JPH09502102A

JPH09502102A - テロメラーゼ活性アッセイ

Info

Publication number: JPH09502102A
Application number: JP51399795A
Authority: JP
Inventors: ハーリー，カルバン・ブルース; キム，ナム・ウー; ワインリッチ，スコット・ローレンス
Original assignee: ジェロン・コーポレイション
Priority date: 1993-11-12
Filing date: 1994-11-10
Publication date: 1997-03-04
Anticipated expiration: 2014-03-31
Also published as: DK0728207T3; WO1995013381A1; DE69424797T2; JPH11243998A; CA2173872A1; JP2875394B2; EP0728207A1; HK1011384A1; CA2173872C; ATE193554T1; US5629154A; PT728207E; AU682082B2; EP0728207B1; GR3034249T3; AU1209095A; DE69424797D1; ES2147602T3

Abstract

(57)【要約】試料中のテロメラーゼ活性は、テロメラーゼ基質およびプライマー伸長工程を含む二反応プロトコールを用いて測定することができる。

Description

【発明の詳細な説明】テロメラーゼ活性アッセイ発明の分野本発明は、テロメアＤＮＡ合成に関係するリボ核タンパク酵素であるテロメラーゼに関するものであり、テロメラーゼ活性を同定および測定するためのアッセイおよびプロトコールを提供するものである。本発明は、分子生物学、化学、薬理学、ならびに医学的診断および予後技術の分野に関する方法および組成物を提供するものである。関連文献の開示テロメアは、真核生物染色体の両端の特殊構造であり、染色体安定化、位置決定、および複製において機能することが明らかである [ブラックバーン(Ｂlackb urn)およびショスタック (Ｓzostak)、１９８４、Ａnn.Ｒev.Ｂiochem. ５３：１６３−１９４；ザキアン (Ｚakian)、１９８９、Ａnn.Ｒev.Ｇenetics ２３：５７９−６０４；ブラックバーン、１９９１ネイチャー（Ｎature）３５０：５６９−５７３]。全ての脊椎動物において、テロメアは、１００〜１０００個の５'−ＴＴＡＧＧＧ−３'配列のタンデム重複および会合タンパクからなっている [ブラックバーン、１９９１；モイジス（Ｍoyzis）ら、１９８８、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐroc.Ｎatl. Acad.Sci. ）８５：６６２２−６６２６]。染色体末端制限フラグメント（ＴＲＦ）のサザンブロット分析は、細胞群における全てのテロメアの合成長さを提供する [ハーリィ（Ｈarley）ら、１９９０、ネイチャー（Ｎature）３４５：４５８ −４６０；オールソップ（Ａllsopp）ら、１９９２、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ（Ｐroc.Ｎ atl.Ａcad.Ｓci.,ＵＳＡ）８９：１０１１４−１０１１８；バジリ（Ｖaziri）ら、１９９３、アメリカン・ジャーナル・オブ・ヒューマン・ジェネンティクス（Ａm.Ｊ.Ｈuman Ｇenentics）５２：６６１−６６７]。現在までに試験された全ての正常体細胞において、ＴＲＦ分析は、両端まで線形ＤＮＡを複製することについてのＤＮＡポリメラーゼの無能さと一致する、染色体が細胞分裂当たり約５０〜２００ヌクレオチドのテロメア配列を失うことを示した [ハーリィら、１９９０；オールソップら、１９９２；バジリら、１９９３；ワトソン (Ｗatson)、１９７２、Ｎature Ｎew Ｂiology ２３９：１９７−２０１]。このテロメアの短縮は、細胞がそれらの分裂を数える有糸分裂時計であることが提案され [ハーリィ (Ｈarley)、１９９１、ミューテーション・リサーチ（Ｍ ut.Ｒes. ）２５６：２７１−２８２]、充分に短いテロメアは、正常な細胞における複製老化のシグナルである［オールソップら、１９９２；バジリら、１９９３；ハスティ（Ｈastie）ら、１９９０、ネイチャー (Ｎature)、３４６：８６６−８６８；リンゼー（Ｌindsey）ら、１９９１、ミューテーション・リサーチ２５６：４５−８；ライト（Ｗright）およびシャイ (Ｓhay)、１９９２、Ｔre nds Ｇenetics ８：１９３−１９７]。対照的に、現在までに試験された非常に多くの不死化細胞は、細胞分裂によるテロメア長さまたは配列の正味の損失を示しておらず、これは、細胞が複製老化を免れ、無期限に増殖するためにテロメアの維持が必要であることを示す [カウンター（Ｃounter）ら、１９９２、ＥＭＢＯ１１：１９２１−１９２９；カウンター（Ｃounter）ら、１９９４、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ（Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.,ＵＳＡ）９１：２９００−２９４０]。固有のリボ核タンパクＤＮＡポリメラーゼであるテロメラーゼは、酵素のＲＮＡ成分内に含有される配列を鋳型として用いて染色体末端でテロメアＤＮＡを合成することが知られている唯一の酵素である [グライダー（Ｇreider）およびブラックバーン (Ｂlackburn)、１９８５、セル（Ｃell）４３：４０５−４１３；グライダー（Ｇreider）およびブラックバーン (Ｂlackburn)、１９８９、ネイチャー３３７：３３１−３３７；ユ（Ｙu）ら、１９９０、ネイチャー３４４：１２６−１３２；ブラックバーン (Ｂlackburn)、１９９２、Ａnn.Ｒev.Bioch em. ６１：１１３−１２９]。ヒトの細胞および組織に関して、テロメラーゼ活性は、不死化細胞系および卵巣癌において同定されたが、致死細胞株または正常な非生殖細胞系組織においては検出されなかった [カウンターら、１９９２；カウンターら、１９９４；モリン (Ｍorin)、１９８９、セル（Ｃell）５９：５２１−５２９]。ＴＲＦ分析と一緒に、これらの結果は、テロメラーゼ活性がテロメア維持に直接関係していることを示しており、この酵素を細胞不死化に関連付けている。テロメラーゼ活性の検出方法、ならびにテロメラーゼ活性を調節するか、またはテロメラーゼ活性に影響を及ぼす化合物の同定方法もまた、テロメア長さもしくはテロメラーゼ活性を制御または測定することによる細胞老化および不死化の治療または診断方法と一緒に開示された。１９９３年１１月２５日に公開されたＰＣＴ特許公開番号９３／２３５７２を参照のこと (出典明示により本明細書の一部とする)。テロメラーゼ活性に影響を及ぼす化合物の同定は、ヒトの疾患の治療に対する試みに重要な利益を与える。癌細胞は、不死化のためにテロメラーゼ活性を発現し、必要とし、正常なヒト体細胞は、検出可能なレベルでテロメラーゼ活性を発現しないので、テロメラーゼ活性を阻害する化合物を用いて、癌を治療することができる。テロメラーゼ活性を刺激または活性化する化合物を用いて、年齢関連疾患および細胞老化に関係する他の症状を治療することができる。テロメラーゼ活性を調節する化合物を同定するための新しく改良されたスクリーニング方法が開発されているが [１９９４年８月１０日に出願されたＵ.Ｓ.特許出願番号０８／、発明者：マイケル・コズロヴスキー（Ｍichael Ｋozlowski）およびカレン・プロウズ (Ｋaren Ｐrowse)、出典明示により本明細書の一部とする]、テロメラーゼ活性の検出および測定のための、感度がよく信頼性のあるアッセイが依然として必要とされている。細胞試料においてテロメラーゼ活性をアッセイするための現行法は、テロメラーゼ基質中に放射性標識ヌクレオチドを組み込むことに依存している [モリン、１９８９]。慣用のアッセイは、オリゴヌクレオチド基質、標識のために放射性デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、および生成物の分析および表示のためにゲル電気泳動を用いる。５'−ＴＴＡＧＧＧ−３'テロメア繰返し中に第１のＧを付加すると、テロメラーゼが失速し、ＤＮＡを放出するので、ゲル上での生成物の特徴的なパターンは、伸長オリゴヌクレオチド基質の６ヌクレオチドラダーである。繰返しの相は、基質の３’−末端配列に依存する；末端が繰返し中にある場合、テロメラーゼが認識し、従って、合成して、隣接する繰返し配列が得られる。テロメア配列オリゴヌクレオチドは、効果的なイン・ビトロ基質であるが、テロメラーゼは、非テロメアＤＮＡ配列からなる基質を用いて繰返しをも合成するであろう。かかる方法を用いて、科学者らは、細胞の低張膨潤（hypotonic swelling）および物理的分断による信頼性のあるテロメラーゼ抽出が少なくとも１０⁷−１０⁸ 個の細胞を必要とし、抽出効率が細胞のタイプにより変わることを見いだした [ カウンターら、１９９２；モリン、１９８９]。慣用のアッセイと比較して増大した、テロメラーゼ活性検出の感度、速度および効率を有するテロメラーゼ活性アッセイが依然として必要とされており、本発明は、この要求を満たすものである。発明の概要本発明は、細胞試料がテロメラーゼ活性を含有するかの判定方法ならびに関連する試薬および当該方法に有用な物質を提供するものである。当該方法は、（ａ）細胞試料から細胞抽出物を調製し；（ｂ）テロメア繰返し配列を欠いているテロメラーゼ基質、およびテロメア繰返し配列の付加によってテロメラーゼがテロメラーゼ基質の伸長を触媒することができる緩衝液からなる反応混合物中に細胞抽出物のアリコットを入れ、（ｃ）伸長テロメラーゼ基質が反応混合物中に存在する場合にテロメア繰返しと充分に相補的な配列からなるプライマーが該伸長テロメラーゼ基質にハイブリダイズし、伸長して、伸長テロメラーゼ基質の相補的コピーを形成するような条件下、該反応混合物に該プライマーを添加して、それに特異的にハイブリダイズさせ、次いで、（ｄ）伸長プライマーと結合した伸長テロメラーゼ基質からなる二本鎖ＤＮＡ分子が存在する細胞試料におけるテロメラーゼ活性の存在と、二本鎖ＤＮＡ分子が存在しない細胞試料におけるテロメラーゼ活性の不在との相互関係を示すことからなる。本発明は、本発明の実施に有用な試薬および関連方法を提供するものでもある。かかる関連方法の１つは、細胞試料からのイン・ビトロ活性の抽出に関係する。本発明の方法によると、該抽出は、非イオンおよび／または両性イオン界面活性剤からなる緩衝液中で行われる。テロメラーゼ活性抽出物を用いて、テロメラーゼ基質伸長反応においてテロメラーゼ基質の伸長を媒介する。本発明のテロメラーゼ活性アッセイのもう１つの重要な工程は、オリゴヌクレオチド「プライマー」の伸長およびこの工程に関係する本発明の多くの有用な試薬にも関係する。典型的には、プライマー伸長は、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて媒介され、該プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼにより、プライマーへのヌクレオチドの添加によって伸長される。該ＤＮＡポリメラーゼは、好ましくは、熱安定ＤＮＡポリメラーゼである；かかるポリメラーゼを用いると、各サイクルが、（１）反応混合物を加熱して、二本鎖ＤＮＡ分子を変性させ；（２）ポリメラーゼを不活化させずに、相補的核酸がハイブリダイズすることができ、かつ、ポリメラーゼがプライマーを伸長することができる温度までに該反応混合物を冷却することからなるプライマー伸長の多重サイクルを行うことができる。当該方法の具体例では、反応混合物中でＰＣＲのための第２のプライマーとして供する過剰量のテロメラーゼ基質を有し、５、１０、１５、２０、３０またはそれ以上の回数の加熱および冷却工程を行うことによる有効なポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）法を利用することもできる。別法として、プライマー伸長は、鋳型依存性ＤＮＡリガーゼによって媒介されることができ、その結果、該プライマーは、ＤＮＡリガーゼにより、該プライマーへのオリゴデオキシリボヌクレオチドの添加によって伸長される。典型的には、ＤＮＡリガーゼは、熱安定ＤＮＡリガーゼであり、プライマー伸長工程は、（１）反応混合物を加熱して、二本鎖ＤＮＡ分子を変性させ；（２）相補的核酸がハイブリダイズすることができ、かつ、リガーゼがプライマーを伸長させることができる温度までに該反応混合物を冷却することによって行われる。当該方法のこの具体例では、反応混合物中の伸長プライマーと相補的なオリゴヌクレオチド（「リゴマー」）を有することによって、および、５、１０、１５、２０、３０またはそれ以上の回数の加熱および冷却工程を行うことによって有効なリガーゼ連鎖反応（「ＬＣＲ」）を利用することもできる。本発明は、本発明の実施に有用なプライマーおよびオリゴマーなどの多くのオリゴヌクレオチドを提供するものでもある。例えば、ＰＣＲを用いて核酸を増幅させる場合、非特異的生成物形成を回避することが必要である。かかる生成物は、「プライマー二量体」（primer-dimer）を形成するための方法で用いたプライマーの相互作用を介することを含む種々の方法によって形成することができる。