JPH09502258A

JPH09502258A - 腎結石症における新規な臨床マーカー、治療剤および使用方法

Info

Publication number: JPH09502258A
Application number: JP7502979A
Authority: JP
Inventors: ウィリアムシー．ジュニア．トーマス; クリストファーディー．バティッチ; ダニエルエル．ピュリッチ
Original assignee: ユニバーシティーオブフロリダ
Priority date: 1993-06-18
Filing date: 1994-06-17
Publication date: 1997-03-04
Also published as: US5376553A; WO1995000844A1; US5719138A; EP0704057A1; US5601804A; US5604103A; US5550259A

Abstract

(57)【要約】ジクエン酸環状エステル（ジクエン酸）は、特発性腎結石症の兆候または疾病素質を示さない健常者に見いだされる、新規な化合物である。ジクエン酸は、新規なクロマトグラフィー法により単離および検出される。さらに、ジクエン酸環状ジエステルを患者に予防的および治療的に投与することにより、いくつかの型の腎結石症を含む石灰化に関する疾病、または金属イオンの存在に関連するその他の疾患あるいは状態を予防または減少させることができる。ジクエン酸の示す金属イオンを錯体化する性質もまた、キレート化剤、および物質中の金属イオンに結合しその量を減少させる方法としての、本発明の化合物の使用に応用できる。

Description

【発明の詳細な説明】腎結石症における新規な臨床マーカー、治療剤および使用方法本発明は、「国立衛生研究所（National Institutes of Health）助成金番号P 01-DK20586」で政府の支援を受け、そして「復員軍人医療センター、ゲーンスビル(Gainesville)、フロリダ州」からの支援を受けている。政府は、本発明において一定の権利を有する。関連出願の相互参照本出願は、1994年6月18日に出願された係属中の出願番号08/080,017号の一部継続出願である。発明の背景腎結石症は、米国における一般的な疾患であり、増加傾向にあることが示されている。1950年には、この疾患を患う米国人は千人あたりわずか0.95人であると推計された。1984年までに、この数は千人の米国人あたり1.64人にまで増加した。「Boyce,W.H.，（1979）米国における結石症の疫学、第18回国際泌尿器科学界 C.M.大会、パリ、会議報告書(Kongressbericht)、第1巻、79〜86ページ」参照。 Sierakowskiらは、1978年の報告で、米国全住民の約12％が一生の間に少なくとも一回は結石症を患うであろうと推計している(Sierakowski,R.,B.Finlayson,R. R.Landes,C.D.Finlayson,N.Sierakowski[1979]Invest.Urol.16:438=441)。この推計値は、腎結石症の発症率の増加に伴い、実質的に増加していることが予想される。腎結石症のもっとも多い型は、石灰性および特発性のものであり、ほとんどが白人男性に起こる。このように、腎結石症の発症率は性および人種の違いに関係することが知られている。地理および食生活による要因も、発症率に影響しうる。正常な生体石化作用（例えば、骨や歯の形成）とは異なり、シュウ酸カルシウム尿路結石症は病的な作用による。この作用は広く研究されているが、この疾患の適当な治療法は、一般の臨床家にとって高度に複雑で不確実なものである。「Thomas、Jr.、W.C.、[1976]腎結石症：治療入門、Charles C.Thomas、出版社、スプリングフィールド、イリノイ州、ページ177」を参照。さらに、腎結石症は患者にとって極めて激しい苦痛を伴う。結石の通過は、結石による機械的な刺激により腎臓の疝痛、腎臓組織の破壊を引き起こし、そして尿流の閉塞により背部の圧痛を引き起こす。また、何らかの異物が存在すると、感染の危険が増す。尿路内での結晶化は、日和見的であり、そしてきわめて随意的である。小さいクリスタライトの形成は、石灰性結石の塩を除去するための正常な腎機能である。異常な状態はおそらく、無制御な結晶の凝集および／または結晶の細胞への結合／保持が原因である。結石症は、尿路内のクリスタライトの結合を防ぐことができない場合に起こる。さらに他の細胞の破壊物および溶質の生体石化および付着成長が、結果的に、流れを閉塞する腎結石を作り出す。無制御のシュウ酸の生合成（高シュウ酸尿症）、リン酸レベルの上昇（リン酸塩尿症）、およびシュウ酸を多く含む食物の過剰摂取などのいくつかの要因は、結石形成を増悪させうるが、胆石症はいまだに発生原因が不明の疾患である。病的なシュウ酸カルシウム生体石化から起こる腎結石症の予防は、米国の健康管理においてかなり費用がかかっている。例えば、年間の約500,000人の米国居住者の入院および手術、またさらに外来患者の体外衝撃波砕石治療の費用は、30 億ドルと推計される。これらの数字には、治療または回復の間の失業期間は含まれていない。Davisら(Davis,G.K.,N.B.Cummings,B.Finlayson,J.L.Meyer,M.J.V. Smith[1974]"Urollthiasis",in Geochemistry and the Enviroment,Natl.Acad.S ci.,Washington,pp.133-138)は、本国のみで年間15,000,000人近くという失業日数を算出しており、これは換算すると約56,000人年の生産性の減少に相当する。