JPH09504424A - 生物活性成分を合成、同定するための生体触媒的方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ある出発化合物に生体触媒反応を行って改変した出発化合物群からなるライブラリーを生成して最適な希望の活性を有する改変出発化合物を同定するための方法に関する。本発明においては、出発化合物、改変化合物は溶液中で遊離している。本方法は、希望の特異的活性を有する修飾医薬化合物の生産に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 生物活性成分を合成、同定するための生体触媒的方法 発明の背景 （ａ） 本発明は、生物活性成分の合成および同定の分野に属する。 （ｂ） 先行技術の記載 先行技術には化学的、細菌学的、あるいは酵素学的手法によって生物活性を有 する化合物を合成する例が多数存在する。これらの手法の最終目標は新規で改善 された医薬化合物を見いだすことにある。 新規医薬化合物の発見のプロセスの大部分は試行錯誤である。効果的な医薬化 合物の構築には多岐にわたる要因が関与するので、新規化合物発見のプロセスを 系統的な手法へと整理するのは非常に困難である。一つの医薬化合物が見いださ れるまでには、典型的には数千もの有機化合物を生物学的ソースから単離するか あるいは化学的に合成して試験しなければならない。 新しい化合物を合成してその生物活性を試験することは新規合成薬を同定する ための第一ステップであるが、これには時間と費用がかかる。活性化合物を同定 したり最適な活性を有する化合物を同定するための典型的なプロセスでは、多く の化合物を合成し、精製し、試験し、かつ他の化合物と比較しなければならない 。新しい化合物の合成の大部分は標準的な化学的方法によってなされる。化学的 方法は実質的にあらゆるタイプの有機化合物の合成に適用されるが、化学反応は 非特異的であるために、最終化合物が製造され試験に供せられる段階に到るまで には有機化合物の合成には多数の工程と複数回の精製が必要である。 最近、新しい生物学的および化学的手法が各種開発されているが、これによる と、小さなペプチドやオリゴヌクレオチドの大きなライブラリーのスクリーニン グや合成が提供される。これらの方法は、幅広い化学的化合物を合成するもので あるとともに生物活性化合物を同定することができる手段を提供するものである 。これら膨大な数の天然のあるいは非天然の高分子化合物の化学合成は複雑では あるが、処理可能ではある。なぜなら、各化合物は同一の化学的プロトコールの セットによって合成されるのであって、違いは単にアミノ酸やヌクレオチドが反 応 シーケンスに導入される順番が任意であるに過ぎないからである。 フォドール(Fodor)、Ｓ．Ｐ．Ａ．ら（１９９０年）、サイエンス、２５１、 ７６７−７７３は、生物活性レセプターに結合する新ペプチドリガンドを発見す るための方法を記載している。この方法は、固相化学と光リソグラフィーを組み 合わせて多岐にわたる小ペプチドを製作するものである。この文献に記載の研究 および関連する研究については、フォドール(Fodor)の国際特許第９２１００９ ２号、ダウワー(Dower)の国際特許第９１１９８１８号、バレット(Barett)の国 際特許第９１０７０８７号、およびピルング(Pirrung)の国際特許第９０１５０ ７０号にも記載されている。 ヒューテン(Houghten)、Ｒ．Ａ．ら（１９９１年）、ネーチャー、３５４、８ ４−８６は、遊離ペプチドのライブラリーの合成手法と共に最適なペプチドのリ ガンドを系統的に同定するための反復選択工程を記載している。この研究は国際 特許出願第９２０９３００号にも記載されている。 ラム(Lam)、Ｋ．Ｓ．ら（１９９１年）、ネーチャー、３５４、８２−８４は 、“１ビーズ、１ペプチド”の手法に基づいてペプチドライブラリーを固相マイ クロプレート支持体上で系統的に合成、スクリーニングするための方法を記載し ている。 クワーラ(Cwirla)、Ｓ．Ｅ．ら（１９９０年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７、６３７８−６３８２は、ランダムに合成したオリゴ ヌクレオチドを特定のファージ遺伝子の５’領域にクローニングしてペプチドラ イブラリーをファージの表面で構築する方法を記載しており、これによって表面 タンパクのＮ末端で数百万の異なった６アミノ酸ペプチドを発現させている。 これらの方法は生物活性を有するペプチドやオリゴヌクレオチドの同定を促進 するものである。しかし、ペプチドやオリゴヌクレオチドは生物学的利用能が低 く、インビボでは安定性に問題があるため、治療剤としての用途には制限がある 。通常、有効な薬物の構造が同定される前の段階として、活性ペプチドやオリゴ ヌクレオチドの構造を模倣する非生物学的化合物を当該ペプチドやオリゴヌクレ オチドの大まかな３次元構造に基づいて合成しなければならない。 ブーニン(Bunin)ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈeｍ．Ｓｏｃ．（１９９２年）、１１４， １０９９７−１０９９８は、固相合成技法を利用した、多くの１，４−ベンゾジ アザピン誘導体の合成を記載している。 先行技術には、非生理的物質を種々の条件下で酵素的に転換させる例が多数存 在する。酵素の特異性は変更／工作可能であることを記載する参考文献 １．Ｚａｋｓ，Ａ．とＫｌｉｂａｎｏｖ，Ａ．Ｍ．、−酵素の基質特異性は有機 溶媒中と水中で逆転する−、ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・ケミカル・ソ サイアティー、１０８、２７６７−２７６８、１９８６。 ２．Ｆｅｒｊａｎｃｉｃ，Ａ．、Ｐｕｉｇｓｅｒｖｅｒ，Ａ．およびＧａｅｒｔ ｎｅｒ，Ｈ．、−有機溶媒中で促進されたペプチド合成におけるＰＥＧ修飾サー モリシンの例外的特異性−、バイオテクノロジー・レターズ、１０（２）、１０ １−１０６、１９８８。 ３．Ｎａｓｒｉ，ＭとＴｈｏｍａｓ，Ｄ．、−有機溶媒の存在下における、特異 性リラクゼーションによる制限エンドヌクレアーゼの能力向上−、Ａｎｎ．Ｎ． Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、５４２、２５５−２６５、１９８８。 ４．Ｓｔａｈｌ，Ｍ．、Ｍａｎｓｓｏｎ，Ｍ．Ｏ．およびＭｏｓｂａｃｈ，Ｋ． 、−Ｄ−アミノ酸エステルをバイオインプリンティング手続によって改変したキ モトリプシによって有機媒体中で合成−、バイオテクノロジー・レターズ、１２ （３）、１６１−１６６、１９９０。 ５．Ｓｔａｈｌ，Ｍ．、Ｊｅｐｐｓｓｏｎ−Ｗｉｓｔｒａｎｄ，Ｕ．、Ｍａｎｓ ｓｏｎ，Ｍ．Ｏ．およびＭｏｓｂａｃｈ，Ｋ．、−無水有機媒体中におけるバイ オインプリンティッドα−キモトリプシンンの誘導された立体選択性と基質選択 性−、ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティー、１１３ （２４）、９３６６−９３６８、１９９１。 ６．Ｇｏｌｏｌｏｂｏｖ，Ｍ．Ｙ．、Ｖｏｙｕｓｈｉｎａ，Ｔ．Ｌ．、Ｓｔｅｐ ａｎｏｖ，Ｖ．Ｍ．およびＡｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚ，Ｐ、−有機溶媒は求核試薬 に関してキモトリプシンの特異性を変更する−、ＦＥＢＳレターズ、 ３０７（３）、３０９−３１２、１９９２。 ７．Ｈｅｒｔｍａｎｎｉ，Ｐ．、Ｐｏｕｒｐｌａｎｃｈｅ，Ｃ．およびＬａｒｒ ｅｔａ−Ｇａｒｄｅ，Ｖ．、−水溶性添加剤による酵素触媒と特異性の方向づけ −、Ａｎｎ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｅｎｚｙｍｅ Ｅｎｇ． ＸＩ．Ｄ．Ｓ．Ｃｌａｒｋ、Ｄ．Ａ．Ｅｓｔｅｌｌ編集）、６７２、３２９−３ ３５、１９９２。 ８．Ｃａｂｅｚａｓ，Ｍ．Ｊ．、ｄｅｌ Ｃａｍｐｏ，Ｃ．、Ｌｌａｍａ，Ｅ． 、Ｓｉｎｉｓｔｅｒｒａ，Ｊ．Ｖ．およびＧａｅｒｔｎｅｒ，Ｈ．、−改変酵素 によって触媒された有機反応 １．α−キモトリプシンの修飾プロセスによる基 質特異性の変更−、ジャーナル・オブ・モレキュラー・キャタリシス、７１（２ ）、２６１−２７８、１９９２。 ９．Ｎａｇａｓｈｉｍａ，Ｔ．、Ｗａｔａｎａｂｅ，Ａ，およびＫｉｓｅ，Ｈ． 、−有機溶媒中でのプロテアーゼによるペプチド合成：基質特異性についての媒 体の効果−、エンザイム・アンド・マイクロバイアル・テクノロジー、１４（１ ０）、８４２−８４７、１９９２。 １０．Ｐａｒｉｄａ，Ｓ．とＤｏｒｄｉｃｋ，Ｊ．Ｓ．、−溶媒および基質の化 学によるリパーゼ特異性の工作−、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、５８（１２）、３ ２３８−３２４４、１９９３。 １１．Ｔａｗａｋｉ，Ｓ．とＫｌｉｂａｎｏｖ，Ａ．Ｍ．、−無水媒体中での酵 素の化学選択性は非常に溶媒依存性である−、バイオキャタリシス、８（１）、 ３−１９、１９９３。 １２．Ｗｅｓｃｏｔｔ，Ｃ．Ｆ．とＫｌｉｂａｎｏｖ，Ａ．Ｍ．、−溶媒の変化 が酵素の基質特異性を変える−、ＪＡＣＳ、１１５（５）、１６２９−１６３１ 、１９９３。酵素の鏡像選択性は変更／工作可能であることを記載する参考文献 １．