本発明は、プライマー二量体形成の問題を最小にするように特別に設計されたプライマーを提供するものである。もう１つの態様では、本発明は、プライマーの５'−末端で非テロメア繰返し配列（テロメア繰返し配列と同一でも相補的でもない配列）からなるプライマーを提供するものである。本発明における「アンカープライマー」（anchored primers）と称するかかるプライマーの使用は、最大プライマー伸長産生物がテロメラーゼ基質のテロメラーゼ媒介伸長の最大産生物ほど大きくないテロメア繰返しを有することを確実にすることができる手段を提供する。かかるプライマーなしで、プライマー伸長および産生物変性の多重サイクルは、反応混合物中、テロメラーゼ伸長テロメラーゼ基質中に存在するよりも多くのテロメア繰返しからなるプライマー伸長産生物を生じることができる。本発明は、テロメラーゼ活性アッセイに有用な試薬、および当該方法の実施を促進するためのこれらの試薬からなるキットの新規形態を提供するものでもある。該活性アッセイは、典型的には単一反応管中で行われ、反応成分を包装するための好都合なフォーマットを提供する。例えば、プライマーが該管の下部でワックス層またはバリヤー下で密封され、テロメラーゼ基質ならびに所望により緩衝液およびポリメラーゼ（またはリガーゼ）がバリヤーの上に位置するように試薬を調製することができる。該管をテロメラーゼ媒介テロメラーゼ基質抽出工程の終わりに加熱すると、ワックスバリヤーが溶融し、プライマーが他の反応成分と混合する。このフォーマットは、非常に特異的な核酸塩基対を確実にする温度でのみ、該プライマーをＤＮＡポリメラーゼおよび伸長テロメラーゼ基質に接近させ易くし、そこで、非特異的プライマー伸長およびプライマー二量体（プライマーおよび非伸長テロメラーゼ基質からなる）形成を減少させる。かくして、本発明の１つの有用なキットは、テロメラーゼ反応緩衝液（所望により熱安定ポリメラーゼまたはリガーゼを含有してもよい）が設置されているワックスバリヤーのすぐ下で密封したプライマーを含有する反応管からなる。テロメラーゼ伸長テロメラーゼ基質の同定を促進させるように種々の試薬を標識化することもできる。かくして、標識ヌクレオシド三リン酸を用い、テロメラーゼ基質またはプライマーにおける標識ヌクレオチドの組込みをモニターすることができる。しかしながら、テロメラーゼ活性のより正確な定量化のために、標識テロメラーゼ基質またはプライマーを用いることができる。本発明の目的のために種々の標識のいずれも用いることができる。かかる標識としては、典型的には、蛍光性標識、リン光性標識、ケミルミネッセンス標識、および放射性標識が挙げられる。別法としては、標識は、単に、非標識「タグ」であってもよく、該タグに結合する標識分子によって認識される。例えば、タグとしてビオチンを用いることができ、アビジン化ホースラディッシュペルオキシダーゼ（「ＨＲＰ」）を用いて、該タグに結合させ、次いで、色素産生性基質（すなわち、ＴＭＢ）を用いて、ＨＲＰの存在を検出することができる。同様の形態で、該タグは、エピトープまたは抗原であってもよく、蛍光性標識または放射性標識抗体を用いて、該タグに結合することができる。本発明は、また、テロメラーゼ活性のための定量的アッセイを提供するための標識以外（または該標識に加えての）手段を提供するものである。本発明のこの態様では、実質的に、（５'から３'への方向で）テロメラーゼ基質、既知の長さ（好ましくは、３塩基）および組成の「スタッファー」（stuffer）配列、特定の数のテロメア繰返し配列、ならびにプライマー伸長工程で用いられたプライマーと相補的な配列（該プライマーは、所望によりアンカー配列を含有していてもよい）からなる既知量の対照オリゴヌクレオチドを反応開始時に反応混合物に添加する。この内部対照の使用は、アッセイが正しく行われたかを判断し易くするだけではなく、試料中に存在するテロメラーゼ活性を定量化し易くする。対照オリゴヌクレオチドは、好都合には、他の反応成分を有するキット中に包装することもできる。本発明の方法は、いずれの起源からのいずれの試料中でもテロメラーゼ活性の検出に幅広く利用できるが、該方法は、特に、ヒトから得られた生体物質の試料中におけるテロメラーゼ活性の検出に有用であり、利用できる。かかる試料は、細胞または細胞性物質を含有し、典型的には、癌の検出のためにヒトから得られる。テロメラーゼは、正常な生後のヒト体細胞によっては発現されないが、ある種の体細胞および造血系の活性化細胞中では低レベルのテロメラーゼ活性を検出することができ、そこで、ヒト体組織または細胞の試料中のテロメラーゼ活性の存在は、ある種の癌細胞を含む不死化細胞が組織中に存在することを示す。全ての癌細胞がテロメラーゼ活性を発現するわけではないが、テロメラーゼ発現は、細胞を不死化させるために必要である。したがって、テロメラーゼ活性を有する細胞の存在は、多くの型の癌に関連しており、特定の侵食癌または転移性癌が存在することを示すのに供することもできる。かくして、本発明は、細胞内で高レベルのテロメラーゼ活性に関連する患者の病状の診断方法を提供するものである。該方法は、患者の細胞中でのテロメラーゼ活性の存在または量を測定することに関係しており、したがって、該方法は、前立腺癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、卵巣／子宮頸癌、肺癌、および白血病に関連する高レベルのテロメラーゼ活性の検出に利用できる。該方法は、テロメラーゼ基質およびプライマー伸長反応による、好ましくは、ポリメラーゼ連鎖反応を用いる細胞内でのテロメラーゼ活性の存在または量を測定することに関係する。本発明のこれらおよび他の態様は、図面の簡単な説明で始まる以下の記載にてより詳細に説明する。図面の簡単な説明第１図は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥの部分で、慣用の方法と比較して、本発明のテロメラーゼ抽出方法および活性アッセイを用いて得られた改良された結果を示す。第１図の部分Ａにおいて、ＣＨＡＰＳ抽出細胞調製を慣用のアッセイで用い、結果は、抽出物が予想通りに動くことを示す。以下の実施例１を参照のこと。第１図の部分Ｂにおいて、テロメラーゼ基質「ＴＳ」は、ＴＳテロメラーゼ伸長生成物（約４個のテロメラーゼ繰返し配列を有する；繰返し配列の数は、伸長生成物から伸長生成物まで変わることができる）と一緒に示され、これは、「ＣＸ」プライマーとの二重鎖を示す (垂直線は、塩基対を示し、星印は、プライマーと非伸長テロメラーゼ基質との相互作用を最小にするようにプラィマーの設計中に組み込まれたミスマッチを示す)。この図における破線矢印は、ＰＣＲ工程の間に形成された陽性プライマー伸長生成物を表す；ＣＸプライマーの有効な伸長生成物は、実際のおよび有効なＴＳ伸長生成物間で挟まれていることを示す。第１図の部分Ｄは、テロメラーゼ活性の特異的検出のためのアッセイ（以下の実施例２を参照のこと）を確認する、本発明の方法（「テロメラーゼ繰返し増幅プロトコール」または「ＴＲＡＰ」とも称される）における陽性シグナルが、ＴＳオリゴヌクレオチドを３個以上の５'−ＴＴＡＧＧＧ−３'繰返しで伸長させることができる不死化細胞抽出物中のリボ核タンパクを必要とすることを示す多重の対照実験の結果を示す。第１図の部分Ｆは、本発明の方法（以下の実施例２を参照）の高い感度を説明するために異なるレベルのテロメラーゼ活性を含有する種々の試料の分析結果を示す。第２図は、ＣＨＡＰＳ洗浄剤溶解法を用いる不死化細胞系および正常体細胞培養物から調製した（以下の実施例１および３を参照）同一の細胞抽出物１０個について行った本発明の方法（第２図の部分Ａ）および慣用のアッセイ（第２図の部分Ｂ）の比較を示す。好ましい具体例の説明本発明は、テロメラーゼ活性の抽出および検出のための新規方法および試薬を提供するものである。同時に、これらの改良の結果、テロメラーゼ活性の検出のための慣用の方法よりも約１０⁴倍の改良を生じる。テロメラーゼは、染色体の両端でテロメアＤＮＡを合成し、不死化細胞の明確でない増殖のために必要であると思われる。種々のヒトの細胞のタイプにおける染色体末端制限フラグメントの分析は、テロメア長さおよび配列が不死化細胞系中で安定に維持されるが、正常な体細胞の分裂培養物中では維持されないことを示した。テロメラーゼと不死との関係は、標識テロメラーゼ基質伸長生成物を形成するためにテロメラーゼ基質中に放射性標識ヌクレオチドを組み込むことに依存する慣用の活性アッセイの制限された感度のために確立するのが困難であった。本発明の方法は、起源の１８種類の組織を表すヒト細胞系および正常体細胞におけるテロメラーゼ活性について試験するために用いられた。６８個の腫瘍誘発細胞系のうち６８個、６個の形質転換細胞系のうち４個、および２２個の正常体細胞培養物のうち０個からの抽出物のテロメラーゼ活性についての確実性を試験した。不死化体細胞および正常体細胞間のテロメラーゼ活性の差異を少なくとも１０００倍であると評価した。これらの発見は、ヒトの細胞におけるテロメア力学におけるテロメラーゼのための直接的な役割を支持する。改良されたテロメラーゼ活性アッセイを提供することに加えて、本発明は、低い細胞数でさえテロメラーゼ活性の均一な抽出を提供する新規洗浄剤溶解法を提供するものである。該方法は、（１）細胞の試料を回収し；（２）非イオンおよび／または両性イオン洗浄剤０.０１〜５％からなる溶解緩衝液中で該試料を溶解させ；（３）遠心分離によって、細胞デブリを除去し、（４）該細胞デブリから分離した上清を回収する工程を含む。当該方法では、種々の非イオンおよび／または両性イオン洗浄剤を用いることができる。好ましい非イオン洗浄剤としては、トゥイーン２０、トリトンＸ−１００、トリトンＸ−１１４、Ｔhesit、ＮＰ−４０、ｎ−オクトルグルコシド、ｎ−ドデシルクルコシド、ｎ−ドデシル− β−Ｄ−マルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド（ＭＥＧＡ−８）、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド（ＭＥＧＡ−１０）、およびイソトリデシルポリ(エチレングリコールエーテル)_nが挙げられ、好ましい両性イオン洗浄剤としては、ＣＨＡＰＳ (３−{(３−コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ}− １−プロパン−スルホナート)、ＣＨＡＰＳＯ (３−{(３−コールアミドプロピル)ジメチル−アンモニオ}−２−ヒドロキシ−１−プロパン−スルホナート)、Ｎ−ドデシル−Ｎ,Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパン−スルホナート、およびジギトニンが挙げられ、特に好ましい洗浄剤としては、ＣＨＡＰＳが挙げられる。洗浄剤の正確な量は、限定的ではないが、０.５％は、典型的にはテロメラーゼ活性の増強された抽出を観察するのに充分である。以下の実施例１は、ＣＨＡＰＳ抽出テロメラーゼ活性が慣用のテロメラーゼ活性アッセイにおいて予想されるように機能することを示す。第１図Ａに示すように、洗浄剤抽出活性は、テロメラーゼ活性の特性を有する伸長産生物の６ヌクレオチドラダーを産生する（レーン１、２および４）；テロメラーゼ媒介伸長について予想されるように、オリゴヌクレオチドテロメラーゼ基質の３'−配列に依存する産生相においてシフトがある；抽出された活性は、（ジデオキシヌクレオチド鎖読み終わり配列決定（dideoxynucleotide chain termination sequencing ）を用いて確認したように）５'−ＴＴＡＧＧＧ−３'繰返しを有するテロメラーゼ基質（モリン (Ｍorin)、１９９１、ネイチャー（Ｎature）３５３：４５４− ４５６；レーン４および５）であることが予め示された非テロメラーゼオリゴヌクレオチドを伸長することができる；活性は、テロメラーゼ活性について予想されるように、ＲＮａｓｅ処理によって完全に破壊されたレーン３および５；グライダー（Ｇreider）およびブラックバーン (Ｂlackburn)、１９８５、セル（Ｃe ll ）４３：４０５−４１３；グライダーおよびブラックバーン、１９８９、ネイチャー３３７：３３１−３３７；モリン、１９８９、セル５９：５２１−５２９)。本発明のテロメラーゼ活性アッセイは、抽出物が本発明の洗浄剤溶解方法を用いて得られる細胞試料のアッセイに限定されないが、かかる抽出物は、特に細胞２、３個しか入手可能でない場合、または、試料中のテロメラーゼ活性を発現する細胞の数が非常に少ない場合に、好ましい。本発明のテロメラーゼ活性アッセイは、かかる環境におけるテロメラーゼ活性を検出する際に慣用のアッセイに非常に優れており、終了するのにより早く、より効率的である。この新規方法は、以下の基本的工程を含む：（ａ）該細胞試料からの細胞抽出物を調製すること；（ｂ）テロメア繰返し配列を欠いているテロメラーゼ基質、および、テロメラーゼがテロメア繰返し配列の添加によってテロメラーゼ基質の伸長を触媒することができる緩衝液からなる反応混合物中に該細胞抽出物のアリコートを入れ、（ｃ）伸長テロメラーゼ基質が反応混合物中に存在する場合に、該プライマーが伸長テロメラーゼ基質にハイブリダイズし、伸長して、伸長テロメラーゼ基質の相補的なコピーを形成するような条件下、反応混合物に、テロメア繰返しと充分に相補的な配列からなるプライマーを添加して特異的にハイブリダイズし；（ｄ）細胞試料中のテロメラーゼ活性の存在と、伸長プライマーに結合した伸長テロメラーゼ基質からなる二本鎖ＤＮＡ分子の存在および二本鎖ＤＮＡ分子が不在である細胞試料中のテロメラーゼ活性の不在との相互関係を示す。