヌクレオチド配列が得られる。 ここで用いられている核酸“プローブ”とは単一鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、ある いはその断片で、ＳＥＱ ＩＤ NO：１のいずれか、好ましくはヌクレオチド33 1−1182に示されているいずれか14またはそれ以上と同じ（あるいはそれと相補 的な）少なくとも14、好ましくは20、より好ましくは50の継 続的な塩基を含んだヌクレオチドの配列を有している。それからプローブを構成 する好ましい領域はＳＥＱ ＩＤ NO：１の５′および／または３′コーディン グ領域を含んでいる。さらに、本発明の転写因子蛋白質のcＤＮＡコード表現領 域全体をプローブとして用いることもできる。プローブは、以下に述べるような 先行技術において公知の方法でラベルすることができ、種々の診断キットで用い ることができる。 ここで述べられている、種々の文法的形態における“ラベル”または“表示手 段”とは、検出可能な信号をつくりだすのに直接または間接的に関与する単一の 原子または分子を示している。いずれのラベルまたは表示手段も本発明の核酸プ ローブ、表現された蛋白質、ポリペプチド断片、あるいは抗体分子に結合させる ことができる。これらの原子または分子は単独でも、または別の試薬との組み合 わせでも用いることができる。こうしたラベルは臨床診断化学において良く知ら れている。 このラベル手段は変性しないで抗体または抗原と化学的に結合して有益な免疫 蛍光トレーサであるフルオロクローム（染料）を形成する蛍光ラベリング試薬な どであってよい。適切な蛍光ラベリング試薬は、フルオレセインイソシアネート （ＦＩＣ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、５−ジメチルア ミン−１−ナフタレンスルホニルクロライド（ＤＡＮＳＣ）、テトラメチルロー ダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、リスアミン、ローダミン8200スル ホニルクロライド（ＲＢ−200−ＳＣ）などである。免疫蛍光分析法の説明は、D eLuca，“Immunofluorescence Analysis”，in Antibody As a Tool，Marchalon isら、eds.，John Wiley & Sons，Ltd.，pp.189−23（1982）に開示されている 。この資料は本明細書に引例として組み込まれいている。 ひとつの実施例では、その指示グループはホースラディッシュペロキシダーゼ （ＨＲＰ）、グルコースオキシダーゼなどの酵素である。主要指示グループが酵 素である場合、目に見える信号をつくりだすために別の試薬が必要となる。ＨＲ Ｐのためのそうした追加試薬としては過酸化水素、ジアミノベンジジンなどの酸 化染料前駆体などである。グルコースオキシダーゼを用いて有用な追加試薬は２ ，２′−アジノ−ジ−（３−エチル−ベンズチアゾリン−Ｇ−スルホン酸）（Ａ ＢＴＳ）である。 別の実施例では、放射性元素がラベリング用試薬として用いられる。典型的な 放射ラベル用試薬はガンマ線放射を発生する放射性元素である。¹²⁴Ｉ，¹²⁵Ｉ，¹²⁶ Ｉ，¹³¹Ｉおよび⁵¹Ｃrなどガンマ線を放出する元素は、ひとつのタイプの放 射性元素指示グループを代表するものである。特に好ましいのは¹²⁵Ｉである。 別のグループの有用なラベルする手段は陽電子を放出する¹¹Ｃ，¹⁸Ｆ，¹⁵Ｏおよ び¹³Ｎなどの元素である。このように放出された陽電子は動物体内に存在する電 子と衝突するとガンマ線を発生する。³²Ｐ，¹¹¹インジウムまたは³Ｈなどのデー タ線放出元素も有用である。 核酸、抗体、ポリペプチド、および蛋白質のラベリングなど、基質へのラベル の結合は先行技術において良く知られている。例えば、本発明による抗体は培養 媒体で提供される放射ラベルされたアミノ酸の代謝による取り込みによってラベ ルすることができる。例えば、Galfreら、Meth，Enzymol.，73：３−46（1981） 参照。活性化された機能基による蛋白質接合、あるいは結合の従来の手段は特に 利用性が高い。例えば、Aurameasら、Scand．J．Immunol.，Vol．８，Suppl．７ ：７−23（1978），Rodwellら、Biotech.，３：889−894（1984）、および米国 特許第4,493,795号参照。 本発明のさらに別の実施例においては、適切な宿主細胞内に上に述べた核酸配 列を表現させることによって本発明による転写因子を遺伝子組換えでつくるため の方法が提供される。ここで述べられている膵臓転写因子をつくりだすのに適し た組換えＤＮＡ表現システムは先行技術において良く知られている。例えば、上 に述べたヌクレオチド配列をさらに操作するためにベクターに組み込むことがで きる。ここに用いられているベクター（またはプラスミド）という用語は、その 表現または複製を目的としてヘテロロガスＤＮＡを細胞に導入するために用いら れる個々の要素を意味している。 適切な表現ベクターには、そうしたＤＮＡの表現を規制することができるプロ モータ領域など、調節配列に操作的に結合されるＤＮＡを表現することができる ベクターなどがある。したがって、表現ベクターとは、プラスミド、ファージ、 遺 伝子組換えウィルス、あるいはその他の、適切な宿主細胞に導入すると挿入され たＤＮＡの表現をもたらすベクターなど、遺伝子組換えＤＮＡまたはＲＮＡ構成 を示している。適切な表現ベクターは当業者にはよく知られており、真核細胞そ して／または原核細胞内で複製することができるもの、そしてエピゾーム性のま までいるもの、そして宿主細胞のゲノムに組み込まれるなどを含む。 ここで用いられているプロモータ領域という用語はそれが操作によって結合さ れるＤＮＡの転写を制御するＤＮＡのセグメントを意味している。プロモータ領 域としては、ポリメラーゼ認識、結合、および転写を開始させるのに十分な特定 の配列を含んでいる。さらに、プロモータ領域には、ＲＮＡポリメラーゼの認識 、結合、および転写の開始を調節する配列を含んでいる。これらの配列はcisア クティングであってもよいし、トランスアクティング因子に反応性のあるもので もよい。