Ｓａｋｕｒａｉ，Ｔ．、Ｍａｒｇｏｌｉｎ，Ａ．Ｌ．、Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ａ ．Ｊ．およびＫｌｉｂａｎｏｖ，Ａ．Ｍ．、−反応溶媒による酵素の鏡像選択性 の制御−、ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティー、 １１０（２１）、７２３６−７２３７、１９８８。 ２．Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ，Ｐ．Ａ．とＫｌｉｂａｎｏｖ，Ａ．Ｍ．、−いか に溶媒は酵素の鏡像選択性に影響するか？−、ジャーナル・オブ・ザ・アメリカ ン・ケミカル・ソサイアティー、１１３（８）、３１６６−３１７１、 １９９ １。 ３．Ｈｕｌｔ，Ｋ．とＮｏｒｔｉｎ，Ｔ．、−いくつかのリパーゼの鏡像選択性 ／制御と予測−、ピュア・アンド・アプライド・ケミストリー、６４（８）、１ １２９−１１３４、１９９２。 ４．Ｍｉｙａｚａｗａ，Ｔ．、Ｋｕｒｉｔａ，Ｓ．、Ｕｅｊｉ，Ｓ．、Ｙａｍａ ｄａ，Ｔ．およびＫｕｗａｔａ，Ｓ．、−ビニルエステルを用いたリパーゼ触媒 不可逆エステル交換反応を経由するラセミカルボン酸の分解／鏡像選択性に関す る、求核試薬としてのアルコールと有機溶媒の効果−、バイオテクノロジー・レ ターズ、１４（１０）、９４１−９４６、１９９２。 ５．Ｔａｗａｋｉ，Ｓ．とＫｌｉｂａｎｏｖ，Ａ．Ｍ．、−溶媒で仲介される酵 素の鏡像選択性の転換−、ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・ケミカル・ソサ イアティー、１１４（５）、１８８２−１８８４、１９９２。 ６．Ｕｅｊｉ，Ｓ．、Ｆｕｊｉｎｏ，Ｒ．、Ｏｋｕｂｏ，Ｎ．、Ｍｉｙａｚａｗ ａ，Ｔ．、Ｋｕｒｉｔａ，Ｓ．、Ｋｉｔａｄａｎｉ，Ｍ．およびＭｕｒｏｍａｔ ｓｕ，Ａ．、−２−フェノキシプロピオン酸のリパーゼ触媒エステル化における 鏡像選択性の溶媒誘導転換−、バイオテクノロジー・レターズ、１４（３）、１ ６３−１６８、１９９２。 ７．Ｔｅｒｒａｄａｓ，Ｆ．、Ｔｅｓｔｏｎｈｅｎｒｙ，Ｍ．、Ｆｉｔｚｐａｔ ｒｉｃｋ，Ｐ．Ａ．およびＫｌｉｂａｎｏｖ，Ａ．Ｍ．、−溶媒に対する、酵素 のプロカイラル選択性の顕著な依存性−、ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・ ケミカル・ソサイアティー、１１５（２）、３９０−３９６、１９９３。 ８．Ｈｅｒｒａｄｏｎ，Ｂ．、−カイラルポリオキシゲン化化合物の生体触媒的 合成：有機溶媒中でのリパーゼ触媒エステル交換反応の鏡像選択性に対する溶媒 の効果−、シンレット、２、１０８−１１０、１９９３。非天然基質を転換する酵素の能力を記載する参考文献 １．Ｂｉａｎｃｈｉ，Ｄ．、Ｃｅｓｔｉ，Ｐ．、Ｇｏｌｉｎｉ，Ｐ．、Ｓｐｅｚ ｉａ，Ｓ．、Ｇａｒａｖａｇｌｉａ，Ｃ．およびＭｉｒｅｎｎａ，Ｌ．、−光学 活性な防カビ剤中間体を水性および有機性の媒体中で酵素によって調製する−、 ピュア・アンド・アプライド・ケミストリー、６４（８）、１０７３−１０７８ 、１９９２。 ２．Ｎａｔｏｌｉ，Ｍ．、Ｎｉｃｏｌｏｓｉ，Ｇ．およびＰｉａｔｔｅｌｌｉ， Ｍ．、−有機溶媒中でリパーゼを用いたフラボノイドアセテートの領域選択性ア ルコリシス−、ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー、５７（２１） 、５７７６−５７７８、１９９２。 ３．Ｉｚｕｍｉ，Ｔ．、Ｔａｍｕｒａ，Ｆ．およびＳａｓａｋｉ，Ｋ、−〈４〉 （１，２）フェロセノファン誘導体の酵素による動的分解−、ブルティン・オブ ・ザ・ケミカル・ソサイアティー・オブ・ジャパン、６５（１０）、２７８４− ２７８８、１９９２。 ４．Ｍｉｙａｚａｗａ，Ｔ．、Ｍｉｏ，Ｍ．、Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｙ．、Ｙａｍ ａｄａ，Ｔ．およびＫｕｗａｔａ，Ｓ、−非タンパクアミノ酸の分解に対するリ パーゼ触媒エステル交換手続−、バイオテクノロジー・レターズ、１４（９）、 ７８９−７９４、１９９２。 ５．Ｍｕｒａｔａ，Ｍ．、Ｕｃｈｉｄａ，Ｈ．およびＡｃｈｉｗａ，Ｋ．、−高 額活性メフォバルビタール、ヘキソバルビタール、およびフェバルバメートの、 リパーゼ触媒鏡像選択的合成−、ケミカル・ファーマスーティカル・ブルティン 、４０（１０）、２６０５−２６０９、１９９２。 ６．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｃ．Ｒ．、Ｇｏｌｅｂｉｏｗｓｋｉ，Ａ．およびＳｔｅｅ ｎｓｍａ，Ｄ．Ｈ．、−有機媒体中での酵素の不整化／シクロヘプタトリエンか らの非天然グルコースの合成−、ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・ケミカル ・ソサイアティー、１１４（２４）、９４１４−９４１８、１９９２。 ７．Ｃｒｕｃｅｓ，Ｍ．Ａ．、Ｏｔｅｒｏ，Ｃ．、Ｂｅｒｎａｂｅ，Ｍ．、Ｍａ ｒｔｉｎｌｏｍａｓ，Ｍ．およびＢａｌｌｅｓｔｅｒｏｓ，Ａ．、−アシル 化スクロースの酵素による調製−、Ａｎｎ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．（ＥｎｚｙｍｅＥｎｇ．ＸＩ．Ｄ．Ｓ．Ｃｌａｒｋ，Ｄ．Ａ．Ｅｓｔｅｌｌ ，ｅｄｓ）、６７２、４３６−４４３、１９９２。 ８．Ｔａｎａｋａ．Ａ．、Ｆｕｋｕｉ，Ｔ．、Ｕｅｊｉｍａ，Ａ．、Ｚｏｎｇ， Ｍ．Ｈ．およびＫａｗａｍｏｔｏ，Ｔ．、−非天然の有機化合物の生物学的転換 ／有機シリコン化合物のエステル化と脱ハロゲン−、Ａｎｎ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＥｎｚｙｍｅＥｎｇ．ＸＩ．Ｄ．Ｓ．Ｃｌａｒｋ，Ｄ．Ａ ．Ｅｓｔｅｌｌ，ｅｄｓ）、６７２、４３１−４３５、１９９２。 ９．Ｋｏｄｅｌｉａ，Ｇ．とＫｏｌｉｓｉｓ，Ｆ．Ｎ．、−有機溶媒中でのフラ ボノイドのアシル化に関する、プロテアーゼで触媒された反応の研究−、Ａｎｎ ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＥｎｚｙｍｅＥｎｇ．ＸＩ．Ｄ．Ｓ ．Ｃｌａｒｋ、Ｄ．Ａ．Ｅｓｔｅｌｌ編）、６７２、４５１−４５７、１９９２ 。 １０．Ｗａｇｎｅｒ，Ｆ．、Ｋｌｅｐｐｅ，Ｆ．、Ｌｏｋｏｔｓｃｈ，Ｗ．、Ｚ ｉｅｍａｎｎ，Ａ．およびＬａｎｇ，Ｓ．、−不動化リパーゼを用いた珍しいワ ックスエステルの合成−、Ａｎｎ．Ｎｅｗ ＹｏｒｋＡｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｅｎ ｚｙｍｅ Ｅｎｇ．ＸＩ．Ｄ．Ｓ．Ｃｌａｒｋ，Ｄ．Ａ．Ｅｓｔｅｌｌ，ｅｄｓ ）、６７２、４８４−４９１、１９９２。 １１．Ｐａｔｅｌ，Ｒ．Ｎ．、Ｈｏｗｅｌｌ，Ｊ．Ｍ．、Ｂａｎｅｒｊｅｅ，Ａ ．、Ｆｏｒｔｎｅｙ，Ｋ．Ｆ．およびＳｚａｒｋａ，Ｌ．Ｊ、−３−ベンゾイル チオ−２−メティルプロパン酸の立体選択性酵素によるエステル化−、Ａｎｎ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｅｎｚｙｍｅ Ｅｎｇ．ＸＩ．Ｄ．Ｓ ．Ｃｌａｒｋ，Ｄ．Ａ．Ｅｓｔｅｌｌ，ｅｄｓ）、６７２、４１５−４２４、１ ９９２。 １２．Ｂｅｒｇｂｒｅｉｔｅｒ，Ｄ．Ｅ．とＭｏｍｏｎｇａｎ，Ｍ、−酵素的方 法による有機金属性試薬の不整合成−、アプライド・バイオケミストリー・アン ド・バイオテクノロジー、３２、１−３、５５−７２、１９９２。 １３．Ｃａｒｒｅｔｅｒｏ，Ｊ．Ｃ．とＤｏｍｉｎｇｕｅｚ，Ｅ．、−ヒドロキ シフェニルスルフォンのリパーゼ触媒による動的分解−、ジャーナル・オブ・オ ーガニック・ケミストリー、５７（１４）、３８６７−３８７３、１９９２。 １４．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｃ．Ｒ．、Ａｄａｍｓ，Ｊ．Ｐ．、Ｂｉｓ，Ｓ．Ｊ．、 Ｄｅｊｏｎｇ，Ｒ．Ｌ．、Ｇｏｌｅｂｉｏｗｓｋｉ，Ａ．、Ｍｅｄｉｃｈ，Ｊ． Ｒ．、Ｐｅｎｎｉｎｇ，Ｔ．Ｄ．、Ｓｅｎａｎａｙａｋｅ，Ｃ．Ｈ．、Ｓｔｅｅ ｎｓｍａ，Ｄ．Ｈ．およびＶａｎｚａｎｄｔ，Ｍ．Ｃ．、−生物活性ポリオール の合成における酵素の応用−、インディアン・ジャーナル・オブ・ケミストリー 、セクションＢ−オーガニック・ケミストリー・インクルーディング・メディシ ナル・ケミストリー、３２（１）、１４０−１４４、１９９３。 １５．Ｆａｂｒｅ，Ｊ．，Ｂｅｔｂｅｄｅｒ，Ｄ．，Ｐａｕｌ，Ｆ．，Ｍｏｎｓ ａｎ，ＰおよびＰｅｒｉｅ，Ｊ．、−ブチルアルファ−Ｄ−グルコピラノシドの 領域特異的な酵素のアシル化−、カルボハイドレート・リサーチ、２４３（２） 、４０７−４１１、１９９３。 １６．Ｂｉａｎｔｉ，Ｄ．，Ｃｅｓｔｉ，Ｐ．，Ｇｏｌｉｎｉ，Ｐ．，Ｓｐｅｚ ｉａ，Ｓ．，Ｇａｒａｖａｇｌｉａ，Ｃ．およびＭｉｒｅｎｎａ，Ｌ．、−光学 活性な防カビ剤中間体を水性および有機性の媒体中で酵素によって調製する−、 インディアン・ジャーナル・オブ・ケミストリー、セクションＢ−オーガニック ・ケミストリー・インクルーディング・メディシナル・ケミストリー、３２（１ ）、１７６−１８０、１９９３。 １７．Ｋａｎｅｒｖａ，Ｌ．Ｔ．