本発明の方法は、実質的に、２つのキー反応を含む：（１）テロメラーゼ基質のテロメラーゼ媒介伸長；および（２）テロメラーゼ伸長基質が試料中に存在するテロメラーゼ活性によって産生された場合のみ進行するプライマー伸長反応。本発明の理解をより完全にするために、まず、（１）試料の性質；（２）イロメラーゼ基質の重要な特徴；および（３）プライマー伸長反応の性質ならびに該反応に用いたプライマーおよび伸長試薬に関するいくつかの世界的な刊行物を考慮すべきである。いずれのタイプの試料も当該方法によって試験することができる。特定の関心のある試料としては診断分析のために得られた組織または腫瘍試料であってもよい細胞試料が挙げられる。種々の細胞におけるテロメラーゼ活性の発現は、科学文献において研究され、検討された。テロメラーゼは、真核細胞病原によるだけでなく、ある種の腫瘍および癌細胞を含む不死化ヒト細胞によっても発現されるが、正常な体（生殖細胞系に対する）組織の細胞によっては、発現されない。しかし、低レベルのテロメラーゼ活性は、幹細胞および造血系のある種の活性化細胞において検出することができる。したがって、試料は、テロメラーゼ発現病原または癌もしくは腫瘍細胞が存在するかを測定するために得られる。かかる目的のために、該試料はしばしばヒトから得られるが、本発明方法によって試験される試料がウシ、ウマ、ヒツジなどの農業的に重要な哺乳動物、ネコおよびイヌのような獣医学的に関心のある他の動物、ならびに病原の存在について試験する環境についての環境から入手することができることを容易に理解することができる。試料の起源とは無関係に、本発明を実施するために、まず、好ましくは本発明の洗浄剤ベース抽出法を用いて細胞抽出物を調製し、次いで、該細胞抽出物または該細胞抽出物のアリコートを、テロメラーゼ基質およびテロメラーゼ活性と適合する緩衝液反応混合物中に入れる。特に選択された適合基質は、試験するテロメラーゼ活性のタイプまたは起源に依存して変わる。微生物によって発現されたテロメラーゼ活性は、他の微生物によって発現されたものとは基質特異性に関して異なる。したがって、ヒト起源の癌細胞が試料中に存在するかを測定するために当該方法を用いる場合、ヒトテロメラーゼによって認識されるテロレメラーゼ基質が用いられる。テトラヒメナ（Ｔetrahymena）およびヒト細胞のテロメラーゼについて種々の基質が知られており、他のタイプの細胞について容易に同定することができる。しかしながら、ＤＮＡポリメラーゼをベースとするプライマー伸長工程を用いる場合、本発明方法は、テロメラーゼ基質がテロメア繰返し配列を含まないことを要求する。当業者は、テロメラーゼ活性によって産生したテロメア繰返し配列がテロメラーゼの起源に依存することを認識するであろう。例えば、テトラヒメナ（Ｔetrahymena）テロメラーゼは、テロメラーゼ基質の末端に配列５'−ＴＴＧＧＧＧ−３'の繰返しを付加するが、ヒトテロメラーゼは、５'−ＴＴＡＧＧＧ− ３'の繰返しを付加する。かくして、ヒトテロメラーゼ活性についてアッセイする本発明方法を用いる場合、テロメラーゼ基質は、配列５'−ＴＴＡＧＧＧ−３' を欠いているヒトテロメラーゼ基質であるべきである。異なる繰返し配列の存在が、以下に説明するような過剰なプライマー二量体形成などの望ましくない結果を生じない限り、ヒトテロメラーゼ基質が、異なる繰返しを付加するテロメラーゼを有する微生物由来のテロメア繰返し配列を欠いていることを要求しない。テロメア繰返し配列を欠くためのテロメラーゼ基質についてのこの要求は、本発明方法の第２反応−−非テロメラーゼ媒介プライマー伸長反応から生じる。この反応では、伸長テロメラーゼ基質が存在する場合、プライマーが伸長基質に結合し、次いで、酵素作用によって伸長されるような条件下、伸長テロメラーゼ基質にのみハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを反応混合物に添加する。テロメラーゼは、テロメア繰返しの添加によってのみテロメラーゼ基質を伸長することができるので、該プライマーは、必ず、テロメア繰返しと相補的な配列からなる。テロメラーゼ伸長反応で用いられたテロメラーゼ基質がテロメア繰返しからなる場合、プライマー伸長反応で用いたプライマーは、有効な陰性の結果をもって、非伸長テロメラーゼ基質にハイブリダイズすることができる。しかしながら、テロメラーゼ基質は、得られた結果の有効性を傷つけることなく、テロメア繰返し配列に非常に関係した配列からなることができる。例えば、特に好ましい本発明のヒトテロメラーゼ基質は、ヒトテロメア繰返しの６個の塩基のうち５個と同一であるが、テロメア繰返し配列を含有しない３'−末端で配列を含有するＴＳとして知られたオリゴヌクレオチドＭ２である。プライマー伸長反応は、プライマーを伸長した第２シグナルを生じることによって試料（伸長テロメラーゼ基質）中でテロメラーゼ活性の存在によって生じたシグナルを増幅するために供する。該プライマーは、プライマー伸長が生じるために伸長テロメラーゼ基質の存在を必要とするいずれの手段によっても伸長することができる；２つの好ましい手段は、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼまたは鋳型依存性ＤＮＡリガーゼのいずれかによって媒介される。これらの手段のいずれかを用いて、テロメラーゼ活性が試料中に存在する場合、伸長テロメラーゼ基質が形成され、次いで、プライマーにハイブリダイズし、プライマー伸長産生物を産生するためにＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡリガーゼについての基質を提供する。プライマー伸長産生物が形成された後、伸長基質からの伸長プライマーを解離することができる (典型的には、加熱によるが、ヘリカーゼによる処理などの酵素的または化学的プロセスを用いることもできる)。さらなるプライマーおよびプライマー伸長試薬が試料中に存在する場合、新しいプライマー／伸長テロメラーゼ基質複合物は、形成することができ、別の伸長プライマーの産生を導く。所望のシグナルの量に依存して、プライマー伸長および変性のプロセスを何回も繰り返すことができる。典型的には、ブライマー伸長および伸長プライマー／伸長テロメラーゼ基質複合物の変性は、少なくとも５、１０、１５、２０〜３０回以上行われる。さらにまた、伸長プライマーの３'−末端と相補的な第２のプライマーが反応混合物中に存在する場合、シグナル（伸長プライマーおよびさらなる伸長テロテメラーゼ基質）を劇的に増加させることができる。プライマー伸長工程の間に反応混合物中に存在する非伸長テロメラーゼ基質は、第２のプライマーとして機能することができる。当業者は、プライマー伸長試薬がＤＮＡポリメラーゼであり、第２プライマーが存在する場合、適当な緩衝液およびヌクレオシド三リン酸が反応混合物に存在するとの条件で、Ｕ.Ｓ特許第４,６８３,１９５号および第４,６８３,２０２号にさらに充分に記載される、ポリメラーゼ連鎖反応のための必要な成分を有する。ＰＣＲ増殖は、本発明のプライマー伸長反応工程を行うための好ましいモードであり、劇的に、慣用のアッセイと比較して、テロメラーゼ活性検出の感度、速度、および効率を増加させる。該プロトコールは、テロメア繰返し増幅プロトコールについて「ＴＲＡＰ」と称され、実施例２および第１図Ｂ−Ｅに説明される。本発明のこの具体例では、テロメラーゼ基質は、ＰＣＲプライマーとしても供される（「上流プライマー」と称される）。低レベルのプライマー／テロメラーゼ基質アニーリングでさえテロメラーゼ産生物と同一の初期のサイクルＰＣＲ産生物（すなわち、ＴＳ＋(５'−ＴＴＡＧＧＧＧ−３')_n）を得ることができるので、他のプライマーの配列は、テロメラーゼ基質およびプライマーのアニーリングを回避するように選択される。その後のサイクルでは、これらの産生物は、間違った陽性を生じるＰＣＲ産生物の産生のための鋳型として供する。本発明は、本発明のＰＣＲに基づく具体例で用いるための種々のオリゴヌクレオチドプライマーおよびテロメラーゼ基質を提供するものである。かかるプライマー（「下流プライマー」と称する）は、「ＣＸ」と称され、３つの不完全なテロメア繰返しおよび１つの完全な繰返しと相補的な配列からなる (５'−(ＣＣＣＴＴＡ)₃ＣＣＣＴＡＡ−３')。３個の繰返しにおける単一のヌクレオチド差異は、（前記のような、テロメア繰返しの６個のヌクレオチドのうち５個を含有する）テロメラーゼ基質ＴＳにアニーリングするＣＸの能力を傷つけ、これにより、プライマー二量体などの非特異的ＰＣＲ産生物の形成を最小にする。テロメア配列相補性によって核をなすこれらのプライマー（ＣＸおよびＴＳ）間の可能な配列は、中断された３'ヌクレオチドがミスマッチされる二本鎖に導き、ポリメラーゼによって効率的には伸長されない。ＣＸプライマーが示すように、および、当業者がこの記載のリビューにより認識するように、「テロメア繰返しに相補的な」配列を有するプラィマーは、該プライマーがハイブリダイズすることを示すテロメラーゼ基質伸長産生物に関する１個以上のミスマッチ塩基を含有するプライマーを含む。この定義内で許容することができるミスマッチの数は、プライマーの長さおよび配列組成、ＰＣＲ工程の間に用いた温度および反応条件、アッセイが行われる目的、および所望の結果に依存して変わることができる。プライマーＣＸに加えて、本発明は、本発明の利益を得るのに必要ではないが、本発明の特異性、感度および効率を非常に増大させる基本的なＰＣＲのいくつかの変更例を提供する。例えば、１つの重要な変更は、緩衝液に関係する：本発明は、テロメラーゼ活性およびＤＮＡポリメラーゼ活性の両方を観察することができる緩衝液を提供するものである。かかる緩衝液の使用は、熟練者に、同一反応容器（典型的には、管：実施例２および第１図Ｃを参照）中でテロメラーゼ基質伸長反応およびプライマー伸長反応の両方を行わせしめる。他の変更は、反応混合物におけるテロメラーゼ基質またはプライマーと相補的である短いオリゴヌクレオチドの使用に関係する。これらの短いオリゴヌクレオチドは、プライマー伸長工程で用いられるプライマーのアニーリング温度よりも約１０℃低い溶融温度（短いオリゴヌクレオチドがハイブリダイズするプライマーまたはテロメラーゼ基質に関する）を有し、プライマー二量体形成および／または非特異的プライマー伸長を防止するように設計される。短いオリゴヌクレオチドは、低い非特異的な温度で不適切なプライマー伸長を防止するプライマー伸長工程のための理想的なアニーリング温度以下の温度でそれらの相補的なオリゴヌクレオチドから溶出した。短いオリゴヌクレオチドがテロメラーゼ基質にハイブリダイズするように設計される場合、充分な一本鎖領域（約３塩基）は、テロメラーゼ媒介伸長を生じせしめるために短いオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする場合、テロメラーゼ基質の３'−末端で残存しなければならない。短いオリゴヌクレオチドがＤＮＡ合成のためにプライマーとして供することを意図しないと仮定すれば、短いオリゴヌクレオチドの３'−末端をブロックして、ヌクレオチドの短いオリゴヌクレオチドへの添加を防止することができる。短いオリゴヌクレオチドがプライマーにハイリダイズするように設計される場合、短いオリゴヌクレオチドの３'−末端をブロックして (すなわち、ビオチンまたはアミノ基で)、短いオリゴヌクレオチドがテロメラーゼ基質として供することを防止すべきである。実施例２に説明するように、種々の他の試薬およびフォーマットを用いて、（１）テロメラーゼ媒介伸長反応の最後に反応混合物を加熱した後にのみ溶融するワックスバリヤーによるプライマーの他の反応成分からの分離；（２）Ｔ４遺伝子３２タンパク（クローンテック (Ｃl1ontech)）の使用；および（３）ＴaqＳt art^TM抗体の使用を含む、高度な特異性を確実にすることができる。当業者は、実施例２に記載の結果を生じるために用いられる試薬が商業的に入手可能であるか、または、オリゴヌクレオチドの場合、商業的に入手可能な計測を用いて調製することができることおよび種々のＤＮＡポリメラーゼ、抗体および一本鎖ＤＮＡ結合タンパクが当該方法で用いられることを認識するであろう。実施例２および第１図に示す結果によって示されるように、ＴＲＡＰアッセイによって評価するように、ＣＨＡＰＳ抽出について１０⁴個の細胞の実施例において用いられた条件について低い限界を伴って（レーン４）、ヒト２９３腎臓細胞からのテロメラーゼポジティブ抽出物を１０⁵個の細胞から慣用的に産生した (第１図Ｅ、レーン３)。１０³個の細胞を表す抽出物の量（１０⁵個の細胞からの抽出物の１％）は、再現可能に、テロメラーゼ活性の検出のための１０²個の細胞等価物の実施例において用いられた条件についての低い限界を伴って (レーン４)、ＴＲＡＰアッセイにおいて明確なポジティブシグナルを与えた (第１図Ｅ、レーン３)。これらの結果は、慣用の方法と比較すると、伸長効率およびテロメラーゼ活性検出の両方における少なくとも１００倍を示し、一緒に１０⁴のファクターによってテロメラーゼ活性の現行の検出可能性を増大させる。１０²個の不死化細胞（第１図Ｅ、レーン４）における検出は、不死化細胞および正常な体細胞間のテロメラーゼ活性における差異が少なくとも３桁の大きさであることを示すが、１０⁵個のＢＪ細胞（レーン１）においては、示さない。