JPH09503050A

JPH09503050A - 心臓トロポニン▲ｉ▼のアッセイ

Info

Publication number: JPH09503050A
Application number: JP6525774A
Authority: JP
Inventors: リチャードダブルユー．ウィックス; レスリーオー．ツァートマン; アネットエム．バーガス; ステイシーエイ．トレッティー
Original assignee: フォートロンバイオサイエンスインク．
Priority date: 1993-05-17
Filing date: 1994-05-16
Publication date: 1997-03-25
Also published as: DE69420556D1; CA2162121A1; US5756682A; WO1994027156A1; ATE184400T1; EP0699306A1; DE69420556T2; AU689777B2; EP0699306B1; AU6834894A; US5834220A

Abstract

(57)【要約】心臓のトロポニンＩの検出方法を説明する。この検出方法は、一方の結合パートナーとして心臓のトロポニンＩに特異的な抗体を、もう一方の結合パートナーとしてトロポニンＣを用いたサンドイッチアッセイである。

Description

【発明の詳細な説明】心臓トロポニンＩのアッセイ発明の背景心筋梗塞（”心臓発作”）の診断確認のために最も広く用いられているインビトロ試験は、血清中のクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム（ＥＣ２．７．３．２）の検出である。一般には、この試験によって十分な結果が得られるが、いくつかの不都合のために、この試験の有用性は限られている。不都合の一例は、心筋梗塞後にこの試験が陽性となる期間が比較的短い（２４−４８時間）ことである。梗塞後４８時間以上たってから患者が病院に到着した場合には、一般に、ＣＫ−ＭＢ試験では、心臓発作の診断を確認することはできない。さらに、ＣＫ− ＭＢアイソザイムは骨格筋組織にも少量含まれているので、骨格筋組織に外傷を有する患者（例えば、自動車事故によって）では、偽陽性の結果が出て、心筋梗塞の診断が困難になることがある。このような問題を回避するために、多くの研究者が、筋肉タンパク質であるトロポニンＩのような、代替となる心筋障害の血清マーカーを検討してきた。トロポニンＩは、筋肉収縮装置の細いフィラメント上に存在するトロポニン複合体の３つのサブユニットのうちの１つである。このトロポニン複合体は、筋肉の収縮過程の制御において中心的な役割を果たしており、そのため、これらの３つのサブユニットは調節タンパク質と呼ばれている。その他の２つのサブユニット（Ｔ及びＣと呼ばれる）も、心筋組織と骨格筋組織の両方において、トロポニンＩと並んで、細い筋フィラメント上に固定されている。トロポニンＩは、心筋組織、緩徐骨格筋組織、及び、速骨格筋組織の様々な遺伝子にコードされている。ヒトにおいては、これら３つの型のトロポニンＩのあいだで、アミノ酸配列の約６０％が相同である。心臓型の非相同領域を用いれば、２つの骨格型と交差反応を起こさないような抗体を開発することができ、真に心臓に特異的な試験の開発が可能となる。Ｃｕｍｍｉｎｓ、ｅｔａｌ．（１９８７）ＡｍｅｒｉｃａｎＨｅａｒｔＪｏｕｒｎａｌ１１３：１３３３−１３４４には、ヒト血清中の心臓トロポニンＩを測定するためのラジオイムノアッセイの開発が記載されている。このアッセイは、トロポニンＩの骨格型と有意に交差反応をするポリクローナル抗体を用いており、心筋梗塞の診断確認における有用性は限られている。また、この試験の感受性は、血清中の低レベルのトロポニンＩを検出するには不十分であった。Ｂｏｄａｒ、ｅｔａｌ．（１９９２）ＣｌｉｎｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ３８：２２．３−２２１４には、２つのモノクローナル抗体を用いた血清トロポニンＩの”サンドイッチ”アッセイ法の開発が記載されている。このアッセイ法では、モノクローナル抗体を用いることにより、心臓に対する特異性が向上しているが、２種類の異なるモノクローナル抗体を使用することが必要となる。また、検査法としては、このアッセイ法は不正確すぎた（１１−２１％の変動係数）。発明の要旨本発明は、生物学的液体中の心臓トロポニンＩ濃度を定量的に決定するための方法、及び、診断試験系に関するものである。本発明によれば、一方の免疫結合パートナーが心臓型トロポニンＩに特異的なポリクローナル抗体、又は、モノクローナル抗体であり、他方の結合パートナーがトロポニン複合体のＣサブユニットであるような、いわゆる”サンドイッチ”イムノアッセイを行うことが可能となることが発見された。この方法と試験系は、生物学的液体中のトロポニンＩを素早く、特異的に測定する方法を提供するものであり、心筋障害の診断確認に非常に適している。一般に、本発明の方法は、試験すべき生物学的液体、心臓トロポニンＩに特異的な抗体又は抗体断片、及び、トロポニンＣ又はトロポニンＣのトロポニンＩ結合断片を、サンプル中のトロポニンＩ、抗体、及び、トロポニンＣが三元複合体を形成するような条件下で、連続的、又は、同時にインキュベートすることから成る。この複合体をサンプルから分離し、生物学的液体中の心臓トロポニンＩ量の指標として、複合体の形成量を検出する。発明の詳細な説明本発明によれば、心臓に特異的な抗体とトロポニンＣサブユニットとの組み合わせを用いたサンドイッチイムノアッセイ法によって、生物学的液体中のトロポニンＩ濃度を定量できる。この発明においては、全血、血清、血漿、リンパ液、尿、汗、胆液、羊水、脳脊髄液、痰、などの生物学的液体を使用できる。心臓、骨格筋、腎臓、脳、肝臓、などの組織抽出液も、本発明の方法で使用可能である。しかし、本発明に適した生物学的液体は、血清、又は、血漿である。より詳細には、本発明は、２つの結合パートナーが使用されるイムノアッセイ試験系であって、２つの結合パートナーの各々がトロポニンＩ抗原と結合可能であり、一方が心臓型トロポニンＩに特異的なモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体（又はそれらの混合物）であり；第二の結合パートナーがトロポニン複合体のＣサブユニットであるような、イムノアッセイ試験系に関する。本発明のある好ましい実施態様においては、２つの結合パートナーのうちの一方が、固相表面に固定化されており、第二の結合パートナーが、信号を発生するマーカーで標識されている。本発明においては、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体（又はそれらの混合物）が、心臓型トロポニンＩに特異的であり、骨格型のトロポニンＩと有意な反応を起こさないことが重要である。これは、トロポニンのＣサブユニットが、心臓型トロポニンＩと骨格型トロポニンＩの両方に対して、かなりの反応性を有するためである。従って、骨格型のトロポニン１と有意に反応するような抗体を用いると、骨格筋組織に障害を有する患者において、偽陽性反応が起こることがある。本発明のある好ましい実施態様においては、当業者に知られた様々な方法によって、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体（又はそれらの混合物）を、適切な固相表面に固定化する。本発明の固相表面は、一つの特定のものには限定されない。固相表面は、当業者に知られたプラスチックチューブ、ビーズ、マイクロタイタープレート、ラテックス粒子、磁石粒子、セルロースビーズ、アガロースビーズ、紙、ディップスティック、などから選択できる。抗体、又は、トロポニンＣの固定化方法は狭い範囲で限定されているものではなく、受動的吸収、共有結合、物理的トラッピング、などが含まれる。本発明において固相として用いられる結合パートナーは、当業者に知られた方法で、固相表面に直接付着させてもよいし、又は、イムノアッセイのインキュベーション中に（インサイチュで）固定化してもよい。例えば、固相表面をアビジン又はストレプトアビジンでコートして、第一結合パートナーをビオチンで標識する。そして、第一結合パートナーを液相の状態で、トロポニンＩを含む生物学的液体と標識した第二結合パートナーへ添加してもよい。或いは、ヤギ又はマウスのＩｇＧに対する抗体を固相表面に固定化し、ヤギ又はマウスのモノクローナル抗体を液相の状態で、インキュベーション容器に添加してもよい。同様に、本発明のある好ましい実施態様においては、第二結合パートナー（トロポニンＣサブユニット）を、信号を発生する様々なマーカーで標識する。これには、放射性同位元素標識、酵素、化学蛍光化合物、蛍光標識、色素、酵素の補因子、ビオチン、などが含まれる（しかし、これらには限定されない）。第二結合パートナーと信号発生マーカーとのあいだの化学結合は、当業者に知られた様々な方法で作成できる。本発明の第二の好ましい実施態様においては、トロポニンＣサブユニットを固相表面に固定化し、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体（又はそれらの混合物）を信号発生マーカーで標識する。固相の第一結合パートナーと標識第二結合パートナーが、トロポニンＩを含むサンプルと接触する順序は、狭い範囲で限定されているものではない。ある好ましい実施態様においては、トロポニンＩを含む生物学的液体と、固相の第一結合パートナー及び標識第二結合パートナとを、同時に接触させる。この方法は、いわゆる”同時”アッセイ法であり、当業者によく知られているものである。適切なインキュベーション期間中に、両方の結合パートナーが生物学的液体中のトロポニンＩと反応してサンドイッチを形成し、その後、固相表面を洗浄して、固相表面に結合していない試薬を除去し、当業者に知られた方法によって、信号発生マーカーを測定する。本発明の別の実施態様においては、トロポニンＩを含む生物学的液体を、まず、固相の第一結合パートナーと接触させる。適切なインキュベーション期間中に、生物学的液体中のトロポニンＩが固相の第一結合パートナーと結合し、その後、固相表面を洗浄して、過剰なトロポニンＩとその他のタンパク質を除去する。次に、固相の第一結合パートナーを、標識第二結合パートナーと接触させて、三元複合体、又は、”サンドイッチ”を完成させ、それに続く第二インキュベーション期間中に、標識した第二結合パートナーが、既に固相の第一結合パートナーに結合したトロポニンＩと結合する。この第二のインキュベーション期間後に、固相表面を洗浄して、結合していない標識第二結合パートナーを除去し、信号発生マーカーを測定する。これは、いわゆる”順番”型サンドイッチイムノアッセイである。本発明の別の実施態様は、液相の標識結合パートナーを、まず、トロポニンＩ抗原を含む生物学的液体とインキュベートし、次に、固相の結合パートナーと接触させる、いわゆる”逆”型イムノアッセイである。この第二のインキュベーション後に、固相を洗浄して、結合していない過剰の試薬やタンパク質を除去し、信号発生マーカーを測定する。本発明の別の実施態様として、第二抗体を用いて、”サンドイッチ”の形成を検出してもよい。例えば、トロポニンＣに特異的な標識抗体を用いて、複合体を検出することもできる。本発明によれば、２つの結合パートナーのうちの一方は、心臓のトロポニンＩに特異的なモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である。このようなポリクローナル抗体は、純粋な心臓トロポニンＩを動物に注射し、動物から採血して、抗体を含む血清を得ることによって、従来の方法で作成できる。本発明で用いる抗体を得るためには、心臓のトロポニンＩを精製するために、当業者に知られている一般的な方法のうちのどの方法を用いてもよい。ポリクローナル抗体は、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ロバ、ウマ、ブタ、ウシ、イヌ、サル、など、どの動物種で作成できる。本発明においては、好ましくは、ヤギで抗体を作成する。本発明において結合パートナーの一つとして用いる抗体、又は、複数の抗体は、心臓型のトロポニンＩに特異的でなければならず、骨格型のトロポニンＩに対しては、ほとんど、又は、全く反応性を持ってはならない。心臓に特異的な抗体をヤギから作成するための好ましい方法において、骨格型トロポニンＩとの交差反応性が非常に低いポリクローナル抗体を作成できることが発見された。精製したトロポニンＩをヤギに注射し、従来の方法によって、動物から血清を回収する。当業者に知られた方法によって、骨格型トロポニンＩ分子とかなり相違する心臓トロポニンＩ分子の一領域に対応する合成ペプチドを合成する。このペプチドは、少なくともアミノ酸５個であり、好ましくは、少なくともアミノ酸７個である。このペプチドは、心臓トロポニンＩのそのような領域に対して、少なくとも７５％、好ましくは、少なくとも９０％の相同性を持たなければならない。このペプチドの配列と、骨格トロポニンＩの対応する領域の配列とは、少なくとも５０％のアミノ酸が相違しなければならない。