プロモータは、調節に応じて、構成的である場合もあり、また、規制的 であってもよい。本発明の実施での使用が考えられる典型的なプロモータには、 ＳＶ40アーリープロモータ、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモータ、マウ ス乳腺腫瘍ウィルス（ＭＭＴＶ）ステロイド誘発性プロモータ、マックロニーマ ウスロイケニアウイルス（ＭＭＬＶ）プロモータなどを含んでいる。 ここで用いられている“操作的に結合される”という用語は、ＤＮＡとプロモ ータ、エンハンサ、転写または翻訳停止 サイト、および他の信号配列など、調節およびエフェクタヌクレオチド配列との 機能的な関係を示している。例えば、ＤＮＡのプロモータへの操作的結合とは、 ＤＮＡとプロモータとの間の、そのＤＮＡの転写が、特にそのＤＮＡを識別し、 そのＤＮＡに結合し、そしてそれを転写するＲＮＡポリメラーゼによって、その プロモータから開始されるような物理的、機能的関係を意味している。表現、そ して／またはインビトロでの転写を最適化するためには、余分な、不適切な別の 翻訳の開始（スタート）コドン、あるいは転写または翻訳のレベルのいずれかで 表現に干渉したり、あるいはそれを低下させてしまう他の配列を除去するために 、それらクローンの５′未翻訳部分を取り除いたり、加えたり、あるいは変更し たりすることが必要な場合もある。また、コンセンサスリボゾーム結合部位〔例 えば、Kozak（1991）J．Biol．Chem．266：19867−19870参照〕を５′のスター トコドンに直接挿入することもできるし、表現を増幅してもよい。こうした修正 が望ましいこと（あるいはその必要性）は経験的に判断できる。 ここで用いられている表現という用語は、ポリ核酸がmＲＮＡに転写されて、 ペプチド、ポリペプチド、または蛋白質に翻訳されるプロセスを意味している。 ポリ核酸がゲノム性ＤＮＡから取り出される場合、その表現には、適切な真核宿 主細胞または生物が選ばれた場合、スプライシングまたはmＲＮＡが含まれる。 原核形質変換ベクターは先行技術においてよく知られており、ｐブルースクリ プト、およびファージ／ラムダＺＡＰベクター（Stratagene，La Jolla，CA）な どを含んでいる。他の適切なベクターおよびプロモータは、1989年１月17日の米 国特許第4,798,885号に詳しく開示されており、その開示全体は本明細書に引例 として組み込まれる。さらに、lac ｚ遺伝子（オペレータ、プロモータ、転写ス タート部位、シャイン−デリガーノ配列、および翻訳開始信号を含む）の５′領 域、トリプトファン遺伝子（trpオペレータ、プロモータ、リボゾーム結合部位 および翻訳イニシエータ）からの調節領域、そして、tap−lacまたは一般的にＴ acプロモータと呼ばれる２つのプロモータを含んでいる融合遺伝子などの配列を 含む表現カセットを用いて、それらの配列にそれらカセットが選ばれたクローニ ングベクターに挿入される前に、合成ＤＮＡを挿入しても差し支えない。 大腸菌細胞を形質変換させるための他の適切なベクターには、ｐＥＴ表現ベク ター（Novagen，米国特許第4,952,496号参照）、例えば、Ｔ７プロモータ、Ｔ７ ターミネータ、誘発性大腸菌lacオペレータ、そしてlacレセプター遺伝子および Ｔ７ターミネータを含むpＥＴ12ａ−ｃ、およびＴ７ターミネータ、および大腸 菌ompＴ分泌信号などを含む。別の適切なベクターは、lppプロモータ、lacＵＶ ５プロモータオペレータ、ompＡ分泌信号、およびlacレセプター遺伝子を含むp ＩＮ−III opmＡ２（Duffaudら、Meth．in Enzymology，153： 492−507，1987）である。好ましい表現ベクターは実施例３に述べるＰＧＥＸ− ２Ｔベクター（Pharmacia）である。 典型的な真核形質変換ベクターには、クローンされた仔ウシパピローマウィル スゲノム、マウスレトロウィルスのクローンされたゲノム、および〔Mulliganお よびBerg，NatureVol.277：108−114（1979）〕に述べられているpＳＶ−２gpt システム、オカヤマ−ベルグクローニングシステム〔Mol．Cell．Biol．Vol.２ ：161−170（1982）〕、およびGenetics Institute〔Science Vol．228：810−8 15（1985）〕に述べられている表現クローニングベクターなどが含まれており、 形質変換された真核細胞系において関心の対象となる蛋白質を少なくとも一定程 度確実に表現してくれる。 哺乳動物の細胞のトランスフェクションのために本発明による転写因子コード 表現ＤＮＡに結合することができる調節要素を含んでいる特に好ましいベースベ クターはpcＤＮＡ１などのサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモータに基づく ベクター（Invitrogen，San Diego，CA），pＭＡＭＮeo(Clontech，Palo Alto， CA)、pＭＳＧ（Pharmacia，Piscataway，NJ）などのＭＭＴＶプロモータに基づ くベクター、およびpＳＶβ（Clontech，Palo Alto，CA）などのＳＶ40プロモー タに基づくベクターである。 本発明の別の実施例によれば、本発明の核酸分子（つまり、ＤＮＡまたはmＲ ＮＡ）を含む“組換え細胞”が提供される。適切な宿主細胞、好ましくはバクテ リア細胞、より好ましく は大腸菌細胞を形質変換する方法、およびヘテロロガス蛋白質をコード表現する 遺伝子を含む該細胞を培養するために適用可能な方法は、先行技術においてよく 知られている。例えば、Sambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual （２ed），Cold Spring Harbor，Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，USA（1989）参照。 形質変換を行うための典型的な方法は、例えば、プラスミド、ウィルス性また はバグテリア性ファージベクターを用いた形質変換、トランスフェクション、エ レクトロポレーション、リポフェクションなどである。