当業者は、前記検出限界が慣用的な方法を単に用いる場合にのみ適用され、本発明方法を用いて、典型的に考慮されるルーチンであるものよりも多少大きな試みを使用するのに同意することを条件として、単一細胞においてテロメラーゼ活性を検出することができることを認識するであろう。例えば、テロメラーゼ媒介伸長工程の時間を増加させ、プライマー伸長サイクルの数を増加させて、２、３個の細胞または単一の細胞におけるテロメラーゼ活性を検出するためのアッセイの感度を増加させることができる。実施例２のテロメラーゼ活性アッセイ法を用いて、種々の組織および個体からの種々の不死化細胞系および正常な体細胞培養物におけるテロメラーゼ活性について試験した。第２図は、ＣＨＡＰＳ洗浄剤溶解法（以下の実施例１および３）を用いて調製した同一の１０個の細胞抽出物について行われるＴＲＡＰアッセイ（第２図Ａ）および慣用アッセイ（第２図Ｂ）の比較を示す。いくつかの細胞系（２９３、ＭＣＦ−７／ＡＤＲ−ＲＥＳ、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＯＶＣＡＲ−３、ＣＯＬＯ２０５、Ｍ１４）は、両方のアッセイにおいて活性を示し、他（ＡｓＰＣ −１およびＰＣ−３）は、ＴＲＡＰアッセイにおいてのみ活性を示し、正常な体細胞培養物（ＢＪ、ＩＭＲ−９０および３１ＹＯ）は、いすれのアッセイによっても検出可能な活性を示さない。これらの結果は、ＴＲＡＰ法が慣用的なアッセイによってネガティブを試験する抽出物におけるテロメラーゼ活性を検出することができることを示す。１８種類の組織からの合計７４個の不死化細胞系および２２個の正常な体細胞培養物を含むように、この観測を拡大し、結果を第１表にまとめて示す (以下の実施例３を参照)。正常な体細胞培養物は、ＴＲＡＰアッセイにおいて検出可能なテロメラーゼ活性を示した。７４個の不死化細胞系のうち６８個は、腫瘍誘発系であり、６個は、ウイルス腫瘍タンパクと形質転換した細胞系であった。６８個の腫瘍系の全ては、テロメラーゼ活性を含有した。６個の形質転換系うち２個は、テロメラーゼ活性についてネガティブを試験した。これらの２個の系が不死である場合、検出可能なテロメラーゼ活性の欠失は、予想されない。しかしながら、これらの系におけるテロメア長さの研究は、テロメラーゼが、系が誘導された正常な体細胞のものよりも長いことを示し、これは、細胞がテロメラーゼ活性の一時的爆発を経験したことを示す。テロメラーゼ活性が再開されない場合、細胞は、無限の複製能を有しない。前記結果および以下の実施例１〜３に示すとおり、本発明のＰＣＲベースの具体例は、試料中のテロメラーゼ活性を測定するための現在利用可能な方法よりも有意な改良を提供する。しかしながら、本発明方法の他の新しい変形法は、有意な長所をも提供する。特に、本発明方法を用いて、単位時間当たりに生じたテロメラーゼ産生物の数を提供することによって、試料中のテロメラーゼ活性を定量化することができる。しかしながら、これらの改良の性質を理解するために、まず、第１図および第２図に示すように、実施例２において示すアッセイを用いて得られた結果をより注意深く考慮する。これらの図面から判明するように、アッセイされた試料のゲル電気泳動で生じたバンドのラダーは、ゲルまで伸びる。かかる結果は、テロメラーゼ媒介伸長反応の間にテロメラーゼによって添加した繰返しの数を反映するか、または、ＰＣＲ増幅の間にプラィマーのスタッガード結合（staggered binding）により生じる。「スタッガード結合」なる用語は、伸長テロメラーゼ基質の３'末端を中断したままであり、したがって、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長のために利用可能な方法で伸長テロメラーゼ基質における配列へのプライマーの結合を意味する。したがって、ＤＮＡポリメラーゼは、ヌクレオチドを伸長テロメラーゼ基質の３' 末端に付加することができ、テロメラーゼ媒介伸長工程で生じたものよりも長い分子を生じる。スタッガード結合が実施例２に記載するような反応で生じるかを測定するために、別々のテロメラーゼ伸長産生物を代表する合成オリゴヌクレオチド、例えば、ＴＳ＋４（ＴＳ＋４個のテロメア繰返し）を用いて、特異的な増幅条件を研究した。高いストリンジェンシー下でさえ、下流のプライマーのスタッガードアニーリングが生じた (例えば、４個の繰返しのうち３個によるアニーリング)。故に、別々のテロメラーゼ伸長産生物のＰＣＲ増幅は、ＰＣＲ産生物の６ヌクレオチドラダーを生じ、ゲル分割の限界までサイズを増大させた。かくして、ＣＸなどのプライマーを用いて産生されたＴＲＡＰアッセイ産生物は、プライマー伸長反応の間のプライマーの鋳型へのスタッガード結合のために、該アッセイにおいて生じたテロメラーゼ産生物の長さ分布を直接的に反映していない。かかる相互作用が基質に添加したテロメラーゼよりも多い繰返しを有する産生物を生じることを防ぐためた、アッセイにおいて下流プライマーとして本発明の新規「アンカー」プイマーを用いることができる。オリゴヌクレオチドＡＣＴ（実施例４を参照）は、その５'末端での６ヌクレオチドアンカー配列およびＣＴＲ（Ｃ−リッチテロメア繰返し）配列（５'−ＣＴＡＡＣＣ−３'）の３個の繰返しからなる２４ヌクレオチドオリゴヌクレオチドプライマーである。本発明の目的のために、アンカー配列は、テロメア繰返し配列と相補的でなく、かつ、同一ではなく、プライマー対ＴＳ／ＣＴＲ４またはＴＳ／ＣＸを用いる場合に観察されるような自体での「増殖」からＰＣＲ産生物を防止するＰＣＲプライマーの５ '末端配列である。種々のアンカー配列を用いることができる。１つの具体例では、アンカー配列は、「ＴＳ−アンカー」プライマーを提供する当該方法のテロメラーゼ媒介伸長工程で用いられたテロメラーゼ基質の配列である。かくして、アンカープライマーは、５'から３'への方向で、テロメラーゼ基質配列、および、テロメア繰返し配列の２個以上の相補的コピーからなる。かかるプライマーを用いることによって、プライマー伸長の第１ラウンド後、反応混合物における過剰の非伸長テロメラーゼ基質がプライマー伸長の第１ラウンドの結果として形成された複合物の両方の鎖の合成をプライムすることができるので、実質的に「一プライマー」モードである本発明の方法を行うことができる。ＴＲＡＰアッセイにおいてプライマーＴＳおよびＡＣＴ（または、別のアンカープライマー）を用いることによって、所定の抽出物におけるテロメラーゼのモースト・プロセッシブ・プロダクト（Ｍost Ｐrocessive Ｐroduct）（ＭＰＰ）を論理的に推論することができる。ＡＣＴなどのアンカープライマーの使用は、ＰＣＲの間の長いバージョンへのテロメラーゼ産生物の増殖を防止する。ＡＣＴプライマーについて、最も遅い移動バンドは、ＰＣＲ前の初期テロメラーゼ産生物のＭＰＰの長さを直接反映する。ＡＣＴプライマーは、ＴＳとＣＸおよびＣＴＲ４などのプライマーとの間で見られる当該タイプのプライマー二量体相互作用に対して耐性である点で本発明の目的のために特に好ましい。本発明のＰＣＲベースの具体例は、前記で詳述され、以下の実施例において例示されているが、本発明方法は、プライマー伸長のいずれの方法を用いても行うことができる。ＰＣＲは、プライマー伸長産生物の指数累積のために提供するが、プライマー伸長産生物の直線的累積は、有用な結果を与えることができる。かくして、単一のプライマーを用いることができ、単に、ＰＣＲを用いる場合に産生される二本鎖核酸の単一の鎖の多くのコピーを作製する。さらにまた、かかるコピーは、ポリメラーゼ媒介プライマー伸長以外のものによって作製することができる。好適な方法としては、リガーゼ連鎖反応[バラニィ (Ｂarany)、１９９１、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ（Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ）８８：１８９−１９３]、核酸配列ベース増幅 [コンプトン (Ｃompton)、１９９１、ネイチャー（Ｎature）３５０：９１−９２]、自給配列複製 [ギャテリィ（Ｇuatelli）ら、１９９０、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ８７：１８７４−１８７８]、鎖置換増幅 [ウォーカー（Ｗalker）ら、１９９２、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ８９：３９２ −３９６]、および分枝鎖状ＤＮＡシグナル増幅［アーディア (Ｕrdea)、１９９４年９月１２日、バイオ／テクノロジー（Ｂio／Ｔech.）１２：９２６−９２８］が挙げられるが、後者の方法は、標的核酸とのプローブハイブリタイゼーションにより産生されたシグナルの増幅に関係する。１つの実施例として、ＤＮＡリガーゼを用いて、鋳型核酸とハイブリダイズした２個のオレゴヌクレオチドと一緒に結合することができる。ＰＣＲにおけると同様に二本鎖核酸が変性される場合、結合および変性のプロセスを何回も繰り返して、初期の鋳型、すなわち、伸長テロメラーゼ基質の多くの相補的コピーを累積することができる。さらに、伸長テロメラーゼ基質上での最初の２個のオリゴヌクオレチドの結合によって産生されたコピーと相捕的な２個の他のオリゴヌクオレチドを添加し、ＤＮＡリガーゼがこの２個と結合して、初期の伸長テロメラーゼ基質のコピーを形成することができるようなこれらのオリゴヌクレオチドを選択する場合、ＬＣＲの基本的な成分を有する。説明するために、以下の４個のオリゴヌクレオチド「リゴマー」を用いる本発明の方法でＬＣＲを用いることができる：ＬＣおよびＣＬＴリゴマーは、伸長テロメラーゼ基質にアニーリングし、次いで、ＤＮＡリガーゼと結合して、ＬＴＳおよびＬＧリゴマーの結合のための鋳型を形成した。これらのリゴマーは、２個のリゴマーがアニーリングして、ＤＮＡリガーゼの平滑末端結合活性によって混合物中の別の二本鎖核酸に結合することができる二本鎖核酸を形成することができないように選択した。本発明の方法のプライマー伸長工程がリガーゼ活性によって媒介される場合に、テロメラーゼ基質がテロメア繰返し配列を含まないことを必要としない。当該方法で種々のかかるリゴマーを用いて、鋳型依存性産生物形成を最小にすることができる。テロメラーゼ伸長産生物のＬＣＲ増幅は、均一サイズの増幅産生物を生じ、そこで、定量的分析に行われる。本発明は、試料中のテロメラーゼの量を定量化するための種々の手段を提供するが、ほとんどの目的のために、定量的結果（テロメラーゼ活性が存在または不在）は、充分である。定量的情報を得るための１つの重要な手段は、以下の実施例４で説明するように、公知の量で各反応混合物に添加した対照オリゴヌクレオチド鋳型の使用である。本発明の実例となる対照オリゴヌクレオチドは、５'から３'への順序で、テロメラーゼ基質配列、スペーサー配列 (任意：スペーサー配列の存在、好ましくは、３塩基、ヌクレオチドの配列または長さであるが、テロメラーゼ陽性試料から産生された反応生成物の電気泳動によって生じたラダーの間隔を変更することができる)、テロメア繰返し配列 (典型的には、複数存在、すなわち、２〜５０コピー)、およびアッセイにおいて用いられたプライマーと相補的な配列（簡単にはテロメア繰返し配列の一部である、プライマーがアンカー配列を含む場合、所望により、アンカー配列と相補的な配列）からなる。もちろん、前記で定義した対照配列と相補的なオリゴヌクレオチドは、対照配列として供することができ、二本鎖対照核酸を用いることもできる。この内部対照の使用は、アッセイが適正に行われたかの決定を容易にするだけでなく、試料中に存在するテロメラーゼ活性の定量化を容易にする。別法としては、公知の量で反応混合物にいずれの配列の対照核酸をも添加することができ、伸長テロメラーゼ基質を増幅するために用いたものと異なるプライマーで対照を増幅することもできる。対照オリゴヌクレオチドを増幅させるために用いた対照オリゴヌクレオチドおよび／またはプラィマーを、テロメラーゼ伸長産生物を標識するために使用されるラベルと同様にまたは別に標識することができる。対照オリゴヌクレオチドは、好都合には、他の反応成分を有するキット中に包装することもできる。さらにまた、種々のタイプのオリゴヌクレオチドを対照としてまたは当該方法の工程で用いることができる。前記検討および以下の実施例は、デオキシリボオリゴヌクレオチドテロメラーゼ基質、対照およびプライマーまたはリゴマーを用いて得られた結果を用いておよびＤＮＡリガーゼまたはポリメラーゼを用いて本発明を説明するが、本発明は、限定されるものではない。かくして、プライマー伸長工程で１個以上の修飾（すなわち、合成または非天然）ヌクレオチドからなるリボオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを用いることができる。同様に、プライマーを伸長するため、および、伸長テロメラーゼ基質をコピーするためにＲＮＡポリメラーゼを用いることができる。本発明のこれらおよび他の変更は、本発明のこの説明を考慮して、当業者に明白であろう。プライマー伸長反応の性質と無関係に、種々の試薬を標識して、反応混合物におけるテロメラーゼ伸長テロメラーゼ基質の同定を容易にすることができる。当業者は、本発明の方法が試料におけるテロメラーゼ活性の、伸長プライマーにアニーリングした伸長テロメラーゼ基質からなる二本鎖核酸の形成（反応混合物に存在する）との相互関係を含むが、（１）伸長テロメラーセ基質；（２）伸長プライマー；または（３）（１）および（２）の両方からなる二本鎖核酸の存在下によってかかる分子の存在を推論することができることに気づくであろう。