心臓トロポニンＩのそのような領域は、骨格型には全く存在しない配列を有する：ＭＥＴ−ＡＬＡ−ＡＳＰ−ＧＹＬ−ＳＥＲ−ＳＥＲ−ＡＳＰ−ＡＬＡ−ＡＬＡ −ＡＲＧ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＡＲＧ−ＰＲＯ−ＡＬＡ−ＰＲＯ−ＡＬＡ−ＰＲＯ −ＩＬＥ−ＡＲＧ−ＡＲＧ−ＡＲＧ−ＳＥＲ−ＳＥＲ−ＡＳＮ−ＴＹＲ−ＡＲＧ −ＡＬＡ−ＴＹＲ−ＡＬＡ−ＴＨＲ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＨＩＳ−ＡＬＡ−ＬＹＳ −ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＳＥＲである。上記の領域の好ましい断片は、以下の配列を有するペプチド：ＡＲＧ−ＡＬＡ−ＴＹＲ−ＡＬＡ−ＴＨＲ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＨＩＳ−ＡＬＡ −ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＳＥＲ、及びかなり相違する別の領域：ＡＲＧ−ＧＬＹ−ＧＬＵ−ＬＹＳ−ＧＬＹ−ＡＲＧ−ＡＬＡ−ＬＥＵ−ＳＥＲ −ＴＨＲ−ＡＲＧ−ＣＹＳ−ＧＬＮ−ＰＲＯ−ＬＥＵ−ＧＬＵ−ＬＥＵ−ＡＬＡであるこのようなペプチドを選択する際の重要な決定因子は、心臓型トロポニンＩと骨格型トロポニンＩの対応する領域との間の相違、及び、これらの合成ペプチドが、ヤギの抗トロポニンＩ血清からどの程度の量の抗体を取り去ることができるか、である。この合成ペプチドを、従来の方法によって、アガロースビーズ上に固定化する。動物血清を固定化合成ペプチドと接触させ、この特定のペプチドに特異的な抗体とアガロースとの間で結合を形成させる。適切な接触期間の後、ビーズを緩衝液で洗浄し、従来の方法によって、精製した心臓特異的トロポニンＩ抗体をビーズから溶出させる。心臓に特異的な抗体をヤギから作成するための第二の好ましい方法では、精製したトロポニンＩをヤギに注射して、従来の方法によって、動物から血清を回収する。精製した心臓トロポニンＩを、従来の方法によって、アガロースビーズ上に化学的に固定化させる。動物血清を、固定化トロポニンＩと接触させ、抗体とトロポニンＩとの間で結合を形成させる。適切な接触期間の後、ビーズを緩衝液で洗浄し、従来の方法によって、精製した抗体をビーズから溶出させる。次に、精製した抗体を、以下のように吸収して、骨格型トロポニンＩと結合する抗体を除去する。骨格筋のトロポニンＩを従来の方法で精製し、アガロースビーズ上に化学的に固定化する。精製した抗体を、骨格トロポニンＩビーズと接触させ、骨格型トロポニンＩと交差反応をする抗体を全て除去する。本発明の第三の好ましい実施態様においては、ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７６）ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ６：５１１−５１９の有名な細胞融合法を用いて、望ましい抗体を分泌するハイブリドーマを作成し、心臓のトロポニンＩに特異的なマウスモノクローナル抗体を作成した。この方法は、心臓トロポニンＩを注射したマウスなどのホスト動物由来の抗体産生細胞を、抗体を分泌する”ハイブリドーマ”を形成するために融合させる２つの細胞集団の一方として用いる方法である。第二の細胞集団は、一般に、組織培養法で生育する能力をこのようなハイブリドーマに与えるガン細胞株、又は、ミエローマ細胞株である。この２つの細胞集団を、ポリエチレングリコールなどを用いた当業者に知られた方法で融合させ、一般的な組織培養法によって、抗体産生細胞を増殖させる。限界希釈法によるサブクローニングによって、均一な細胞集団が得た後、インビトロ又はインビボで、標準的な方法によって、抗体産生ハイブリドーマを増殖させる。この方法で作成したモノクローナル抗体は、未精製物としても使用できるが、最高の結果を得るためには、当業者に知られた方法によって、モノクローナル抗体を高純度（例えば９５％以上）にまで精製する。この方法には、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、又は、固定化プロテインＡ又は固定化プロテインＧとのアフィニティクロマトグラフィーなどが含まれる。本発明で使用される心臓に特異的な抗体（ポリクローナル、又は、マウスモノクローナルの何れか）は、完全なＩｇＧ分子として用いてもよいし、抗原結合部位を含む分子断片として用いてもよい。そのような断片には、当業者に知られた方法によって、パパイン、トリプシン、又は、ペプシンなどの酵素で消化して調製したＦａｂ、Ｆａｂ’、又は、Ｆ（ａｂ）’２断片が含まれる。本発明の２つの結合パートナーの一方として使用されるトロポニンＣサブユニットは、様々な組織や、様々な動物種から得ることができる。トロポニンＣサブユニット源としては、骨格筋、又は、心筋組織が好ましい。なぜならば、これらの組織には、トロポニンＣが高濃度で含まれているためである。組織は、どのような動物種から選択してもよい、特に、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ロバ、ヒト、ウマ、ブタ、ウシ、イヌ、サルなどのほ乳類から選択される。本発明の好ましい実施態様では、ウサギの骨格筋からトロポニンＣを単離した。トロポニンＣは、Ｐｏｔｔｅｒｅｔａｌ．（１９８２）ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ８５：２４１−２６３などの文献で報告されている従来の方法によって単離できる。一般に、抽出、等電沈殿、イオン交換クロマトグラフィーなどのよく知られた技術を用いて単離される。本発明によって最高の結果を得るためには、トロポニンＣを高純度（例えば、９５％以上）にまで精製することが望ましい。従来の遺伝子工学技術によって、トロポニンＣの分子全体、又は、様々な分子断片を生合成してもよい。或いは、有機タンパク合成技術によって、トロポニンＣを化学合成してもよい。本発明においては、トロポニンＣの断片に対応するペプチドを使用してもよい。本発明のイムノアッセイのインキュベーション時間と温度は、狭い範囲で限定されているものではない。インキュベーション時間は、１分から４８時間の範囲であるが、好ましくは５分から１２０分間である。同様に、インキュベーション温度は４℃から５６℃で行うことができる。好ましいインキュベーション温度は２０から３７℃である。本発明のアッセイを実施するため試薬は、キットの状態に組み立てることができる。そのようなキットには、別々の容器に入った心臓トロポニンＩに特異的な抗体と、トロポニンＣが含まれる。抗体、又は、トロポニンＣを固相に固定化してもよい。抗体、又は、トロポニンＣを標識してもよい。酵素標識を使用した場合には、酵素の基質をキットに含めることができる。第二抗体を用いて複合体を標識するアッセイの場合には、抗トロポニン抗体又はトロポニンＣに特異的な第二抗体がキットに含まれる。キットには、適切なスタンダード物質、陽性コントロール及び陰性コントロール、及び、アッセイを実施するための説明書を含めてもよい。以下の例は、本発明をさらに説明するものであるが、本発明を何ら限定するものではない。例１トロポニンＣの精製Ｉ．筋原繊維画分の調製ニュージーランドタイプのウサギ３匹を屠殺し、後脚と背筋を切除する。組織から余分な脂肪を取り除き、１ｃｍ片に切断する。得られた組織（約１７８５グラム）を６つに分け、合計４２００ｍｌの５０ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭエチレンジアミン四酢酸塩、１５ｍＭメルカプトエタノール、０．１％トリトンＸ−１００、及び、３０μｇ／ｍｌフェニルメチルスルホニルフルオリドを含む２０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８．０（洗浄緩衝液）でホモジェナイズする。得られたホモジェネートを、７０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離し、上清を廃棄する。得られた沈殿を４２００ｍｌの洗浄緩衝液で再度ホモジェナイズし、再度遠心分離して沈殿を得る。このようにして合計８回洗浄する。最終的な沈殿を、９０００ｍｌの１Ｍ塩化ナトリウム、０．１ｍＭ塩化カルシウム、１ｍＭメルカプトエタノールを含む２５ｍＭＴｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８．０（抽出緩衝液）でホモジェナイズし、４℃で一晩撹拌する。得られた抽出物を、７０００×ｇ、４℃で１時間遠心分離し、上清を得る（筋原繊維画分）。ＩＩ．等電沈殿ステップＩの筋原繊維画分を高速で撹拌し、１Ｎ塩酸を用いて、溶液のｐＨを４．６に調整する。１０分間撹拌後、得られた懸濁液を、７０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離する。沈殿を廃棄し、上清を高速で撹拌しながら、１Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ８．０に調整する。次に、固体の硫酸アンモニウムを最終濃度が６０％飽和となるように溶液に添加し、４℃で一晩撹拌してトロポニンタンパク質を沈殿させる。ＩＩＩ．ＤＥＡＥセファロース精製ステップＩＩの懸濁液を、７０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離し、得られた沈殿を、約１００ｍｌの６Ｍ尿素、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸塩、１ｍＭメルカプトエタノールを含む５０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８．０（ＤＥＡＥ緩衝液）に溶解する。溶解したタンパク質を透析バッグへ移し、最終希釈度が少なくとも１：１００万となるように、ＤＥＡＥ緩衝液に対して透析する。ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシアバイオテックインク．、ピスケータウェイ、ニュージャージー州）をつめた１６×５ｃｍのカラムをＤＥＡＥ緩衝液で平衡化する。透析したサンプルを、８０ｍｌ／時間の流速でカラムに供し、約４５０ｍｌのＤＥＡＥ緩衝液でカラムを洗浄して、１２ｍｌの画分を回収する。流速を１５０ｍｌ／時間へと速め、ＤＥＡＥ緩衝液１リットルと、０．５Ｍ塩化カリウムを含むＤＥＡＥ緩衝液１リットルを用いてトロポニンＣを溶出する。トロポニンＣを含む画分をプールし、窒素圧力下で、ミリポアの再生セルロース製１０，０００カット膜を用いて、約１４ｍｌに濃縮する。濃縮したトロポニンＣを透析バッグへ移し、最終希釈度が１／１０¹²となるように、１０ｍＭリン酸カリウム、１Ｍ塩化カリウム、ｐＨ６．５に対して、４℃で透析する。例２トロポニンＩの精製Ｉ．ゲルへのトロポニンＣの結合ヤギ抗トロポニンＩ抗体を作成するために、まず、Ｓｙｓｋａｅｔａｌ．（１９７４）ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ４０：２５３−２５７の方法に従って、心臓のトロポニンＩを単離した。例１の方法によって単離したトロポニンＣ（約５００ｍｇ）を、アクチゲルＡＤＬゲル（ステロジーンコーポレーション、アルカディア、カリフォルニア州）に結合させる。まずゲル５０ｍｌを、１０ｍＭリン酸カリウム、１Ｍ塩化カリウム、ｐＨ６．５（結合緩衝液）で洗浄する。トロポニンＣをゲルに添加して、シアノホウ化水素ナトリウムを最終濃度が０．１Ｍとなるように添加する。得られた懸濁液を室温で４時間撹拌し、カラムへ流し込んでゲルを回収する。次に、ゲルを２２５ｍｌの結合緩衝液で洗浄する。ゲルをカラムから取り出し、１５０ｍｌの０．１Ｍエタノールアミンを含む１０ｍＭリン酸カリウム、１Ｍ塩化カリウム、ｐＨ６．５に加える。シアノホウ化水素ナトリウムを最終濃度が０．１Ｍとなるように添加する。懸濁液を４℃で一晩撹拌し、未反応の結合基をブロックする。次に、ゲルをカラムに戻し、１５０ｍｌの結合緩衝液で洗浄し、１００ｍｌの０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０５％アジ化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．２で洗浄する。ＩＩ．トロポニンＩの精製死後に得たヒトの心臓１個から、過剰な脂肪と弁を取り除き、４℃で１ｃｍ片に切断する。得られた組織（約３５２グラム）をひとまとめとして、７５２ｍｌの８Ｍ尿素、１５ｍＭメルカプトエタノール、１ｍＭ塩化カルシウムを含む７５ｍＭＴｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８．０（抽出緩衝液）で、室温でホモジェナイズする。得られたホモジェネートを７０００×ｇで３０分間遠心分離し、得られた上清をチーズクロスを通して濾過して粒子を除去する（心臓抽出物）。ステップＩで調製したトロポニンＣ結合ゲルをカラムにつめ、室温で、２５０ｍｌの抽出緩衝液で洗浄する。ゲルをカラムから取り出し、濾過した心臓抽出物と混合する。得られた懸濁液を室温で８０分間撹拌し、７０００×ｇで２０分間遠心分離する。