ヘテロロガスＤＮＡは、 そのエクストラクロモゾーマルメンテナンスを可能にする配列を任意に含み、該 ヘテロロガスＤＮＡは（宿主内で安定して保持されるようにさせるための別の手 段として）宿主のゲノムに組入させることができる。 本発明の実施において使用が考えられる宿主生物としては、その内部において ヘテロロガス蛋白質の遺伝子組換えによる生産が行われている生物を含んでいる 。こうした宿主生物の例としては、バクテリア（例えば、大腸菌）、イースト菌 （サッカロミセスセレビシアエ、カンジダトロピカリス、ハンセヌラポリモルフ ィア、およびＰ．パストリスなど；米国特許第4,882,279号、第4,837,148号、第 4,929,555号および第4,855,231号参照）、哺乳動物細胞（例えば、ＨＥＫ293， ＣＨＯおよびＬtk細胞）、昆虫細胞などである。現在の段階で好ましい宿主生物 はバクテリアである。最も好ましいバク テリアは大腸菌である。 本発明の別の実施例によれば、本発明による膵臓転写因子に対して発生する抗 体が提供される。こうした抗体は、本発明による蛋白質、その断片を抗体生産の ための抗原として用いることによって、当業者によく知られている標準的な手法 を用いてつくることができる（例えば、実施例６参照）。本発明による抗体は、 通常、本発明による転写因子蛋白質、またはその断片を含むインカラムで哺乳動 物を免疫化し、それによって、免疫化試薬のための免疫特性を有する抗体分子の 生産を誘発することによってつくりだされる。 例えば、本発明による蛋白質の合成ペブチド断片に対してウサギ内に発生され る抗体は、合成ペプチドおよび等モルベースの対応する本発明による転写因子蛋 白質を識別し、好ましくは、天然の蛋白質の活性を抑制する能力を有している。 本発明に対する抗体は、例えば、４℃で２時間の反応によるビスジアゾ化ベンジ ジン（ＢＤＢ）リンケージによるＢＳＡにそれを抗原として結合させるために、 Ｃ−端末にＴyrが加えられた適切な合成断片によって、雄および雌の生後３か月 のニュージーランド白ウサギを免疫化することによって得ることができる。低分 子量物質を除去するためにこの反応混合体を透析され、得られた物質を液体窒素 内で凍結され、−20℃で保存される。動物はBenoitら、P．N．A．S．USA，79，9 17−921（1982）の手順によって、１mg当量のペプチド抗原で免疫化される。４ 週間の間隔を置いて、これらの動物を 200μgの抗原を注射することによってブーストし、その後、10日から14日間飼育 する。３回目のブースト後、クロラミン−Ｔ法によってつくられた放射沃素化抗 原ペブチドを結合する能力について抗血清を調べ、ＣＭＣ−イオン交換カラムク ロマトグラフィーによって精製される。次に、抗体分子を哺乳動物から集めて、 例えば、ＩgＧフラクションを得るためにＤＥＡＥセファデックスを用いるなど の、公知の方法において望ましい程度にまで分離される。 この抗体の特異性をさらに強化するために、これらの抗体を固体相添加免疫化 ポリペプチドを用いた免疫親和性クロマトグラフィーによって精製することがで きる。抗体は抗体分子と免疫反応して固体相免疫複合体を形成するのに十分な時 間、固体相転写因子ペプチドと接触される。結合した抗体は、次に、標準的な手 法で複合体から分離される。ＳＥＱ ＩＤ NO：２のアミノ酸196−214と免疫反 応性がある典型的な抗膵臓ホルモン抗体については、実施例６に述べる。 このようにしてつくられた抗体は、なかんずく、組織または血管流体などの哺 乳動物、好ましくはヒトの体サンプルに存在している膵臓島転写因子蛋白質のレ ベルを検出するための診断方法およびシステムにおいて用いることができる。こ うした抗体は、また、本発明による転写因子蛋白質の免疫親和性または親和性ク ロマトグラフィーによる精製のために用いることができる。 本発明のさらに別の実施例においては、膵臓ホルモン遺伝 子を制御する転写を調節する方法が提供され、この方法は： 該プロモータを本発明による転写因子蛋白質と接触させるステップで構成され ている。 ここで用いられいる“接触させる”という用語は、（例えば、適切な緩衝液、 または生理学的条件など）適切な環境条件の下で、本発明による転写因子、ある いはＤＮＡに結合するその断片を、膵臓ホルモン遺伝子プロモータからの組織特 異性プロモータ要素、好ましくはインシュリン遺伝子プロモータと結合させるの に十分な時間だけ提供することを意味している。こうした接触は細胞を含まないインビトロ システムか、生物学的に活性を有するインシュリン蛋白質をコード表 現する遺伝子を含んだ細胞の内部で、インビトロまたはインビボで培養された細 胞のいずれかで行われる。 本発明のさらに別の実施例においては、哺乳動物におけるインシュリンのレベ ルを調整する方法が提供され、該方法は： グルコースの存在下で、生物学的に活性を有するインシュリン蛋白質をコード 表現する遺伝子を本発明による転写因子蛋白質、またはそのＤＮＡ結合断片と接 触させるステップを含んでいる。 “グルコースの存在下で”という表現は、本発明による転写因子蛋白質のグル コースに応答した表現が発生するのに十分な濃度でグルコースが存在しているこ とを意味している。例えば、グルコースレベルが80〜90mg/ml血管流体の正常範 囲より慢性的に高い患者においては、本発明による転写因子 蛋白質のグルコース応答反応が起きる。 本治療法を実施するためには、膵臓転写因子蛋白質をコード表現する本発明に よる核酸を膵臓島Ｂ−細胞などの生物学的に活性のあるインシュリンを表現する ことができる適切な細胞に導入する。本発明によるホメオボックス−タイプの転 写因子はインシュリン遺伝子の表現をトランスアクティベートすることは分かっ ているので、本発明による転写因子蛋白質の表現を発生させると、インシュリン 遺伝子を含んだ任意の細胞のインシュリンの表現を発生させると考えられる。加 えて、本発明による転写因子蛋白質の表現レベルは種々の濃度のグルコースと反 応することが分かっているので、本発明による方法は、インシュリンのグルコー ス応答表現のための手段を提供してくれる。 本発明による核酸はインビボでそうした細胞に導入することもできるし、ある いは、インビトロでそれら細胞をそうしたことを必要とする患者の体内に移植す る前にインビトロで培養された細胞に導入することもできる。