さらに経済効果について表現すると、56,000人の労働力は約130,000人から150,0 00人の都市全体の生産性に相当する。従って、このような疾患を、結石が形成される前であっても、検出し治療するための簡便、正確、かつ再現性の高い方法が、腎結石症の治療において大いに貢献することは明らかである。従来、腎結石形成の検出または腎結石症の治療のための方法が、記述されているが、本発明とは全く異なるものである。例えば、米国特許第5,137,722号には、シュウ酸カルシウム結石病の治療のための抽出物および薬剤学的組成物に関する記載がある。抽出物は、植物、日本ビワ(Eriobotrya japonica)より精製される。抽出物は、シュウ酸含有化合物を全く含まない。米国特許第4,399,003号には、患者がシュウ酸カルシウム型の腎結石を発症する傾向があるかどうかを診断するための方法およびキットに関する記載がある。その方法は、正常な尿の参照標準物と比較した、患者の尿検体中のカルシウムイオン濃度の減少の割合を測定することを含む。この方法は、患者の尿中のカルシウムイオン濃度を直接測定しない以下に記述する診断法とは実質的に異なる。米国特許第4,888,182号もまた、カルシウム腎結石の治療および予防のための方法および組成物に関して記述している。対照的に、本発明の方法は、182号において記載されているクエン酸塩およびそのイオン性塩の使用法とは明確に区別される、新規の化合物および使用方法を含む。結石形成者の小集団（例えば、高シュウ酸尿症の患者、腎尿細管性アシドーシスの患者、急性高カルシウム症の患者）を除く、本発明が関係する特発性腎結石形成者のはるかに多い集団を特徴づけるための、単一の基準または一そろいの基準は明確には定義されていない。尿路結石症を区別するためのいくつかの有効な診断法が、科学または医学文献に記載されている。例示すると、Zhmurovの研究によって(Zhmurov,V.A.[1991]Ur ol.Nefrol-Moscow May-June(3):12-15)、結石形成者の尿中のリン脂質構成の変化が見いだされ、Azouryらの研究によって([1990]Urolog.Res.18:7-11)、健常者および結石形成者の尿検体を区別するための核磁気共鳴のプロトン緩和速度(PRR )が使用されることが報告された。Zhmurovらの方法は、リン脂質構成の複雑なパターンの変化の分析が明らかに不利である。Azouryらの方法に関しては、核磁気共鳴装置が高額であることが、臨床実験室において一般的に利用されない主な要因である。 Zhmurovらの手法もAzouryらの手法も、市販の診断法としては確立されていない。さらに根本的なこととして、ZhmurovらおよびAzouryらにより報告された変化は、腎結石が存在することまたはジクエン酸環状ジエステルが存在しないことに対する、二次的な病態生理学的反応に関連している可能性があり（以下の考察を参照）、一般的に結石症の発生以前に適用することはできない。ある特定の患者で見出される特定の型の結石は、主に結晶形成を抑制するために通常存在する阻害剤の欠損によって生じる。いくつかの化合物が、結晶形成の阻害に寄与する因子として提唱されている。例えば、Schreierらは、尿中のシュウ酸カルシウム結晶形成を阻害する活性の約半分が5000ダルトン以下の化合物に依存し、活性の一部が二リン酸およびクエン酸に依存することが示されたと報告している。グリコサミノグリカン(GAGs)、リボ核酸(RNAs)、および糖タンパク質という、3種類の高分子量の阻害剤は全阻害の約40％を担う。阻害活性の残りは、化学的に未決定の化合物に依存する。このように、様々な化合物が潜在的な腎結石阻害剤として提唱されている(Schreier,E.E.,K.E.Lee,J.L.Rubin,P.G.Werne ss,L.H.Smith[1979]"Macromoleculer Inhibitors of Calcium Oxalate Crystal Growth and Aggregation in Urine",In Oxalate in Human Biochemistry and Cl inical Pathology(G.A.Rose et al.,eds),London,The Welcome Foundation,pp22 -610)。尿はセメントをうまく硬化させないということが、何十年も前より知られている。本発明者らの一人は、カラムクロマトグラフィを用いた、尿からの、セメント硬化を阻害すると思われる分画の単離を記述している。セメントの硬化能を減少させるクエン酸化合物が合成されたが、化合物の正確な構造は決定されていない。化合物は、60年近く前に記述されたビタミンCの調製法によりパイナップルから単離された、水溶性のジ−、トリ−、またはテトラメチルクエン酸とは異なることが決定されている。「Bose,P.K.,S.N.Bhattacharyya(1936)Science and C ulture 2:162」を参照。さらに、セメント硬化の阻害における化合物の役割、および腎結石症との関連は決定されていなかった(Thomas,Jr.,W.C.[1988]Md.Med.J .Kidey Disease 17:403-413)。また、この化合物が天然の阻害物質に相当するかどうか、あるいは、この化合物が単一の化学物質であるかどうかもわかっていなかった。しかも、石灰性結石症が何らかの単独の代謝物質の欠如と確実に関連があるはずだということを示すような証拠は全く得られなかった。結石の阻害物質としての役割を提唱しようとしたこれらの研究による不確かな性質は、後の研究により証明され、引き続きタンパク質、特に糖蛋白質がシュウ酸カルシウム結晶の形成の阻害に重要な役割を果たすことが提唱された。