とＳｕｎｄｈｏｌｍ，Ｏ、−有機溶媒中でのジ ルチアゼム合成のラセミ中間体の分解におけるリパーゼ触媒分解−、ジャーナル ・オブ・ザ・ケミカル・ソサイアティー−ペルキン・トランズアクションズＩ、 １３、１３８５−１３８９、１９９３。 １８．Ｉｋｅｄａ，ＩとＫｌｉｖａｎｏｖ，Ａ．Ｍ．、−複合化による、疎水性 溶媒に溶解した糖のリパーゼで触媒されたアシル化、−バイオテクノロジー・ア ンド・バイオエンジニアリング、４２（６）、７８８−７９１、１９９３。 １９．Ｈｙｕｎ、Ｃ．Ｋ．，Ｋｉｍ，Ｊ．Ｈ．，およびＲｙｕ，Ｄ．Ｄ．Ｙ．、 −セファレキシンの酵素による合成における水の活性の上昇効果−、バイオテク ノロジー・アンド・バイオエンジニアリング、４２（７）、８００−８０６、１ ９９３。 ２０．Ｐａｎｚａ，Ｌ．，Ｌｕｉｓｅｔｔｉ，Ｍ．Ｃｒｏｃｉａｔｉ，Ｅ．及び Ｒｉｖａ，Ｓ．、−４，６−Ｏ−ベンジリデン・グリコピラノシドの酵素触媒作 用による選択的アシル化−、Ｊ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｈｅｍ．、１２ （１）、１２５−１３０、１９９３。 ２１．Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｋｏｂａｔａｋｅ，Ｅ．，Ｉｋａｒｉｙａｍａ，Ｙ．お よびＡｉｚａｗａ，Ｍ．、−水−有機溶媒混合溶液中でのビリルビンオキシダー ゼによって触媒された１，５−ジヒドロキシナフタレンの領域酸化的重合−、ジ ャーナル・オブ・ポリマー・サイエンス、パートＡ−ポリマー・ケミストリー、 ３１（１１）２８５５−２８６１、１９９３。 ２２．Ｋｎａｎｉ，Ｄ．およびＫｏｈｎ，Ｄ．Ｈ．、−有機溶媒中の酵素的ポリ エステル化 ２．ラテラル置換脂肪族ポリエステルとコポリエステルの、酵素で 触媒された合成−、Ｊ．Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉ．ＰａｒｔＡ−ポリマー・ケミ ストリー、３１（１２）、２８８７−２８９７、１９９３。 ２３．Ｋａｎｅｒｖａ，Ｌ．Ｔ．およびＳｕｎｄｈｏｌｍ，Ｏ．、−有機溶媒中 でのメチルトレオ−２−ヒドロキシ−３−（４−メトキシフェニル）−３−（２ −ｘ−フェニルチオ）プロピオネートの分解における酵素によるアシル化−、ジ ャーナル・オブ・ザ・ケミカル・ソサイアティー−ペルキン・トランズアクショ ンズＩ、２０、２４０７−２４１０、１９９３。 ２４．Ｓｈａｒｍａ，Ａ．およびＣｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙ，Ｓ．、−炭水化 物のリパーゼ触媒によるアシル化−、バイオテクノロジー・レターズ、１５（１ １）、１１４５−１１４６、１９９３。 ２５．Ｐａｖｅｌ，ＫおよびＲｉｔｔｅｒ，Ｈ．、−重合体化学における酵素 ７．イソプロピルアルコールと９−フルオレニルメタノールを用いた末端カルボ キシのメタクリルオリゴマーとコポリマーの、リパーゼ触媒エステル化−、マク ロモレキュラー・シミー−、マクロモレキュラー・ケミストリー・アンド・フィ ジクス、１９４（１２）、３３６９−３３７６、１９９３。 ２６．Ｕｅｊｉｍａ，Ａ．，Ｆｕｋｕｉ，Ｔ．，Ｆｕｋｕｓａｋｉ，Ｅ．，Ｏｍ ａｔａ，Ｔ．，Ｋａｗａｍｏｔｏ，Ｔ．，Ｓｏｎｏｍｏｔｏ，Ｋ．およびＴａｎ ａｋａ，Ａ．、−有機溶媒中でのハイドロラーゼを用いた立体選択的エステル化 による効率のよいオルガノシリコン化合物の動的分解−、Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、３８（４）、４８２−４８６、１９９ ３。 ２７．Ｍｕｋｅｓｈ，Ｄ．，Ｓｈｅｔｈ，Ｄ．，Ｍｏｋａｓｈｉ，Ａ．，Ｗａｇ ｈ，Ｊ．，Ｔｉｌａｋ，Ｊ．Ｍ．，Ｂａｎｅｒｊｉ，Ａ．Ａ．およびＴｈａｋｋ ａｒ，Ｋ．Ｒ．、−イソソルバイドとソルビトールの、リパーゼで触媒されたエ ステル化−、バイオテクノロジー・レターズ、１５（１２）、１２４３−１２４ ６、１９９３。 ２８．Ｂａｌｄｅｓｓａｒｉ，Ａ．，Ｉｇｌｅｓｉａｓ，Ｌ．Ｅ．およびＧｒｏ ｓ，Ｅ．Ｇ．、−リパーゼの触媒作用によるエステル交換反応を利用した３−メ ルカプトプロパン−１，２−ジオールの領域選択的アシル化−、ジャーナル・オ ブ・ケミカル・リサーチ−Ｓ９、３８２−３８３、１９９３。 ２９．Ｄｅ Ｇｏｅｄｅ，Ａ．Ｔ．Ｊ．Ｗ．，Ｂｅｎｃｋｈｕｉｊｓｅｎ，Ｗ． ，ｖａｎ Ｒａｎｔｗｉｊｋ，Ｆ．，Ｍａａｔ，Ｌ．およびｖａｎ Ｂｅｋｋｕ ｍ，Ｈ．、−官能化エチルエステルを用いた、アルキルα−Ｄ−グルコピラノシ ドの選択的リパーゼ触媒作用による６−Ｏ−アシル化−、（Recueil Des Travau x Chimiques des Pays Bas）−ジャーナル・オブ・ザ・ロイヤル・ネーデルラン ド・ケミストリー・ソサイアティー、１１２（１１）、５６７−５７２、１９９ ３。 ３０．Ｍｅｎｅｎｄｅｚ，Ｅ．とＧｏｔｏｒ，Ｖ．、−酵素によるオキシモリシ ス反応を経由するオキシム類のアシル化とアルコキシカルボニル化−、シンセシ ス−シュツットガルト、１、７２−７４、１９９３。 ３１．Ｌｉ，Ｙ．Ｆ．とＨａｍｍｅｒｓｃｈｍｉｄｔ，Ｆ、−有機化学における 酵素 １．エステル溶解性酵素によるα−（アシロキシ）フォスフォネートの鏡 像選択的加水分解−、テトラヘドロン−アシンメトリー、４（１）、１０９−１ ２０、１９９３。 ３２．Ｓｃｈｌｏｔｔｅｒｂｅｃｋ，Ａ．，Ｌａｎｇ，Ｓ．，Ｗｒａｙ，Ｖ．お よびＷａｇｎｅｒ，Ｆ．、−フコースのリパーゼで触媒されたモノアシル化−、 バイオテクノロジー・レターズ、１５（１）、６１−６４、１９９３。 ３３．Ｆｒｙｋｍａｎ，Ｈ．，Ｏｈｒｎｅｒ，Ｎ．，Ｎｏｒｉｎ，Ｔ．および Ｈｕｌｔ，Ｋ．、−第二アルコールのリパーゼで触媒された分解における、アシ ル供与体としてのＳ−エチルチオシアネート−、テトラヘドロン・レターズ、３ ４（８）、１３６７−１３７０、１９９３。 ３４．Ｏｇｕｎｔｉｍｅｉｎ，Ｇ．Ｂ．，Ｅｒｄｍａｎｎ，Ｈ．およびＳｃｈｍ ｉｄ，Ｒ．Ｄ．、−有機溶媒中での糖エステルのリパーゼで触媒された合成−、 バイオテクノロジー・レターズ、１５（２）、１７５−１８０、１９９３。 ３５．Ｌｏｐｅｚ，Ｒ．，Ｐｅｒｅｚ，Ｃ，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｍａｙｏｒａ ｌｅｓ，Ａ．およびＣｏｎｄｅ，Ｓ．、−アルキル２，３，４−トリ−Ｏ−アシ ル−β−Ｄ−キシロピラノシドの酵素によるエステル交換反応−、Ｊ．Ｃａｒｂ ｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｈｅｍ．、１２（２）、１６５−１７１、１９９３。 ３６．Ｎａｅｍｕｒａ，Ｋ．，Ｉｄａ，Ｈ．およびＦｕｋｕｄａ，Ｒ、−バイカ ルボサイクリック化合物のアルコールの、リパーゼＹＳ−触媒作用による鏡像選 択的性エーテル交換反応−、Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊａｐａｎ、６６（ ２）、５７３−５７７、１９９３。 ３７．Ｌａｍｂｕｓｔａ，Ｄ．，Ｎｉｃｏｌｏｓｉ，Ｇ．Ｐｉａｔｔｅｌｌｉ， ＭおよびＳａｎｆｉｌｉｐｐｏ，Ｃ．、−有機溶媒中でのリパーゼで触媒された フェノールのアシル化−、Ｉｎｄ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．、セクションＢ、３２（１） 、５８−６０、１９９３。 ３８．Ａｓｔｏｒｇａ，Ｃ．，Ｒｅｂｏｌｌｅｄｏ，Ｆ．およびＧｏｔｏｒ，Ｖ ．、−ジエステル類の酵素によるヒドラジノリシスおよびＮ−アミノスクシニミ ド誘導体の合成−、シンセシス−シュツットガルト、３、２８７−２８９、１９ ９３。 ３９．Ｆｕｋｕｉ，Ｔ．，Ｋａｗａｍｏｔｏ，Ｔ．およびＴａｎａｋａ，Ａ．、 −立体性シリコン原子を有する光学活性シリルメタノールの、ヒドロラーゼで触 媒された鏡像選択的エステル化による酵素的調製−、テトラヘドロン−アシンメ トリー、５（１）、７３−８２、１９９４。 ４０．Ｖａｚｑｕｅｚ−Ｄｕｈａｌｔ，Ｒ．，Ｗｅａｔｌａｋｅ，Ｄ．Ｗ．Ｓ． およびＦｅｄｏｒａｋ，Ｐ．Ｍ．、−有機溶媒含有系における芳香族化合物のリ グニンペロキシダーゼによる酸化−、アプライド・アンド・エンバイロンメンタ ル・マイクロバイオロジー、６０（２）、４５９−４６６、１９９４。 ４１．Ｋｏｄｅｌｉａ，Ｇ．，Ａｔｈａｎａｓｉｏｕ，Ｋ．およびＫｏｌｉｓｉ ｓ，Ｆ．Ｎ．、−有機溶媒中でのブチリルルチン・エステルの酵素による合成お よび哺乳類細胞培養におけるその細胞性効果−、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂ ｉｏｔｅｃｈ．、４４（３）、２０５−２１２、１９９４。 ４２．Ｔｓａｉ，Ｓ．Ｗ．とＷｅｉ，Ｈ．Ｊ．、−トリメチルシリルメタノール を用いたリパーゼによるナプロキセンの鏡像選択的エステル化における溶媒の影 響−、バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリング、４３（１）、６ ４−６８、１９９４。 ４３．Ａｔｈａｗａｌｅ，Ｖ．Ｄ．とＧａｏｎｋａｒ，Ｓ．Ｒ．、−リパーゼ触 媒ポリトランスエステル化によるポリエステルの酵素による合成−、バイオテク ノロジー・レターズ、１６（２）、１４９−１５４、１９９４。 ４４．Ｊａｎｓｓｅｎ，Ｇ．Ｇ．とＨａａｓ，Ｍ．Ｊ．、−ポリエチレングリコ ール４００のオレイン酸エステルのリパーゼ触媒による合成−、バイオテクノロ ジー・レターズ、１６（２）、１６３−１６８、１９９４。 ４５．Ｋｉｔａｚｕｍａ，Ｔ．，Ｉｋｅｙａ，Ｔ．およびＭｕｒａｔ，Ｋ．、− 光学活性トリフッソ化化合物の合成：加水分解酵素添加不整マイケル反応−、ジ ャーナル・オブ・ケミカル・ソサイアティー、ケミカル・コミュニケーションズ 、１３３１、１９８６。微生物的転換を記載する参考文献 １．Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｈ．Ｌ．、−有機合成における試薬としての真菌：プロス タノイド類、ステロイド類、およびその他の天然産物の代謝産物の調製−、Ｒｅ ｖ．Ｌａｔｉｎｏａｍ．Ｑｕｉｍ．，（１ｓｔ Ｓｐｅｃ．Ｓｕｐｐｌ．）、３ １８−３２９、１９９０。 ２．Ｓｉｈ，Ｃ．Ｊ．とＲｏｓａｚｚａ，Ｊ．Ｐ．、−有機合成における微生物 的転換−、Ｔｅｃｈ．Ｃｈｅｍ．（Ｎ．Ｙ．）、１０（Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅ ｍ．Ｓｙｓｔ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、パート１）、６９−１０６、１９７６。 ３．Ｓｉｈ，Ｃ．Ｊ．とＣｈｅｎ，Ｃ．Ｓ．、−ケトン類の微生物的不整触媒− 鏡像選択的還元−、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、２３（ ８）、５７０−５７８、１９８４。 ４．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｌ．Ａ．とＫｎｏｗｌｅｓ，Ｃ．Ｊ．，Ｌｉｎｔｏｎ， Ｅ．Ａ．およびＷｙａｔｔ，Ｊ．Ｍ．、−ニトリル類の微生物的生物バイオトラ ンスフォーメーション−、Ｃｈｅｍ．Ｂｒ．、２４（９）、９００、１９８８。 ５．Ｓｅｒｖｉ，Ｓ．、−有機合成における試薬としてのパン屋のイースト−、 シンセシス１、１−２５、１９９０。 ６．Ｃｓｕｋ，Ｒ．とＧｌａｎｚｅｒ，Ｂ．Ｉ．、−有機化学におけるパン屋の イーストで仲介された転換−、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．、９１（１）、４９−９７、 １９９１。 ７．Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｓ．Ｍ．，Ｗｉｇｇｉｎｓ，Ｋ．およびＣａｓｙ，Ｇ．、 −有機合成における全細胞および単離酵素−、Ｗｉｌｅｙ、ニューヨーク、１９ ９２。 ８．Ｗａｒｄ，Ｏ．Ｐ．とＹｏｕｎｇ，Ｃ．Ｓ．、−イーストの酵素または細胞 による有機化合物の還元的バイオトランスフォーメーション−、Ｅｎｘｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．、１２（７）、４８２−４９３、１９９０。レビュー １．Ｊｏｎｅｓ，Ｊ．Ｂ．、−有機合成における酵素−、テトラヘドロン、４２ （１３）、３３５１−３４０５、１９８６。 ２．Ｙａｍａｄａ，Ｈ．とＳｈｉｍｉｚｕ，Ｓ．、−生物学的および化学的に有 用な化合物を生産するための微生物的および酵素的プロセス−、Ａｎｇｅｗ．Ｃ ｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、２７（５）、６２２−６４２、１９８８。 ３．Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｓ．Ｍ．、−有機合成における触媒としての酵素−、 ＮＡＴＯ ＡＳＩ Ｓｅｒ．，Ｓｅｒ．Ａ．、１７８、４４３−４６３、１９８ ９。４．Ｃｈｅｎ，Ｓ．Ｓ．とＳｉｈ，Ｃ．Ｊ．、−有機溶媒中での鏡像選択性 生体触媒の最適化の一般的事項：リパーゼの使用−、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．（ Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、２８、ｎ６、６９５−７０７）、１０１（６）、７ １１−７２４、１９８９。 発明の概要 本発明は、出発化合物から非生物学的有機化合物のライブラリーを合成し、生 物活性を示すライブラリー中で個々の化合物を同定するために用いられる。ペプ チドやオリゴヌクレオチドと異なり、非生物学的有機化合物は、治療剤と認定さ れた剤を多量に含有している。本発明は、新しい薬剤の候補を直接同定する目的 や、最適とはいえない活性を有していたりあるいは好ましくない副作用を有する 既に確立された薬剤化合物を最適化するための目的で用いることもできる。これ は高度に特異的な生物活性反応を用いることで達成される。 酵素は非常に選択的な触媒である。酵素の特徴は精巧な立体的、領域的、およ び化学的選択性をもって反応を触媒する点にあって、これらは従来の合成化学で はすべてを同時に達成しえないものである。さらに、酵素は非常に多様に変更可 能であって、有機溶媒中で機能するように工作することもできるし、極端なｐＨ や温度でも作用でき、また、天然における生理学的基質とは構造的に無関係の化 合物の反応を触媒することもできる。 酵素は広範な天然および非天然の基質に対して反応性を有し、実質的にあらゆ る有機鉛化合物を修飾することが可能である。さらに、伝統的な化学触媒と異な って、酵素は高度に鏡像選択性および領域選択性である。酵素が示す高度な官能 基選択性によって、新しい活性化合物に至る合成系列における各反応を辿ること ができる。酵素はまた、天然においては生理的機能とは無関係である多くの反応 を触媒することもできる。例えば、ペロキシダーゼは、過酸化水素によるフェノ ールの酸化を触媒する。ペロキシダーゼは、この酵素の元来の機能とは無関係の 水酸化をも触媒することができる。その他の例としては、プロテアーゼが挙げら れ、これはポリペプチドの分解を触媒する。有機溶液中では、ある種のプロテア ーゼは糖類をアシル化することができるが、この機能はプロテアーゼの元来の機 能とは無関係なものである。 本発明は、酵素における特徴的な触媒特性を利用するものである。生体触媒（ 例えば精製酵素や粗酵素、さらに死んだ細胞や生きている細胞）を化学的転換に 使用するには、特定の出発化合物と反応する特定の生体触媒の同定が通常必要で あるが、本発明においては、多くの出発化合物中に存在する官能基に対して特異 的であるような、選択された生体触媒と反応条件が用いられる。各生体触媒は一 つの官能基に対して特異的であるか、あるいは幾つかの官能基に対して特異的で あって、この官能基を含有する多くの出発化合物と反応することができる。 生体触媒反応によって一つの出発化合物から誘導体集団が導かれる。この誘導 体をさらなる生体触媒反応工程に付して第二の誘導体集団を得ることもできる。 このような生体触媒誘導体生成の各繰り返し単位ごとに、元の化合物の数千もの 変形物を生産することができる。 酵素は、出発化合物の特定の部位と反応しつつも当該化合物分子の残部には影 響を及ぼさないが、このプロセスは伝統的な化学的方法によっては到底達成しえ ない。この高度な生体触媒的特異性が、ライブラリー中で一つの活性化合物を同 定する手段を提供する。ライブラリーは、これを生産するのに用いられる一連の 生体触媒的反応、即ちいわゆる“生合成ヒストリー”によって特徴付けられる。 ライブラリーを生物活性についてスクリーニングし、生合成ヒストリーを追跡す れば、活性化合物を産する特定の反応系列が同定される。この反応系列を繰り返 すと合成された化合物の構造が決定される。この同定法は他の合成、スクリーニ ング手法と異なり、不動化の技術を要さず、化合物は実質的にどのようなタイプ のスクリーニングアッセイによっても自由に溶液中で合成し、試験することがで きる。官能基に関し酵素反応が高度な特異性を有することによって、生体触媒的 に生成されたライブラリーを構築する特異的な酵素反応を“追跡する”ことがで きる、という点を認識することが重要である。 多くの手続段階がロボットによってオートメ化され、一日に何千もの生体触媒 反応やスクリーニングアッセイを処理することを可能としているとともに、高レ ベルの精度および再現性を確実なものとしている。その結果、現行の化学的方法 では数年かからないと得られなかったであろう誘導体化合物のライブラリーを数 週間程度で得ることができる。 本発明の特徴は、溶解した状態の出発化合物とそれに由来する誘導体を包含す る点にある。この点が本発明における特に特徴的な様相であって、これまでは障 害と考えられていたものである。生物活性化合物を同定するための従前の有機的 改変技術においては、不溶性の支持体に付着した誘導体と出発化合物とが使用さ れた。この例はエルマン(Ellman)（ブーニン、Ｂ．Ｓ．；エルマン、Ｊ．Ａ．“ １，４−ベンゾジアゼピン誘導体の固相合成のための一般的および便宜的方法” Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９２年、１１４、１０９９７−１０９９８） 、ゴードンら（ゴードン、Ｅ．Ｍ．；バレット、Ｒ．Ｗ．；ダウワー、Ｗ．Ｊ． ；フォドール、Ｓ．Ｐ．Ａ．；ギャロップ、Ｍ．Ａ．