本発明による核酸 は、インビトロで上に述べた組換え細胞をつくるためのいずれかの方法を用いて 適切な内分泌性細胞に導入することができる。 膵臓細胞を移植するための方法は先行技術においてよく知られている。例えば 、ヒトへの挿入に適した成長可能な細胞、好ましくは膵臓島細胞を含んでいる移 植可能な合成組織マトリックス構造について開示している米国特許第4,997,443 号 および第4,902,295号参照。移植される細胞を宿主の免疫応答から保護するため の細胞カプセル化移植法は先行技術においてよく知られている（例えば、米国特 許第4,353,888号および第4,696,286号参照）。したがって、インシュリンをプロ セスできるどのヒト細胞、好ましくは内分泌性細胞を、ここで述べられている治 療法での使用の対象として考えることができる。 例えば、本発明による転写因子蛋白質のグルコース応答表現を確実に行わせ、 それによってインシュリンのグルコース応答表現を起こさせるようにするために 、哺乳動物のプライマリー発生時島細胞、好ましくはヒトのものを、本発明によ る転写因子をコード表現する核酸および／または生物学的に活性を有するインシ ュリン蛋白質をコード表現するひとつ、または複数の適切なベクターと共に分離 または形質導入してもよい。さらに、上皮細胞を島細胞内に区別させる方法につ いて述べた米国特許第4,935,000号および生物学的な活性を有するインシュリン をつくりだすことができるランゲルハンスの島をつくりだす方法について述べて いる米国特許第4,868,121号参照。 ひとつの実施例において、本発明による転写因子蛋白質をコード表現する核酸 を哺乳動物の細胞、好ましくは膵臓島細胞に、適切な先行技術においてよく知ら れているウィルス性ベクターを用いて、インビボまたはインビトロのいずれかで 伝達することができる。特にインビボでの“遺伝子治療”方 法のために設計された適切なレトロウィルス性ベクターは、例えば、ＷＩＰＯの 刊行物ＷＯ 9205266およびＷＯ 9214829に述べられており、これらの資料は核酸 をインビボでヒトの細胞に効率的に導入する方法について述べている。さらに、 本発明による転写因子のインビボでの表現を制限あるいは低下させることが望ま しい場合、本発明による核酸のアンチセンスストランドを導入することが考えら れる。 ここで望まれている“生物学的に活性を有するインシュリン蛋白質をコード表 現する遺伝子”とは、イン−ビボで表現された場合に、その蛋白質が生理学的に 正常な方法でグルコースの濃度を調整できるように、インシュリン蛋白質をコー ド表現する遺伝子を指している。 本発明のさらに別の実施例においては、哺乳動物の糖尿病を措置するための方 法が提供され、該方法は： グルコースの存在下で、生物学的に活性を有するインシュリン蛋白質をコード 表現する遺伝子を含んだ細胞内で、本発明の核酸ベクターを表現するステップを 含んでいる。 以下の非限定的実施例を参照して、本発明についてさらに詳しく説明する。こ こで触れられているすべての米国特許および刊行物はその全体が引例として組み 込まれる。 特に他の記述がないかぎり、本発明は、例えば、Maniatisら、Molecular Clon ing：A Laboratory Manual ，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spri ng Harbor，New York，USA（1982）；Sambrookら、Molecular Cloning：A Labor atory Manual（２ed），Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor ，New York，USA（1989）；Davisら、Basic Methods in Molecular Biology，El sevier Science Publishing，Inc.，New York，USA（1986）；またはMethodsin Enzymology：Guide to Molecular Cloning Technique ：Vol.152，S．L．Berger およびA．R．Kimmerl Eds.，Academc Press Inc.，San Diego，USA（1987）など の資料に述べられている。 Ｔu６細胞系は膵臓腫瘍から得られたものである（Madsenら、1986，J．Cell B iol .，103：2025−2034参照）。本発明によるcＤＮＡは、先行技術においてよく 知られている方法を用いていずれかの膵臓島細胞源から得ることができる。すべ ての場合に、共トランスフェクトされたＲＳＶ−ルシフェラーゼレセプタープラ スミドの活性に正常化した後、ＣＡＴ活性が測定された。ＣＭＶ−ＩＴＦ−１表 現プラスミドは標準クローニング手順を用いて、ペアレントプラスミドを含んだ ＣＭＶプロモータ（例えば、Stratagene，La Joll，CAから商業的に入手できるp ＯＧ44など）にＩＴＦ−１ ｃＤＮＡを挿入することによって構成された。“− ＴＳＥ”および“４Ｘ ＴＳＥ”ソマトスタチンプラスミドがLeonardら、（199 2）ＰＮＡＳ，89：6247−6251に述べられている手順で作成された。 実施例１ Ｔu６ cＤＮＡライブラリー構成 Ｔu６ cＤＮＡは、タイムセーバーcＤＮＡ合成キット （Pharmacia）を用いて５μgのＴu６細胞誘導ポリ(Ａ)指定ＲＮＡから合成され た。Ｅco ＲＩオーバーハングを有するＮot Ｉ/Ｅco ＲＩアダプタがcＤＮＡ端 に結紮され、組み込まれなかったリンカーはＣＬ−４Ｂセファロースカラム（Ph armacia）によるクロマトグラフィーによってcＤＮＡから分離した。1.5〜４kb のcＤＮＡがアガロースゲル電気泳動によってサイズ指定され、λgt−11ファー ジアームに結紮された。Gigapack II Gold（Stratagene）でパッケージングし た後、このライブラリーは４×10⁶pfuを含んでおり、これは青／白色選択で判定 して再結紮されたファージアームの２％以下であった。 実施例２ ホメオボックス−タイプ転写因子蛋白質をコード表現するcＤＮＡの分離 ホメオボックス配列はアミノ酸ＬＥＫＥＦ（センス方向、aa.