しかし、クエン酸、リン酸、ピロリン酸、グリコサミノグリカン、ネフロカルシン(nephrocalcin)、タム−ホースフォール(Tamm-Horsfall)タンパク質、ウロポンチン(uropontin)、などのいくつかの物質の疫学研究では、これらの物質のうちのいずれも、石灰性結石症のための明白な単独の決定マーカーとしては用いることができないということが示された。したがって、腎結石の疾病素質を有する患者を同定するための予想診断法の開発が、それらの疾病素質を有する患者の予防を行うことにより費用を軽する手段を提供するために必要である。よって、以下に述べるような単独の明白なマーカーは、当業者に実質的に貢献する。発明の簡単な要約本発明は、新規な化合物、ジクエン酸環状ジエステルまたはそのアナログ、誘導体、代謝前駆体、代謝物、または塩の存在の有無に基づき、健常者および腎結石形成患者を区別する方法に関する。健常者にこの化合物が存在し、そして結石形成患者には存在しないということは、診断法としてそれを使用できるという明らかな利点を提供する。わずか2〜3mlの尿中のジクエン酸環状ジエステルの含量を分析することにより、結石の症状の発現前に結石形成に対する疾病素質を診断することができる。例えば診断の目的に用いられるキットには、実質的に純粋な新規化合物またはそのアナログ、誘導体、代謝前駆体、代謝物、または塩が含まれうる。本発明の化合物はまた、クエン酸と、例えばジシクロヘキシルカルボジイミド (dicyclohexylcarbodiimide)などの脱水剤との反応を用いた新規な方法により合成される。さらに、本発明の化合物、またはその誘導体、代謝物、または塩、および本発明の化合物を含む組成物は、例えば腎結石病のような石灰化に関連する疾患の治療に適用可能な石灰化阻害のための新規な方法において用いられうる。本発明の化合物の金属イオンを錯体化する性質を利用して、有害な部位における遊離金属イオンの濃度を減少させることが、本発明のもう一つの目的である。このように、いくつかの疾患、または金属の毒性あるいは汚染に関連する遊離金属イオンと結合しその量を減少させる、錯体化剤としての本発明の化合物の使用も、本発明に含まれると考えられる。錯体化剤は、金属イオンの存在により引き起こされる食物の変色の阻害剤としても有用である。図面の簡単な説明図１は、合成ジクエン酸環状ジエステル（8.3分）およびクエン酸（6分）のHP LC曲線である。約4分のピークは、注入または溶液のピークである。図2aは、健常者より得た尿検体のHPLC溶出曲線である。図2bは、結石病患者より得た尿検体のHPLC溶出曲線である。発明の詳細な開示本発明者らは、腎結石症の兆候または疾病素質を示さないヒトの尿中に新規な尿代謝物を発見した。本発明者らの発見により、ハイドロキシアパタイト結晶形成に対する主要な尿中の阻害剤は、2,000ダルトン以下の分子量を有し、以下のような構造式で表されるクエン酸を多く含む酸性化合物であるということが証明された。図中において、R₁、R₂、R₃、およびR₄は同じであっても異なっていてもよく、OH 、O-(CH₂)_nCH₃(nは1〜50)、O-アリル、NH、N、アルキル、またはN-アリルである。X₁およびX₂は、同じであっても異なっていてもよく、OまたはNHである。好ましい態様として、化合物はジクエン酸環状ジエステルであり、R₁＝R₂＝R₃＝R₄＝ OHそしてX₁＝X₂＝Oである。ジクエン酸環状ジエステルは、本明細書において「ジクエン酸」とも記述し、ジクエン酸環状ジエステル、およびそのアナログ、誘導体、代謝物、または塩を意味する。これらの本発明の化合物のアナログ、誘導体、代謝前駆体、代謝物、または塩は、当業者により容易に理解されうる。例えば、代謝前駆体とは、本化合物の環化していないモノ−またはジエステル、またはペプチド、補酵素、あるいはその他の体内で生物学的に変換もしくは代謝されて化合物から切断される分子に関連もしくは結合した、化合物もしくはその前駆体を含む本発明の化合物の原型と理解される。クエン酸の自己エステル化により形成される本発明の化合物には、環化していない二量体、および三量体またはその他の多量体も含まれる。新規化合物は、新規のクロマトグラフィー操作を用いて単離するか、または本明細書に述べたような化学的またはバイオテクノロジー的な操作により合成することができる。新規ジクエン酸環状ジエステルの化学合成において、クエン酸および脱水剤、例えばジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダゾール(carbonyld iimidazole)、その他のジイミドを基本とした剤など、が出発物質として用いられる。ジエステルを合成するには、ジイミド化合物およびクエン酸を典型的には 1:2の比で供給する。クエン酸をジイミドの二倍モル以下の量で、例えば1:1以下での比で供給すると、ジクエン酸モノエステル中間体が形成される。モノエステルは、体内での代謝過程においても中間体として形成されうる。新規化合物は、テトラヒドロフラン(THF)の存在下で脱水反応により合成できる。好ましくは、クエン酸およびTHFは無水物の形で供給される。この反応において用いられるその他の化合物は、当業者により理解される。例えば、酒石酸、イソクエン酸、または3-アミノクエン酸などのその他のカルボキシ酸、がジクエン酸の構造アナログを作成するための出発原料としてクエン酸と共に用いられる。ピリジンなどのその他の溶媒、および様々な水性緩衝液も、THFの代わりに、またはTHFに添加して用いられる。生物学的試料中の本発明の化合物の存在を検出するための、新規な方法についても記述する。