上清を廃棄し、沈殿したゲルを、抽出緩衝液と共にカラムへ戻す。カラムを、合計７００ｍｌの抽出緩衝液を使って室温で洗浄し、８Ｍ尿素、１５ｍＭメルカプトエタノール、１０ｍＭエチレンジアミン四酢酸塩を含む７５ｍＭＴｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８．０（溶出緩衝液）を使って、精製されたトロポニンＩをカラムから溶出させる。１２ｍｌの画分を回収し、有意な量のトロポニンＩを含む全ての画分をまとめてプールする。プールしたトロポニンＩへ、十分な量の１０ｍＭエチレンジアミン四酢酸塩、１５ｍＭメルカプトエタノールを含む７５ｍＭＴｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８．０を添加し、尿素濃度を８Ｍから６Ｍにする。得られた溶液を、窒素圧力下で、ミリポアの１０，０００カットの再生セルロース膜を使って濃縮し、最終液量を１４．２ｍｌとする。最終的なタンパク質濃度は、ブラッドフォードのタンパク質アッセイ法と、スタンダード物質としてウシアルブミンを用いて測定した。例３精製ヤギ抗トロポニンＩ抗体の調製Ｉ．ヤギ抗トロポニンＩ抗血清の調製例２の方法から得られた精製トロポニンＩを、等容量のフロインドアジュバント（不活性化したＭ−ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓｂａｃｉｌｌｉを含む鉱物油懸濁物）と混合する。得られた混合物をホモジェナイズして、水／油エマルジョンを作成し、初期免疫原とする。まず、ヤギに、例２のように調製した２５０μ ｇの心臓トロポニンＩを含む免疫原を注射して、初期免疫する。その後１ヶ月ごとに、２５０μｇ−５００μｇの精製した心臓トロポニンＩを、不活性化したＭ −ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓｂａｃｉｌｌｉを除いて上記と同様に調製し（不完全フロインドアジュバント）、免疫原としてヤギに注射する。注射後７−１０日目に、ヤギから採血し、ヤギ抗トロポニンＩ血清を得る。ＩＩ．合成トロポニンＩペプチドアガロースビーズの調製当業者に知られた固相ペプチド法により、以下の合成ペプチドを調製する：ＡＲＧ−ＡＬＡ−ＴＹＲ−ＡＬＡ−ＴＨＲ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＨＩＳ−ＡＬＡ −ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＳＥＲ−ＣＹＳ簡単には、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）をアルファアミノ保護基ととして使用し、アプライドバイオシステムズ４３１型自動ペプチド合成機で、ペプチドを合成した。全てのアミノ酸と溶液は、アプライドバイオシステムズから購入し、合成用グレードであった。合成後、ペプチドを樹脂から切り離し、６．６７％フェノール、４．４％（ｖ／ｖ）チオアニソール、８．８％エタネジチオールを含むトリフルオロ酢酸から成る切断カクテルを用いて、側鎖のブロックを外した。切り離したペプチドを沈殿させ、冷ジエチルエーテルで数回洗浄した。次に水に溶解して、凍結乾燥した。粗ペプチドを、アミノ酸分析（ウォーターズＰｉｃｏ−Ｔａｇ_tmシステム）、及び、逆相ＨＰＬＣに供した。逆相ＨＰＬＣでは、０．１％ＴＦＡ水溶液と０．１％ＴＦＡ中９９．９％アセトニトリルとを可動緩衝液として使用し、Ｖｙｄａｃ８Ｃカラムを用いた。このペプチドが使用に適しているかどうかは、大きな単一ピークの存在と適切なアミノ酸組成を証拠として判断した。ペプチド１０ｍｇを、２０ｍｌの５ｍＭエチレンジアミン四酢酸塩（ＥＤＴＡ）を含む５０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．５に溶解することで、得られたペプチドを、６％架橋アガロースビーズ（スルフォリンクゲル、ピヤースケミカルカンパニー、ロックフォード、イリノイ州）に結合させる。１０ｍｌのスルフォリンクゲルを、１２０ｍｌの５ｍＭＥＤＴＡを含む５０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８．５（結合緩衝液）を用いて、カラムの中で洗浄する。洗浄したゲルを、トロポニンＩペプチドの溶液へ添加して、室温で４時間、及び、４℃で１６時間撹拌する。得られた懸濁液をカラムに流し入れ、残りの反応基をブロックするために、さらに５０ｍＭメルカプトエタノールを添加した結合緩衝液２０ｍｌを加える。この懸濁液を室温で６０分間撹拌し、次に、４０ｍｌの１Ｍ塩化ナトリウム溶液と、４０ｍｌの０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０５％アジ化ナトリウムを含む５ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．２で洗浄する。ＩＩＩ．心臓に特異的なトロポニンＩ抗体の単離ステップＩで調製した抗血清を回収して、その５６ｍｌを、５６ｍｌの０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む５ｍＭイミダゾール緩衝液、ｐＨ７．２で希釈する。フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、ロイペプチン、アプロチニン、ペプスタチンＡを、最終濃度が各々１５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．７５μｇ／ｍｌとなるように添加して、抗血清中のプロテアーゼを阻害する。ステップＩＩで調製した合成ペプチドゲルを希釈した抗血清へ加え、室温で１時間撹拌する。得られた混合物をカラムへ移し、５５ｍｌの１Ｍ塩化ナトリウムと０．０５％アジ化ナトリウムを含む５ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．２で洗浄する。精製した心臓に特異的な抗体を、５５ｍｌの第一溶出緩衝液（イムノピュアジェントルＡＧ／ＡＢ溶出緩衝液、ピヤースケミカルカンパニー、ロックフォード、イリノイ州）と、それに続いて、５５ｍｌの第二溶出緩衝液（３Ｍチオシアン酸ナトリウムと０．０５％アジ化ナトリウムを含む５ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．０）を用いて、カラムから溶出させる。これらの溶出液の両方に含まれる精製抗体を、最終希釈度が１０⁶となるように、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む５ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．２に対して透析し、窒素圧力下で約２５ｍｌへ濃縮し、最終希釈度が１０⁹となるように、０．１５Ｍ塩化ナトリウムと０．０５％アジ化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２に対して透析する。得られた透析物を７０００×ｇで１５分間遠心分離し、不溶性の物質を除去する。精製された心臓に特異的なトロポニンＩ抗体を含む上清のタンパク質濃度は、吸光率Ｅ，１％＝１３．０を用いて、２８０ｎｍで分光光度的に決定する。例４トロポニンＣ−アルカリホスファターゼの調製Ｉ．例１の方法で調製したトロポニンＣを、以下の方法によって、アルカリホスファターゼと化学的に結合させる。１０７ｕｌの容量のトロポニンＣ（３ｍｇ）を、ジメチルスルホキシド中で７ｍｇ／ｍｌの濃度となるように調製した２５ｕｌのＳＡＴＡ溶液（Ｎ−サクシニミジルＳ−アセチルチオアセテート、ピヤースケミカルカンパニー、ロックフォード、イリノイ州）で処理する。反応液を室温で３０分間撹拌した後、溶液を、２リットルの２ｍＭＥＤＴＡを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５に対して、４℃で一晩透析する。ヒドロキシルアミンを最終濃度が５０ｍＭとなるように添加して、ＳＡＴＡ修飾トロポニンＣを脱アセチル化し、溶液を室温で２時間静置する。次に、修飾トロポニンＣを、２リットルの２ｍＭＥＤＴＡを含む３０ｍＭトリエタノールアミン、ｐＨ７．２に対して、一晩透析する。１．５５ｍｌの容量のコウシ小腸由来アルカリホスファターゼ（ＡＰ）６ｍｇ（バイオザイムコーポレーション、サンディエゴ、カリフォルニア州）を、ガラス製試験管に入れる。脱イオン水で５ｍｇ／ｍｌの濃度になるように新しいスルホ−ＳＭＣＣ溶液（スルホサクシニミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート、ピヤースケミカルカンパニー、ロックフォード、イリノイ州）を調製する。合計８７ｕｌのＳＭＣＣ溶液をＡＰへ添加し、室温で１時間撹拌する。次に、修飾ＡＰ溶液を、２リットルの５ｍＭ塩化マグネシウムと１ｍＭ塩化亜鉛を含む３０ｍＭトリエタノールアミン、ｐＨ７．２に対して、４℃で一晩透析する。合計１．３５ｍｇのＳＡＴＡ修飾トロポニンＣを、４ｍｇのＳＭＣＣ修飾ＡＰと混合し、４℃で２４時間撹拌する。メルカプトエチルアミンとヨードアセタミドを最終濃度が１０ｍＭとなるように溶液に添加し、室温で２０分間撹拌する。次に、得られたＡＰ結合トロポニンＣを、セファクリルＳ−３００（ファルマシアバイオテックインク．、ピスケータウェイ、ニュージャージー州）をつめた１．５×９０ｃｍカラムに通して、ＡＰトロポニンＣコンジュゲートを未反応生成物から精製した。例５ヒト骨格トロポニンＩの精製Ｉ．筋原繊維画分の精製ヒトの骨格筋組織（胸筋）を４℃で解凍し、脂肪を取り除く。合計８３．６グラムの組織を１ｃｍ片に切断し、７５０ｍｌの５０ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭＥＤＴＡ、１％トリトンＸ−１００界面活性剤、１５ｍＭメルカプトエタノール、３０μｇ／ｍｌＰＭＳＦを含む２０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．０（洗浄緩衝液１）でホモジェナイズする。得られたホモジェネートを７０００×ｇで２５分間遠心分離し、上清を廃棄する。得られた沈殿を、７５０ｍｌの洗浄緩衝液１で再度ホモジェナイズし、再度遠心分離して沈殿を得る。このようにして、合計７回洗浄する。次に、沈殿を、洗浄緩衝液２（５０ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭＥＤＴＡ、１５ｍＭメルカプトエタノール、３０μｇ／ｍｌＰＭＳＦを含む２０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．０）で、同様に３回洗浄する。得られた沈殿を、７５０ｍｌの０．６Ｍヨウ化カリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭＥＤＴＡ、５ｍＭアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、５ｍＭメルカプトエタノール、３０μｇ／ｍｌＰＭＳＦ、１．３μｇ／ｍｌロイペプチン、１．３μｇ／ｍｌペプスタチンＡを含む３５ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．７でホモジェナイズする。得られた懸濁液を４℃で１５分間撹拌し、７０００×ｇで３０分間遠心分離する。得られた上清を、最終希釈度が１／２００となるように、５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭＥＤＴＡ、３０μｇ／ｍｌＰＭＳＦ、１ｍＭＡＴＰ、２ｍＭメルカプトエタノールを含む３５ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．５に対して透析する。得られた溶液を、７０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を得る。ＩＩ．ＤＥＡＥセファロースクロマトグラフィーステップＩの上清に、固体の硫酸アンモニウムを、最終濃度が８０％飽和となるように添加する。懸濁液を４℃で２１／２時間撹拌した後、懸濁液を７０００×ｇで３０分間遠心分離する。上清を廃棄し、沈殿を、２００ｍｌの９Ｍ尿素、０．５ｍＭＥＤＴＡ、１５ｍＭメルカプトエタノール、３０μｇ／ｍｌＰＭＳＦを含む５０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．０に溶解する。得られた溶液を、最終希釈度が１０⁴となるように、６Ｍ尿素、０．５ｍＭＥＤＴＡ、１５ｍＭメルカプトエタノール、３０μｇ／ｍｌＰＭＳＦを含む５０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．０（ＤＥＡＥ緩衝液）に対して、４℃で透析する。得られた溶液を、室温で、ＤＥＡＥ緩衝液で平衡化した１３×４．８ｃｍのＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂカラムへ、流速９０ｍｌ／時間の速度で供する。１０ｍｌの画分を回収し、トロポニン１を含む溶出両分をまとめてプールする。