ホメオドメイン の17−21）およびＩＷＦＱＮ（アンチセンス方向、aa.48−52）をコード表現す る変性オリゴヌクレオチドプライマーによってＰＣＲ増幅を行うことによってフ ァージＴu−６ cＤＮＡライブラリーから分離された。用いられた合成プライマ ーは５′−GGCGGATCCCTXRARARRGART（Ａ/Ｔ）Ｃ−３′（ＳＥＱ ＩＤ NO：５ ）および５′GGCGGATCCC（Ｇ/Ｔ）RTTYTGRAACCA−３′（ＳＥＱ ＩＤ NO：６ ）で、ここでＲ＝Ａ/ＧおよびＹ＝Ｃ/Ｔである。ＰＣＲは各プライマーおよび１ ng Ｔu６ cＤＮＡを20pmol用いて行われた。 アニーリング温度が45℃で３サイクル行われ、その後55℃の温度で35サイクル行 われた。予想された129bpのＰＣＲ生成物をアガロースゲル電気泳動で溶かし、 ゲルから取り出して、ブルースクリプトＳＫ IIにサブクローンし、そして、二 重鎖ＤＮＡ配列決定によって分析された。予想されたサイズの６つの増幅された ＤＮＡ断片が得られ、ブルースクリプトＳＫ IIにサブクローンされた。分析の 対象となった６つの組換えクローンのうち、５つは同じホメオドメイン断片に対 応していた。 全長ＩＴＦ−１ cＤＮＡクローンを得るために、ＩＴＦ−１ ＰＣＲ断片を ランダムプライマーラベリングで高度の特異活性にラベルした。Ｔｕ−６ λgt1 1ライブラリーから10⁶程度のプラークがＩＴＦ−１断面プローブへのハイブリダ イゼーションによってスクリーンされた。30のポジティブプラークが精製され、 そのうちのいくつかはブルースクリプトＳＫ IIにサブクローンされ、両方の鎖 の上で配列された。 283個のアミノ酸によって構成される新しい蛋白質をコード表現する全長1.6kbの cＤＮＡクローンが得られ、これはインシュリン転写因子−１またはＩＴＦ−１ （ＳＥＱ ＩＤ NO：１）と命名された。 実施例３ 大腸菌内でのホメオボックス−タイプ転写因子蛋白質の表現 上の実施例２に述べられた1.6kb ＩＴＦ−１のcＤＮＡ配列をフレームで、バ クテリア性表現ベクターpＧＥＸ−２Ｔ （Pharmacia）に挿入した。その結果得られた表現プラスミドを“pＩＴＦ−１” にラベルして、大腸菌鎖ＢＬ21に導入した。ＬＢ培養液（Sambrookら、supra参 照）＋30μg/mlのアンピシリンを0.6のＯＤ Ａ₆₀₀に加えたもの１リットル内で 培養された。0.25ｇ ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピアノシ ド）で３時間刺激を与えた後、遠心分離にかけ、プロテアーゼ抑制因子（１mM ＰＭＳＦ、トラシロル、および100Ｕ/mlレウペプチン）を含んでいるＨＤＢ緩衝 液（140mM ＮａＣｌ，５mM ＫＣｌ，0.7mM Ｎａ₂ＨＰＯ₄，25mMヘペスpH7.4）に 再懸濁させた。氷上で30分間リソザイム（１mg/ml）によって措置することによ って細胞を溶解した。その後、抽出物が１％トリトンＸ−100、５mM ＥＤＴＡ， １mM ＤＴＴ，１Ｍ ＮａＣｌの最終濃度を持つように、細胞溶解液を加えた。次 に細胞溶解物を40kgで30分間遠心分離にかけ、上澄液を１％トリトン、プロテア ーゼ抑制因子、およびＤＴＴを含んだＨＤＢ緩衝液内で１mMで２時間平衡透析し た。その溶解物をさらに500μlグルタチオン−アガロースビーズと４℃の温度下 で20分間混合した。このビーズを７回洗浄し、分離したところ、このビーズを７ ユニットのトロンビンと室温で１時間培養することによって、組換えＩＴＦ−１ 蛋白質が溶出した。 実施例４ ＲＮＡse保護およびインサイ（in situ）ハイブリダイゼーション分析 本発明による転写因子蛋白質の生産がインシュリンおよびソマトスタチン生産 に関連する内分泌性細胞タイプにだけ限定されているかどうかを判定するために 、ＲＮＡse保護アッセイを種々の細胞系および組織から得たＲＮＡに関して行っ た。ＲＮＡは、11種類のラットの細胞株と、11匹の成熟したラットの視床株、大 脳、中脳、脳幹、小腸、皮質、膵臓、心臓、腎臓、肝臓、および脾臓から得た組 織を用いて、標準酸／グアジニジウム／フェノール方法（上述Sambrook参照）で 作成された。ＲＮＡse保護分析を行うために、ＳＥＱ ＩＤ NO：１のアミノ酸 60〜165に対応するＩＴＦ−１ cＤＮＡの318bp断片を含むHind III直線化プラ スミドリボプローブが用いられた。このリボプローブを総量30μgのＲＮＡにア ニールして、上のLeanordらに述べられているように処理した。Ｔu−６およびＲ ＩＮ５ ＡＨ膵臓島細胞系の両方でＩＴＦ−１ＲＮＡが観察されたが、ＰＣ12， ＪＥＧ−３，ＣＯＳ，ＨＴ22，Helaその他を含む非内分泌性細胞株では検出でき る程のＩＴＦ−１ ＲＮＡは観察されなかった。検査された11種類のラット組織 のうち、膵臓および小腸だけがＩＴＦ−１ ＲＮＡを含んでおり、対応する本発 明による転写因子蛋白質が小腸および膵臓の内分泌性細胞だけに高度に限定され ていることを示している。 ＩＴＦ−１ ＲＮＡ生産の部位はインサイ（in situ）ハイブリダイゼーショ ンでも確認された。インサイハイブリダイゼーションを行うために、膵臓および 小腸を低温保持装置 上で切開して、スライド上に載せ、ＩＴＦ−１アンチセンスリボプローブとハイ ブリダイズさせた（例えば、Leeら、（1990）Mol．and Cellular Neuroscience ，１：168−177参照）。³⁵ＳでラベルしたＩＴＦ−１アンチセンスリボプローブ を用いて、ＩＴＦ−１ ＲＮＡが島に観察されたが、周辺の外分泌性腺房細胞で は観察されなかった。島内部では、ハイブリダイゼーション信号はすべての細胞 に均等に分散されていた。島細胞のわずか10〜20％だけがソマトスタチンをつく りだすので、β−細胞を含んでいるインシュリンなどの他の細胞タイプもこの因 子をつくりだすものと考えられる。ＩＴＦ−１ ＲＮＡは小腸のほとんどの上皮 細胞に存在しているが、これらのうちの少数のみがソマトスタチンをつくりだす ことが分かっている。したがって、両方の組織で、ソマトスタチンをつくりだす 細胞はＩＴＦ−１を表現する細胞のうちの小部分だけであるように思われる。 