好ましくは、生物学的試料は、生物学的試料中の不純化合物からジクエン酸環状ジエステルを実質的に分離する、除去段階としての分離操作にかけられる。生物学的試料とは、典型的には尿または血液であるが、ジクエン酸が検出可能な程度に存在する、唾液などの消化液、リンパ液、またはその他の細胞内あるいは細胞外液もしくは組織を含む、その他の体液でもよい。分離法には、カラムクロマトグラフィーの利用が含まれ、それにはさらに、ゲル浸透カラムで尿などの試料から標的化合物を分離する第一段階が含まれる。典型的には、セファデックスG-25を固定相として用いたクロマトグラフィーカラムが、この第一段階で標的化合物を吸着するために用いることができる。化合物は、塩溶液、好ましくは炭酸アンモニウムのような炭酸塩溶液により固定相から溶出される。クエン酸含有分画は、それからイオン交換カラムクロマトグラフィーによりさらに分離される。クエン酸含有分画は、比色定量により決定することができる。クエン酸に関連する電荷のために、イオン交換クロマトグラフィ操作の固定相としては陰イオン交換樹脂が好ましい。それから、イオン交換カラムから溶出したジクエン酸分画を、二度目のゲル浸透カラムに通過させ、溶出し、そして凍結乾燥する。凍結乾燥した残渣を、次の検出のために水に再溶解する。検出は好ましくは、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)分析による。典型的なHPLC溶出曲線を図１に示す。図１において、ゼロ吸光度以上の3つのピークは、溶液または注入のピーク（溶出時間2〜4分）、クエン酸のピーク（6分で最大）、そしてジクエン酸環状ジエステルのピーク（8.3〜8.6分に存在）である。これらの分離および検出方法を健常者および結石患者からの尿試料へ適用することにより、ジクエン酸ジエステルのピークが腎結石患者からの試料には存在しないことが観察された（図2a〜2bを参照）。尿中のジクエン酸環状ジエステルの存在の決定は、完全に盲検法により行い、全ての例において、健常者では顕著にジクエン酸環状ジエステルのピークが表れたが、腎結石患者では溶出曲線の基線以上のジクエン酸環状ジエステルのピークが表われなかった。さらに、腎結石患者に付加的にクエン酸を経口投与した場合、クエン酸ピークは顕著であったが、クエン酸摂取量を比較的多くしても、ジクエン酸環状ジエステルは表れなかった。このように、ジクエン酸環状ジエステルの有無は、個人が腎結石を発症しやすいかどうかを診断するための有益な、貴重な決定因子である。以下に限定されないが、動脈硬化におけるアテローム形成、微小血管の血栓として現れる血液の凝固系亢進、骨の棘突起形成や歯石形成などの骨におけるカルシウム沈着、および胆石の発生を含むその他の疾患状態にも病的な石灰化作用が含まれ、そしてこれらも本発明の目的の病的な石灰化状態であると考えられる。ジクエン酸環状ジエステルは、臨床マーカーとして、そしてこれらの状態の治療のために用いることができる。好ましくは、ジクエン酸環状ジエステルの存在は、本明細書に述べた新規なHPLC法により検出される。しかしながら、体液中のジクエン酸環状ジエステルの検出法には、以下に限定されないが、吸着／イオン交換クロマトグラフィー、比色定量、電気泳動、紫外／可視／赤外／ラマンスペクトル、ガスクロマトグラフィ、質量分析、および免疫化学的、生化学的手法を含むその他の方法の利用も含まれる。これらの検出法には、分析前にジクエン酸の誘導体を作成することも含まれる。別々に梱包されたジクエン酸、前駆体、代謝物、または反応体を含むキットは、病的な石灰化状態の診断および治療において有益に用いられうる。例えば、ジクエン酸の存在を診断する比色定量試験は、中性4M ヒドロキシアミンおよび塩化鉄溶液を含むキットとして梱包されうる。試験する生物検体をヒドロキシアミンと混合した後、塩化鉄溶液を添加すると約540nmで検出される発色反応生成物が得られる。ジクエン酸環状ジエステルの検出は、化合物の直接的または間接的な検出より得られる。例えば、ジクエン酸環状ジエステルの代謝前駆体または中間体、またはそれらの代謝産物の検出は、化合物自体の検出と同様に行うことができる。さらにジクエン酸の生合成を触媒する酵素の検出、またはジクエン酸を代謝して分解する酵素が存在しないことの検出もまた、ジクエン酸の有無を検出するために有効に用いることができる。新規な化合物、またはそのアナログ、誘導体、または塩に対する抗体、またはジクエン酸の生合成あるいは生体変化に関わる代謝酵素に対する抗体を作成することができるということも理解される。抗体作成の操作は当業者にとって標準的なものであり、当業者により容易に実施されうる。例えば、ジクエン酸そのものに対する抗体を作成するか、または化合物をハプテンとして用い受容可能な免疫原である担体に結合させ抗体を作成することができる。これらの抗体は、アフィニテイクロマトグラフィーなどの精製過程、イムノアッセイまたは診断のキット、治療、および抗体が典型的に用いられるその他の方法および過程に有用である。ジクエン酸を検出するための特異的抗体を使用する試験には、化合物、またはハプテン−担体結合体の化合物特異的部分に対する抗体の認識すなわち結合が含まれる。抗体は放射能や酵素マーカーなどのいかなる手段によっても標識でき、または標識をした二次抗体によりさらに認識させることも可能である。ジクエン酸環状ジエステルは、ハイドロキシアパタイトおよびシュウ酸カルシウム結晶形成の強力な阻害剤である。本発明者らの実験により、結石形成の少なくとも一段階（すなわち、原基形成、成長、凝集、腎尿細管表面への結晶沈着）がこの新規な腎石灰化阻害剤により遮断されることが示された（実施例５を参照）。腎結石病およびその他の病的な石灰化作用の新規な治療は、ジクエン酸ジエステル、そのアナログ、代謝物、誘導体、または塩の投与により達成される。