得られたプール液を、窒素圧力下で、ミリポア再生セルロース膜を用いて、最終容量５ｍｌへ濃縮する。ＩＩＩ．ゲル濾過クロマトグラフィーステップＩＩからの濃縮トロポニンＩサンプルを、４℃で、ＤＥＡＥ緩衝液で平衡化した２．５×９０ｃｍのセファクリルＳ−３００ゲルカラムへ、流速３０ｍｌ／時間の速度で供する。精製された骨格トロポニンＩを含む画分をまとめてプールし、最終希釈度が１／１００となるように、１ｍＭＥＤＴＡと６Ｍ尿素を含む１０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．０に対して透析する。最終的なタンパク質濃度は、ブラッドフォードの方法によって、ウシアルブミンをスタンダードとして決定する。例６トロポニンＩの免疫化学的アッセイＩ．トロポニンＩの同時サンドイッチイムノアッセイ例３に従って調製した精製トロポニンＩ抗体を、０．０５％アジ化ナトリウムを含む１００ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ４．０で、１０μｇ／ｍｌに希釈する。１００ｕｌの抗体を用いて、ポリスチレン製のマイクロタイタープレート（ダイナテックコーポ．シャントリー、バージニア州）を室温で一晩かけてコートする。マイクロタイタープレートを、１Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．２で３回洗浄し、１０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．２、１０％グルクロン酸、１％ウシ血清アルブミン、０．０５％プロクリン−３００（ロームアンドハース、フィラデルフィア、ペンシルバニア州）から成る溶液で、室温で、１時間かけてブロックする。マイクロタイタープレートのウェルから余分な液体を吸引し、室温でプレートを乾燥させる。抗体でコートしたプレートは、使用時まで、４℃で保存した。例２のように調製した心臓トロポニン１を、トロポニンＩ不含の正常ヒト血清で、最終濃度が５、２５、及び、５０ｎｇ／ｍｌとなるように希釈し、イムノアッセイのスタンダードとする。例４の用に調製したトロポニンＣ標識アルカリホスファターゼを、２０％熱非働化ヤギ血清、１ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ塩化亜鉛、０．０５％アジかナトリウムを含む５０ｍＭトリエタノールアミン、ｐＨ７．４で、５μｇ／ｍｌの濃度へ希釈する。先に調製した抗体コートマイクロタイタープレートのウェルへ、血清サンプル、又は、トロポニンＩスタンダード（２０ｕｌ）を、二連で添加した。次に、トロポニンＣ標識ＡＰ（８０ｕｌ）をウェルへ加え、室温で２時間インキュベートする。次に、マイクロタイタープレートのウェルを脱イオン水で５回洗浄し、全てのウェルに、５ｍＭ塩化マグネシウム、０．１Ｍ塩化亜鉛、０．０２％トゥイーン２０、０．０５％プロクリン３００を含む２５ｍＭジエタノールアミン、ｐＨ９．８０中の０．８３ｍｇ／ｍｌパラニトロフェニルフォスフェートから成る基質溶液（１００ｕｌ）を加える。基質溶液を、室温で３０分間インキュベートし、１００ｕｌの２Ｎ水酸化ナトリウムを添加して反応を停止する。マイクロタイタープレート中の溶液の吸収を、適切な測定機器を用いて、４０５ｎｍで測定する。典型的なスタンダード曲線を表ＩＩに示す。例７トロポニンＩイムノアッセイの性質Ｉ．心筋梗塞が記録されている患者から集めた血清（ＭＩ血清）と、正常で健康な被験者由来の血清（正常血清）を、例６のトロポニンＩイムノアッセイで試験した。また、例５にように調製した骨格トロポニンＩを、最終濃度が２９μｇ／ｍｌとなるように正常血清に添加し、このアッセイと骨格トロポニンＩとの交差反応性を調べた。表ＩＩＩに示すように、本発明のアッセイでは、心臓発作を患う患者と、正常で健康な被験者とを明確に区別できる。また、このアッセイ系と、骨格型のトロポニンＩとの交差反応性は、＜０．０１％である。同等の態様当業者であれば、通常の実験によって、ここで説明した本発明の特定の実施態様と同等の態様を認識、又は、突き止めることができるであろう。そのような同等の態様は、以下の請求の範囲によって網羅されるものである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年５月８日【補正内容】本発明においては、トロポニンＣの断片に対応するペプチドを使用してもよい。本発明のイムノアッセイのインキュベーション時間と温度は、狭い範囲で限定されているものではない。インキュベーション時間は、１分から４８時間の範囲であるが、好ましくは５分から１２０分間である。同様に、インキュベーション温度は４℃から５６℃で行うことができる。好ましいインキュベーション温度は２０から３７℃である。本発明のアッセイを実施するため試薬は、キットの状態に組み立てることができる。そのようなキットには、別々の容器に入った心臓トロポニンＩに特異的な抗体と、トロポニンＣが含まれる。抗体、又は、トロポニンＣを固相に固定化してもよい。抗体、又は、トロポニンＣを標識してもよい。酵素標識を使用した場合には、酵素の基質をキットに含めることができる。第二抗体を用いて複合体を標識するアッセイの場合には、抗トロポニン抗体又はトロポニンＣに特異的な第二抗体がキットに含まれる。キットには、適切なスタンダード物質、陽性コントロール及び陰性コントロール、及び、アッセイを実施するための説明書を含めてもよい。以下の例は、本発明をさらに説明するものであるが、本発明を何ら限定するものではない。例１トロポニンＣの精製Ｉ．筋原繊維画分の調製ニュージーランドタイプのウサギ３匹を屠殺し、後脚と背筋を切除する。組織から余分な脂肪を取り除き、１ｃｍ片に切断する。得られた組織（約１７８５グラム）を６つに分け、合計４２００ｍｌの５０ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭエチレンジアミン四酢酸塩、１５ｍＭメルカプトエタノール、０．１％トリトン^TMＸ− １００、及び、３０μｇ／ｍｌフェニルメチルスルホニルフルオリドを含む２０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８．０（洗浄緩衝液）でホモジェナイズする。得られたホモジェネートを、７０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離し、上清を廃棄する。得られた沈殿を４２００ｍｌの洗浄緩衝液で再度ホモジェナイズし、再度遠心分離して沈殿を得る。このようにして合計８回洗浄する。最終的な沈殿を、９０００ｍｌの１Ｍ塩化ナトリウム、０．１ｍＭ塩化カルシウム、１ｍＭメルカプトエタノールを含む２５ｍＭＴｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８．０（抽出緩衝液）でホモジェナイズし、４℃で一晩撹拌する。得られた抽出物を、７０００×ｇ、４℃で１時間遠心分離し、上清を得る（筋原繊維画分）。ＩＩ．等電沈殿ステップＩの筋原繊維画分を高速で撹拌し、１Ｎ塩酸を用いて、溶液のｐＨを４．６に調整する。１０分間撹拌後、得られた懸濁液を、７０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離する。沈殿を廃棄し、上清を高速で撹拌しながら、１Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ８．０に調整する。次に、固体の硫酸アンモニウムを最終濃度が６０％飽和となるように溶液に添加し、４℃で一晩撹拌してトロポニンタンパク質を沈殿させる。ＩＩＩ．ＤＥＡＥセファロース^TM精製ステップＩＩの懸濁液を、７０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離し、得られた沈殿を、約１００ｍｌの６Ｍ尿素、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸塩、１ｍＭメルカプトエタノールを含む５０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８．０（ＤＥＡＥ緩衝液）に溶解する。溶解したタンパク質を透析バッグへ移し、最終希釈度が少なくとも１：１００万となるように、ＤＥＡＥ緩衝液に対して透析する。ＤＥＡＥセファロース^TMＣＬ−６Ｂ（ファルマシアバイオテックインク．、ピスケータウェイ、ニュージャージー州）をつめた１６×５ｃｍのカラムをＤＥＡＥ緩衝液で平衡化する。透析したサンプルを、８０ｍｌ／時間の流速でカラムに供し、約４５０ｍｌのＤＥＡＥ緩衝液でカラムを洗浄して、１２ｍｌの画分を回収する。流速を１５０ｍｌ／時間へと速め、ＤＥＡＥ緩衝液１リットルと、０．５Ｍ塩化カリウムを含むＤＥＡＥ緩衝液１リットルを用いてトロポニンＣを溶出する。トロポニンＣを含む画分をプールし、窒素圧力下で、ミリポアの再生セルロース製１０，０００カット膜を用いて、約１４ｍｌに濃縮する。濃縮したトロポニンＣを透析バッグへ移し、最終希釈度が１／１０¹²となるように、１０ｍＭリン酸カリウム、１Ｍ塩化カリウム、ｐＨ６．５に対して、４℃で透析する。例２トロポニンＩの精製Ｉ．ゲルへのトロポニンＣの結合ヤギ抗トロポニンＩ抗体を作成するために、まず、Ｓｙｓｋａｅｔａｌ．（１９７４）ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ４０：２５３−２５７の方法に従って、心臓のトロポニンＩを単離した。例１の方法によって単離したトロポニンＣ（約５００ｍｇ）を、アクチゲル^TMＡＤＬゲル（ステロジーンコーポレーション、アルカディア、カリフォルニア州）に結合させる。まずゲル５０ｍｌを、１０ｍＭペプチド１０ｍｇを、２０ｍｌの５ｍＭエチレンジアミン四酢酸塩（ＥＤＴＡ）を含む５０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．５に溶解することで、得られたペプチドを、６％架橋アガロースビーズ（スルフォリンク^TMゲル、ピヤースケミカルカンパニー、ロックフォード、イリノイ州）に結合させる。１０ｍｌのスルフォリンク^TMゲルを、１２０ｍｌの５ｍＭＥＤＴＡを含む５０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８．５（結合緩衝液）を用いて、カラムの中で洗浄する。洗浄したゲルを、トロポニンＩペプチドの溶液へ添加して、室温で４時間、及び、４℃で１６時間撹拌する。得られた懸濁液をカラムに流し入れ、残りの反応基をブロックするために、さらに５０ｍＭメルカプトエタノールを添加した結合緩衝液２０ｍｌを加える。この懸濁液を室温で６０分間撹拌し、次に、４０ｍｌの１Ｍ塩化ナトリウム溶液と、４０ｍｌの０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０５％アジ化ナトリウムを含む５ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．２で洗浄する。ＩＩＩ．心臓に特異的なトロポニンＩ抗体の単離ステップＩで調製した抗血清を回収して、その５６ｍｌを、５６ｍｌの０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む５ｍＭイミダゾール緩衝液、ｐＨ７．２で希釈する。フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、ロイペプチン、アプロチニン、ペプスタチンＡを、最終濃度が各々１５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．７５μｇ／ｍｌとなるように添加して、抗血清中のプロテアーゼを阻害する。ステップＩＩで調製した合成ペプチドゲルを希釈した抗血清へ加え、室温で１時間撹拌する。得られた混合物をカラムへ移し、５５ｍｌの１Ｍ塩化ナトリウムと０．０５％アジ化ナトリウムを含む５ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．２で洗浄する。精製した心臓に特異的な抗体を、５５ｍｌの第一溶出緩衝液（イムノピュア^TMジェントルＡＧ／ＡＢ溶出緩衝液、ピヤースケミカルカンパニー、ロックフォード、イリノイ州）と、それに続いて、５５ｍｌの第二溶出緩衝液（３Ｍチオシアン酸ナトリウムと０．０５％アジ化ナトリウムを含む５ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．０）を用いて、カラムから溶出させる。これらの溶出液の両方に含まれる精製抗体を、最終希釈度が１０⁶となるように、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む５ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．２に対して透析し、窒素圧力下で約２５ｍｌへ濃縮し、最終希釈度が１０⁹となるように、０．１５Ｍ塩化ナトリウムと０．０５％アジ化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２に対して透析する。得られた透析物を７０００×ｇで１５分間遠心分離し、不溶性の物質を除去する。