しかしながら、如何なる場合も、典型的には、１個以上の反応生成物中に組み込まれた標識を介して伸長テロメラーゼ基質および／またはプライマーの存在を検出することによってこの相互関係を作成するであろう。例えば、標識ヌクレオシド三リン酸、標識プライマー、または標識テロメラーゼ基質（または、同一のものとの組合せ）を用いることができ、および標識のテロメラーゼ基質またはプライマー伸長産生物中への組込みをモニターすることができる。対照は、同一または異なる標識で標識化される。本発明の目的のために種々の標識を用いることができる。かかる標識としては、典型的には、蛍光標識、リン光標識、ケミルミネッセンス標識および放射性標識が挙げられる。別法としては、該標識は、単に非標識「ｔａｇ」であってもよく、次いで、ｔａｇに結合する標識分子によって認識される。例えば、ｔａｇとしてビオチンを用いることができ、アビジニル化ホースラディッシュペルオキシダーゼ（「ＨＲＰ」）を用いてｔａｇに結合させ、次いで、色素産生性基質（すなわち、ＴＭＢ）を用いてＨＲＰの存在を検出することがてきる。同様に、ｔａｇは、エピトープまたは抗原として用いることができ、蛍光性または放射性標識抗体を用いてｔａｇに結合させることができる。標識の検出は、実施者の要求および用いた特定の標識または検出手段に依存してさらなる工程を含んでもよい。いくつかの場合、実写は、まず、以下に例示するように、ゲル電気泳動を用いてお互いから反応生成物を分離する。他の分離方法、すなわち、クロマトグラフィーを用いることもできるが、いくつかの目的のために、分離は、行われず、伸長テロメラーゼ基質および／またはプライマーの検出は、反応が行われた容器から反応混合物を取り出さずに行われるであろう。本発明の１つの重要な長所は、当該方法の、関心のある検出フォーマットへの適用性である。用いた方法および試薬のこの説明を有すると、研究および診断適用を含む本発明のテロメラーゼアッセイのための適用を考慮することができる。アッセイが迅速かつ簡素であり、単一管反応およびin situ検出に従うので、テロメラーゼ陽性細胞を検出することを必要とする研究および臨床実験装置において該アッセイを用いることがてきる。かかる適用としては、限定されないが、（ｉ）陽性癌細胞の同定のための腫瘍検体における不死化細胞の検出；（ii）不死化剤（例えば、オンコジーン）を含むテロメラーゼを活性化、抑制解除、阻害、または抑制する能力を有する薬剤またはテロメラーゼおよび伸長テロメラーゼおよび細胞の複製寿命を活性化する化合物の細胞ベースまたは無細胞スクリーンにおける同定；（iii）培養系で、または、テロメラーゼ活性を有する体細胞または初期の始原細胞のイン・ビボでの同定；（iv）分化および発育の間のテロメラーゼ調節の試験；（ｖ）テロメラーゼの精製の間に生じたテロメラーゼ陽性フラクションの同定；（vi）原生動物または真菌類感染の同定：および（vii）テロメラーゼ活性の不在によって特徴付けられるある種のタイプの不妊の診断が挙げられる。本発明の診断方法は、起源の細胞または組織タイプと一緒に用いることができ、細胞がテロメラーゼ活性を示すとすれば、起源の不死化細胞を検出するために用いることができる。ヒトの試料について、典型的には、不死化細胞の検出を用いて、限定されないが以下に挙げる充実性（solid）腫瘍および白血病を含む種々のタイプのいずれの癌細胞の存在も検出することができる：アプドマ (apudom a)、分離腫、鰓腫、悪性カルチノイド症候群、カルチノイド心臓病、癌 (例えば、ウォーカー癌、基底細胞癌、基底有棘細胞癌、ブラウン−ピース（Ｂrown−Ｐ earce）癌、腺管癌、エールリッヒ腫瘍、クレブス２、メルケル細胞、粘液性癌腫、非小細胞肺癌、燕麦細胞腫、乳頭状癌、硬性癌、細気管支癌、気管支原生癌、扁平上皮癌、および移行上皮癌)、組織球障害、白血病 (例えば、Ｂ−細胞性白血病、混合型白血病、ヌル細胞性白血病、Ｔ−細胞性白血病、Ｔ−細胞性慢性白血病、ＨＴＬＶ−ＩＩ−関連白血病、リンパ性急性白血病、リンパ性慢性白血病、肥満細胞性白血病、および骨髄性白血病)、悪性組織球増殖症、ホジキン病、免疫増殖症 (immunoproliferative small)、非ホジキンリンパ腫、プラスマ細胞腫、細網組織増殖症、黒色腫、軟骨芽細胞腫、軟骨腫、軟骨肉腫、線維腫、線維肉腫、巨細胞腫、組織球腫、脂肪腫、中皮腫、粘液腫、粘液肉腫、骨腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、滑膜腫、腺線維腫、腺リンパ腫、癌肉腫、脊索腫、頭蓋咽頭腫、未分化胚細胞腫、過誤腫、間葉腫、中腎腫、筋肉腫、エナメル上皮腫、セメント質腫、歯牙腫、奇形腫、胸腺腫、栄養膜腫、腺癌、腺腫、胆管腫、コレステリン腫、円柱腫、嚢胞腺腫、顆粒膜細胞腫、半陰陽性卵巣腫瘍、ヘパトーム、汗腺腫、膵島細胞腫、ライディヒ細胞腫、乳頭腫、セルトーリ細胞腫、胞膜細胞腫、平滑筋腫、平滑筋肉腫、筋原細胞腫、筋腫、筋肉腫、横紋筋腫、横紋筋肉腫、脳室上衣細胞腫、神経節細胞腫、神経膠腫、髄芽細胞腫、髄膜腫、神経鞘腫、神経芽細胞腫、神経上皮腫、神経線維腫、神経腫、傍神経節腫、非クロム親和性傍神経節腫、角化血管腫、好酸球増多随伴性血管類リンパ組織増殖症、硬化性血管腫、血管腫症、グロムス血管腫、血管内皮芽細胞腫、血管腫、血管周囲細胞腫、血管肉腫、リンパ管腫、リンパ管肉腫、松果体腫、癌肉腫、軟骨肉腫、葉状嚢肉腫、線維肉腫、血管肉腫、平滑筋肉腫、白血肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、筋肉腫、粘液肉腫、卵巣癌、横紋筋肉腫、肉腫 (例えば、ユーイング肉腫、実験肉腫、カポージ肉腫、および肥満細胞肉腫)、新生物 (例えば、骨、胸、消化器系、結腸直腸、肝臓、膵臓、下垂体、睾華丸、眼窩、頭部および頸部、中枢神経系、聴覚、骨盤、気道、および尿生殖器)、神経線維腫症、および子宮頸部形成異常。本発明の診断方法では、該アッセイは、高いレベルのテロメラーゼが存在するかを決定するために行われるであろう。「高いレベル」なる用語は、特定細胞におけるテロメラーゼ活性の絶対的レベルがその個体における正常な体細胞と比較して、または、病状に悩んでいない他の個体における正常な体細胞と比較して上昇していることを意味する。一般的に、テロメラーゼ活性の検出可能なレベルは、正常な生後ヒト体細胞組織からの細胞において上昇したと考えられる。高いレベルのテロメラーゼ活性は、生殖細胞中に存在し、低レベルのテロメラーゼ活性は、幹細胞およびある種の造血系細胞において検出することかできるか、かかる細胞は、本発明方法の実施者についての問題を提供しない。生殖細胞は、ヒト体組織試料から容易に区別および／または分離することができ、幹細胞およびある種の造血細胞中に存在するテロメラーゼ活性は、体組織試料中に存在する２、３のかかる細胞がテロメラーゼ活性アッセイからの偽陽性シグナルを生じないように低いレベルで存在する。体細胞におけるテロメラーゼ活性の検出は、あるタイプの癌細胞のような不死化細胞の存在を示し、該検出を用いて、細胞が病理学によって非癌性であると分類される場合でさえ測定を行うことができる。かくして、本発明の方法は、細胞が肉眼的に癌性になる前に高い信頼性をもって癌性症状を検出させる。当業者は、細胞抽出物の使用がほとんどの目的のために好ましいが、無傷細胞を用いることができるような方法を変更できることをも認識するであろう。この具体例では、無傷細胞をテロメラーゼ基質オリゴヌクレオチドで処理し、次いで、細胞が機能性テロメラーゼ活性を有する場合にオリゴヌクレオチドが伸長される。次いで、ポリメラーゼまたはリガーゼ、プライマー、およびヌクレオシド三リン酸（ポリメラーゼを用いる場合）を用いる確立したin situ ＰＣＲおよびＬＣＲ法を固定化細胞上で用いて、テロメラーゼ伸長基質オリゴヌクレオチドを増幅する。次いで、例えば、プライマー伸長の間の標識ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの組込みを用いて顕微鏡によってテロメラーゼ陽性細胞を検出することができる。本発明の診断試験は、他の診断試験と組み合わせて行うこともできる。いくつかの場合、かかる組合せ試験は、疾患の進行に関する有用な情報を提供することができるが、テロメラーゼ活性について試験するための本発明の方法は、これに関して非常に有用な情報を提供する。本発明の方法を用いて患者試料の癌細胞の存在を検出するが、テロメラーゼ活性の存在を用いて、患者が疾患の進行過程にある場合に、特定の腫瘍が隣接組織を侵すと思われるか、または、離れた位置に転移すると思われるか、および癌の発生が再発するかを測定することができる。本発明の方法と組み合わせるさらなる情報を提供する試験としては、エストロゲンレセプター、プロゲステロンレセプター、ＤＮＡ倍数性、Ｓ期における細胞のフラクション、結節性状態、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子産生物、ｐ５３、ｐ１６、ｐ２１、ｒａｓ、および他のオンコジーンについての診断試験が挙げられる。本発明は、本発明の診断方法を行うためのキットを提供するものでもある。かかるキットは、容易に入手可能な物質および試薬から調製することができ、種々の具体例で機能することができる。例えば、かかるキットは、１種類以上の以下の物質のからなり得る：反応管、緩衝液、洗浄剤、オリゴヌクオレチドテロメラーゼ基質、対照試薬、オリゴヌクレオチドプライマー、および指示。本発明の特に好ましいキットは、テロメラーゼ基質およびプライマーを入れた反応管からなる。このキットの好ましい形態は、プライマーがワックスバリヤーによって他の反応成分から分離されるような管からなる。種々のキットおよび成分は、キットの予定された使用者および該使用者の個々の要求に依存して、本発明に従って調製することができる。以下の実施例は、本発明を説明するための本発明の特定の態様を記載し、当業者のために本発明の説明を提供する。該実施例は、単に、本発明の理解および実施において有用な特定の方法を提供するものなので、該実施例は、本発明を限定しようとするものではない。実施例１ＣＨＡＰＳ抽出テロメラーゼの調製この実施例では、本発明の両性イオン洗浄剤ベース抽出方法を用いて調製した細胞抽出物を、慣用のテロメラーゼアッセイを用いてテロメラーゼ活性について試験した。該細胞抽出物は、テロメラーゼ活性を発現することが知られている、アデノウイルスタイプ５ＤＮＡのフラグメントと形質転換したヒト胚体腎臓細胞由来の不死化２９３細胞から調製した。該細胞を、５％〜１０％ウシ胎児血清を含有するジョクリク（Ｊoklik）培地中で増殖させ、次いで、遠心分離により回収し (特記しない限り、以下、該方法は、約１×１０⁶個の細胞を回収したと仮定する)、ＰＢＳ中で１回洗浄し、４℃で１分間、１０,０００Ｘｇでペレット化し、氷冷洗浄緩衝液［１０mＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ (pＨ７.５)、１.５mＭＭgＣl₂、１０mＭＫＣl、１mＭＤＴＴ、ＤＥＰＣ処理水］１mＬ中に再懸濁させた。該細胞を再度ペレット化し、氷冷溶解緩衝液［１０mＭトリス−ＨＣｌ(pＨ７.５)、１ mＭＭgＣl₂、１mＭＥＧＴＡ、１mＭＰＭＳＦ、５mＭ β−メルカプトエタノール、ＤＥＰＣ処理水、０.５％ＣＨＡＰＳ [ピアス（Ｐierce）より入手]、１０％グリセロール］中に細胞１０⁴−１０⁶個当たり溶解緩衝液２０μlの濃度（実験の目的に依存する）で再懸濁させた。該懸濁液を氷上で３０分間インキュベートし、次いで、４℃で３０分間、１００,０００Ｘｇで微小超遠心分離（micro ultracentrifuge）で回転させた。上清を別の管に取り出し、ドライアイスで急速冷凍させ、−７０℃で貯蔵した。これらの抽出物は、典型的には、５〜１０mg ／mlの全タンパク濃度を含有しており、テロメラーゼ活性は、多重冷凍−解凍に対して安定であった。慣用のテロメラーゼアッセイのための方法およびその条件は、１mＭの濃度でオリゴヌクレオチド基質を用いて、以下の文献の記載に従った：カウンター（Ｃ ounter）ら、１９９２；カウンターら、１９９４、ヨーロピアン・モレキュラー・バイオロジー・オーガニゼイション・ジャーナル（ＥＭＢＯＪ.）１１：１９２１−１９２９；およびカウンターら、１９９４、ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ.Ｖirol.）６８：３４１０−３４１４。モリン (Ｍorin)、１９８９、セル（Ｃell）５９：５２１−５２９も参照のこと。該生成物を８％ポリアクリルアミド配列決定ゲル上で分離し、Ｐhosphorimager^TMスクリーン［モレキュラー・ダイナミクス (Ｍolecular Ｄinamics)、カリファルニア州サニーベイル］に一晩暴露した。結果を第１図Ａに示す。異なるゲル寸法のために、第１図Ａと第２図Ｂとの間で生成物分析が異なることに注意する。慣用のアッセイで用いたテロメラーゼ基質は、５'−ＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧ−３'（「 (ＧＴＴＡＧＧ)₃」と略記する；第１図Ａのレーン１を参照）；５'−ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧ−３'（「(ＴＴＡＧＧＧ)₃」と略記する；第１図Ａのレーン２および３を参照）および５'−ＡＡＴＣＣＧＴＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＴ−３'（「ＴＳ」と略記する；第１図Ａのレーン４および５を参照）であった。