このようにジクエン酸は、特発性腎結石症またはその他の病的な石灰化を含む石灰化作用の予防または治療に有用である。病的な石灰化による疾患、またはその兆候を有する患者の治療は、これらの患者に対して、有効量の、化合物そのもの、または新規な化合物、その前駆体、アナログ、誘導体、代謝物、または塩を含む組成物を投与することにより行われる。これらの組成物に用いられる化合物は、生物学的供給源から単離および精製するか、化学的に合成するか、バイオテクノロジーを用いて作成することができる。好ましくは、新規な化合物は経口または非経口により治療投与されるか、食事の補助物質として供給される。しかし、以下に例示したように、新規化合物のその他の投与経路も用いることができる。 Fe(II)、Fe(III)、Al(III)などの金属イオンのキレート化により高親和性の錯体が生成するため、キレート化活性を示すジクエン酸環状ジエステルは、病的な状態に関連するこれらおよびその他の遊離金属イオンの濃度を制御する、すなわち低下させるための金属イオン錯体化剤として有用である。異常な遊離金属イオン濃度に関連する病態には、例えばウィルソン病、アルツハイマー病、および心臓発作や脊髄損傷の患者に頻繁に見られる再潅流損傷が含まれる。金属イオンを錯体化する方法は、カドミウム、鉛、ストロンチウム、砒素などで見られる、動物またはヒトにおける重金属中毒の治療にも用いることができる。本発明の化合物は、環境の重金属汚染を含む、遊離金属イオンに結合し、それによりその濃度を減少させるための錯体化剤として用いることができる。例えば、ジクエン酸は治療薬として、または化合物を生物学的または環境的な物質に接触させることにより、重金属が存在するかもしれない水、土壌、または大気のような環境的な物質から重金属イオンを除去するためのフィルターとして、用いられうる。ある遊離金属イオンは食物を変色させることも知られている。したがって、ジクエン酸は、食物中の遊離金属イオン濃度を減少させ、それにより食物を変色させる作用を阻害する錯体化剤として使用することができる。これらの遊離金属イオン錯体化剤としてのジクエン酸の使用における方法は、当業者により容易に理解されるであろう。以下は、本発明の実施のためのもっとも好適な態様を含む操作を説明する実施例である。これらの実施例は、本発明を限定するためのものではない。特に断らない限り、パーセントとはすべて重量により、溶液の混合物の割合はすべて体積による。実施例1−尿または血清検体からのジクエン酸環状ジエステルの単離 24時間にわたり集めた尿（各検体をあわせ、採取の間は冷蔵保存した。）の一部を、G-25ゲル浸透カラムに通過させた。検体は5mM炭酸アンモニウムで溶出し、クエン酸含有分画を比色定量で同定し、集め、そして凍結乾燥した。検体を水に再び溶解し、ダウエックス(Dowex)AG-1X8陰イオン交換クロマトグラフィカラムに通過させた。検体を炭酸アンモニウムの濃度を増加させながら（100mMから7 00mMまでの直線勾配）溶出し、クエン酸含有分画を再び集め凍結乾燥した。固体を水に再溶解し、二度目のセファデックスG-25カラムに通過させ、そしてクエン酸含有分画を集め凍結乾燥した。20mlの検体血清について同様の操作を用い、主要な石灰化阻害分画を得た。実施例2−高速液体クロマトグラフィー分析上記のクロマトグラフィー法により得たクエン酸含有分画を0.5〜1.0mlの水に再溶解し、ヘウレット−パッカード(Hewlett-Packard)1090a 高容量液体クロマトグラフを用いて、C-18逆相クロマトグラフィーカラムにかけた。検体は、トリフルオロ酢酸の1パーセント（体積／体積）アセトニトリル溶液で等電的に溶出し、214nmの紫外吸光度により検出した。実施例3−生物検体中のジクエン酸環状ジエステルの検出上記の分離操作の後の、患者の尿検体のHPLC分析で、腎結石患者ではジクエン酸環状ジエステルが全く現れなかった。健常者および結石患者での測定の結果を図2aおよび図2bに示した。さらに実験を盲検法により行い、その結果を一人または複数人で解読した。すべての例において、健常者では明確なジクエン酸環状ジエステルのピークが現れ、一方腎結石患者では溶出曲線の基線以上に区別できるジクエン酸環状ジエステルのピークは現れなかった。食事に比較的高濃度のクエン酸ジエステルを添加した腎結石患者でも、HPLC分析でジクエン酸環状ジエステルのピークはやはり現れなかった。したがって、腎結石患者にジクエン酸環状ジエステルが存在しないのは、利用できるクエン酸前駆体の減少が原因ではない。さらに、2人の尿酸結石（石灰性の腎結石とは必ずしも関連しない）の患者では、尿中にジクエン酸環状ジエステルが観察された。上皮小体機能亢進症の結果としてシュウ酸カルシウム結石を形成する患者も、尿中にジクエン酸環状ジエステルを有することを見いだした。このように、ジクエン酸環状ジエステル決定因子は、特発性シュウ酸カルシウム尿石症のマーカーとして用いることができ、そして特発性結石形成をその他のホルモン関連性の腎結石病と区別する。これらの実験の結果は、以下の表1に示した。本発明者らの実験結果は常に健常者と腎結石患者を分離し、そしてそれは腎結石患者の検出に本発明が利用できることを証明する。実施例4−その他の石灰化作用に対するジクエン酸の適用ジクエン酸化合物、および化合物の検出に関わる使用法またはその予防もしくは治療のための治療法について、主に腎結石に関して本明細書に記述した。その他の重要な特発性石灰化作用に対しても、ジクエン酸の検出または投与は有用である。それらには、以下の状態が含まれるが、これに限定されるものではない。 A.凝集血液の凝集は、内因系および外因系凝固機序両方を担う多くのカルシウム活性化酵素にとって必須の活性化剤である、カルシウムイオン濃度に対してきわめて感受性が高い。