精製された心臓に特異的なトロポニンＩ抗体を含む上清のタンパク質濃度は、吸光率Ｅ，１％＝１３．０を用いて、２８０ｎｍで分光光度的に決定する。例４トロポニンＣ−アルカリホスファターゼの調製Ｉ．例１の方法で調製したトロポニンＣを、以下の方法によって、アルカリホスファターゼと化学的に結合させる。１０７ｕｌの容量のトロポニンＣ（３ｍｇ）を、ジメチルスルホキシド中で７ｍｇ／ｍｌの濃度となるように調製した２５ｕｌのＳＡＴＡ溶液（Ｎ−サクシニミジルＳ−アセチルチオアセテート、ピヤースケミカルカンパニー、ロックフォード、イリノイ州）で処理する。反応液を室温で３０分間撹拌した後、溶液を、２リットルの２ｍＭＥＤＴＡを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５に対して、４℃で一晩透析する。ヒドロキシルアミンを最終濃度が５０ｍＭとなるように添加して、ＳＡＴＡ修飾トロポニンＣを脱アセチル化し、溶液を室温で２時間静置する。次に、修飾トロポニンＣを、２リットルの２ｍＭＥＤＴＡを含む３０ｍＭトリエタノールアミン、ｐＨ７．２に対して、一晩透析する。１．５５ｍｌの容量のコウシ小腸由来アルカリホスファターゼ（ＡＰ）６ｍｇ（バイオザイムコーポレーション、サンディエゴ、カリフォルニア州）を、ガラス製試験管に入れる。脱イオン水で５ｍｇ／ｍｌの濃度になるように新しいスルホ−ＳＭＣＣ溶液（スルホサクシニミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート、ピヤースケミカルカンパニー、ロックフォード、イリノイ州）を調製する。合計８７ｕｌのＳＭＣＣ溶液をＡＰへ添加し、室温で１時間撹拌する。次に、修飾ＡＰ溶液を、２リットルの５ｍＭ塩化マグネシウムと１ｍＭ塩化亜鉛を含む３０ｍＭトリエタノールアミン、ｐＨ７．２に対して、４℃で一晩透析する。合計１．３５ｍｇのＳＡＴＡ修飾トロポニンＣを、４ｍｇのＳＭＣＣ修飾ＡＰと混合し、４℃で２４時間撹拌する。メルカプトエチルアミンとヨードアセタミドを最終濃度が１０ｍＭとなるように溶液に添加し、室温で２０分間撹拌する。次に、得られたＡＰ結合トロポニンＣを、セファクリル^TMＳ−３００（ファルマシアバイオテックインク．、ピスケータウェイ、ニュージャージー州）をつめた１．５×９０ｃｍカラムに通して、ＡＰトロポニンＣコンジュゲートを未反応生成物から精製した。例５ヒト骨格トロポニンＩの精製Ｉ．筋原繊維画分の精製ヒトの骨格筋組織（胸筋）を４℃で解凍し、脂肪を取り除く。合計８３．６グラムの組織を１ｃｍ片に切断し、７５０ｍｌの５０ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭＥＤＴＡ、１％トリトン^TMＸ−１００界面活性剤、１５ｍＭメルカプトエタノール、３０μｇ／ｍｌＰＭＳＦを含む２０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．０（洗浄緩衝液１）でホモジェナイズする。得られたホモジェネートを７０００×ｇで２５分間遠心分離し、上清を廃棄する。得られた沈殿を、７５０ｍｌの洗浄緩衝液１で再度ホモジェナイズし、再度遠心分離して沈殿を得る。このようにして、合計７回洗浄する。次に、沈殿を、洗浄緩衝液２（５０ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭＥＤＴＡ、１５ｍＭメルカプトエタノール、３０μｇ／ｍｌＰＭＳＦを含む２０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．０）で、同様に３回洗浄する。得られた沈殿を、７５０ｍｌの０．６Ｍヨウ化カリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭＥＤＴＡ、５ｍＭアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、５ｍＭメルカプトエタノール、３０μｇ／ｍｌＰＭＳＦ、１．３μｇ／ｍｌロイペプチン、１．３μｇ／ｍｌペプスタチンＡを含む３５ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．７でホモジェナイズする。得られた懸濁液を４℃で１５分間撹拌し、７０００×ｇで３０分間遠心分離する。得られた上清を、最終希釈度が１／２００となるように、５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭＥＤＴＡ、３０μｇ／ｍｌＰＭＳＦ、１ｍＭＡＴＰ、２ｍＭメルカプトエタノールを含む３５ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．５に対して透析する。得られた溶液を、７０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を得る。ＩＩ．ＤＥＡＥセファロース^TMクロマトグラフィーステップＩの上清に、固体の硫酸アンモニウムを、最終濃度が８０％飽和となるように添加する。懸濁液を４℃で２１／２時間撹拌した後、懸濁液を７０００×ｇで３０分間遠心分離する。上清を廃棄し、沈殿を、２００ｍｌの９Ｍ尿素、０．５ｍＭＥＤＴＡ、１５ｍＭメルカプトエタノール、３０μｇ／ｍｌＰＭＳＦを含む５０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．０に溶解する。得られた溶液を、最終希釈度が１０⁴となるように、６Ｍ尿素、０．５ｍＭＥＤＴＡ、１５ｍＭメルカプトエタノール、３０μｇ／ｍｌＰＭＳＦを含む５０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．０（ＤＥＡＥ緩衝液）に対して、４℃で透析する。得られた溶液を、室温で、ＤＥＡＥ緩衝液で平衡化した１３×４．８ｃｍのＤＥＡＥセファロース^TMＣＬ−６Ｂカラムへ、流速９０ｍｌ／時間の速度で供する。１０ｍｌの画分を回収し、トロポニンＩを含む溶出画分をまとめてプールする。得られたプール液を、窒素圧力下で、ミリポア再生セルロース膜を用いて、最終容量５ｍｌへ濃縮する。ＩＩＩ．ゲル濾過クロマトグラフィーステップＩＩからの濃縮トロポニンＩサンプルを、４℃で、ＤＥＡＥ緩衝液で平衡化した２．５×９０ｃｍのセファクリル^TMＳ−３００ゲルカラムへ、流速３０ｍｌ／時間の速度で供する。精製された骨格トロポニンＩを含む画分をまとめてプールし、最終希釈度が１／１００となるように、１ｍＭＥＤＴＡと６Ｍ尿素を含む１０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．０に対して透析する。最終的なタンパク質濃度は、ブラッドフォードの方法によって、ウシアルブミンを標準として決定する。例６トロポニンＩの免疫化学的アッセイＩ．トロポニンＩの同時サンドイッチイムノアッセイ例３に従って調製した精製トロポニンＩ抗体を、０．０５％アジ化ナトリウムを含む１００ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ４．０で、１０μｇ／ｍｌに希釈する。１００ｕｌの抗体を用いて、ポリスチレン製のマイクロタイタープレート（ダイナテックコーポ．シャントリー、バージニア州）を室温で一晩かけてコートする。マイクロタイタープレートを、１Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．２で３回洗浄し、１０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．２、１０％グルクロン酸、１％ウシ血清アルブミン、０．０５％プロクリン^TM−３００（ロームアンドハース、フィラデルフィア、ペンシルバニア州）から成る溶液で、室温で、１時間かけてブロックする。マイクロタイタープレートのウェルから余分な液体を吸引し、室温でプレートを乾燥させる。抗体でコートしたプレートは、使用時まで、４℃で保存した。例２のように調製した心臓トロポニンＩを、トロポニンＩ不含の正常ヒト血清で、最終濃度が５、２５、及び、５０ｎｇ／ｍｌとなるように希釈し、イムノアッセイのスタンダードとする。例４の用に調製したトロポニンＣ標識アルカリホスファターゼを、２０％熱非働化ヤギ血清、１ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ塩化亜鉛、０．０５％アジかナトリウムを含む５０ｍＭトリエタノールアミン、ｐＨ７．４で、５μｇ／ｍｌの濃度へ希釈する。先に調製した抗体コートマイクロタイタープレートのウェルへ、血清サンプル、又は、トロポニンＩスタンダード（２０ｕｌ）を、二連で添加した。次に、トロポニンＣ標識ＡＰ（８０ｕｌ）をウェルへ加え、室温で２時間インキュベートする。次に、マイクロタイタープレートのウェルを脱イオン水で５回洗浄し、全てのウェルに、５ｍＭ塩化マグネシウム、０．１Ｍ塩化亜鉛、０．０２％トゥイーン２０、０．０５％プロクリン^TM３００を含む２５ｍＭジエタノールアミン、ｐＨ９．８０中の０．８３ｍｇ／ｍｌパラニトロフェニルフォスフェートから成る基質溶液（１００ｕｌ）を加える。基質溶液を、室温で３０分間インキュベートし、１００ｕｌの２Ｎ水酸化ナトリウムを添加して反応を停止する。マイクロタイタープレート中の溶液の吸収を、適切な測定機器を用いて、４０５ｎｍで測定する。典型的なスタンダード曲線を表ＩＩに示す。１０．前記トロポニンＣが、ウサギの骨格筋から得られたものである、ことを特徴とする請求項１記載のアッセイ。１１．前記抗体が、骨格トロポニンＩには存在しない心臓トロポニンＩの領域に対して少なくとも７５％の相同性を有するアミノ酸配列を持つペプチド、又は、骨格トロポニンＩの対応領域とはアミノ酸配列の少なくとも５０％のアミノ酸が相違するペプチドを含む固相と、抗トロポニンＩ抗血清とを、前記ペプチドに特異的な抗体が前記固相へ結合できるような条件下で接触させ；前記固相を抗血清から分離し、その後、結合した前記抗体を前記固相から溶出することによって調製される、心臓トロポニンＩに特異的なポリクローナル抗体である、ことを特徴とする請求項１記載のアッセイ。１２．前記ペプチドが：ＭＥＴ−ＡＬＡ−ＡＳＰ−ＧＹＬ−ＳＥＲ−ＳＥＲ−ＡＳＰ−ＡＬＡ−ＡＬＡ− ＡＲＧ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＡＲＧ−ＰＲＯ−ＡＬＡ−ＰＲＯ−ＡＬＡ−ＰＲＯ− ＩＬＥ−ＡＲＧ−ＡＲＧ−ＡＲＧ−ＳＥＲ−ＳＥＲ−ＡＳＮ−ＴＹＲ−ＡＲＧ− ＡＬＡ−ＴＹＲ−ＡＬＡ−ＴＨＲ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＨＩＳ−ＡＬＡ−ＬＹＳ− ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＳＥＲ、ＡＲＧ−ＡＬＡ−ＴＹＲ−ＡＬＡ−ＴＨＲ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＨＩＳ−ＡＬＡ− ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＳＥＲ、及び、ＡＲＧ−ＧＬＹ−ＧＬＵ−ＬＹＳ−ＧＬＹ−ＡＲＧ−ＡＬＡ−ＬＥＵ−ＳＥＲ− ＴＨＲ−ＡＲＧ−ＣＹＳ−ＧＬＮ−ＰＲＯ−ＬＥＵ−ＧＬＵ−ＬＥＵ−ＡＬＡから成る群より選択される配列全体、又は、配列の一部のアミノ酸配列を持つ、ことを特徴とする請求項１１記載のアッセイ。１３．前記抗体が、ＡＲＧ−ＡＬＡ−ＴＹＲ−ＡＬＡ−ＴＨＲ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＨＩＳ−ＡＬＡ− ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＳＥＲ、又は、その一部のアミノ酸配列を持つペプチドに特異的なモノクローナル抗体、又は、ポリクローナル抗体である、ことを特徴とする請求項１記載のアッセイ。１４．心臓トロポニンＩのアッセイを行うための試薬を含むキットであって：ａ．心臓トロポニンＩに特異的な抗体、又は、抗体断片、及び、ｂ．トロポニンＣ、又は、そのトロポニンＩ結合断片、から成る、ことを特徴とするキット。１５．前記トロポニンＣが、酵素標識されている、ことを特徴とする請求項１４記載のキット。１６．前記酵素が、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、及び、ベータガラクトシダーゼから成る群より選択される、ことを特徴とする請求項１５記載のキット。１７．前記トロポニンＣが、ウサギの骨格筋から得られたものである、ことを特徴とする請求項１４記載のキット。１８．