“薬剤発見のための組合せ 技術の適用 １．背景とペプチド組合せライブラリー”、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ ．、１９９４、３７、１２３３−１２５１；およびゴードン、Ｅ．Ｍ．；バレッ ト、Ｒ．Ｗ．；ダウワー、Ｗ．Ｊ．；フォドール、Ｓ．Ｐ．Ａ．；ギャロップ、 Ｍ．Ａ．“薬剤発見のための組合せ技術の適用２．組合せ有機合成、ライブラリ ー・スクリーニング戦略、および将来への指針”、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１ ９９４、３７、１３８５−１４０１；ホッブス・ドウィットら（ホッブス・ドウ ィット、Ｓ．；キーリー、Ｊ．Ｓ．；スタンコヴィック、Ｃ．Ｊ．；シュレーダ ー、Ｍ．Ｃ．；レイノルズ・コディー、Ｄ．Ｍ．；パヴィア、Ｍ．Ｒ．“ダイヴ ァーソマーズ：非ペプチド、非オリゴマー性の化学的多様性”Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ． （ＵＳＡ）、１９９３、９０、６９０９−６９１３）。溶解した状態でライブラ リーを合成することに加え、本発明のライブラリーは、固相支持体からのライブ ラリー除去を行うことなく即座にスクリーニングすることができる。よって、成 分を溶解状態に保持することによって、本発明は出発化合物および誘導体のライ ブラリーを生成しかつスクリーニングするための有用で便利でかつ効率のよい方 法を提供する。 本発明は、具体的には数々の多岐にわたる技術を利用するものである。例えば 、（１）薬剤候補のライブラリーを生産するための酵素反応の利用；（２）溶液 中で遊離している酵素または粒子表面に不動化された酵素、および溶液に溶解し ている状態で誘導された有機化合物の使用；（３）レセプターの使用（以下、こ の 用語は、ライブラリー中において有望な医薬候補を同定するために有用でかつ、 生体化合物やその他の結合分子に対して親和性を示す、真のレセプター、酵素、 抗体、およびその他の生体分子を指すものとし、このようなレセプターが細胞膜 あるいは完全な細胞に結合している場合も含む）；（４）ライブラリーを試験し て希望する活性の有無を調べるための生体触媒プロセス全体の自動化および操作 工程の多くの自動化；および（５）生体触媒反応を、合成された化合物とレセプ ター分子との結合を即座に測定できる薬剤スクリーニング機器と組み合わせ、あ るいは生体触媒反応を全細胞アッセイにおいて組合せ、これによって生物活性化 合物の元となる特異的反応系列を即座に同定すること。 特に、本発明は薬剤を同定するための方法に関し、本方法は次の（ａ）−（ｄ ）： （ａ）生体触媒群を出発化合物と混合することにより一連の生体触媒反応群を 引き起して反応混合物を得、次いで改変された出発化合物群からなるライブラリ ーを生成すること、 （ｂ）前記改変された出発化合物群からなるライブラリーを試験して、希望の 活性を示す改変された出発化合物が当該ライブラリー中に存在するかどうかを決 定すること、 （ｃ）前記ライブラリーの一部を生産するために用いられた生体触媒反応群を 構成する各触媒反応を系統的に消去し、次いでこのライブラリーの前記一部の中 に産生された化合物群を試験して前記希望の活性を示す改変された出発化合物の 存在、不存在を確認することによって、前記希望の活性を示す改変された出発化 合物を産生する特異的な生体触媒反応群を同定すること、および （ｄ）前記希望の活性を示す改変された化合物を産生する生体触媒反応群を繰 り返して反応生成物の化学組成を決定すること、 からなる。 具体的には、前記の酵素反応は、−出発化合物の構造内に存在し差別化しうる 別個の構造部分(moleties)と反応する酵素群との反応である。各酵素はある一つ の構造部分、あるいは関連する複数の構造部分からなる群に対して特異的である 。さらに、各酵素は、上記した別個の構造部分を含有する多くの異なった出発化 合 物と反応する。系統的に各反応を消去するほかに、本発明は、各反応を構築する 系統的プロセスを提供するが、これは反応経路の終点からのアプローチである。 本発明の格別の特徴は、出発化合物およびこれに引き続く誘導体が溶解した状態 である点に存する。 図面の簡単な説明 図１は、出発活性化合物ＡＺＴと、生体触媒誘導体生成の可能性を有する４つ の部位、および誘導体化合物群からなるライブラリーを生産するために用いられ 得る可能性を有する８つの可能な生体触媒反応を示す。 図２は、一日に数百の生体触媒反応とスクリーニングアッセイをロボットによ る自動化によって行う自動化システムを示す。 図３は、活性化合物を産生する反応系列を同定するための生体触媒反応群の追 跡を示し、これは、後でその活性化合物を生産してその構造を同定するために利 用される。 図４ａは、カスタノスペルミンの生体触媒修飾を示す。 図４ｂは、メトトレキセートの生体触媒修飾を示す。 発明の開示 以下、好ましい実施態様に関連させつつ本発明を記載するが、本発明は掲載さ れた特定の態様によって限定されるものではない。本発明の態様は、まずＡＺＴ について次いでタキソールについて記載するが、これらは本発明の単に一部の態 様であるに過ぎない。実際、添付の請求の範囲に記載された発明の範囲と精神に 沿うものであるかぎり、全ての代替物、改変物、および等価物が本発明に包含さ れ、保護の対象とされるものである。 本発明の好ましい態様を次の例で説明する。 ａ）ＡＺＴ（３’−アジドチミジン）等の出発化合物を選択する。この出発化 合物は、薬物活性を示すかあるいは所与の疾病や障害に対して薬物活性を示すと 信じられている化合物である。この化合物を、その官能基の内容および構造の変 更に関して分析する。分析には選択された生体触媒反応を利用する。選択された 生体触媒反応によって化学的に改変されうる官能基を表Ｉに示す。これらの官能 基の一以上の官能基は、実質的に全ての有機化合物中に存在する。これらの官能 基を修飾、改変する為に用いられる可能性を有する酵素反応の一部のリストを表 ＩＩに示す。 ｂ）選択された生体触媒反応を用いてこれらの官能基を系統的に改変し、かつ 生物活性に関するスクリーニング対象となる誘導体化合物群のライブラリーを生 産するための戦略的方法を適用する。ＡＺＴは、生体触媒的改変のために選択さ れる４つの官能基を有する。これらは即ち主たるヒドロキシル基、二つのカルボ ニル基、および第３級アミンである。 生合成戦略は、生体触媒“反応ボックス”の番号の形態で指定されるが、これ は、出発化合物中に存在する特定の官能基に作用する特定のタイプの生体触媒反 応群に対応する番号である。これらの“反応ボックス”を表ＩＩＩに示す。次の 生体触媒“反応ボックス”を選択してＡＺＴ誘導体ライブラリーの合成に使用す る：Ａ３、Ａ１１、Ｃ２、Ｇ６、Ｇ１０およびＧ１２。図１は、これらの選択さ れた生体触媒反応ボックスとＡＺＴとの反応を示す。 ｃ）生体触媒反応ボックスを図２に示す自動化システムに加える。本システム は前記の生体触媒反応と誘導体生成物のライブラリーの合成を自動的に行うよう にプログラムされている。単一の自動化システムで一日に数百もの予めプログラ ムされた生体触媒反応を行うことができる。各“反応ボックス”で生産される反 応生成物を分析し結果を掛け算することで、生成可能な化合物の全数の概数を算 出することができる。表ＩＶに、各反応ボックスで産生される可能性のある反応 生成物の数を示す。ＡＺＴの場合においては、最大１．７５×１０¹¹個の新規化 合物が合成できる。これはペプチドライブラリーとも好ましく比較されうるもの である点に留意されたい。例えば、ヘキサペプチドのライブラリーは２０⁶個即 ち６４百万個の化合物を含有するであろう。この数は、本明細書に記載する生合 成手法の利用によって達成可能な化合物の単に一部、約０．０４％に過ぎない。 表Ｖは、１１個の他の出発薬物化合物についての同様の分析結果を示す。この表 から判るように、本発明の生合成反応によって、医薬スクリーニングに供するた めの膨大な数の誘導体化合物を生成することができる。 ｄ）新規化合物群からなる合成ライブラリーをアッセイに付す。アッセイとし ては酵素阻害アッセイ、レセプター結合アッセイ、イムノアッセイ、および／ま たは細胞アッセイが挙げられ、これによって生物活性化合物を同定する。誘導体 化合物のライブラリーをアッセイに付す前に、当該ライブラリーに存在する残存 ＡＺＴを除去するかあるいは阻止して、スクリーニングアッセイ結果の解釈を簡 略化する。これはＨＰＬＣ、ＴＬＣ、または出発化合物に対して特異的なモノク ローナル抗体の添加によって容易に達成可能である。数々のインビトロアッセイ を利用して、抗ウイルス活性、抗癌活性、抗高血圧活性、およびその他の良く知 られた医薬活性が試験される。これらのアッセイの幾つかを表ＶＩに記載する。 これらのアッセイの多くは、自動化システム上でも実行可能である。 ｅ）陽性の結果が出たライブラリーは、生体触媒追跡プロトコールを用いてさ らに分析する。このプロトコールによって、スクリーニングアッセイで陽性とな る化合物の合成のための反応系列を迅速に同定する。生体触媒が示す高度な特異 性（即ち、所与の官能基と反応する所与の酵素の能力）によって、本アプローチ を容易に行うことができる。ライブラリーは、このライブラリーを生産するため に用いる一連の生体触媒反応、即ち所謂“生合成ヒストリー”によって特徴付け られる。