ヒトにおける正常なカルシウム状態は、二つのホルモン性因子により効果的に維持される。：(a)骨カルシウム動員を阻害し、血中カルシウムイオン濃度の上昇を抑制するカルシトニン；および(b)骨質を溶解する破骨細胞を動員してカルシウムを血中へ放出し、そして腎尿細管におけるカルシウムイオンの再吸収を促進する副甲状腺ホルモン。イオン性カルシウム（すなわち、未結合のCa²⁺）は、もっとも可能性の高いフィードバックシグナルであるため、血中のカルシウムイオンに結合する代謝物は、低カルシウム剤として作用し凝固を抑制することができる。従来のように、腎結石患者にジクエン酸環状ジエステルが存在しないということが認識されていないことにより、凝固系亢進は促進される。このように、健常者の血液中の正常なジクエン酸濃度と比較して、腎結石患者の血液中のジクエン酸濃度が増加しているということは、凝固の抑制に有用であるかもしれない。凝固系亢進の阻害は、血栓症に対する公知の治療法または予防法である。したがってジクエン酸は、血管形成術、および患者の凝血を抑制する必要のあるその他の操作において、凝固を阻害するために臨床で典型的に用いられるヘパリン硫酸の特に重要な代用品となりうる。 B.動脈硬化動脈の硬化（または動脈硬化）は、石灰化を含む、循環を妨げる病気である。一例は、動脈の中膜(middle layer)(または中膜(medla))の病的な石灰化の後に血管内に脂肪沈着が形成される、脈管内膜性の動脈硬化症である。もう一つの形態の動脈硬化は、石灰化のみならず血管内の損傷組織の形成の結果としても起こる。最終的に、石灰化が進み、血管の内部が硬化するにつれ、血管の弾力性が喪失し、そしてそれに付随して血圧が上昇する。ジクエン酸環状ジエステルは病的な石灰化を抑制するため、本発明者らの、ジクエン酸が健常者に存在するという発見は、この剤を健常者の動脈硬化の抑制に用いることができるということを示している。したがって、血中のジクエン酸濃度の上昇は、動脈硬化の過程および程度を阻害することができる。 C.磨歯剤／歯石阻害口内洗浄剤口内の病的な石灰化は歯周病の原因となるため、様々な磨歯剤および口内洗浄剤にピロリン酸塩が処方され、それが遊離のカルシウムに結合しそれにより歯における結石形成のための熱力学的な駆動力を減少させる。ジクエン酸環状エステルが従来認識されていなかった天然の病的な石灰化阻害剤であるという本発明者らの発見は、磨歯剤および口内洗浄用の組成物が、結石沈積の予防において有益な治療であり得るということを示している。さらに、ジクエン酸は二つの異なる方法（すなわち、遊離カルシウムイオンへの結合、および石灰化表面への結合）により作用するため、この代謝物は、ピロリン酸のようなカルシウムイオン結合性のみの薬剤と比較して、有利な性質を提供しうる。実施例5−ジクエン酸の治療以外への適用ジクエン酸の有利なカルシウム結合性を考慮すると、臨床に関わる当業者にも臨床に関わらない当業者にも、ジクエン酸またはジクエン酸を含む組成物が治療以外の適用において利用できるということが理解されよう。例えば、実験科学、または血液製剤の分析、採取、あるいは利用に関する当業者は、採血管、静脈内または動脈内カテーテルで、または行っている作業にとって血液凝固が有害であるような適用において、抗凝固剤としてジクエン酸を用いることができる。また、石灰化作用の阻害は、医療以外の分野にも有用である。例えば、特に給水中に高濃度のカルシウムが存在する地理的な地域では、水管や配管設備の内壁における石灰化が問題となりうる。ジクエン酸はカルシウムイオンに結合するという有利な性質を有し、それにより水管などの内壁におけるカルシウム沈着を防止することができる。ジクエン酸を含む組成物は、石灰化作用の開始を防ぐために、水路に適用するか、または水管や配管設備へ塗布したり取り込ませたりすることができる。このように、ジクエン酸およびジクエン酸を含む組成物は、これらの非病理学的な石灰化作用を防ぐための方法にも用いることができると本発明者らは考える。遊離カルシウムイオンまたはカルシウム塩の沈着に関連するその他の石灰化作用もまた、本発明のジクエン酸により阻害することができる。実施例6−ジクエン酸環状ジエステルの合成無水クエン酸（5ミリモル、960mg）およびジシクロヘキシルカルボジイミド（ 10ミリモル、2.06g）を、30ml無水テトラヒドロフラン中で１時間攪拌した。つづく脱水反応の間に形成されたジシクロヘキシル尿素結晶は、濾過により除去し、そして濾過液を真空乾燥し、ジエステル含有固体残さを得た。クエン酸とジシクロヘキシルカルボジイミドのジクエン酸への合成的変換は、 HPLC溶出特性と質量分析両方により確認した。図1に示したように、ジクエン酸とクエン酸は明確なクロマトグラフィー特性を有し、付加的なジクエン酸のイオン性電荷は、それに対応してアイソスクラチック溶出での保持時間の増大を引き起こす。さらに、分子イオンの質量は、イオン性試料のレーザー脱着を装備したフィニガン(Finnigan)飛行時間型四重極分析計を用いて348.1であった。この値は、ジクエン酸環状ジエステルの構造を基に予測した質量に一致する。実施例7−ジクエン酸の石灰化阻害ジクエン酸は、二つの異なる石灰化試験において強力な効力を示した。まず本発明者らは、カルシウムとリン酸の過飽和溶液での腱の石化試験を用いた(Thoma s,W.C.,Jr.,A.Tomita［1967］Am.J.Pathol.51:621-628)。3〜5mMクエン酸もしくはジクエン酸の存在下または非存在下で、カルシウムイオン(3〜7mg/liter)およびリン酸(2〜5mg/liter)を含む緩衝溶液中で、鉱化のためのマトリックス物質としてウシアキレス腱を用いた。