前記抗体が、ＭＥＴ−ＡＬＡ−ＡＳＰ−ＧＹＬ−ＳＥＲ−ＳＥＲ−ＡＳＰ−ＡＬＡ−ＡＬＡ− ＡＲＧ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＡＲＧ−ＰＲＯ−ＡＬＡ−ＰＲＯ−ＡＬＡ−ＰＲＯ− ＩＬＥ−ＡＲＧ−ＡＲＧ−ＡＲＧ−ＳＥＲ−ＳＥＲ−ＡＳＮ−ＴＹＲ−ＡＲＧ− ＡＬＡ−ＴＹＲ−ＡＬＡ−ＴＨＲ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＨＩＳ−ＡＬＡ−ＬＹＳ− ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＳＥＲ、ＡＲＧ−ＡＬＡ−ＴＹＲ−ＡＬＡ−ＴＨＲ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＨＩＳ−ＡＬＡ− ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＳＥＲ、及び、ＡＲＧ−ＧＬＹ−ＧＬＵ−ＬＹＳ−ＧＬＹ−ＡＲＧ−ＡＬＡ−ＬＥＵ−ＳＥＲ− ＴＨＲ−ＡＲＧ−ＣＹＳ−ＧＬＮ−ＰＲＯ−ＬＥＵ−ＧＬＵ−ＬＥＵ−ＡＬＡから成る群より選択されるペプチドに特異的なモノクローナル抗体、又は、ポリクローナル抗体である、ことを特徴とする請求項１４記載のキット。１９．生物学的液体中の心臓トロポニンＩを定量するための固相イムノアッセイであって：ａ．ｉ）生物学的液体サンプル；ｉｉ）心臓トロポニンＩに特異的なポリクローナル抗体、又は、抗体断片を含む固相免疫吸着剤；及びｉｉｉ）標識トロポニンＣ、又は、そのトロポニンＩ結合断片を、前記サンプル中のトロポニンＩが、前記固定化抗体、及び、前記標識トロポニンＣと複合体を形成するために十分な条件下で、同時にインキュベートし；ｂ．前記サンプルから前記固相免疫吸着剤を分離し；ｃ．前記生物学的液体中の心臓トロポニンＩの量の指標として、前記固相に結合した標識トロポニンＣ又はその断片の量、又は、結合していない標識トロポニンＣまたはその断片の量を検出する、ことを特徴とする固相イムノアッセイ。２０．前記生物学的液体が、血清である、ことを特徴とする請求項１９記載のイムノアッセイ。２１．前記固相が、プラスチック表面である、ことを特徴とする請求項１９記載のイムノアッセイ。２２．前記トロポニンＣが、酵素標識されている、ことを特徴とする請求項１９記載のイムノアッセイ。２３．前記酵素が、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、及び、ベータガラクトシダーゼから成る群より選択される、ことを特徴とする請求項２２記載のイムノアッセイ。２４．前記トロポニンＣが、ウサギの骨格筋から得られたものである、ことを特徴とする請求項１９記載のイムノアッセイ。２５．前記抗体が、骨格トロポニンＩには存在しない心臓トロポニンＩの領域に対して少なくとも７５％の相同性を有するアミノ酸配列を持つペプチド、又は、骨格トロポニンＩの対応領域とはアミノ酸配列の少なくとも５０％のアミノ酸が相違するペプチドを含む固相と、抗トロポニンＩ抗血清とを、前記ペプチドに特異的な抗体が前記固相へ結合できるような条件下で接触させ；前記固相を前記抗血清から分離し、その後、結合した前記抗体を前記固相から溶出することによって調製される、心臓トロポニンＩに特異的なポリクローナル抗体である、ことを特徴とする請求項１９記載のイムノアッセイ。２６．前記ペプチドが：ＭＥＴ−ＡＬＡ−ＡＳＰ−ＧＹＬ−ＳＥＲ−ＳＥＲ−ＡＳＰ−ＡＬＡ−ＡＬＡ− ＡＲＧ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＡＲＧ−ＰＲＯ−ＡＬＡ−ＰＲＯ−ＡＬＡ−ＰＲＯ− ＩＬＥ−ＡＲＧ−ＡＲＧ−ＡＲＧ−ＳＥＲ−ＳＥＲ−ＡＳＮ−ＴＹＲ−ＡＲＧ− ＡＬＡ−ＴＹＲ−ＡＬＡ−ＴＨＲ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＨＩＳ−ＡＬＡ−ＬＹＳ− ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＳＥＲ、ＡＲＧ−ＡＬＡ−ＴＹＲ−ＡＬＡ−ＴＨＲ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＨＩＳ−ＡＬＡ− ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＳＥＲ、及び、ＡＲＧ−ＧＬＹ−ＧＬＵ−ＬＹＳ−ＧＬＹ−ＡＲＧ−ＡＬＡ−ＬＥＵ−ＳＥＲ− ＴＨＲ−ＡＲＧ−ＣＹＳ−ＧＬＮ−ＰＲＯ−ＬＥＵ−ＧＬＵ−ＬＥＵ−ＡＬＡから成る群より選択される配列全体、又は、配列の一部のアミノ酸配列を持つ、ことを特徴とする請求項２５記載のイムノアッセイ。２７．前記ポリクローナル抗体が、ＡＲＧ−ＡＬＡ−ＴＹＲ−ＡＬＡ−ＴＨＲ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＨＩＳ−ＡＬＡ− ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＳＥＲ、というペプチドに特異的である、ことを特徴とする請求項１９記載のイムノアッセイ。２８．トロポニンＩの固相イムノアッセイを行うための試薬キットであって：ａ．心臓トロポニンＩに特異的なポリクローナル抗体、又は、抗体断片を含む固相免疫吸着剤、及び、ｂ．標識トロポニンＣ、又は、そのトロポニンＩ結合断片、から成る、ことを特徴とするキット。２９．前記トロポニンＣが、酵素標識されている、ことを特徴とする請求項２８記載のキット。３０．前記酵素が、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、及び、ベータガラクトシダーゼから成る群より選択される、ことを特徴とする請求項２９記載のキット。３１．前記トロポニンＣが、ウサギの骨格筋から得られたものである、ことを特徴とする請求項２８記載のキット。３２．前記ポリクローナル抗体が、ＭＥＴ−ＡＬＡ−ＡＳＰ−ＧＹＬ−ＳＥＲ−ＳＥＲ−ＡＳＰ−ＡＬＡ−ＡＬＡ− ＡＲＧ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＡＲＧ−ＰＲＯ−ＡＬＡ−ＰＲＯ−ＡＬＡ−ＰＲＯ− ＩＬＥ−ＡＲＧ−ＡＲＧ−ＡＲＧ−ＳＥＲ−ＳＥＲ−ＡＳＮ−ＴＹＲ−ＡＲＧ− ＡＬＡ−ＴＹＲ−ＡＬＡ−ＴＨＲ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＨＩＳ−ＡＬＡ−ＬＹＳ− ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＳＥＲ、ＡＲＧ−ＡＬＡ−ＴＹＲ−ＡＬＡ−ＴＨＲ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＨＩＳ−ＡＬＡ− ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＳＥＲ、及び、ＡＲＧ−ＧＬＹ−ＧＬＵ−ＬＹＳ−ＧＬＹ−ＡＲＧ−ＡＬＡ−ＬＥＵ−ＳＥＲ− ＴＨＲ−ＡＲＧ−ＣＹＳ−ＧＬＮ−ＰＲＯ−ＬＥＵ−ＧＬＵ−ＬＥＵ−ＡＬＡから成る群より選択されるペプチドに特異的である、ことを特徴とする請求項２８記載のキット。３３．ＭＥＴ−ＡＬＡ−ＡＳＰ−ＧＹＬ−ＳＥＲ−ＳＥＲ−ＡＳＰ−ＡＬＡ−ＡＬＡ−ＡＲＧ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＡＲＧ−ＰＲＯ−ＡＬＡ−ＰＲＯ−ＡＬＡ−ＰＲＯ−ＩＬＥ−ＡＲＧ−ＡＲＧ−ＡＲＧ−ＳＥＲ−ＳＥＲ−ＡＳＮ−ＴＹＲ−ＡＲＧ−ＡＬＡ−ＴＹＲ−ＡＬＡ−ＴＨＲ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＨＩＳ−ＡＬＡ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＳＥＲ、及び、ＡＲＧ−ＡＬＡ−ＴＹＲ−ＡＬＡ−ＴＨＲ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＨＩＳ−ＡＬＡ− ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＳＥＲ、から成る群より選択されるペプチドに特異的なポリクローナル抗体。３４．ＭＥＴ−ＡＬＡ−ＡＳＰ−ＧＹＬ−ＳＥＲ−ＳＥＲ−ＡＳＰ−ＡＬＡ−ＡＬＡ−ＡＲＧ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＡＲＧ−ＰＲＯ−ＡＬＡ−ＰＲＯ−ＡＬＡ−ＰＲＯ−ＩＬＥ−ＡＲＧ−ＡＲＧ−ＡＲＧ−ＳＥＲ−ＳＥＲ−ＡＳＮ−ＴＹＲ− ＡＲＧ−ＡＬＡ−ＴＹＲ−ＡＬＡ−ＴＨＲ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＨＩＳ−ＡＬＡ− ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＳＥＲ、及び、ＡＲＧ−ＡＬＡ−ＴＹＲ−ＡＬＡ−ＴＨＲ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＨＩＳ−ＡＬＡ− ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＳＥＲ、から成る群より選択されるペプチドに特異的なモノクローナル抗体。３５．骨格トロポニンＩには存在しない心臓トロポニンＩの領域に対して少なくとも７５％の相同性を有するアミノ酸配列を持つペプチド、又は、骨格トロポニンＩの対応領域とはアミノ酸配列の少なくとも５０％のアミノ酸が相違するペプチドを含む固相と、抗トロポニンＩ抗血清とを、前記ペプチドに特異的な抗体が前記固相へ結合できるような条件下で接触させ；前記固相を前記抗血清から分離し、その後、結合した前記抗体を前記固相から溶出することによって調製される、ことを特徴とする心臓トロポニンＩに特異的なポリクローナル抗体製剤。３６．ＭＥＴ−ＡＬＡ−ＡＳＰ−ＧＹＬ−ＳＥＲ−ＳＥＲ−ＡＳＰ−ＡＬＡ−ＡＬＡ−ＡＲＧ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＡＲＧ−ＰＲＯ−ＡＬＡ−ＰＲＯ−ＡＬＡ−ＰＲＯ−ＩＬＥ−ＡＲＧ−ＡＲＧ−ＡＲＧ−ＳＥＲ−ＳＥＲ−ＡＳＮ−ＴＹＲ−ＡＲＧ−ＡＬＡ−ＴＹＲ−ＡＬＡ−ＴＨＲ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＨＩＳ−ＡＬＡ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＳＥＲ、及び、ＡＲＧ−ＡＬＡ−ＴＹＲ−ＡＬＡ−ＴＨＲ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＨＩＳ−ＡＬＡ− ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＳＥＲ、及び、これらの一部分から成る群より選択されるペプチドを含む固相と、抗トロポニンＩ抗血清とを、前記ペプチドに特異的な抗体が前記固相へ結合できるような条件下で接触させ；前記固相を前記抗血清から分離し、その後、結合した前記抗体を前記固相から溶出することによって調製される、ことを特徴とする請求項３５記載の心臓トロポニンＩに特異的なポリクローナル抗体製剤。３７．前記抗トロポニンＩ抗血清が、精製した心臓トロポニンＩで動物を免役することによって調製される、ことを特徴とする請求項３５記載のポリクローナル抗体製剤。３８．前記ポリクローナル製剤が、インビトロ用途である、ことを特徴とする請求項３５記載のポリクローナル抗体製剤。３９．前記抗トロポニンＩ抗血清が、精製した心臓トロポニンＩで動物を免役することによって調製される、ことを特徴とする請求項３６記載のポリクローナル抗体製剤。４０．ＡＲＧ−ＧＬＹ−ＧＬＵ−ＬＹＳ−ＧＬＹ−ＡＲＧ−ＡＬＡ−ＬＥＵ−ＳＥＲ−ＴＨＲ−ＡＲＧ−ＣＹＳ−ＧＬＮ−ＰＲＯ−ＬＥＵ−ＧＬＵ−ＬＥＵ−ＡＬＡというペプチドに特異的なポリクローナル抗体。４１．ＡＲＧ−ＧＬＹ−ＧＬＵ−ＬＹＳ−ＧＬＹ−ＡＲＧ−ＡＬＡ−ＬＥＵ−ＳＥＲ−ＴＨＲ−ＡＲＧ−ＣＹＳ−ＧＬＮ−ＰＲＯ−ＬＥＵ−ＧＬＵ−ＬＥＵ−ＡＬＡというペプチドに特異的なモノクローナル抗体。４２．ＡＲＧ−ＧＬＹ−ＧＬＵ−ＬＹＳ−ＧＬＹ−ＡＲＧ−ＡＬＡ−ＬＥＵ−ＳＥＲ−ＴＨＲ−ＡＲＧ−ＣＹＳ−ＧＬＮ−ＰＲＯ−ＬＥＵ−ＧＬＵ−ＬＥＵ−ＡＬＡというペプチド、又は、この一部分を含む固相と、抗トロポニンＩ抗血清とを、前記ペプチドに特異的な抗体が前記固相へ結合できるような条件下で接触させ；前記固相を前記抗血清から分離し、その後、結合した前記抗体を前記固相から溶出することによって調製される、ことを特徴とする請求項３５記載の心臓トロポニンＩに特異的なポリクローナル抗体製剤。４３．前記抗トロポニンＩ抗血清が、精製した心臓トロポニンＩで動物を免役することによって調製される、ことを特徴とする請求項４２記載のポリクローナル抗体製剤。４４．骨格トロポニンＩには存在しない心臓トロポニンＩの領域に対して少なくとも７５％の相同性を有するアミノ酸配列を持つペプチド、又は、骨格トロポニンＩの対応領域とはアミノ酸配列の少なくとも５０％のアミノ酸が相違するペプチドを含む固相と、抗トロポニンＩ抗血清とを、前記ペプチドに特異的な抗体が前記固相へ結合できるような条件下で接触させ；前記固相を前記抗血清から分離し、その後、結合した前記抗体を前記固相から溶出する、ことを特徴とする心臓トロポニンＩに特異的なポリクローナル抗体の調製方法。４５．前記抗トロポニンＩ抗血清が、精製した心臓トロポニンＩで動物を免役することによって調製される、ことを特徴とする請求項４４記載の方法。４６．