このライブラリーを構成する各部分が生物活性を有するか否かについて スクリーニングを繰り返して調べ、活性化合物を産生する特定の反応系列を同定 する。図３にこの追跡プロセスを示す。例えば、太線のパス１５は最も活性の高 い化合物に至る反応経路を示す。反応系列を繰り返し、化学分析に供するに十分 な量の生成物を生成する。この生体触媒反応の特異性はまた、活性化合物を産生 する反応経路を正確に再現することを可能とする。活性化合物の構造は出発化合 物、基質、および同定された生体触媒反応系列を分析することによって定性的に 決定される。次いでこの構造を、ガスクロマトグラフィー、質量分析法、ＮＭＲ 分析法、その他の有機分析方法によって確認する。この同定法においては生成物 の精製工程は不要であって、かつ有望な新規薬物化合物を同定するために必要な 試験スクリーニングも少ない。本プロセスは新規薬物化合物の合成、同定に必要 な時間を驚異的に短縮する。加えて、この活性化合物同定法は不動化技術を要せ ず、かつ化合物の合成および試験は、実質的にどのようなタイプのスクリーニン グアッセイ（レセプターアッセイ、酵素阻止アッセイ、イムノアッセイ、細胞、 動物モデル）によってもインビボ様の条件下で溶液中で遊離体のままで行うこと ができる。 医薬の分野の当業者は、表ＩＩおよび表ＩＩＩに掲載したような多くの生体触 媒転換、並びに表ＶＩに掲載したインビトロの薬剤スクリーニングアッセイを承 知しているであろう。 また、溶媒、バッファー、ｐＨ、イオン強度、試薬濃度、および温度などのフ ァクターを制御、調整することによって生体触媒反応が最適化されうるというこ とは、医薬分野の当業者の了解事項であろう。 生体触媒反応に用いられる生体触媒は未精製酵素や精製酵素、細胞溶解調製物 、部分精製溶解産物調製物、生きた細胞や生きていない完全な形の細胞などであ って、これらは溶液、懸濁液として、または磁性体や非磁性体表面上に不動化さ せて使用する。 加えて、非特異的な化学反応を前記生体触媒反応と組み合わせて行うことによ り、出発化合物の改変物ライブラリーを得ることができる。そのような非特異的 化学反応の例としては次のものが挙げられる：芳香族化合物や脂肪族化合物のヒ ドロキシル化；酸化反応；還元反応；水和反応；脱水反応；加水分解反応；酸又 は塩基を使用する触媒されたエステル化反応；エステル交換反応；アルドール縮 合反応；還元的アミノ化；アミノ分解反応；脱水素ハロゲン化反応；ハロゲン化 反応；アシル化反応；アシル基置換反応；芳香族基置換反応；グリニャール合成 反応；フリーデル−クラフツアシル化反応；エステル化反応。 前記生体触媒反応は、磁性生体触媒を形成する磁性粒子に不動化された生体触 媒を用いて行うことができる。この態様での方法は、不動化された生体触媒を基 質（群）、コファクター（群）、および特異的生体触媒反応に用いられる溶媒／ バッファー条件と組合せることにより、前記生体触媒反応を開始することによっ て行われる。次いで磁性生体触媒を生体触媒反応混合物から除去して生体触媒反 応を停止する。除去は、外部磁界を印加して生体触媒が不動化された磁性粒子を 磁界源に引きつけ、凝集させることにより、効果的に磁性生体触媒を生体触媒反 応混合物から分離することにより行われる。これによって磁性生体触媒は第一反 応容器に残しつつ、磁性生体触媒が除去された反応混合物を第一反応容器から第 二反応容器に移すことができる。第二の生体触媒反応は第一の生体触媒反応とは 完全に独立して行われる。この第二の生体触媒反応では、磁性粒子に不動化され た第二の生体触媒を、前記第一の反応容器から移された生体触媒反応混合物を含 有する第二の反応容器に添加する。最後にこれらの工程を繰り返し、それぞれ別 個の独立した一連の生体触媒反応群を達成する。ここにおいて、各反応はそれぞ れ対応する出発化合物改変物を産生する反応である。 このような生体触媒反応は、生体触媒反応混合物に生体触媒を添加したり、除 去したりするのに好都合である表面であればどのような表面上に不動化された生 体触媒を用いても行うことができ、これによってもそれぞれ別個の独立した一連 の生体触媒反応群が達成される。ここにおいて、各反応はそれぞれ対応する出発 化合物改変物を産生する反応である。 また、生体触媒反応は、公知の薬物化合物を誘導してそのような薬物化合物の 新規誘導体群を産生し、そのライブラリーから最適な活性を示す個々の化合物を 選択するために用いることもできる。これを達成するには、高度の親和性を有す るレセプターを生体触媒反応混合物に組み込む。このような組み込みが可能な理 由は、生合成の反応条件とスクリーニングの反応条件が適合するためである。高 度の親和性を有するレセプターを出発活性化合物のモル濃度の約二分の一で反応 混合物に加えると、基本的に全てのレセプターが出発活性化合物に結合するとと もに等モル濃度の出発活性化合物が溶液中に遊離し、生体触媒による改変のため に利用できる。もし生体触媒反応混合物が、レセプターに対するより高度な結合 親和性を有する誘導体を生産し、これが改善された医薬性能に転換できる場合、 この誘導体は結合した出発活性化合物と置き代わるとともにレセプターとは複合 体を形成したままで、よってさらなる生体触媒転換から保護されるであろう。実 験の最後にレセプター複合体を単離し、解離して、結合化合物を分析する。本手 法によれば、個々の化合物を精製したり試験したりする必要なしに、改良された 薬剤化合物の同定を行うことができる。 生体触媒反応とインビトロのスクリーニングアッセイは、自動化したロボット 装置を用いて行うことができる。この自動化ロボット装置は、 （ａ）付属ＸＹＺピペッティングブームを有するＸＹテーブル（ここでブーム は、ＸＹテーブル上に位置する試薬容器群から、酵素、基質、コファクター、溶 媒溶液、およびアッセイ試薬の容積量を、同じＸＹテーブル上に位置する反応お よびアッセイ容器に添加する）、 （ｂ）前記ＸＹテーブルに取り付けられたＸＹＺ反応容器移動ブームであって 、ＸＹテーブル上に位置する反応およびアッセイ容器を、同じＸＹテーブル上の 異なった位置に移動するために用いられるＸＹＺ反応容器移動ブーム、 （ｃ）前記ＸＹテーブルに取り付けられ、反応およびアッセイ容器をインキュ ベーション期間中内包するとともに反応混合物の温度を制御する温度インキュベ ーションブロック、 （ｄ）前記ＸＹテーブルに取り付けられた磁気分離ブロックであって、外部磁 界を適用することによって磁気粒子上に不動化された生体触媒を生体触媒混合物 から分離し、磁性粒子を磁界源に引きつけ凝集させて、効果的に磁性粒子を生体 触媒反応混合物のバルクから分離する磁気分離ブロック、および （ｅ）ＸＹＺピペッティングブーム、ＸＹＺ反応容器移動ブーム、温度ブロッ クおよび磁気分離ブロックのそれぞれと接続されたプログラム可能なマイクロプ ロセッサであって、生体触媒反応を引き起こして出発化合物の改変物を産生する にあたってのこれらの機能的ユニットの運動と操作の全て、および所望の活性を 決定するためのアッセイを精密に制御しかつ調整するマイクロプロセッサ、を有 するものである。 図２は、本発明による自動化ロボット装置を示す。本システムのフレーム１に は、出発化合物群２のためのコンテナ群、酵素、コファクター、およびバッファ ーなどの試薬群３のためのコンテナ群が搭載されている。また、種々のカテゴリ ーの反応に対する試薬を含有する特定の生合成ボックス４がある。フレームには さらに、反応容器５の列、および特定の温度で反応を行うためのウェル７を有す る加熱ブロック６が配置される。本フレームは、スクリーニング試験８の試薬の ための領域８を有し、これはスクリーニングテストを行うために用いる試薬を含 有する。また、領域９はスクリーニングテストを行うためのアッセイ容器を有す る。本自動化システムはＸ−Ｙ−Ｚピペッティングおよび容器移動ブーム１０を 用いて全試薬および溶液を分配するとともに反応容器を移動させる。 操作に当たっては、Ｘ−Ｙ−Ｚ反応容器移動ブームは、特定の出発化合物改変 物を作るための特定の位置へと出発化合物と試薬を移送することができるが、移 送されたこれらの改変物はアッセイを行うための特定の位置へとさらに移送され る。このようにして、出発化合物の改変物の生成および最適活性のための試験の プロセスの大部分が自動化される。 図４ａと４ｂは、カスタノスペルミン(castanospermine)およびメトトレキセ ート(methotrexate)の誘導体生成を示す。これらの態様の全ては、表ＩＩに記載 する生体触媒転換および表ＶＩに記載するアッセイを利用している。 本明細書に記載する発明は医薬を指向するものであるが、食物添加剤、殺虫剤 、除草剤、および植物や動物の成長ホルモンを始めとする各種の生物活性化合物 にも同様に本発明方法を適用可能であることは生物学の分野の当業者にとって認 識されるであろう。 実施例１ １．酵素によるタキソールのエステル化 １．１ 反応生成物の分析 タキソールの酵素によるエステル化生成物の分析は、逆相ＨＰＬＣをＷａｔｅ ｒｓシステム（９９０光ダイオードアレー検出器装備）に適用し、３．９×３０ ０ｍｍμＢｏｎｄａｐａｋＣ₁₈カラムを用いて行った。使用した溶媒系は、水／ アセトニトリル混合物（４０：１５v/v）とイソプロパノールから なるものであった。下記の線型勾配プログラムで１ｍｌ／分で溶出させた。 