この試験において、ジクエン酸は同濃度のクエン酸より、鍵のコラーゲン繊維における結晶形成の阻害の効果が12〜14倍高かった。二つ目の石灰化プロトコルとして(Antinozzi,P.A.,C.M.Brown,D.L.Purich［19 92］J.Crystal Growth 125:215-222)、塩化カルシウムとシュウ酸カリウムを0.1 M塩化ナトリウムと0.01M N,N'-ヒドロキシエチルピペラジン−エタンスルホン酸 (pH6.5)を含む緩衝溶液に、18の相対過飽和度（すなわち、シュウ酸カルシウムイオン活量を平行溶解度積で割ったもの）で添加した。5mM ジクエン酸が存在すると、同濃度のクエン酸の5〜8倍、シュウ酸カルシウム結晶化の速度が阻害された。実施例8−処方本発明の化合物は、様々な非治療目的および治療目的に有用である。本発明の化合物が、腎結石形成の阻害およびその他の石灰化作用に関連する疾患に有効であることは明らかである。本明細書においては、特発性腎結石症の制御を例として特別に取り上げる。新規化合物およびそれを含む組成物の治療への適用は、現在当業者に知られているまたは将来的に知られるであろういかなる好適な治療の方法および技術によっても達成されると考えられる。さらに、本発明の化合物は、他の有用な化合物および組成物の調製のための出発物質または中間体として使用される。上記に示したような宿主への投与量は、石灰化症の同定、および患者の年齢、健康、および体重、さらにもしあれば併用治療、治療の頻度、治療の比、などの要因に依存する。本発明の化合物は、薬剤学的に有用な化合物の調製のための既知の方法に従い、処方化されうる。処方化は、当業者によく知られた、そして容易に利用できる数多くの出典に詳細に記述されている。例えば、「E.W.MartinによるRemington の薬剤科学(Remington's Pharmaceutical Science)」は、本発明に関して用いられうる処方化について記述している。一般的に、組成物の効果的な投与を促進するために、有効量の生物活性を有する化合物を好適な担体に結合させて、本発明の組成物は処方化される。本発明の化合物は、好適な量の有効成分を含む錠剤、軟膏、カプセル、丸剤、散剤、エアロゾル、顆粒、内服用液剤または懸濁液などの様々な形態で有利に用いられる。これらの組成物は、本明細書においてそして付随の請求の範囲において、一般的に「薬剤学的組成物」と記述する。典型的には、それらは単位投与量の形態であり、すなわちヒトまたは動物の対象への単位投与量として好適な単位ごとに物理的に区別されている。その各単位は、一つまたは複数の希釈体または担体などの薬剤学的に許容される他の成分との関連において、所望の治療効果または予防効果を生み出すように計算した、あらかじめ決められた量の有効成分を含む。薬剤学的な成分がエアロゾルである場合、有効成分は、共溶媒、湿潤剤などの補助剤を含む、カーボンジオキシド、窒素、プロパンなどのガスとともに高圧エアロゾル容器に充填されうる。薬剤学的組成物が軟膏である場合、有効成分はカカオ脂、ビスコースポリエチレングリコール、硬化油などの希釈基剤と混合され、そしてその混合物は必要であれば乳化されうる。本発明に従い、薬剤学的組成物は、有効成分として、一つまたは複数の非毒性の薬剤学的に許容される成分または担体を含む。本発明において用いられるこのような担体の例としては、エタノール、ジメチルスルホキシド、グリセロール、シリカ、アルミナ、澱粉、および等価な担体および希釈体が挙げられる。有効量は、このような組成物が用いられる条件の変化により様々に変化するが、活性に必要な最小量は約50マイクログラムである。目的の治療にこの投与量を供給するためには、本発明の新規な薬剤学的組成物は、担体または希釈体を含む組成物の総重量に対する一つまたは複数の新規化合物の総重量が約0.01％と約50％の間、特に約％0.1と約30％の間であるのが有利である。投与される有効成分の投与量レベルを例示すると、動物の体重に対して、静脈注射で0.01から約20mg/kg、腹腔内注射で0.01から約100mg/kg、皮下注射で0.0 1から約100mg/kg、筋肉内注射で0.01から約100mg/kg、経口投与で0.01から約100 mg/kg、経皮投与で0.01から約500mg/kgそして好ましくは0.01から約20mg/kg、鼻腔内滴下で0.01から約20mg/kg、そしてエアロゾルで0.01から約20mg/kgである。本発明の化合物は、治療を必要とする対象に対して、非経口投与、経口投与、または局所投与される。活性を有する化合物は、生理食塩水、または平衡塩溶液のような生理学的に許容される液体と混合されうる。そして、錠剤やカプセルのような固体処方は、当業者に知られた腸溶コーテイングまたはその他の賦形剤を用いて作成されうる。本発明の化合物は、例えば、静脈注射、筋肉内注射、腹腔内注射、鼻腔内投与、経皮投与、または皮下注射により適用される。本発明の化合物は、強力な治療法を提供するために、その他の物質と組み合わせることも可能である。本明細書に記述した実施例および態様は、具体的に説明するためのものであり、これを考慮して様々な修飾または変化が当業者により提唱されうる。そしてそれらは、本発明の意図および範囲内であり、請求の範囲の範囲内である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｄ 241/18 8615−4ＣＣ０７Ｄ 241/18 319/12 9454−4Ｃ 319/12 Ｇ０１Ｎ 31/00 0276−2ＪＧ０１Ｎ 31/00 Ｖ 33/53 0276−2Ｊ 33/53 Ｓ (72)発明者ピュリッチダニエルエル. アメリカ合衆国フロリダ州ゲインズビルナインティーファーストストリート 750 エス．ダブリュー.