前記心臓トロポニンＩに特異的なポリクローナル抗体が、ＭＥＴ−ＡＬＡ−ＡＳＰ−ＧＹＬ−ＳＥＲ−ＳＥＲ−ＡＳＰ−ＡＬＡ−ＡＬＡ− ＡＲＧ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＡＲＧ−ＰＲＯ−ＡＬＡ−ＰＲＯ−ＡＬＡ−ＰＲＯ− ＩＬＥ−ＡＲＧ−ＡＲＧ−ＡＲＧ−ＳＥＲ−ＳＥＲ−ＡＳＮ−ＴＹＲ−ＡＲＧ− ＡＬＡ−ＴＹＲ−ＡＬＡ−ＴＨＲ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＨＩＳ−ＡＬＡ−ＬＹＳ− ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＳＥＲ、及び、ＡＲＧ−ＡＬＡ−ＴＹＲ−ＡＬＡ−ＴＨＲ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＨＩＳ−ＡＬＡ− ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＳＥＲ、及び、これらの一部分から成る群より選択されるペプチドを含む固相と、抗トロポニンＩ抗血清とを、前記ペプチドに特異的な抗体が前記固相へ結合できるような条件下で接触させ；前記固相を前記抗血清から分離し、その後、結合した前記抗体を前記固相から溶出することによって調製される、ことを特徴とする請求項４４記載の方法。４７．前記抗トロポニンＩ抗血清が、精製した心臓トロポニンＩで動物を免役することによって調製される、ことを特徴とする請求項４６記載の方法。４８．請求項３５の前記心臓トロポニンＩに特異的なポリクローナル抗体が、ＡＲＧ−ＧＬＹ−ＧＬＵ−ＬＹＳ−ＧＬＹ−ＡＲＧ−ＡＬＡ−ＬＥＵ−ＳＥＲ− ＴＨＲ−ＡＲＧ−ＣＹＳ−ＧＬＮ−ＰＲＯ−ＬＥＵ−ＧＬＵ−ＬＥＵ−ＡＬＡというペプチド、又は、この一部分を含む固相と、抗トロポニンＩ抗血清とを、前記ペプチドに特異的な抗体が前記固相へ結合できるような条件下で接触させ；前記固相を前記抗血清から分離し、その後、結合した前記抗体を前記固相から溶出することによって調製される、ことを特徴とする請求項４４記載の方法。４３．前記抗トロポニンＩ抗血清が、精製した心臓トロポニンＩで動物を免役することによって調製される、ことを特徴とする請求項４８記載の方法。【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年７月３１日【補正内容】３５．骨格トロポニンＩには存在しない心臓トロポニンＩの領域に対して少なくとも７５％の相同性を有するアミノ酸配列を持つペプチド、又は、骨格トロポニンＩの対応領域とはアミノ酸配列の少なくとも５０％のアミノ酸が相違するペプチドを含む固相と、抗トロポニンＩ抗血清とを、前記ペプチドに特異的な抗体が前記固相へ結合できるような条件下で接触させ；前記固相を前記抗血清から分離し、その後、結合した前記抗体を前記固相から溶出することによって調製される、ことを特徴とする心臓トロポニンＩに特異的なポリクローナル抗体製剤。３６．ＭＥＴ−ＡＬＡ−ＡＳＰ−ＧＹＬ−ＳＥＲ−ＳＥＲ−ＡＳＰ−ＡＬＡ−ＡＬＡ−ＡＲＧ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＡＲＧ−ＰＲＯ−ＡＬＡ−ＰＲＯ−ＡＬＡ−ＰＲＯ−ＩＬＥ−ＡＲＧ−ＡＲＧ−ＡＲＧ−ＳＥＲ−ＳＥＲ−ＡＳＮ−ＴＹＲ−ＡＲＧ−ＡＬＡ−ＴＹＲ−ＡＬＡ−ＴＨＲ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＨＩＳ−ＡＬＡ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＳＥＲ、及び、ＡＲＧ−ＡＬＡ−ＴＹＲ−ＡＬＡ−ＴＨＲ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＨＩＳ−ＡＬＡ− ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＳＥＲ、及び、これらの一部分から成る群より選択されるペプチドを含む固相と、抗トロポニンＩ抗血清とを、前記ペプチドに特異的な抗体が前記固相へ結合できるような条件下で接触させ；前記固相を前記抗血清から分離し、その後、結合した前記抗体を前記固相から溶出することによって調製される、ことを特徴とする請求項３５記載の心臓トロポニンＩに特異的なポリクローナル抗体製剤。３７．前記抗トロポニンＩ抗血清が、精製した心臓トロポニンＩで動物を免役することによって調製される、ことを特徴とする請求項３５記載のポリクローナル抗体製剤。３８．前記ポリクローナル製剤が、インビトロ用途である、ことを特徴とする請求項３５記載のポリクローナル抗体製剤。３９．前記抗トロポニンＩ抗血清が、精製した心臓トロポニンＩで動物を免役することによって調製される、ことを特徴とする請求項３６記載のポリクローナル抗体製剤。４０．ＡＲＧ−ＧＬＹ−ＧＬＵ−ＬＹＳ−ＧＬＹ−ＡＲＧ−ＡＬＡ−ＬＥＵ−ＳＥＲ−ＴＨＲ−ＡＲＧ−ＣＹＳ−ＧＬＮ−ＰＲＯ−ＬＥＵ−ＧＬＵ−ＬＥＵ−ＡＬＡというペプチドに特異的なポリクローナル抗体。４１．ＡＲＧ−ＧＬＹ−ＧＬＵ−ＬＹＳ−ＧＬＹ−ＡＲＧ−ＡＬＡ−ＬＥＵ−ＳＥＲ−ＴＨＲ−ＡＲＧ−ＣＹＳ−ＧＬＮ−ＰＲＯ−ＬＥＵ−ＧＬＵ−ＬＥＵ−ＡＬＡというペプチドに特異的なモノクローナル抗体。４２．ＡＲＧ−ＧＬＹ−ＧＬＵ−ＬＹＳ−ＧＬＹ−ＡＲＧ−ＡＬＡ−ＬＥＵ−ＳＥＲ−ＴＨＲ−ＡＲＧ−ＣＹＳ−ＧＬＮ−ＰＲＯ−ＬＥＵ−ＧＬＵ−ＬＥＵ−ＡＬＡというペプチド、又は、この一部分を含む固相と、抗トロポニンＩ抗血清とを、前記ペプチドに特異的な抗体が前記固相へ結合できるような条件下で接触させ；前記固相を前記抗血清から分離し、その後、結合した前記抗体を前記固相から溶出することによって調製される、ことを特徴とする請求項３５記載の心臓トロポニンＩに特異的なポリクローナル抗体製剤。４３．前記抗トロポニンＩ抗血清が、精製した心臓トロポニンＩで動物を免役することによって調製される、ことを特徴とする請求項４２記載のポリクローナル抗体製剤。４４．骨格トロポニンＩには存在しない心臓トロポニンＩの領域に対して少なくとも７５％の相同性を有するアミノ酸配列を持つペプチド、又は、骨格トロポニンＩの対応領域とはアミノ酸配列の少なくとも５０％のアミノ酸が相違するペプチドを含む固相と、抗トロポニンＩ抗血清とを、前記ペプチドに特異的な抗体が前記固相へ結合できるような条件下で接触させ；前記固相を前記抗血清から分離し、その後、結合した前記抗体を前記固相から溶出する、ことを特徴とする心臓トロポニンＩに特異的なポリクローナル抗体の調製方法。４５．前記抗トロポニンＩ抗血清が、精製した心臓トロポニンＩで動物を免役することによって調製される、ことを特徴とする請求項４４記載の方法。４６．前記心臓トロポニンＩに特異的なポリクローナル抗体が、ＭＥＴ−ＡＬＡ−ＡＳＰ−ＧＹＬ−ＳＥＲ−ＳＥＲ−ＡＳＰ−ＡＬＡ−ＡＬＡ− ＡＲＧ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＡＲＧ−ＰＲＯ−ＡＬＡ−ＰＲＯ−ＡＬＡ−ＰＲＯ− ＩＬＥ−ＡＲＧ−ＡＲＧ−ＡＲＧ−ＳＥＲ−ＳＥＲ−ＡＳＮ−ＴＹＲ−ＡＲＧ− ＡＬＡ−ＴＹＲ−ＡＬＡ−ＴＨＲ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＨＩＳ−ＡＬＡ−ＬＹＳ− ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＳＥＲ、及び、ＡＲＧ−ＡＬＡ−ＴＹＲ−ＡＬＡ−ＴＨＲ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＨＩＳ−ＡＬＡ− ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＳＥＲ、及び、これらの一部分から成る群より選択されるペプチドを含む固相と、抗トロポニンＩ抗血清とを、前記ペプチドに特異的な抗体が前記固相へ結合できるような条件下で接触させ；前記固相を前記抗血清から分離し、その後、結合した前記抗体を前記固相から溶出することによって調製される、ことを特徴とする請求項４４記載の方法。４７．前記抗トロポニンＩ抗血清が、精製した心臓トロポニンＩで動物を免役することによって調製される、ことを特徴とする請求項４６記載の方法。４８．請求項３５の前記心臓トロポニンＩに特異的なポリクローナル抗体が、ＡＲＧ−ＧＬＹ−ＧＬＵ−ＬＹＳ−ＧＬＹ−ＡＲＧ−ＡＬＡ−ＬＥＵ−ＳＥＲ− ＴＨＲ−ＡＲＧ−ＣＹＳ−ＧＬＮ−ＰＲＯ−ＬＥＵ−ＧＬＵ−ＬＥＵ−ＡＬＡというペプチド、又は、この一部分を含む固相と、抗トロポニンＩ抗血清とを、前記ペプチドに特異的な抗体が前記固相へ結合できるような条件下で接触させ；前記固相を前記抗血清から分離し、その後、結合した前記抗体を前記固相から溶出することによって調製される、ことを特徴とする請求項４４記載の方法。４９．前記抗トロポニンＩ抗血清が、精製した心臓トロポニンＩで動物を免役することによって調製される、ことを特徴とする請求項４８記載の方法。５０．サンドイッチイムノアッセイで用いるための請求項３５記載のポリクローナル抗体製剤。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＧ０１Ｎ 33/50 0276−2ＪＧ０１Ｎ 33/50 Ｔ 33/531 0276−2Ｊ 33/531 Ａ // Ａ６１Ｋ 39/395 9284−4ＣＡ６１Ｋ 39/395 Ｄ 9284−4ＣＮ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ツァートマンレスリーオー. アメリカ合衆国 15801 ペンシルバニア州デュボイス、トレジャーレイク 875 (72)発明者バーガスアネットエム. アメリカ合衆国 59074 モンタナ州ライゲイト、ロシメイロード 361 (72)発明者トレッティーステイシーエイ. アメリカ合衆国 15865 ペンシルバニア州サイクスビル、イーストメインストリート 111

Claims

【特許請求の範囲】１．生物学的液体中の心臓トロポニンＩを定量するためのアッセイであって：ａ．ｉ）生物学的液体サンプル；ｉｉ）心臓トロポニンＩに特異的な抗体、又は、抗体断片；及びｉｉｉ）トロポニンＣ、又は、そのトロポニンＩ結合断片を、前記サンプル中のトロポニンＩ、前記抗体、及び、前記トロポニンＣが三元複合体を形成するような条件下で、連続的、又は、同時にインキュベートし；ｂ．前記サンプルから前記三元複合体を分離し；ｃ．前記生物学的液体中の心臓トロポニンＩの量の指標として、前記三元複合体の形成を検出する、ことを特徴とするアッセイ。２．前記生物学的液体サンプル、前記抗体又はその断片、及び、トロポニンＣ又はその断片が、三元複合体を形成するために、一緒に同時にインキュベートされる、ことを特徴とする請求項１記載のアッセイ。３．前記抗体、及び、前記サンプルが、前記抗体と前記サンプル中のトロポニンＩとの間で二元複合体を形成するためにインキュベートされ、次いで、前記二元複合体、及び、トロポニンＣが、前記三元複合体を形成するために一緒にインキュベートされる、ことを特徴とする請求項１記載のアッセイ。４．前記抗体が、固相に固定化されている、ことを特徴とする請求項１記載のアッセイ。５．前記トロポニンＣが、固相に固定化されている、ことを特徴とする請求項１記載のアッセイ。６．前記固相が、プラスチック面である、ことを特徴とする請求項４記載のアッセイ。７．前記生物学的液体が、血清である、ことを特徴とする請求項１記載のアッセイ。８．前記トロポニンＣが、酵素標識されており、前記三元複合体の形成が、前記三元複合体に関わる酵素活性の測定によって検出される、ことを特徴とする請求項１記載のアッセイ。９．前記酵素が、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、及び、ベータガラクトシダーゼから成る群より選択される、ことを特徴とする請求項８記載のアッセイ。１０．前記トロポニンＣが、ウサギの骨格筋から得られたものである、ことを特徴とする請求項１記載のアッセイ。１１．前記抗体が、骨格トロポニンＩには存在しない心臓トロポニンＩの領域に対して少なくとも７５％の相同性を有するアミノ酸配列を持つペプチド、又は、骨格トロポニンＩの対応領域とはアミノ酸配列の少なくとも５０％のアミノ酸が相違するペプチドを含む固相と、抗トロポニンＩ抗血清とを、前記ペプチドに特異的な抗体が固相へ結合できるような条件下で接触させ；固相を抗血清から分離し、その後、結合した抗体を固相から溶出することによって調製される、心臓トロポニンＩに特異的なポリクローナル抗体である、ことを特徴とする請求項１記載のアッセイ。１２．前記ペプチドが：ＭＥＴ−ＡＬＡ−ＡＳＰ−ＧＹＬ−ＳＥＲ−ＳＥＲ−ＡＳＰ−ＡＬＡ−ＡＬＡ− ＡＲＧ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＡＲＧ−ＰＲＯ−ＡＬＡ−ＰＲＯ−ＡＬＡ−ＰＲＯ− ＩＬＥ−ＡＲＧ−ＡＲＧ−ＡＲＧ−ＳＥＲ−ＳＥＲ−ＡＳＮ−ＴＹＲ−ＡＲＧ− ＡＬＡ−ＴＹＲ−ＡＬＡ−ＴＨＲ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＨＩＳ−ＡＬＡ−ＬＹＳ− ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＳＥＲ、ＡＲＧ−ＡＬＡ−ＴＹＲ−ＡＬＡ−ＴＨＲ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＨＩＳ−ＡＬＡ− ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＳＥＲ、及び、ＡＲＧ−ＧＬＹ−ＧＬＵ−ＬＹＳ−ＧＬＹ−ＡＲＧ−ＡＬＡ−ＬＥＵ−ＳＥＲ− ＴＨＲ−ＡＲＧ−ＣＹＳ−ＧＬＮ−ＰＲＯ−ＬＥＵ−ＧＬＵ−ＬＥＵ−ＡＬＡから成る群より選択される配列全体、又は、配列の一部のアミノ酸配列を持つ、ことを特徴とする請求項１１記載のアッセイ。