第１図Ａのレーン３および５で用いた抽出物は、テロメラーゼのＲＮＡ成分を分解し、活性を完全に破壊するＲＮａｓｅ（ＤＮａｓｅ不含、ベーリンガー・マンハイム (Ｂoehringer Ｍannheim)）０.５μgと一緒に抽出物１０μlを２５ ℃で１０分間インキュベートすることによってＲＮａｓｅで前処理した。テロメラーゼは、Ｇトリプレットの最初のＧを添加した後に小休止し、そこで、最初の小休止前に添加したヌクレオチドの数（かくして、ラダーのフェージング）は、 (ＧＴＴＡＧＧ)₃については５であり (レーン１)、(ＴＴＡＧＧＧ)₃については４であり (レーン２)、ＴＳオリゴヌクレオチドについては２である (レーン４；ＴＳ伸長産生物の線図については、第１図Ｂを参照)。第１図Ａによって示されるように、ＣＨＡＰＳ抽出テロメラーゼ活性は、ヒトテロメラーゼについて予想されるように機能した。該物質は、用いた種々のテロメラーゼ基質の各々について予想されるバンドパターンを生じ、該バンドパターンは、該抽出物のＲＮａｓｅによる前処理で完全に破壊された。実施例２テロメラーゼ伸長産生物のＰＣＲ増幅この実施例は、ＤＮＡポリメラーゼを用いてポリメラーゼ連鎖反応におけるプライマー伸長反応を媒介させる本発明のテロメラーゼアッセイ法を説明する。第１図Ｂに示すように、反応成分は、テロメラーゼがテロメア繰返し（第１図Ｂにおいて小文字配列によって示される）を合成することによって伸長し、ＰＣＲ工程において上流プライマーとしても機能するテロメラーゼ基質ＴＳ (その配列は、前記実施例１に記載されている)、および構造が配列５'−(ＣＣＣＴＴＡ)₃ＣＣＣＴＡＡ−３'によって定義される下流プライマ−ＣＸを含む。ＰＣＲの間のＤＮＡ合成は、第１図Ｂにおいて破線矢印で示され、ＣＸプライマーの最適なアニーリングは、垂直線を用いて示され、星印は、ＣＸプライマー／伸長テロメラーゼ基質において設計されたミスマッチを示し、これは、ＣＸプライマーと非伸長ＴＳオリゴヌクレオチドテロメラーゼ基質との間の相互作用を減少させ、故に、プライマー二量体（より正確には、ＣＸプライマー／ＴＳ二量体形成）を最小にする。前記のように、テロメラーゼは、ＴＳオリゴヌクレオチドのような非テロメア配列のオリゴヌクレオチドを伸長することが知られており [モリン (Ｍorin)、１９９１、ネイチャー（Ｎature）３５３：４５４−４５６]、オリゴヌクレオチド基質ＴＳを用いて、ＰＣＲプライマー相補性による非特異的増幅を回避した。プライマー相互作用を回避するための別の変更として、下流プライマーＣＸにおけるミスマッチ、一本鎖結合タンパクＴ４遺伝子３２タンパク、ホットスタートＰＣＲ、および５０℃のアニーリング温度を用いて、この実施例に記載するテロメラーゼ活性アッセイを行った。これらの条件下、特異的増幅は、オリゴヌクレオチド基質が３個以上の５'−ＴＴＡＧＧＧ−３'繰返しで伸長した場合にのみ生じ、ヌクレオチド４０個（最初の増幅可能なテロメラーゼ産生物）からゲル分析の限界まで伸長するＴＲＡＰアッセイ産生物の６ヌクレオチドラダーを生じる。本発明方法の容易さおよび効率を非常に改良するもう１つの重要な変更は、テロメラーゼおよびＤＮＡポリメラーゼの両方が機能することができる新規反応緩衝液の研究に関係する。この緩衝液の使用により、第１図Ｃに示すような、ＴＲＡＰアッセイのための単一管装置またはフォーマットが用いられる。この変更により、ＣＸプライマーが、最初に、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件を媒介する高温でのみ溶融するワックスバリヤーにより反応混合物の残部から分離されるので、プライマー伸長の特異性が増加する。該アッセイ管は、ＣＸプライマー（０.１μg）の懸濁液（５０ng／μl）２μlを添加し、該管の下部に回転させ、Ｓpeed−Ｖac^TM遠心分離器中で乾燥するまで蒸発させることによって調製した。痕跡量のブロモフェノールブルーをＣＸプライマー懸濁液に添加して、サーマルサイクリング前にワックスバリヤーを通る起こり得る漏出をモニターした。この目的のための色素の添加は、本発明の実施のために決して必要なわけではないが、色素添加は、製造工程の完全性をモニターするための慣用方法である。次いで、管を７０℃で加熱し、溶融ワックス［Ａmpliwax^TM、パーキン−エルマー ( Ｐerkjn−Ｅlmer)］７−１０μlを該管中にピペットで移した。該ワックスを室温で固化した後、該管を４℃で貯蔵した。管は、使用前に室温に加温した。アッセイパフォーマンスに対する影響は、２カ月間まで４℃で貯蔵した調製管を用いても観察されなかった；かかる管（およびこれを含むキット）の予想される半減期は、室温でさえ少なくとも１年であると予想される。反応は、典型的には、ワックスバリヤーの上方でのＴＲＡＰ反応溶液５０μl の添加によって行われる。該反応溶液は、２０mＭトリス−ＨＣl (pＨ８.３)、１.５mＭＭgＣl₂、６３mＭＫＣl、０.００５％トゥイーン２０、１mＭＥＧＴＡ、各５０μＭｄＮＴＰ、ＴＳオリゴヌクレオチド０.１μg、０.５mＭＴ４遺伝子３２タンパク、０.１mg／mlＢＳＡ、Ｔaq ＤＮＡポリメラーゼ２ユニット ( 所望により、クローンテック（Ｃlontech）から入手した同量のＴaqＳtart^TM抗体で処理したＴaq ２ユニットを用いて、ホットスタートＰＣＲを行ってもよい) 、およびＣＨＡＰＳ細胞抽出物１−２μlを含有した。生成物の放射性標識のために、該反応物に１０μＣi／μl ³²Ｐ−ｄＧＴＰおよび／または³²Ｐ−ｄＣＴＰ（３０００Ｃi／mmol）０.２〜０.４μlを添加した。テロメラーゼによるオリゴヌクレオチドＴＳの伸長のために２０℃で１０分後、該管をサーマルサイクラー（９６ウエルＳingleblock^TMシステム、エリコンプ (Ｅricomp)）に移して、各サイクルのインキュベーション温度および時間が９４℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、および７２℃で３０秒〜１.５分間であるサイクルを２７サイクル行った。ワックスバリヤーが〜７０℃で溶融すると、ＣＸプライマー（０.１μg）が遊離された。当業者は、この実施例に記載した反応時間、温度、および緩衝液が実施者の要求、用いた特定の基質およびプライマー、ならびに抽出物およびＤＮＡポリメラーゼの供給源によって変わり得ることを認識しているであろう。例えば、テロメラーゼ伸長反応は、テロメラーゼの供給源に依存して、約１０〜約４２℃の範囲の温度で行うことができる。テロメラーゼ反応時間は、用いたプライマー伸長工程の数、試料中にあることが予想されるテロメラーゼの量、および実施者に利用可能な時間に依存して、非常に広範囲に変わり得る。典型的には、テロメラーゼ反応時間は、５〜６０分であるが、この時間は、数時間までであってもよい。同様に、ＰＣＲサイクルは、幅広く変わるサイクル時間および温度からなってもよい。最も簡単なＰＣＲサイクルは、二本鎖核酸変性工程、続く、プライマーアニーリングおよび伸長工程からなる。変性は、典型的には、反応混合物を加熱することによって行われるが、ヘリカーゼ処理などの他の方法を用いることができ、該加熱方法自体は、広範囲の温度で、ＤＮＡを損傷させないが変性させるのに充分な時間行うことができる。同様に、プライマーアニーリングの時間および温度は、反応緩衝液およびプライマー配列、濃度、および組成、ならびに実施者によって必要とされる特異性に非常に大きく依存し、一方、プライマー伸長工程の時間および温度は、用いたＤＮＡポリメラーゼのタイプに非常に大きく依存する。当業者は、本発明が時間、温度、緩衝液のバリエーションならびに該方法で用いることができる他の反応成分によって限定されないと認識し理解するであろう。試料の分析のため、反応混合物の半分を、１５％ポリアクリルアミド非変性ゲル上で、０.５ＸＴＢＥ中、電気泳動に付すことによって分析した。生成物の視覚化は、ゲルの臭化エチジウム染色、銀染色、オートラジオグラフィー、またはＰhosphorimager^TM分析［モレキュラー・ダイナミックス、カリフォルニア州サニーベイル］によるものであった。この実施例に記載のアッセイの第１のセットの結果を第１図Ｄに示す。アッセイのこのセットは、テロメラーゼ活性のためのＴＲＡＰアッセイの特異性を試験するように設計した。第１図Ｄのレーン１は、ＴＳオリゴヌクレオチドを省略した対照試料を含有する；レーン２は、細胞抽出物を省略した対照試料を含有する；レーン３は、不死化２９３細胞抽出物のＴＲＡＰアッセイ試料を含有する；レーン４は、６５℃で１０分間インキュベートすることにより前処理してテロメラーゼを加熱不活化した２９３抽出物の試料を含有する；レーン５は、２５℃で、ＲＮａｓｅ（ＤＮａｓｅ不含、ベーリンガー・マンハイム (Ｂoehringer Ｍannheim)）と一緒に１０分間インキュベートすることにより前処理してテロメラーゼのＲＮＡ成分を破壊した２９３抽出物の試料を含有する；レーン６は、フェノール抽出２９３抽出物の試料（同量のフェノール：クロロホルム混合物（１：１）中で混合し、３０秒間撹拌し、遠心分離して相を分離させ、水性相を回収することによる）を含有する；レーン７は、抽出物（５０μl）をブロメラインプロテアーゼ［ベーリンガー・マンハイム］５μgと一緒に３７℃で１０分間インキュベートすることによってプロテアーゼで前処理し、同量の担体固定化α₂−マクログロブリン［ベーリンガー・マンハイム］と一緒に２５℃で３０分間撹拌しつつインキュベートし、次いで、１０,０００Ｘｇで１０分間遠心分離し (α₂−マクログロブリン／ブロメライン複合物をペレット化する)、分析のために上清を回収することによってブロメラインプロテアーゼを除去した２９３抽出物の試料を含有する；レーン８は、テロメラーゼ活性を欠いているべきである正常な線維芽細胞ＢＪ細胞抽出物を含有する；レーン９は、ＤＥＡＥクロマトグラフィー［モリン、１９９１、ネイチャー（Ｎature）３５３：４５４−４５６］によってテロメラーゼを富化した細胞抽出物を含有する。第１図Ｄに示すように、これらの多重対照実験の結果は、ＴＲＡＰアッセイにおける陽性シグナルが、ＴＳオリゴヌクレオチドを２個以上の５'−ＴＴＡＧＧＧ−３'繰返しで伸長させる能力を有する不死化細胞抽出物においてリボ核タンパクを必要とすることを示し、テロメラーゼ活性の特異的検出のためのアッセイを確認する。ＴＲＡＰアッセイの感度をより厳密に試験するために、アッセイのもう１つのセットを行って、用いた条件下で洗浄剤抽出およびＴＲＡＰ検出の限界を試験した。種々の個数の細胞の抽出のために、溶解緩衝液の量を１００μlで一定に維持した。これらのアッセイの結果を第１図Ｅに示す。レーン１は、１０⁷個の正常線維芽細胞ＢＪ細胞の抽出物からの約１０⁵個の細胞等価物をアッセイした結果を示す；バンドのラダーの不在によって示されるように、活性は観察されなかった。レーン２は、１０⁶涸の不死化２９３細胞の抽出物からの約１０⁴個の細胞等価物をアッセイした結果を示す；テロメラーゼ活性は観察された。レーン３は、１０⁵個の２９３細胞の抽出物からの約１０³個の細胞等価物をアッセイした結果を示す；テロメラーゼ活性は観察された。レーン４は、１０⁴個の２９３細胞の抽出物からの約１０²個の細胞等価物をアッセイした結果を示す；テロメラーゼ活性は観察された。レーン５は、１０³個の２９３細胞の抽出物からの約１０個の細胞等価物をアッセイした結果を示す；活性は観察されなかった。レーン６は、溶解緩衝液のみを有する対照をアッセイした結果を示す；活性は観察されなかった。１０⁶個の２９３細胞からの抽出物の連続希釈のＴＲＡＰアッセイによって、１０²個の細胞におけるテロメラーゼ検出の限界を確認した。この限界は、用いたＴＲＡＰアッセイ条件の関数であり、現行法の感度の絶対的限界よりもむしろ所定の条件下での実施限界を考慮すべきである。また、例えば、ＣＸの代わりにプライマーＣＴＲ３［(５'−ＣＣＣＴＡＡ−３')₃］またはＣＴＲ４［(５'−ＣＣＣＴＡＡ−３')₄］の使用は、感度を増大させるが、これらのプライマーは、非伸長ＴＳプライマーと相互に作用すると思われる。感度の限界は、合成テロメラーゼ産生物ＴＳ＋４（オリゴヌクレオチドＴＳに続いて４個のテロメア繰返しを含有する）の滴定によっても分析された。ＴＳ＋４オリゴヌクレオチドの希釈物を熱処理（テロメラーゼ不活化）２９３抽出物と混合し、ＴＲＡＰアッセイで分析した。この分析において、該アッセイは、ＴＳ＋４の１０⁶個の分子からの明らかな陽性シグナルを与えた。さらに、慣用アッセイによるマウステロメラーゼがほとんど非プロセッシブであることを示す場合でさえ [すなわち、単一の繰返しだけを添加する；プロウズ（Ｐrowse）ら、１９９３、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ（Ｐ roc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ）９０：１４９３−１４９７]、マウス組織（テロメラーゼ活性は、マウスの体細胞中に存在する）および細胞抽出物からのテロメラーゼ活性は、ＴＲＡＰアッセイによって検出された。これは、ＴＲＡＰアッセイが、慣用アッセイによって視覚化することができない非常に低レベルのプロセッシブマウステロメラーゼ活性を検出することを示す。実施者の便宜のため、以下の産生情報が提供される。反応管は、ロビンズ・サイエンティフィック（Ｒobbins Ｓcientific）（カリフォルニア州サニーベイル）からの０.