生成物のピークは光ダイオードアレー検出器によって２２７ｎｍで検出した。 １．２ タキソールエステルの酵素による合成−活性生体触媒の同定 （反応ボックスＢ−４） 粗リパーゼ類、粗プロテアーゼ類、および精製プロテアーゼ類からなる５５の 酵素（表ＶＩＩ）の混合物（総重量：６００ｍｇ）を、タキソール（１７．０ｍ ｇ、２０μｍｏｌ）とビニルブチレート（０．２５ｍｌ、１．５ｍｍｏｌ）を２ ．９ｍｌのｔｅｒｔ−アミルアルコールに溶解した溶液中に添加した。これを隔 壁でシールされたガラス製試験管に入れ３０秒超音波処理し、オービット・シェ ーカーにて２５０ｒｐｍ、３５℃で４８時間処理した。その後、遠心分離により 懸濁固体触媒を除去することで反応を停止した。タキソールエステルを含有する 上清を真空中で蒸発乾固し０．３ｍｌのメタノール中に再溶解した。得られた濃 縮溶液の分割量（１５μｌ）を２５０μｌのメタノールで希釈し、ＨＰＬＣによ って１．１に記載のようにして分析した。クロマトグラフィー分析によって、保 持時間９．７分（未反応タキソール）に一ピーク、１４．６分（２’−タキソー ル・ブチレート、収率７％）に一ピークの結果を得た。 次いで酵素を３グループに分けた。即ち、２６のリパーゼ（１００ｍｇ／ｍｌ ）、２６の粗プロテアーゼ（１００ｍｇ／ｍｌ）、および４精製プロテアーゼ（ １０ｍｇ／ｍｌ）の３グループに分け、上記と同じ反応を行った。精製プロ テアーゼのみが顕著な活性を示し、４８時間後の２’−ブチレートの収率は１５ ％であった。次いでこの精製プロテアーゼを個々の酵素に分割（全て濃度１０ｍ ｇ／ｍｌで使用）すると、サーモリシン（バチルス・サーモプロテオリチカス・ ロッコａ．ｋ．ａ．サーモリシンからの細菌性プロテアーゼ）が４８時間後の収 率２ ４％で最も活性の高い酵素として同定された。この手法は、未反応生体触 媒を除去する一連のプロセスに活性生体触媒を付すことによって、活性生体触媒 が容易に同定できることを示すものである。 １．３ タキソールエステル混合物の酵素による合成−一連の反応ボックスに よるタキソールの誘導体生成 この合成に用いた酵素触媒の最適なものは、サーモリシン、ＫＣ１、およびリ ン酸カリウムバッファーを含有する水溶液（ｐＨ７．５）を凍結乾燥して得たも のであった。凍結乾燥後に得た固体触媒は５％の酵素、９４％のＫＣ１、および １％のリン酸カリウムを含有していた。粉末状にした酵素触媒（３３５ｍｇ−１ ６．７５ｍｇのサーモリシン含有）をタキソール（１７．０ｍｇ、２０μｍｏｌ ）とビニルカプロエート（直鎖；Ｃ６エステル）（０．２４ｍｌ、１．５ｍｍｏ ｌ）を２．９ｍｌのｔｅｒｔ−アミルアルコールに溶解した溶液中に添加した。 この混合物を隔壁でシールされたガラス製試験管に入れ３０秒超音 波処理し、オービット・シェーカーにて２５０ｒｐｍ、３５℃で処理した。２８ 時間処理後、反応混合物（酵素含有）を取り出し、この混合物の全量を、ビニル プロピオネート（０．２４ｍｌ、２．２ｍｍｏｌ）、ビニルアクリレート（０． ２４ｍｌ、２．２ｍｍｏｌ）、およびビニルブチレート（０．２４ｍｌ、１．９ ｍｍｏｌ）を含有する別の溶液に添加した。この第二の反応物を攪拌機に入れ、 ２５０ｒｐｍ３５℃でインキュベートした。２４時間後、反応混合物（酵素含有 ）を取り出し、この混合物の全量を、ビニルアセテート（０．２５ｍｌ、２．６ ｍｍｏｌ）およびビニルクロロアセテート（０．２４ｍｌ、１．８ｍｍｏｌ）を 含有する別の溶液に添加した。反応は３５℃、２５０ｒｐｍで２４時間行った。 次いで、懸濁固体触媒を遠心分離することによって反応を停止した。一連の反応 は、タキソールとタキソール誘導体が溶解性であるという性質によってスムーズ に進行した。タキソールエステルを含有する上清を真空中で蒸発乾固し、０．３ ｍｌのメタノール中に再溶解した。得られた濃縮溶液の分割量（１５μｌ）を２ ５０μｌのメタノールで希釈し、ＨＰＬＣによって１．１に記載のようにして分 析した。クロマトグラフィー分析によって、保持時間９．７分（未反応タキソー ル）のピーク、１１分と１３分の間（全概算収率：５２％）のブロードなピーク 、１４．６分のピーク（収率：９％）、１７．４分のピーク（収率１８％）、お よび１８．４分の小ピーク（収率０．２％）という結果が得られた。全反応収率 は約８０％であった。 １．４ 反応混合物からのタキソールの取り出し １．３で生成した反応生成物の濃縮メタノール溶液を分取ＴＬＣシリカプレー ト（ワットマン、２０×２０ｃｍ、シリカ層厚：５００μｍ、蛍光マーカー含有 ）に付し、プレートを、クロロホルム：アセトニトリル（４：１v/v）の混合溶 媒で展開した。生成物のスポットの位置は、スポットに紫外線を照射して決定し た。タキソールのＲｆ値は０．１６でタキソールエステルのＲｆ値は０．２８〜 ０．７１の間であった。生成物をＴＬＣプレートから取り出し、エチルアセテー トに溶解した。次いで生成物を真空中で乾燥した。 １．５ タキソールエステル混合物のスクリーニング 上記のタキソール誘導体のライブラリーを、ＨＬ−６０細胞（前骨髄球白血病 細胞系）およびＭＯＬＴ−４細胞（リンパ芽球白血病細胞系）に対する細胞毒性 に関してスクリーニングした。細胞を、９６穴プレートに各ウェル３０，０００ 個の細胞濃度で播種し、１０％のウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ−１６４０培 地で３７℃で２４時間生育させた。その後培地を、タキソール誘導体をＤＭＳＯ に最終濃度１００ｎＭ〜０．１ｎＭとなるように溶解させた新鮮培地（既に分取 薄層クロマトグラフィーで除去されているタキソールは除く）と交換した。細胞 培地中におけるＤＭＳＯの最終濃度は０．５％(v/v)であった。７２時間後、サ ンプルを取り出し細胞数を数えた。トリパンブルー除去および血球計算盤上での マニュアル細胞計数によって全細胞数と生存度を決定した。用量に対する応答デ ータを表ＩＸに示す。血球計算盤での計数の結果、上記タキソール誘導体ライブ ラリーには少なくとも一つの細胞毒性誘導体が含有されていることが判明した。 １．６ 活性生成物（群）を同定するための追跡調査 １．６．１ 個々のタキソールエステルの酵素による合成 − 上記１．３に 記載のタキソールのアシル化を含む反応を組み立てることによって活性タキソー ルエステルを同定する。 酵素によるアシル化反応は予測可能な性質を有するので、混合物の化学組成を 分析することなくあり得る生成物を同定することができる。そこでそれらのあり 得る生成物を下記のようにして個々に合成し、次いで追跡プロセスの一環として これら個々のエステル生成物に関するスクリーニングを開始する。 上記１．３の記載に従って調整した粉末状酵素触媒（１４０ｍｇ）をタキソー ル溶液（５．５ｍｇ、６．５μｍｏｌ）に添加し、１．０ｍｌのｔｅｒｔ−アミ ルアルコールに溶解した個々のビニルエステル（８０μｌ、約２ｍｍｏｌ）上に 加えた。アシル化剤としては次のビニルエステルを用いた：アセテート、クロロ アセテート、アクリレート、プロピオネート、ブチレート、およびカプロエート 。各混合物は、隔壁でシールされたガラス試験管に入れ、３０秒間超音波処理し た。次いでオービット・シェーカーにて２５０ｒｐｍ、３５℃で処理した。９６ 時間後、遠心分離により懸濁固体触媒を除去することで反応を停止した。タキソ ールエステルを含有する上清を真空中で蒸発乾固し０．３ｍｌのメタノール中に 再溶解した。得られた各濃縮溶液からその分割量（２０μｌ）を取り、８０μｌ のメ タノールで希釈し、ＨＰＬＣによって１．１に記載のように分析した。ＨＰＬＣ 分析の結果を表ＶＩＩＩに示す。 １．６．２ 薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）による反応生成物の回収 個々のエステル反応生成物をＴＬＣによってタキソールから単離した。１．６ の記載によって得た反応生成物の濃縮メタノール溶液を分取ＴＬＣシリカプレー ト（ワットマン、２０×２０ｃｍ、シリカ層の厚さ：５００μｍ、蛍光マーカー 含有）に付し、プレートを、クロロホルム：アセトニトリル（４：１v/v）の混 合溶媒で展開した。生成物のスポットの位置は、スポットに紫外線を照射して決 定した。各生成物のＲｆ値を表ＶＩＩＩに示す。生成物のスポットを別々にプレ ートから掻き取り、掻き屑を１５ｍｌのエチルアセテートによって溶出して生成 物を回収した。真空中でエチルアセテートを蒸発させて乾燥生成物を得た。 １．６．３ 個々のタキソールエステルのスクリーニング 新たに合成された生成物（群）の何れが活性を有するかを決定するために、ラ イブラリーの合成ヒストリーを“追跡調査”した。この追跡調査にあたっては、 可能性のある全エステル生成物を個々に（上記のようにして）酵素的に合成した 。ＴＬＣで生成物を単離後、各誘導体の細胞毒性の有無を、上記の手続きによっ て試験した。細胞毒性試験の結果、二つの誘導体、２’−クロロアセチルタキソ ールおよび２’−アクリロイルタキソールが両細胞株に対して活性を有すること が判明した（表ＩＸ）。 実施例 ２ ２．酵素によるタキソールの加水分解 ２．１ 反応生成物の分析 タキソールの酵素による加水分解生成物の分析は、逆相ＨＰＬＣをＷａｔｅｒ ｓシステム（９９０光ダイオードアレー検出器装備）に適用し、３．９×３００ ｍｍμＢｏｎｄａｐａｋＣ₁₈カラムを用いて行った。