実施例５ ゲル流動性変動およびＤＮＡse Ｉ保護分析 ラットのインシュリンプロモータ内部では、“Ｐ−Ｂox”（ＳＥＱ ＩＤ NO ：８）および“ＦＬＡＴ”または“Ｅ２”（ＳＥＱ ＩＤ NO：９）と呼ばれる ２つの組織特異性要素は、膵臓島細胞内のインシュリン表現のプロモートに関与 している。ソマトスタチンプロモータの内部では、ＴＳＥ Ｉ（ＳＥＱ ＩＤ N O：３）およびＴＳＥ II（ＳＥＱ ＩＤ NO：４）と呼ばれる２つの相互に関連 した組織特異性要素 が膵臓島Ｔu−６細胞内でのソマトスタチン表現をプロモートする。ＩＴＦ−１ がこれら機能的に定義された要素に結合できるかどうかを判定するために、組換 えＩＴＦ−１蛋白質を原核ＧＳＴ−ＩＴＦ−１表現プラスミド（実施例３に説明 ）を用いて形質変換した大腸菌から作成した。グルタチオン−アガロースビーズ 上で精製した後、ＧＳＴ−ＩＴＦ−１融合蛋白質をスロンビンで切断してアミノ 酸から伸びた161アミノ酸ＩＴＦ−１ポリペプチド断片の検索を可能にした。Ｓ ＥＱ ＩＤ NO：12の124−283。 ソマトスタチンプロモータによるＤＮＡse Ｉ保護に関する研究それぞれ−10 4から−86まで（５′−TTGCGAGGCTAATGGTGCG−３、ＳＥＱ ＩＤ NO：３）およ び−303から−281（５′−GATCTCAGTAATAATCATGCAG−３′，ＳＥＱ ＩＤ NO： ４）に広がっている二重鎖スマトスタチンＴＳＥ ＩおよびＴＳＥ IIオリゴ類を 用いて行われた（ヤマモトら、1990，Cell，60：611−617参照）。ミュータント ＴＳＥ Ｉは上述のLeonardらに述べられている方法にしたがって作成され、ＴＳ Ｅ IIオリゴは５′−GATCTCAGGCCGGCCGCATGCAC−３′（ＳＥＱ ＩＤ NO：７） の配列を含んでいた。ＴＳＥ ＩおよびＴＳＥ II部位の両方にわたって個別のフ ットプリントが観察された。両方の部位での保護は粗Ｔu−６核抽出物を用いて 得られたフットプリンティングパターンと一致していた。ＴＳＥ II部位は更に 低い濃度のＩＴＦ−１で完全に保護されたが、このことはこの部位がＴＳＥ Ｉ 部位より高い親和 性でこの蛋白質と結合するのかもしれないことを示している。 同様のＤＮＡse保護アッセイがラットインシュリンＩ組織−特異性プロモータ 断片“Ｐ−Ｂox”（ＳＥＱ ＩＤ NO：８）および“ＦＬＡＴ”（ＳＥＱ ＩＤ NO：９）（上述のOhlssonおよびEdlund参照）に対応する二重鎖オリゴヌクレ オチドを用いて行われた。ソマトスタチンプロモータ断片のために得られた結果 と同様、組換えＩＴＦ−１蛋白質を用いて行われたアッセイで、インシュリンプ ロモータ“Ｐ−Box”および“ＦＬＡＴ”部位の両方に広がる個別フットプリン トが観察された。 ラベルされたＴＳＥ ＩおよびＴＳＥ IIオリゴを用いたゲル流動性変動アッセ イ（例えば、上述のYamamotoら参照）が、ＩＴＦ−１のＤＮＡ結合特性を評価す るために行われた。その結果はいずれの部位に対する組換えＩＴＦ−１蛋白質の 結合もラベルされていない野生タイプのＴＳＥ ＩまたはＴＳＥ IIコンペティタ ＤＮＡによって簡単に取って代わられることを示している。しかしながら、ＴＡ ＡＴ認識モチーフに置換基を有したＴＳＥ ＩおよびＴＳＥ IIのミュータントバ ージョン（Version）はＩＴＦ−１結合に対して同様の能力を示すことはできな かった。フットプリンティングに関する研究の場合と同様、ＩＴＦ−１蛋白質の ＴＳＥ II蛋白質に対する親和性はＴＳＥ Ｉに対する親和性より高いように思わ れる。 同様のゲル流動性変動アッセイがラットインシュリンＩ組 織特異性プロモータ断片“Ｐ−Ｂox”および“ＦＬＡＴ”（上述の、Ohlssonお よびEdlund参照）に対応する二重鎖オリゴヌクレオチド類を用いて行われた。そ の結果は、いずれの部位に対する組換えＩＴＦ−１蛋白質の結合もラベルされな い野生タイプのＰ−ＢoxまたはＦＬＡＴコンペティタＤＮＡによって簡単に取っ て代わられることを示している。しかしながら、Ｐ−ＢoxおよびＦＬＡＴのミュ ータントバージョンがＩＴＦ−１結合に関して同様の力を発揮することはできな かった。 ソマトスタチン表現細胞における他のＤＮＡ−結合活性に対してＩＴＦ−１ ＤＮＡ−結合が相対的にどれ程強力かについてのアッセイがＴu−６核抽出物を 用いた変動実験で行われた。高親和性ＴＳＥ IIプローブを用いて、Ｃ１，Ｃ２ ，Ｃ３と命名された３つの複合体がそれぞれの流動性に基づいて観察された。複 合体Ｃ１とＣ３は抽出物の量が少なくても現れたのに、複合体Ｃ２は抽出物の濃 度を高くした場合にだけ現れた。Ｃ１とＣ２は、両方とも野生タイプに取って代 わられたのに対して、ミュータントＴＳＥＩおよびＴＳＥ IIオリゴによっては 取って代わられなかったので、高い親和性複合体を示しているように思われる。 Ｃ１とＣ２のいずれも、Helaなどの非内分泌性細胞抽出物では観察されなかった ので、これらの複合体も組織特異性であるように思われる。 実施例６ 抗体およびウェスターンブロット分析 （実施例５に述べられた）Ｃ１，Ｃ２およびＣ３複合体がＩＴＦ−１に関連し た因子を持っているかどうかを判定するために、ＳＥＱ ＩＤ NO：２のアミノ 酸196−214から延びている合成ＩＴＦ−１ペプチドに対して、ウサギのモノクロ ーナル抗血清（抗ＩＴＦ−１）が形成された。この抗ＩＴＦ−１抗血清は、ウェ スターンブロット分析で組換えＩＴＦ−１蛋白質を特異的に識別する。ＩＴＦ− １抗血清によるウェスターンブロット分析は細胞質および核Ｔu−６抽出物（例 えば、上述Leonardら参照）で行われた。 Ｔu−６抽出物において、ＩＴＦ−１抗血清は核および細胞質抽出物の49kD蛋 白質を特異的に識別した。この帯域の分子量は予想されたＩＴＦ−１の質量（31 kD）とはまったく異なっており、この49kD免疫反応性生成物がＩＴＦ−１ ＲＮ Ａによってプログラムされるレチクロサイト細胞溶解物からのインビトロ翻訳生 成物とコミグレートする。 核および細胞質フラクションの両方でのＩＴＦ−１蛋白質を示しているウェス ターンブロットデータから予想されるように、複合体Ｃ１は両方の抽出物（細胞 質と核）で観察され、この蛋白質が抽出物調製中に漏出する可能性を示唆してい る。