２mlのＳtrip-ease^TM管であり、使用前にオートクレーブ処理した。全てのオリゴデオキシリボヌクレオチドは、キーストーン・ラボラトリー（Ｋey stone Ｌaboratory）（カリフォルニア州メンロ・パーク）から入手した超高純度であり [ＨＰＬＣ精製した]、１mg／mlの濃度でＤＥＰＣ処理Ｈ₂Ｏに懸濁させた。Ｔaq ＤＮＡポリメラーゼ、トゥイーン２０、およびＴ４遺伝子３２タンパクは、ベーリンガー・マンハイムから購入した。放射性同位体は、エヌイーエヌ−デュポン（ＮＥＮ−Ｄupont）から購入した。ｄＮＴＰは、ファルマシア（Ｐharmacia）から購入し、アリコットに分け、−２０℃で貯蔵し、使用前に解凍した（２回以下）。全ての他の反応成分は、分子生物学用であり、特記しない限り、シグマ（Ｓigma）から購入した。ジエチルピロカルボネート（ＤＥＰＣ）処理し、脱イオン化し、滅菌したＨ₂Ｏを慣用的に用いた。実施例３ＴＲＡＰおよび慣用テロメラーゼアッセイの相対的な感度 −− 正常な体細胞および不死化細胞におけるテロメラーゼ活性のアッセイこの実施例は、不死化細胞系および正常な体細胞培養物の細胞試料について行ったテロメラーゼアッセイを記載する。ＢＪ細胞などの粘着細胞培養物、ヒト皮膚線維芽細胞の正常な体細胞培養物は、抽出物調製前に集密度８０％まで増殖した。該アッセイ（反応当たり１０⁵個の細胞等価物）は、前記実施例１および２の記載に従って行い、アッセイの結果を第２図ＡおよびＢならびに下記第１表に示す。ＴＲＡＰアッセイの結果を第２図Ａに示す；慣用アッセイの結果を第２図Ｂに示す。アッセイは、ＣＨＡＰＳ洗浄剤溶解法（前記実施例１および２を参照）を用いて調製した同一の１０個の細胞抽出物について行った。第２図Ａにおいて、偶数レーンは、試料中のテロメラーゼ活性を除去すべきであるＲＮａｓｅで前処理した抽出物についての結果を示す。レーン１および２は、乳癌系ＭＣＦ−７／ＡＤＲ−ＲＥＳについての結果を示す；レーン３および４は、膵臓癌系ＡｓＰＣ−１についての結果を示す；レーン５および６は、前立腺癌系ＰＣ−３についての結果を示す；レーン７および８は、黒色腫系Ｍ１４についての結果を示す；レーン９および１０は、正常包皮線維芽細胞培養ＢＪについての結果を示す；レーン１１および１２は、肺癌系ＮＣＩ−Ｈ２３についての結果を示す；レーン１３および１４は、正常間質線維芽細胞培養３１ＹＯについての結果を示す；レーン１５および１６は、正常肺線維芽細胞培養ＩＭＲ−９０についての結果を示す；レーン１７および１８は、卵巣癌系ＯＶＣＡＲ−３についての結果を示す；レーン１９および２０は、結腸癌系ＣＯＬＯ２０５についての結果を示す；レーン２１および２２は、不死化腎臓細胞系２９３についての結果を示す。第２図Ｂには、慣用アッセイについての結果（反応当たり１０⁶個の細胞等価物）を示す。レーン１は、不死化細胞系２９３についての結果を示す；レーン２は、ＲＮａｓｅ前処理２９３についての結果を示す；レーン３−１２は、第２図Ａにおける奇数レーン１−１９と同じである。いくつかの不死化細胞系（２９３、ＭＣＦ−７／ＡＤＲ−ＲＥＳ、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＯＶＣＡＲ−３、ＣＯＬＯ２０５、Ｍ１４）は、両方のアッセイで活性を示し、その他（ＡｓＰＣ−１およびＰＣ−３）は、ＴＲＡＰアッセイでのみ活性を示し、正常体細胞培養物（ＢＪ、ＩＭＲ−９０および３１ＹＯ）は、いずれのアッセイによっても検出可能な活性を示さない。これらの結果は、ＴＲＡＰ法が慣用アッセイによって陰性を試験する抽出物におけるテロメラーゼ活性を検出することができることを示す。この測定は、１８種類の組織からの７４個の不死化細胞系および２２個の正常体細胞培養物の合計を含むように膨らませられ、結果を以下の第１表にまとめて示す。各分裂細胞培養物を洗浄剤抽出し、ＴＲＡＰアッセイを用いてテロメラーゼ活性について試験した。特異的な不死化細胞系および正常体細胞培養物は、起源の組織によって記載される。試験した不死化細胞系および正常体細胞培養物は、以下のものであった：（１）皮膚 −− 黒色腫 (ＬＯＸＩＭＶＩ、Ｍ１４、Ｍ alme−３Ｍ、ＵＡＣＣ−６２)、正常線維芽細胞 (ＧＦＳ、Ｓ３７ｂ、Ｍalme− ３、ＢＪ)、正常ケラチノサイト (１包皮)；（２）結合組織 −− 線維肉腫 ( ＨＴ−１０８０)；（３）脂肪 −− 脂肪肉腫 (ＳＷ８７２)；（４）乳房 −− 腺癌 (ＭＣＦ７、ＭＣＦ−７／ＡＤＲ−ＲＥＳ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１)、腺管癌 (Ｔ４７Ｄ、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５)、癌 (ＭＤＡ−ＭＢ−１５７、ＭＤＡ −ＭＢ−１７５−ＶＩ、ＭＤＡ−ＭＢ−４３６、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＺＲ− ７５−１、ＺＲ−７５−３０、ＵＡＣＣ−８１２、ＵＡＣＣ−８９３、ＢＴ−２０、ＢＴ−４７４、ＢＴ−４８３、ＢＴ−５４９、ＨＳ５７８Ｔ、ＳＫ−ＢＲ− ３、ＳＣＣ７０、ＳＣＣ３８、ＳＣＣ２０２)、正常上皮および体細胞 (ＨＭＥ：１５、１７、３１、３２、３５)；（５）肺 −− 癌 (ＭＣＩ−Ｈ５２２、ＮＣＩ−Ｈ２３、Ａ５４９、ＥＫＶＫ、１２９９、Ｈ１４６、Ｈ６９、ＮＣＩ− Ｈ４６０、Ｈ３５８、Ｈ１８２)、形質転換したＳＶ４０Ｔ抗原 (ＩＤＨ４、ＳＷ２６−ＩＧ、ＳＷ−２６−Ｃ４)、正常胎児線維芽細胞 (ＧＦＬ、ＩＭＲ−９０、Ｗｉ３８)；（６）胃 −− 胃癌 (ＫＡＴＯ−ＩＩＩ)；（７）膵臓 −− 腺管癌 (ＳＵ.８６.８６)、腺癌 (ＡｓＰＣ−１、Ｃapan−１)；（８）卵巣 −− 癌 (ＯＶＣＡＲ−３、ＯＶＣＡＲ−５、ＩＧＲＯＶ−１)、腺癌 (ＯＶＣＡＲ− ８)；（９）頸 −− 癌 (ＨｅＬａＳ３、Ｃ−３３Ａ、ＨＴ−３)、正常１上皮細胞；（１０）子宮 −− 正常な１子宮内膜細胞；（１１）腎臓 −− 癌 (Ａ４９８、ＣＡＫＩ−１)、Ａｄ５−形質転換胚体腎臓細胞 (２９３)；（１２）膀胱 −− 癌 (５６３７)、移行上皮癌 (Ｔ２４)、扁平上皮癌 (ＳＣａＢＥＲ)、正常胎児 (ＦＨｓ７３８Ｂ１)；（１３）結腸 −− 腺癌 (ＣＯＬＯ２０５、ＳＷ−６２０、ＨＣＴ−１１６)；（１４）前立腺 −− 腺癌 (ＰＣ−３、ＤＵ１４５)、ＳＶ４０形質転換ＢＰＨ線維芽細胞 (ＢＰＨ−１)、正常間質線維芽細胞 (３１ＹＯ)、ＢＰＨ線維芽細胞 (Ｓ５２)；（１５）ＣＮＳ −− 癌 (Ｕ２５１、ＳＮＢ−７５)、神経膠芽細胞腫 (ＳＦ２６８)；（１６）血液 −− 白血病 ( Ｍolt４、ＨＥＬ)、Ｔ−細胞白血病 (ジャーカット)、急性前骨髄球性白血病 ( ＨＬ−６０)、慢性骨髄性白血病 (Ｋ−５６２)、細網肉腫 (Ｕ−９３７)；（１７）網膜 −− ＳＶ４０形質転換色素上皮 (ＡＧＯ６０９６Ａ)；および（１８）関節：正常な滑膜線維芽細胞（ＨＳＦ）。正常体細胞培養物のうち、ＴＲＡＰアッセイにおいて検出可能なテロメラーゼ活性を示すものはなかった。７４個の不死化細胞系のうち６８個は、腫瘍誘導系であり、６個は、腫瘍タンパク（oncoprotein）で形質転換された細胞系であった。６８個の腫瘍系の全ては、テロメラーゼ活性を含有していた。６個の形質転換系のうち２個は、テロメラーゼ活性について陰性を試験した。これらの２つの系が不死化である場合、検出可能なテロメラーゼ活性の欠失は、予想外である。しかしながら、これらの系におけるテロメア長さの研究は、テロメアが、系を誘導した正常体細胞のものよりも長かったことを示した。これは、該細胞がテロメラーゼ活性の瞬間的なバーストを経験したことを示す。テロメラーゼ活性が再び起こらない場合、該細胞は、無期限には複製しないであろう。実施例４テロメア繰返し増幅プロトコール（ＴＲＡＰ）のための標準的な操作方法この実施例は、５つの部分：（Ａ）ワークステーション装備；（Ｂ）プレコーション；（Ｃ）微量抽出；（Ｄ）定量化アッセイ；および（Ｅ）分析における本発明のＴＲＡＰアッセイを行うための段階的なプロトコールを提供する。記載された方法は、活性の定量化分析のために準備し、多くの推奨がなされるが、当業者は、用いた条件および望まれる結果の性質に依存して、全ての情況において全ての推奨に従う必要は全くない。Ａ．ワークステーション装備ＴＲＡＰアッセイの装備における重要な因子は、最初の反応混合物がＰＣＲ工程前に調製される環境である。理想的な環境は、各々、間違った陰性および陽性の結果を生じ得るリボヌクレアーゼおよびＰＣＲ増幅ＤＮＡ生成物の汚染を含まない。主なＰＣＲ産生物（およびＲＮａｓｅ）汚染源は、実験を行う人であり、高い標準の個人衛生を維持し、ＰＣＲ産生物を開放する際もしくはピペットで移す際、またはＰＣＲ産生物の電気泳動後にゲル緩衝液を処分する際にＰＣＲ産生物のエアゾールの発生を回避すべきである。試料を超えて研究者に向かって濾過空気を送風するポジティブ空気置換フード（positive air displacement hood）が理想的である。分離溶液、ピペット、管、およびチップは、常に、フードの内側で用い、保持すべきである。作業空間は、反応のセットアップ前に１０％ブリーチで拭くべきであり、該フードは、使用しない場合には、慣用的に、ＵＶ照射すべきである。ピペットのバレルもまた、エアロゾル耐性チップを用いる場合でさえ、１０％ブリーチ中に定期的に浸漬すべきである。研究者は、グローブおよび弾性リストストラップを有する使い捨て実験コートを身につけるべきである；該実験コートは、定期的に変えるべきである。ＴＲＡＰ反応をセットアップするための専用作業空間は、標準的なカビィホール型デスク上に、ＶＷＲからの４５.７cm（Ｌ）×３０.５cm（Ｗ）×６１cm（Ｈ）サイズのアクリル製シールド（カタログ番号＃５６６１５−８４８）を置くことによって作製することができる。該テスクの上部は、厚板または重い布によって覆われ、前面は、該シールドによってブロックされている。この配置は、保温隙間を作り出し、この場合、汚染物質が外部から作業空間中へ入るのを防ぎ、該試料は、研究者から物理的に遮断される。全ての溶液、ピペット、チップおよび管は、ステーションの内側に維持され、作業空間は、慣用的に、該ステーションの上部に設置した短波ＵＶランプによってＵＶ照射される [ブラック・レイ・ユーブイ・ランプ (Ｂlack ＲayＵＶ lamp)、ＸＸ−１５Ｓ、ＶＷＲカタログ番号＃３６５７５−０５９]。（Ｂ）プレコーション前記のように、および、ＴＲＡＰアッセイがＰＣＲ増殖およびリボ核タンパク（テロメラーゼ）のイン・ビトロ活性の使用の両方を取り入れているので、共に該アッセイに不利益となり得るＰＣＲ産生物汚染（ＤＮＡ）およびＲＮａｓｅ汚染を防止するように厳重な注意か必要である。テロメラーゼ抽出およびＰＣＲ増幅工程を含むアッセイプロトコールの全ての工程において以下の基本的なプレコーションを行い、問題を回避することができる：（１）全ての溶液についてＤＥＰＣ処理Ｈ₂Ｏを使用し、使用前に少量の溶液をアリコートに分取する；（２）該アッセイ溶液（ＰＣＲ緩衝液、ＣＨＡＰＳ抽出緩衝液、ｄＮＴＰ、Ｔａｑポリメラーゼなど）を実験室中の他の試薬から分離させておく；（３）グローブを身につける；（４）アッセイのためのピペッターおよびエアゾール耐性チップ（ＡＲＴ）の専用セットを使用する；および（５）該試料を調製すると同一の空間中で増幅試料を分析しない (すなわち、アッセイ試薬およびピペット／チップが置かれている同一のベンチ上でのＰＣＲ増幅後にＰＣＲ管を開放しない；代わりに、ＰＣＲベンチから離れた位置で他のピペッター（所望により、ＡＲＴを有しない）を使用する)。（Ｃ）微量抽出微量抽出工程で用いる溶解緩衝液についての物質要求条件を以下に示す。微量抽出工程は、以下の工程を含む：１．細胞計数を確立させ、該細胞をペレット化させ、該細胞をＰＢＳ（ＣaおよびＭgを含まない）中で２回洗浄し、再ペレット化し、ＰＢＳを除去する。２．洗浄緩衝液に細胞を懸濁させ、該細胞を再ペレット化する。３．洗浄緩衝液を除去し、細胞１０⁶−１０⁴個当たり溶解緩衝液２０μl（適用に依存する）に細胞ペレットを再懸濁させる。４．氷上で３０分間細胞をインキュベートする。５．４℃で２０分間、１００００Ｘｇでマイクロセントリフュージ［エッペンドルフ (Ｅppendorf)］中で細胞を回転させる。６．別の管に抽出物を取り出し、ＴＲＡＰアッセイ当たり１〜２μlを用いる；所望により、ドライアイス上で残存物を急速冷凍し、−７０℃で貯蔵することができる。（Ｄ）定量アッセイ当該アッセイのために以下の物質を推奨する：ＴＲＡＰワックスバリヤー反応管；ＡＣＴプライマー (５'−ＧＣＧＣＧＧ[ＣＴＡＡＣＣ]₃−３'、１００ng／管)；２.５mＭｄＮＴＰ [ファルマシア (Ｐharmacia)]；末端標識ＴＳプライマー（Ｍ２、０.１mg／ml）；Ｔａｑポリメラーゼ［ベーリンガー・マンハイム］；および１０ＸＴＲＡＰ緩衝液。ＡＣＴ−ＩＣは、特に、Ｍ２（ＴＳ）テロメラーゼ基質（およびＰＣＲプライマー）およびＡＣＴプライマーについて設計された配列：５'−ＡＡＴＣＣＧＴＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＴＡＧＣＣＣＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＣＣＧＣＧＣ−３'の内部対照オリゴヌクレオチドである。アンカー配列と相補的な配列の存在が任意であること、内部対照中に存在するこの配列を有しないのが望ましい場合があることに注意すべきである。