１３．前記抗体が、ＡＲＧ−ＡＬＡ−ＴＹＲ−ＡＬＡ−ＴＨＲ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＨＩＳ−ＡＬＡ− ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＳＥＲ、又は、その一部のアミノ酸配列を持つペプチドに特異的なモノクローナル抗体、又は、ポリクローナル抗体である、ことを特徴とする請求項１記載のアッセイ。１４．心臓トロポニン１のアッセイを行うための試薬を含むキットであって：ａ．心臓トロポニンＩに特異的な抗体、又は、抗体断片、及び、ｂ．トロポニンＣ、又は、そのトロポニンＩ結合断片、から成る、ことを特徴とするキット。１５．前記トロポニンＣが、酵素標識されている、ことを特徴とする請求項１４記載のキット。１６．前記酵素が、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、及び、ベータガラクトシダーゼから成る群より選択される、ことを特徴とする請求項１５記載のキット。１７．前記トロポニンＣが、ウサギの骨格筋から得られたものである、ことを特徴とする請求項１４記載のキット。１８．前記抗体が、ＭＥＴ−ＡＬＡ−ＡＳＰ−ＧＹＬ−ＳＥＲ−ＳＥＲ−ＡＳＰ−ＡＬＡ−ＡＬＡ− ＡＲＧ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＡＲＧ−ＰＲＯ−ＡＬＡ−ＰＲＯ−ＡＬＡ−ＰＲＯ− ＩＬＥ−ＡＲＧ−ＡＲＧ−ＡＲＧ−ＳＥＲ−ＳＥＲ−ＡＳＮ−ＴＹＲ−ＡＲＧ− ＡＬＡ−ＴＹＲ−ＡＬＡ−ＴＨＲ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＨＩＳ−ＡＬＡ−ＬＹＳ− ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＳＥＲ、ＡＲＧ−ＡＬＡ−ＴＹＲ−ＡＬＡ−ＴＨＲ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＨＩＳ−ＡＬＡ− ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＳＥＲ、及び、ＡＲＧ−ＧＬＹ−ＧＬＵ−ＬＹＳ−ＧＬＹ−ＡＲＧ−ＡＬＡ−ＬＥＵ−ＳＥＲ− ＴＨＲ−ＡＲＧ−ＣＹＳ−ＧＬＮ−ＰＲＯ−ＬＥＵ−ＧＬＵ−ＬＥＵ−ＡＬＡから成る群より選択されるペプチドに特異的なモノクローナル抗体、又は、ポリクローナル抗体である、ことを特徴とする請求項１４記載のキット。１９．生物学的液体中の心臓トロポニンＩを定量するための固相イムノアッセイであって：ａ．ｉ）生物学的液体サンプル；ｉｉ）心臓トロポニンＩに特異的なポリクローナル抗体、又は、抗体断片を含む固相免疫吸着剤；及びｉｉｉ）標識トロポニンＣ、又は、そのトロポニンＩ結合断片を、前記サンプル中のトロポニンＩが、前記固定化抗体、及び、前記標識トロポニンＣと複合体を形成するために十分な条件下で、同時にインキュベートし；ｂ．前記サンプルから前記固相免疫吸着剤を分離し；ｃ．前記生物学的液体中の心臓トロポニンＩの量の指標として、前記固相に結合した標識トロポニンＣ又はその断片の量、又は、結合していない標識トロポニンＣ又はその断片の量を検出する、ことを特徴とする固相イムノアッセイ。２０．前記生物学的液体が、血清である、ことを特徴とする請求項１９記載のイムノアッセイ。２１．前記固相が、プラスチック表面である、ことを特徴とする請求項１９記載のイムノアッセイ。２２．前記トロポニンＣが、酵素標識されている、ことを特徴とする請求項１９記載のイムノアッセイ。２３．前記酵素が、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、及び、ベータガラクトシダーゼから成る群より選択される、ことを特徴とする請求項２２記載のイムノアッセイ。２４．前記トロポニンＣが、ウサギの骨格筋から得られたものである、ことを特徴とする請求項１９記載のイムノアッセイ。２５．前記抗体が、骨格トロポニン１には存在しない心臓トロポニンＩの領域に対して少なくとも７５％の相同性を有するアミノ酸配列を持つペプチド、又は、骨格トロポニンＩの対応領域とはアミノ酸配列の少なくとも５０％のアミノ酸が相違するペプチドを含む固相と、抗トロポニンＩ抗血清とを、前記ペプチドに特異的な抗体が固相へ結合できるような条件下で接触させ；固相を抗血清から分離し、その後、結合した抗体を固相から溶出することによって調製される、心臓トロポニンＩに特異的なポリクローナル抗体である、ことを特徴とする請求項１９記載のイムノアッセイ。２６．前記ペプチドが：ＭＥＴ−ＡＬＡ−ＡＳＰ−ＧＹＬ−ＳＥＲ−ＳＥＲ−ＡＳＰ−ＡＬＡ−ＡＬＡ− ＡＲＧ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＡＲＧ−ＰＲＯ−ＡＬＡ−ＰＲＯ−ＡＬＡ−ＰＲＯ− ＩＬＥ−ＡＲＧ−ＡＲＧ−ＡＲＧ−ＳＥＲ−ＳＥＲ−ＡＳＮ−ＴＹＲ−ＡＲＧ− ＡＬＡ−ＴＹＲ−ＡＬＡ−ＴＨＲ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＨＩＳ−ＡＬＡ−ＬＹＳ− ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＳＥＲ、ＡＲＧ−ＡＬＡ−ＴＹＲ−ＡＬＡ−ＴＨＲ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＨＩＳ−ＡＬＡ− ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＳＥＲ、及び、ＡＲＧ−ＧＬＹ−ＧＬＵ−ＬＹＳ−ＧＬＹ−ＡＲＧ−ＡＬＡ−ＬＥＵ−ＳＥＲ− ＴＨＲ−ＡＲＧ−ＣＹＳ−ＧＬＮ−ＰＲＯ−ＬＥＵ−ＧＬＵ−ＬＥＵ−ＡＬＡから成る群より選択される配列全体、又は、配列の一部のアミノ酸配列を持つ、ことを特徴とする請求項２５記載のイムノアッセイ。２７．前記ポリクローナル抗体が、ＡＲＧ−ＡＬＡ−ＴＹＲ−ＡＬＡ−ＴＨＲ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＨＩＳ−ＡＬＡ− ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＳＥＲ、というペプチドに特異的である、ことを特徴とする請求項１９記載のイムノアッセイ。２８．トロポニンＩの固相イムノアッセイを行うための試薬キットであって：ａ．心臓トロポニンＩに特異的なポリクローナル抗体、又は、抗体断片を含む固相免疫吸着剤、及び、ｂ．標識トロポニンＣ、又は、そのトロポニンＩ結合断片、から成る、ことを特徴とするキット。２９．前記トロポニンＣが、酵素標識されている、ことを特徴とする請求項２８記載のキット。３０．前記酵素が、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、及び、ベータガラクトシダーゼから成る群より選択される、ことを特徴とする請求項２９記載のキット。３１．前記トロポニンＣが、ウサギの骨格筋から得られたものである、ことを特徴とする請求項２８記載のキット。３２．前記ポリクローナル抗体が、ＭＥＴ−ＡＬＡ−ＡＳＰ−ＧＹＬ−ＳＥＲ−ＳＥＲ−ＡＳＰ−ＡＬＡ−ＡＬＡ− ＡＲＧ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＡＲＧ−ＰＲＯ−ＡＬＡ−ＰＲＯ−ＡＬＡ−ＰＲＯ− ＩＬＥ−ＡＲＧ−ＡＲＧ−ＡＲＧ−ＳＥＲ−ＳＥＲ−ＡＳＮ−ＴＹＲ−ＡＲＧ− ＡＬＡ−ＴＹＲ−ＡＬＡ−ＴＨＲ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＨＩＳ−ＡＬＡ−ＬＹＳ− ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＳＥＲ、ＡＲＧ−ＡＬＡ−ＴＹＲ−ＡＬＡ−ＴＨＲ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＨＩＳ−ＡＬＡ− ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＳＥＲ、及び、ＡＲＧ−ＧＬＹ−ＧＬＵ−ＬＹＳ−ＧＬＹ−ＡＲＧ−ＡＬＡ−ＬＥＵ−ＳＥＲ− ＴＨＲ−ＡＲＧ−ＣＹＳ−ＧＬＮ−ＰＲＯ−ＬＥＵ−ＧＬＵ−ＬＥＵ−ＡＬＡから成る群より選択されるペプチドに特異的である、ことを特徴とする請求項２８記載のキット。３３．ＭＥＴ−ＡＬＡ−ＡＳＰ−ＧＹＬ−ＳＥＲ−ＳＥＲ−ＡＳＰ−ＡＬＡ−ＡＬＡ−ＡＲＧ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＡＲＧ−ＰＲＯ−ＡＬＡ−ＰＲＯ−ＡＬＡ−ＰＲＯ−ＩＬＥ−ＡＲＧ−ＡＲＧ−ＡＲＧ−ＳＥＲ−ＳＥＲ−ＡＳＮ−ＴＹＲ−ＡＲＧ−ＡＬＡ−ＴＹＲ−ＡＬＡ−ＴＨＲ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＨＩＳ−ＡＬＡ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＳＥＲ、ＡＲＧ−ＡＬＡ−ＴＹＲ−ＡＬＡ−ＴＨＲ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＨＩＳ−ＡＬＡ− ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＳＥＲ、及び、ＡＲＧ−ＧＬＹ−ＧＬＵ−ＬＹＳ−ＧＬＹ−ＡＲＧ−ＡＬＡ−ＬＥＵ−ＳＥＲ− ＴＨＲ−ＡＲＧ−ＣＹＳ−ＧＬＮ−ＰＲＯ−ＬＥＵ−ＧＬＵ−ＬＥＵ−ＡＬＡから成る群より選択されるペプチドに特異的なポリクローナル抗体。３４．ＭＥＴ−ＡＬＡ−ＡＳＰ−ＧＹＬ−ＳＥＲ−ＳＥＲ−ＡＳＰ−ＡＬＡ− ＡＬＡ−ＡＲＧ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＡＲＧ−ＰＲＯ−ＡＬＡ−ＰＲＯ−ＡＬＡ− ＰＲＯ−ＩＬＥ−ＡＲＧ−ＡＲＧ−ＡＲＧ−ＳＥＲ−ＳＥＲ−ＡＳＮ−ＴＹＲ− ＡＲＧ−ＡＬＡ−ＴＹＲ−ＡＬＡ−ＴＨＲ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＨＩＳ−ＡＬＡ− ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＳＥＲ、ＡＲＧ−ＡＬＡ−ＴＹＲ−ＡＬＡ−ＴＨＲ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＨＩＳ−ＡＬＡ− ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＳＥＲ、及び、ＡＲＧ−ＧＬＹ−ＧＬＵ−ＬＹＳ−ＧＬＹ−ＡＲＧ−ＡＬＡ−ＬＥＵ−ＳＥＲ− ＴＨＲ−ＡＲＧ−ＣＹＳ−ＧＬＮ−ＰＲＯ−ＬＥＵ−ＧＬＵ−ＬＥＵ−ＡＬＡから成る群より選択されるペプチドに特異的なモノクローナル抗体。３５．骨格トロポニンＩには存在しない心臓トロポニンＩの領域に対して少なくとも７５％の相同性を有するアミノ酸配列を持つペプチド、又は、骨格トロポニンＩの対応領域とはアミノ酸配列の少なくとも５０％のアミノ酸が相違するペプチドを含む固相と、抗トロポニンＩ抗血清とを、前記ペプチドに特異的な抗体が固相へ結合できるような条件下で接触させ；固相を抗血清から分離し、その後、結合した抗体を固相から溶出することによって調製される、ことを特徴とする心臓トロポニンＩに特異的なポリクローナル抗体製剤。３６．ＭＥＴ−ＡＬＡ−ＡＳＰ−ＧＹＬ−ＳＥＲ−ＳＥＲ−ＡＳＰ−ＡＬＡ−ＡＬＡ−ＡＲＧ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＡＲＧ−ＰＲＯ−ＡＬＡ−ＰＲＯ−ＡＬＡ−ＰＲＯ−ＩＬＥ−ＡＲＧ−ＡＲＧ−ＡＲＧ−ＳＥＲ−ＳＥＲ−ＡＳＮ−ＴＹＲ−ＡＲＧ−ＡＬＡ−ＴＹＲ−ＡＬＡ−ＴＨＲ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＨＩＳ−ＡＬＡ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＳＥＲ、ＡＲＧ−ＡＬＡ−ＴＹＲ−ＡＬＡ−ＴＨＲ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＨＩＳ−ＡＬＡ− ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＳＥＲ、及び、ＡＲＧ−ＧＬＹ−ＧＬＵ−ＬＹＳ−ＧＬＹ−ＡＲＧ−ＡＬＡ−ＬＥＵ−ＳＥＲ− ＴＨＲ−ＡＲＧ−ＣＹＳ−ＧＬＮ−ＰＲＯ−ＬＥＵ−ＧＬＵ−ＬＥＵ−ＡＬＡ、及び、これらの一部分から成る群より選択されるペプチドを含む固相と、抗トロポニンＩ抗血清とを、前記ペプチドに特異的な抗体が固相へ結合できるような条件下で接触させ；前記固相を前記抗血清から分離し、その後、結合した抗体を前記固相から溶出することによって調製される、ことを特徴とする請求項３５記載の心臓トロポニンＩに特異的なポリクローナル抗体製剤。