Ｔu−６核抽出物によって予備培養した場合、ＩＴＦ−１抗血清はＣ１およ びＣ２複合体を完全に破壊したが、Ｃ３に対してはまったく影響を示さなかった 。免疫前血清はこれら複合体のいずれに対してもまったく影響を示さなかったの で、我々が得た結果は、ＩＴＦ−１蛋白質がＴu−６細胞内のＴ ＳＥ結合活性の大部分を担っていることを示唆している。 さらに、複合体Ｃ１は全長組換えＩＴＦ−１蛋白質−ＴＳＥ複合体と同じ相対 流動性を示しているおり、これはＣ１がＩＴＦ−１を含んでいることを示してい る。Ｔu−６核抽出物の濃度を増大させるとＣ２が出現するという事実は、この 複合体がＩＴＦ−１の２量体形態に基づくものかもしれない可能性を示唆してい る。実際に、ＴＳＥ II部位はこの部位上の２つのホメオドメインモノマー間の 協同的結合を促進する可能性のある２ＴＡＡＴモチーフを含んでいる。 ゲル流動性変動アッセイのテストでは、ＩＴＦ抗血清は組換えＩＴＦ−１のＴ ＳＥプローブへの結合を特異的に抑制したが、ＩＳＬ−１蛋白質の結合は抑制し なかった。 実施例７ インビトロ転写 インシュリンおよびソマトスタチンプロモータからの転写に対する組換えＩＴ Ｆ−１の影響は、ＰＣ12抽出物の代わりにHeLa核抽出物が用いられたことを除け ば、前に述べたのと同様の方法で（例えば、Gonzalesら、（1991）Mol. & Cell ．Biol. ，11（３）：1306−1312参照）行われた。ＩＴＦ−１およびＣＲＥＢ蛋 白質は個別と組み合わせの両方で評価が行われた。Hela核抽出物は検出可能なレ ベルのＩＴＦ−１蛋白質を含んでおらず、内発性の蛋白質の干渉を受けずにこの 因子のテストを行うことが可能であった。 簡単に言うと、10mM ＨＥＰＥＳ pH7.9，60mM ＫＣｌ， 0.2mM ＥＤＴＡ，５mM ＭｇＣｌ₂，５％グリセロール、２％ポリビニルアルコー ル、２mM ＤＴＴ，100ng ｐＵＣα１（コントロールＤＮＡテンプレート）、20 0ngソマトスタチンプロモータテンプレート、83ｇ核酸抽出物、および組換え転 写アクチベータ“−ＴＳＥ”および“４Ｘ ＴＳＥ”を含んだ最終体積50ｌ内で 反応が行われた。“−ＴＳＥ”プラスミドはＣＲＥ部位は含んでいるが、ＴＳＥ 部位は含んでいない最小ソマトスタチンプロモータ構成物を含んでいる。“４Ｘ ＴＳＥ”プラスミドはＣＲＥ部位の上流に配置された４つのＴＳＥ Ｉ部位を 含むソマトスタチンプロモータベクターである。中間コントロールとして、ヒト α−グロブリンテンプレートが用いられた。 ４つのリボヌクレオチドすべてを加えてそれぞれ400Ｍの最終濃度にするまえ に、ＤＮＡテンプレート、核抽出物、およびアクチベータ蛋白質が30℃の温度下 で、30分間、集合させられた。さらに30分間培養した後、フェノール／クロロホ ルム／イソアミルアルコール［50：49：１］による抽出を行って反応を終わらせ 、プライマー延長分析によって分析された（上述のGonzalesら参照）。α−グロ ブリンプロモータからの延長生成物は64ヌクレオチドであり、ソマトスタチンプ ロモータからの生成物は56および57ヌクレオチドの二重構造である。 精製ＩＴＦ−１蛋白質を追加した後にソマトスタチン転写が著しく誘発される ことが、ソマトスタチンＣＲＥの上流に 挿入された４ＴＳＥ Ｉ部位を用いて観察された。対照的に、ＩＴＦ−１は、テ ストされた蛋白質のどのようなレベルでも、ＴＳＥ部位（−ＴＳＥ）を欠いたα −グロブリン制御プライマーやソマトスタチンテンプレートには刺激性の影響を 及ぼさなかった。対照的に、精製されたＣＲＥＢ蛋白質は−ＴＳＥと４Ｘ ＴＳ Ｅ Ｉテンプレートの両方から転写を開始させた。 ＩＴＦ−１がインビボでのソマトスタチン転写を刺激するかどうかを判定する ために、ＩＴＦ−1 cＤＮＡが、標準的な方法を用いて、サイトメガロウィルス （ＣＭＶ）表現ベクター（例えば、ＰＯＧ４，Stratagene）に挿入された。Hela 細胞で調べた場合、ＣＭＶ−ＩＴＦ−１表現プラスミドはＴＳＥ ＩおよびＴＳ Ｅ IIソマトスタチンレポータープラスミドの両方を12倍程度刺激したのに対し て、これらの部位を含んでいない親のソマトスタチンプラスミドには軽微な影響 が現れただけだった。ＣＭＶ−ＩＴＦ−１も、ＰＣ12細胞に共トランスフェクシ ョンするとＴＳＥ ＩおよびＴＳＥ IIレポーター活性を刺激したが、−ＴＳＥプ ラスミドは刺激性を示さなかった。これらの結果は、ＩＴＦ−１が細胞のタイプ に依存して、ソマトスタチンプロモータからの転写を特異的に刺激することがで きることを示している。 組換えＩＴＦ−１のラットインシュリンプロモータへの影響を評価するために 、同様のアッセイが行われた。この場合も、結果は、ＩＴＦ−１が細胞タイプに 依存した形態でイン シュリンプロモータからの転写を特異的に刺激することができることを示してい る。 実施例８ 本発明によるホメオボックス−タイプ転写因子蛋白質の内発性遺伝子表現に対す るグルコース濃度の影響 膵臓島細胞を０〜20mMの範囲の種々の濃度のグルコースの存在下で培養した。 次に、ＲＮＡを島細胞の種々の培養物から分離して、ＳＥＱ ＩＤ NO：１から 選んだcＤＮＡ断片でプローブした。 その結果は、グルコース濃度が高い場合（つまり、20mM程度）、ＩＴＦ−１ ＲＮＡの量に対してかなり高いレベルのＩＴＦ−１ ＲＮＡが検出された。した がって、本発明による膵臓転写因子の内発性表現はグルコースの濃度に対応した 反応性を示す。 いくつかの好ましい実施例を参照にしつつ、上に本発明について説明してきた が、本明細書および特許請求の範囲に述べられている本発明の精神と範囲を逸脱 せずに修正、変更が可能なことは分かるであろう。 配列の要約 配列ＩＤ NO：１は本発明による内分泌性ホルモン転写因子（ＩＴＦ−１）を コード表現するcＤＮＡの核酸配列（および推測されるアミノ酸配列）である。 配列ＩＤ NO：２は本発明による内分泌性転写因子（ＩＴＦ−１）の推測され るアミノ酸配列である。 配列ＩＤ NO：３はＴＳＥ Ｉである。 配列ＩＤ NO：４はＴＳＥ IIである。 配列ＩＤ NO：５は実施例２に述べられている合成プライマーである。 配列ＩＤ NO：６は実施例２に述べられている合成プライマーである。 配列ＩＤ NO：７は実施例５に述べられているミユータントＴＳＥ IIである 。 