このオリゴヌクレオチド内部対照の存在（ＡＣＴ−ＩＣの最終量は、ＴＲＡＰ反応５０μl当たり５〜１０amol［１０^-3fmol］であろう）は、ＲＮａｓｅ処理または非抽出物対照に関係なく、ＴＲＡＰアッセイの第１および第２産生物の間にゲル上にバンドとして出現する特異的なＰＣＲ増幅産生物を生じる。この内部対照バンドを用いて、種々の試料からのＰＣＲ増幅を標準化し、末端標識ＴＳオリゴヌクレオチド基質／プライマーと合わせて用いた場合に生じたテロメラーゼ産生物の数を算出することができる（以下の分析を参照）。反応混合物を調製するために、以下の物質を、ワックスバリヤー下に乾燥ＡＣＴプライマー０.１μgを含有するＴＲＡＰ反応管中で混合する。任意成分としては、Ｔ４遺伝子３２タンパク（５mg／ml、ベーリンガー・マンハイムから入手可能）０.２μlおよびＴaqＳtart^TM抗体（クローンテック（Ｃlo ntech）から入手可能）０.４μlが挙げられる。当該反応は、以下の工程に従って行われる：１．室温（２０℃）で１０分間、反応混合物をインキュベートする；２．以下の温度で所定の時間：９４℃／３０秒、６０℃／３０秒、および７２ ℃／３０秒、反応混合物をインキュベートして、ＰＣＲを行い；この３工程サイクルを２０〜３０回、好ましくは２７回繰り返す；３．ブロモフェノールブルーおよびキシレンシアノールを含有する充填染料を添加し、ブロモフェノールブルーがゲルを流し出すまで、試料を０.６ＸＴＢＥ中１０〜１５％非変性ＰＡＧＥに付す（ベーリンガー・マンハイムからの分子マーカーＶは、このゲルについての良好なＤＮＡマーカーである）；４．例えば、Ｐhosphorimager^TMスクリーン（放射性標識のため）または他の適当な検出手段によって産生物形成を観察する。（Ｅ）分析前記に概略記載したプロトコールを用い、内部対照をテロメラーゼ基質抽出産生物と同一の効率で増幅させると仮定し、式（Ｔ＝レーン当たりの合計数）：[( ＴＴＲＡＰ産生物− ＴＡＣＴ−ＩＣ）／ＴＡＣＴ−ＩＣ］×（添加したＡＣＴ−ＩＣの分子数）に従って、所定の反応で生じたテロメラーゼ分子の数を評価することができる。得られた数は、所定のインキュベーション時間（通常、１０分）に生じたテロメラーゼ産生物の分子の数である。この計算は、ＴＳ基質が末端標識された場合にのみ有効であり、（ＡＣＴプライマーおよび内部対照が用いられる場合でさえ）放射性ｄＮＴＰの直接組込みが検出のために用いられるＴＲＡＰプロトコールに適用されない。これらの条件は、試料間のＰＣＲ増幅で起こり得る変化について考慮し、そこで、標準的な測定法を提供する。抽出物が非常に高レベルのテロメラーゼ活性を有する場合、ＡＣＴ−ＩＣからのシグナルは、検出をするのがより困難になり得る。というのは、この方法は、テロメラーゼ産生物と内部対照とが共に同一プライマーについて競争する「競合ＰＣＲ」に関係するからである。すなわち、該プライマーは、正確に言うと、定量分析のための鋳型よりも過剰に存在すべきである。したかって、試料が非常に高レベルのテロメラーゼ活性を有する場合、ＰＣＲプライマーが制限されないように抽出物を希釈することができる。別法として、既知量で該反応混合物にいずれの配列の対照核酸を添加することもでき、該対照を、伸長テロメラーゼ基質を増幅するために用いられたものと異なるプライマーで増幅させることができる。対照オリゴヌクレオチドを増幅するために用いられる対照オリゴヌクレオチドおよび／またはプライマーを、テロメラーゼ伸長産生物を標識化するために用いられた標識と同一にまたは該標識とは異なって標識することができる。前記実施例は、本発明の種々の態様および本発明が実施され得る方法を記載している。該実施例は、本発明の多くの異なる具体例の完全な記載を提供するものではない。前記の全ての刊行物および特許出願は、出典明示により本明細書の一部とする。かくして、前記発明は、理解の明瞭さのために説明および実施例により多少詳細に記載されるが、ある種の変化および変更が以下の請求の範囲の精神または範囲から逸脱せずに行われることは、本発明の教示に照らして当業者に容易に明らかであろう。

【手続補正書】【提出日】１９９６年７月５日【補正内容】補正した請求の範囲１．細胞試料がテロメラーゼ活性を含有するかの判定方法であって、（ａ）細胞試料から細胞抽出物を調製し；（ｂ）テロメア繰返し配列を欠いているテロメラーゼ基質、およびテロメア繰返し配列の付加によってテロメラーゼがテロメラーゼ基質の伸長を触媒することができる緩衝液からなる反応混合物中に細胞抽出物のアリコットを入れ、（ｃ）伸長テロメラーゼ基質が反応混合物中に存在する場合にテロメア繰返しと充分に相補的な配列からなるプライマーが該伸長テロメラーゼ基質にハイブリダイズし、伸長して、伸長テロメラーゼ基質の相補的コピーを形成するような条件下、該反応混合物に該プライマーを添加して、それに特異的にハイブリダイズさせ、次いで、（ｄ）伸長プライマーと結合した伸長テロメラーゼ基質からなる二本鎖ＤＮＡ分子が存在する細胞試料におけるテロメラーゼ活性の存在と、二本鎖ＤＮＡ分子が存在しない細胞試料におけるテロメラーゼ活性の不在との相互関係を示すことからなることを特徴とする、細胞試料がテロメラーゼ活性を有するかの判定方法。２．工程（ｃ）が、さらに、（１）反応混合物を加熱して、二本鎖ＤＮＡ分子を変性させ；次いで、（２）相補的核酸がハイブリダイズすることができ、かつ、伸長テロメラーゼ基質が存在する場合にプライマーが伸長することができる温度に該反応混合物を冷却する工程を含む請求項１記載の方法。３．加熱および冷却工程が少なくとも５回繰り返され、該プライマーが各冷却工程の間に伸長プライマーの形成のために充分な量で存在する請求項２記載の方法。４．鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼが反応混合物中に存在し、プライマーが、ＤＮＡポリメラーゼにより、ヌクレオチドのプライマーへの添加によって伸長される請求項２記載の方法。５．鋳型依存性ＤＮＡリガーゼが反応混合物中に存在し、プライマーが、ＤＮＡリガーゼにより、オリゴヌクレオチドリゴマーのプライマーへの結合によって伸長される請求項２記載の方法。６．熱安定性鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼが反応混合物中に存在し、プライマーが、ＤＮＡポリメラーゼにより、ヌクレオチドのプライマーへの添加によって伸長される請求項２または３記載の方法。７．熱安定性鋳型依存性ＤＮＡリガーゼが反応混合物中に存在し、プライマーが、ＤＮＡリガーゼにより、オリゴヌクレオチドリゴマーのプライマーへの結合によって伸長される請求項３記載の方法。８．細胞抽出物が非イオンまたは両性イオン洗浄剤からなる緩衝液中で細胞試料中の細胞を溶解させることによって調製される請求項３記載の方法。９．細胞試料がヒトの細胞試料である請求項３記載の方法。１０．プライマーが、最初に、ワックスバリヤーによって細胞抽出物と分離されており、次いで、反応混合物が加熱されて、該ワックスバリヤーが溶融され、該プライマーが反応混合物に添加される請求項２、３または６記載の方法。１１．反応混合物が標識テロメラーゼ基質を含有する請求項２、３、６または１０記載の方法。１２．反応混合物が標識プライマーを含有する請求項２、３、６、１０または１１記載の方法。１３．反応混合物が標識または非標識のヌクレオチド三リン酸を含有する請求項２、３、６、１０、１１または１２記載の方法。１４．標識が蛍光性原子、放射性原子、リン光性原子およびケミルミネッセンス標識からなる群から選択される請求項１１、１２または１３記載の方法。１５．標識がビオチン、エピトープおよび抗原からなる群から選択される請求項１１、１２または１３記載の方法。１６．テロメラーゼ基質およびプライマーが、プライマー伸長工程の間に該基質と該プライマーとの二量体を形成するような結合を実質的に行わない配列を有する請求項６記載の方法。１７．プライマーが該プライマーの５’−末端で非テロメア繰返し配列を有する請求項６記載の方法。１８．プライマーが少なくとも２個のテロメア繰返し配列を有する請求項６記載の方法。１９．テロメア繰返し配列を欠いているテロメラーゼ基質がオリゴヌクレオチドＴＳである請求項２、３、６、１０、１１、１２または１３記載の方法。２０．プライマーがＣＸである請求項２、３、６、１０、１１、１２、１３または１９記載の方法。２１．標識または非標識のテロメラーゼ基質および標識または非標識のプライマーからなるテロメラーゼ活性測定用試薬。２２．ワックスバリアーを含有する請求項２１記載の試薬。２３．標識または非標識のヌクレオチド三リン酸を含有する請求項２１または２２記載の試薬。２４．ＤＮＡポリメラーゼを含有する請求項２１、２２または２３記載の試薬。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号０８／２５５，７７４ (32)優先日 1994年６月７日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号０８／３１５，２１４ (32)優先日 1994年９月28日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ (72)発明者ワインリッチ，スコット・ローレンスアメリカ合衆国94123カリフォルニア州、サンフランシスコ、ゴーフ・ナンバー５・ 2929番

Claims

【特許請求の範囲】１．細胞試料がテロメラーゼ活性を含有するかの判定方法であって、（ａ）細胞試料から細胞抽出物を調製し；（ｂ）テロメア繰返し配列を欠いているテロメラーゼ基質、およびテロメア繰返し配列の付加によってテロメラーゼがテロメラーゼ基質の伸長を触媒することができる緩衝液からなる反応混合物中に細胞抽出物のアリコットを入れ、（ｃ）伸長テロメラーゼ基質が反応混合物中に存在する場合にテロメア繰返しと充分に相補的な配列からなるプライマーが該伸長テロメラーゼ基質にハイブリダイズし、伸長して、伸長テロメラーゼ基質の相補的コピーを形成するような条件下、該反応混合物に該プライマーを添加して、それに特異的にハイブリダイズさせ、次いで、（ｄ）伸長プライマーと結合した伸長テロメラーゼ基質からなる二本鎖ＤＮＡ分子が存在する細胞試料におけるテロメラーゼ活性の存在と、二本鎖ＤＮＡ分子が存在しない細胞試料におけるテロメラーゼ活性の不在との相互関係を示すことからなることを特徴とする、細胞試料がテロメラーゼ活性を有するかの判定方法。２．工程（ｃ）が、さらに、（１）反応混合物を加熱して、二本鎖ＤＮＡ分子を変性させ；次いで、（２）相補的核酸がハイブリダイズすることができ、かつ、伸長テロメラーゼ基質が存在する場合にプライマーが伸長することができる温度に該反応混合物を冷却する工程を含む請求項１記載の方法。３．加熱および冷却工程が少なくとも５回繰り返され、該プライマーが各冷却工程の間に伸長プライマーの形成のために充分な量で存在する請求項２記載の方法。４．鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼが反応混合物中に存在し、プライマーが、ＤＮＡポリメラーゼにより、ヌクレオチドのプライマーへの添加によって伸長される請求項２記載の方法。５．鋳型依存性ＤＮＡリガーゼが反応混合物中に存在し、プライマーが、ＤＮＡリガーゼにより、オリゴヌクレオチドリゴマーのプライマーへの結合によって伸長される請求項２記載の方法。６．熱安定性鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼが反応混合物中に存在し、プライマーが、ＤＮＡポリメラーゼにより、ヌクレオチドのプライマーへの添加によって伸長される請求項３記載の方法。７．熱安定性鋳型依存性ＤＮＡリガーゼが反応混合物中に存在し、プライマーが、ＤＮＡリガーゼにより、オリゴヌクレオチドリゴマーのプライマーへの結合によって伸長される請求項３記載の方法。８．細胞抽出物が非イオンまたは両性イオン洗浄剤からなる緩衝液中で細胞試料中の細胞を溶解させることによって調製される請求項３記載の方法。９．細胞試料がヒトの細胞試料である請求項３記載の方法。１０．プライマーが、最初に、ワックスバリヤーによって細胞抽出物と分離されており、次いで、反応混合物が加熱されて、該ワックスバリヤーが溶融され、該プライマーが反応混合物に添加される請求項３記載の方法。１１．反応混合物が標識テロメラーゼ基質を含有する請求項３記載の方法。１２．反応混合物が標識プライマーを含有する請求項３記載の方法。１３．反応混合物が標識ヌクレオチド三リン酸を含有する請求項３記載の方法。１４．テロメラーゼ基質およびプライマーが、プライマー伸長工程の間に該基質と該プライマーとの二量体を形成するような結合を実質的に行わない配列を有する請求項６記載の方法。１５．プライマーが該プライマーの５’−末端で非テロメア繰返し配列を有する請求項６記載の方法。１６．プライマーが少なくとも２個のテロメア繰返し配列を有する請求項６記載の方法。１７．プライマーおよびリゴマーが、最初に、ワックスバリヤーによって細胞抽出物と分離されており、次いで、反応混合物が加熱されて、該ワックスバリヤーが溶融され、該プライマーが反応混合物に添加される請求項７記載の方法。１８．テロメア繰返し配列を欠いているテロメラーゼ基質がオリゴヌクレオチドＴＳである請求項９記載の方法。１９．プライマーがＣＸまたはＡＣＴである請求項９記載の方法。２０．標識が放射性原子、蛍光性原子、リン光性原子、レセプターに対するリガンド、ビオチン、およびアビジンからなる群から選択される請求項１２記載の方法。