Claims

【特許請求の範囲】１．以下の段階を含む、患者の病的な石灰化状態を検出するための方法。 (a)患者から生物検体を得ること。 (b)患者のジクエン酸環状ジエステルの存在の有無を決定するために検体を分析すること。２．患者がヒトである、請求の範囲１記載の方法。３．生物検体が尿である、請求の範囲１記載の方法。４．分析段階(b)に高速液体クロマトグラフィーを用いる、請求の範囲１記載の方法。５．生物検体を少なくとも一つの分離操作にかける段階を含む、請求の範囲１記載の方法。６．分離操作がカラムクロマトグラフィーである、請求の範囲６記載の方法。７．分離操作が以下の段階を含む請求の範囲６記載の方法。 (i)生物検体をゲル浸透カラムクロマトグラフィーにかける。 (ii)段階(i)からの溶出液をイオン交換クロマトグラフィーにかける。 (iii)段階(ii)からの溶出液を二度目のゲル浸透カラムクロマトグラフィーにかける。８．ジクエン酸環状ジエステル、またはそのアナログ、誘導体、代謝前駆体、代謝物、あるいはそれらの塩のいずれかである、石灰化作用を阻害する化合物。９．以下の構造を有する請求の範囲８記載の化合物。図中において、R₁、R₂、R₃、およびR₄は同じであっても異なっていてもよく、OH 、nが1から50までであるO(CH₂)_nCH₃、O-アリル、NH、N-アルキル、またはN-アリルのいずれかであり、X₁およびX₂は同じであっても異なっていてもよく、OまたはN Hのいずれかである。１０．化合物が以下の構造を有する、請求の範囲８記載の化合物。１１．ジクエン酸環状ジエステル、またはそのアナログ、誘導体、代謝前駆体、代謝物、あるいはそれらの塩を適用することまたは投与することを含む、石灰化を阻害する方法。１２．ジクエン酸環状ジエステル、またはそのアナログ、誘導体、代謝前駆体、代謝物、あるいはそれらの塩の有効量を患者に投与することを含む、病的な石灰化状態を治療する方法。１３．病的な石灰化状態が腎結石症、動脈硬化、血液凝固または凝固系亢進、胆石、骨カルシウム沈着、歯石からなる群から選ばれた疾患として出現するものである、請求の範囲１２記載の方法。１４．治療が患者への経口投与を含む、請求の範囲１２記載の方法。１５．経口投与が食事の補助物質の形態である、請求の範囲１４の方法。１６．ジクエン酸環状ジエステル、またはそのアナログ、誘導体、代謝前駆体、代謝物、あるいはそれらの塩、および薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物。１７．反応液中で、反応生成物を生成する好適な溶媒中のクエン酸および脱水剤を反応させ、そして反応生成物を単離することを含む、ジクエン酸環状ジエステルを合成する方法。１８．単離段階が、反応液中で生成したジクロロヘキシル尿素結晶を除去することを含む、請求の範囲１７記載の方法。１９．ジクロロヘキシル尿素結晶の除去後、反応生成物を含む残渣を得るために反応液を乾燥することを含む、請求の範囲１８記載の方法。２０．反応生成物がジクエン酸環状ジエステルである、請求の範囲１９記載の方法。２１．独立して梱包された実質的に純粋なジクエン酸環状ジエステルを標準品として含む、生物検体中のジクエン酸環状ジエステルを検出するためのキット。２２．独立して梱包された、ジクエン酸環状ジエステルを特異的に認識しそれに結合する抗体を含むイムノアッセイキットである、請求の範囲２１記載のキット。２３．独立して梱包された、ジクエン酸特異的抗体を特異的に認識しそれに結合する二次抗体を含む、請求の範囲２２記載のイムノアッセイキット。２４．独立して梱包されたジクエン酸環状ジエステルと反応するアミン物質、および独立して梱包された塩化鉄成分を含む比色定量キットである、請求の範囲２１記載のキット。２５．ジクエン酸環状ジエステル、またはそのアナログ、誘導体、代謝前駆体、代謝物、あるいはそれらの塩を含む、歯苔形成または歯石の阻害のための磨歯剤。２６．ジクエン酸環状ジエステル、またはそのアナログ、誘導体、代謝前駆体、代謝物、あるいはそれらの塩を含む、金属イオン錯体化剤。２７．遊離金属イオンを、有効量のジクエン酸環状ジエステル、またはそのアナログ、誘導体、代謝前駆体、代謝物、あるいはそれらの塩に接触させることを含む、生物学的または環境的な物質中に存在する遊離金属イオンを錯体化する方法。２８．金属イオンがFe(III)である、請求の範囲２２記載の方法。