配列ＩＤ NO：８はインシュリンプロモータ“Ｐ−Ｂox”領域である。 配列ＩＤ NO：９はインシュリンプロモータ“ＦＬＡＴ”（Ｅ２）領域である 。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 14/47 8517−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 16/18 16/18 7804−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 9358−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/08 5/10 9284−4Ｃ Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ 15/09 ＺＮＡ 9284−4Ｃ Ｎ Ｃ１２Ｐ 21/08 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/566 // Ａ６１Ｋ 39/395 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 9281−4Ｂ 5/00 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/566 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＰ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．膵臓島細胞内のホルモン遺伝子表現を制御する複数のプロモータに結合する 能力を有する分離されたホメオボックス−タイプ転写因子蛋白質。 ２．膵臓および小腸内の該ホルモン遺伝子表現をトランスアクティベートする能 力を有する請求項１の転写因子蛋白質。 ３．該ホルモン遺伝子表現を抑制する能力を有する請求項１の転写因子蛋白質。 ４．該ホルモン遺伝子がインシュリン、グルカゴン、およびソマトスタチン遺伝 子である請求項２の転写因子蛋白質。 ５．該蛋白質が該プロモータ内の組織特異性プロモータ要素（ＴＳＥ）と結合し 、そして、該ＴＳＥがＳＥＱ ＩＤ NO：３，ＳＥＱ ＩＤ NO：４，ＳＥＱ ＩＤ NO：８あるいはＳＥＱ ＩＤ NO：９から選択されることを特徴とする請 求項１の転写因子蛋白質。 ６．該分泌性細胞内で表現される請求項１による転写因子蛋白質。 ７．該転写因子蛋白質が細胞外のグルコース濃度の変動に反応を示す請求項１の 転写因子蛋白質。 ８．該蛋白質が該転写因子蛋白質のホメオボックス領域のポジション44にヒスチ ジンを有している請求項１の転写因子蛋白質。 ９．該転写因子蛋白質のアミノ酸配列が配列ＩＤ NO：２に示されている蛋白質 配列と基本的に同じである請求項１の転写因子蛋白質。 10．配列ＩＤ NO：２に示されている蛋白質配列と基本的に同じアミノ酸配列を 有している請求項９による転写因子蛋白質。 11．インシュリンおよびソマトスタチン遺伝子プロモータと結合する能力を有す る分離されたホメオボックス−タイプのホルモン転写因子蛋白質。 12．膵臓および小腸内部のインシュリンおよびソマトスタチン遺伝子表現をトラ ンスアクティベートする能力を有する請求項11の蛋白質。 13．インシュリンおよびソマトスタチン遺伝子表現を抑制する能力を有する請求 項11による蛋白質。 14．該転写因子蛋白質が該プロモータ内の組織特異性プロモータ要素と結合し、 該ＴＳＥがＳＥＱ ＩＤ NO：３，ＳＥＱ ＩＤ NO：４，ＳＥＱ ＩＤ NO： ８またはＳＥＱ ＩＤ NO：９から選ばれる請求項11の蛋白質。 15．該転写因子蛋白質が細胞外のグルコース濃度の変動に反応性を示す請求項11 の蛋白質。 16．請求項１の転写因子蛋白質をコード表現する分離された核酸。 17．請求項11の転写因子蛋白質をコード表現する分離された核酸。 18．(a) ＳＥＱ ＩＤ NO：２に示されているアミノ酸配列をコード表現する ＤＮＡ、 (b) やや厳格な条件の下で(ａ)のＤＮＡとハイブリダイズし、生物学的に 活性のある膵臓ホルモン転写因子をコード表現するＤＮＡ、または (c) 上記(ａ)または(ｂ)に対する変性体で、生物学的に活性を有する膵臓 ホルモン転写因子をコード表現するＤＮＡ変性体 から選択される核酸、またはその機能性断片。 19．該核酸のヌクレオチド配列が、ＳＥＱＩＤ ＮＯ：１と基本的には同じであ る請求項18の核酸。 20．該核酸がｃＤＮＡである請求項18の核酸。 21．請求項18の核酸を含むベクター。 22．請求項18の核酸を含む組換え細胞。 23．請求項21のベクターを含む組換え細胞。 24．ホメオボックス−タイプの膵臓島ホルモン転写因子を表現する方法において 、該方法が請求項22の細胞を該転写因子の表現に適した条件の下で培養するステ ップを含む方法。 25．請求項１の転写因子蛋白質に対して発生する分離された抗体。 26．該抗体がモノクローナル抗体である請求項25の抗体。 27．内分泌性膵臓島ホルモン遺伝子を制御するプロモータからの転写を制御する 方法において、 グルコースの存在下で、該プロモータを請求項１の転写因子蛋白質と接触さ せるステップを含む方法。 28．該転写因子蛋白質がＳＥＱ ＩＤ NO：１のヌクレオチド331−1182と基本 的に同じヌクレオチド配列によってコード表現される請求項27の方法。 29．哺乳動物のインシュリンのレベルを調節する方法において、 グルコースの存在下で生物学的に活性を有するインシュリン蛋白質を請求項 １による転写因子蛋白質、またはそのＤＮＡ−結合断片と接触させるステップを 含む方法。 30．該接触が該転写因子蛋白質のインサイ（in situ）表現によって達成され、 そして、該転写因子蛋白質がＳＥＱＩＤ NO：１のヌクレオチド331−1182と基 本的に同じヌクレオチド配列によってコード表現される請求項29の方法。 31．グルコースの存在下で、哺乳動物の糖尿病を措置するための方法において、 生物学的な活性を有するインシュリン蛋白質をコード表現する遺伝子を含んでい る細胞において、請求項20によるベクターを表現するステップを含む方法。