使用した溶媒系は、水／ア セトニトリル混合物からなるものであった。下記の直線勾配プログラムで１ｍｌ ／分で溶媒をＨＰＬＣシステムに供給した。 生成物のピークは光ダイオードアレー検出器によって２２７ｎｍで検出した。 ２．２．タキソールの酵素による加水分解 （反応ボックスＪ−８とＳ−８） 加水分解に用いた酵素触媒は、等量のサーモリシン、サブチリシン・カールス バーグ、キモトリプシン、およびトリプシンを含有する水溶液（ｐＨ７．５に調 整）を凍結乾燥することによって調整した。酵素触媒（１．１ｍｇ）を０．７ｍ ｌの０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した。水性酵素溶液は 、タキソール（２．０ｍｇ、２．４μｍｏｌ）を０．３ｍｌのｔｅｒｔ−アミル アルコールに溶解した溶液中に加えた。このようにして生成した二層性の反応系 を、隔壁でシールしたガラス試験管に入れ、オービット・シェーカーにて７５ス トローク／分、２０℃で攪拌した。２６時間後、有機溶媒層を取り出し、蒸発乾 燥し０．２ｍｌのメタノール中に再溶解してＨＰＬＣ分析に付した。水相を３． ５ｍｌのメタノールで希釈し、遠心分離により不溶性の固体（沈降酵素）を除去 した。清澄な上清を蒸発乾燥し、０．２ｍｌのメタノール中に再溶解してＨＰＬ Ｃ分析に付した。ＨＰＬＣ分析は２．１の記載に従って行った。前記二相性の反 応系の水相を精査したが得られたメタノール溶液にはタキソールも、また何らの 加水分解産物も検出されなかった。一方、有機層から得た乾燥残渣のメタノール 溶液をクロマトグラフィーに付すと、酵素によるタキソール加水分解産物 の生成を示す、保持時間２０．４分（未反応タキソール）のピークと１８．４分 のピークを得、これはＵＶ吸収の特性カーブによって同定された。この生成物の 収率は９％と見積もられた。 実施例 ３ ３．酵素によるタキソールのグリコシル化 ３．１ 反応生成物の分析 タキソールの酵素によるグリコシル化生成物の分析は、逆相ＨＰＬＣをＷａｔ ｅｒｓシステム（９９０光ダイオードアレー検出器装備）に適用し、３．９×３ ００ｍｍμＢｏｎｄａｐａｋＣ₁₈カラムを用いて行った。使用した溶媒系は、水 ／メタノール混合物からなるものであった。下記の直線勾配プログラムで１ｍｌ ／分で溶媒をＨＰＬＣシステムに供給した。 生成物のピークは光ダイオードアレー検出器によって２２７ｎｍで検出した。 ３．２．タキソールの酵素によるグリコシル化 タキソールのグリコシル化は、パン屋から入手したα−グルコシダーゼを生体 触媒として用いて行った。なお、用いた酵素は以下のとおりである：醸造業者か ら入手したα−グルコシダーゼ（ｐＨ７．０）、パン屋から入手したα−グルコ シダーゼ（ｐＨ７．０）、大腸菌からのβ−ガラクトシダーゼ（ｐＨ５．０）、 Ａ．オリーゼからのβ−ガラクトシダーゼ（ｐＨ５．０）、およびウシ肝臓から のβ−グルクロニダーゼ（ｐＨ５．０）であった。これらの酵素を２種の混合物 （１つはｐＨ７．０、１つはｐＨ５．０）で使用した所、ｐＨ７．０の混合物の みがグリコシル化タキソール中で活性を有した。次いでこの混合物を個々の酵素 に分けた所、パン屋から入手したα−グルコシダーゼが活性な生体触媒であるこ とが判明した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ドルディック，ジョナサン エス. アメリカ合衆国 52240 アイオワ州 ア イオワシティ，ウォルナット リッジ レ ーン 2996 (72)発明者 クラーク，ドーラス エス. アメリカ合衆国 94611 カリフォルニア 州 オークランド，ホリーロード ドライ ブ 3066

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．次の（ａ）−（ｄ）： （ａ）生体触媒群を出発化合物と混合することにより一連の生体触媒反応群を 引き起して反応混合物を得、次いで改変された出発化合物群からなるライブラリ ーを生成すること、 （ｂ）前記改変された出発化合物群からなるライブラリーを試験して、希望の 活性を示す改変された出発化合物が当該ライブラリー中に存在するかどうかを決 定すること、 （ｃ）前記ライブラリーの一部を生産するために用いられた生体触媒反応群を 構成する各触媒反応を系統的に消去し、次いでこのライブラリーの前記一部の中 に産生された化合物群を試験して前記希望の活性を示す改変された出発化合物の 存在、不存在を確認することによって、前記希望の活性を示す改変された出発化 合物を産生する特異的な生体触媒反応群を同定すること、および （ｄ）前記希望の活性を示す改変された化合物を産生する特異的な生体触媒反 応群を繰り返して反応生成物の化学組成を決定すること、 の各段階を含むことを特徴とする薬剤の同定方法。 ２．（ａ）前記生体触媒反応が、出発物質の構造内に存在する別個の構造部分 と反応する生体触媒群との反応であり、 （ｂ）各生体触媒が、ある一つの構造部分、あるいは関連する複数の構造部分 からなる群に対して特異的であり、かつ、 （ｃ）各生体触媒が、前記別個の構造部分を含有する多くの異なった出発化合 物と反応するものである、請求項１記載の薬剤の同定方法。 ３．次の（ａ）−（ｅ）： （ａ）出発化合物に対して一連の生体触媒反応を行って改変された出発化合物 群のライブラリーを生成すること、 （ｂ）希望の活性を有する出発化合物のための高親和性レセプターを提供し、 各生体触媒反応によって形成された改変化合物を前記高親和性レセプターに暴露 すること、 （ｃ）高親和性レセプター−改変出発化合物複合体を生体触媒反応混合物から 単離すること、 （ｄ）前記複合体を各成分部分に解離すること、および （ｅ）解離された改変出発化合物の化学組成を決定すること、 の各段階を含むことを特徴とする薬剤の同定方法。 ４．次の（ａ）〜（ｇ）： （ａ）出発化合物に高親和性のレセプターを添加するにあたり、基本的に当該 高親和性レセプターの全てが当該出発化合物に結合しほぼ等モル量の出発化合物 が溶液中に遊離の形態で残存して生体触媒による改変に利用可能であるような濃 度で当該レセプターを添加して生体触媒反応混合物を形成すること、 （ｂ）出発化合物よりも高い親和性を示す改変された出発化合物を生成し、こ れによって前記出発化合物を前記高親和性レセプターから排除すること、 （ｃ）前記改変された出発化合物と前記高親和性レセプターとの複合体を形成 し、これによって前記改変された出発化合物をさらなる生体触媒反応から保護す ること、 （ｄ）前記複合体を前記生体触媒反応混合物から分離すること、 （ｅ）前記複合体を各成分部分に解離すること、 （ｆ）解離された改変出発化合物の化学組成を決定すること、および （ｇ）上記の段階（ａ）〜（ｂ）を繰り返して改変された出発化合物のライブ ラリーを生成すること、 の各段階を含むことを特徴とする薬剤の同定方法。 ５．前記高親和性レセプターが、生きた細胞表面上若しくは生きた細胞内に存 在するかまたは天然若しくは人工支持体に不動化されて存在するものである、請 求項４記載の薬剤の同定方法。 ６．前記生体触媒反応は、次の（ａ）〜（ｇ）： （ａ）第一および第二アルコールの酸化、 （ｂ）アルデヒドおよびケトンの還元、 （ｃ）第一および第二アルコールのアシル化、 （ｄ）第一および第二アルコールのグリコシル転移、 （ｅ）第一および第二アルコールのエーテル化、 （ｆ）一級および二級アミンのアシル化、および （ｇ）カルボン酸のエステル化 からなる群から選択される反応である請求項１記載の薬剤の同定方法。 ７．前記生体触媒が、粗酵素若しくは精製酵素、細胞溶解調製物、部分精製溶 解産物調製物、生存細胞若しくは完全な非生存細胞を、溶解可能な形態、懸濁さ れた形態、あるいは不動化された形態で用いられるものである、請求項１記載の 薬剤の同定方法。 ８．前記生体触媒反応が、非特異的な化学反応群と組み合わせて行って改変さ れた出発化合物群のライブラリーを生成する反応である請求項１記載の薬剤の同 定方法。 ９．さらに、 （ａ）前記反応混合物を、希望の活性を有する化合物と、極在する若しくは不動 化されたレセプター分子もしくは細胞との結合を測定する薬剤スクリーニング装 置に暴露すること、 （ｂ）前記薬剤スクリーニング装置からの陽性測定値を、前記反応混合物の合 成に用いた一連の生体触媒反応および希望の活性を有する改変された出発化合物 を生成する特異的反応シーケンスに関連付けること、および （ｃ）前記生体触媒反応シーケンスを繰り返して希望の活性を有する改変出発 化合物を生成し、その化学組成を決定すること、 を含むものである請求項１記載の薬剤の同定方法。 １０．前記生体触媒反応が磁性粒子に不動化されて磁性生体触媒を形成している 生体触媒を用いて行い、当該方法がさらに次の（ａ）〜（ｄ）： （ａ）前記不動化された生体触媒を、基質（群）、コファクター（群）、およ び特異的生体触媒反応に用いられる溶媒／バッファー条件と組合せることによっ て生体触媒反応を開始すること、 （ｂ）前記磁性生体触媒を前記生体触媒反応混合液から除去して生体触媒反応 を停止するにあたり、外部磁界を印加して生体触媒が不動化された磁性粒子を磁 界源に引きつけ、凝集させることによって効果的に磁性生体触媒をバルクの生体 触媒反応混合物から分離し、これによって磁性生体触媒を第一反応容器に残しつ つ、磁性生体触媒が除去された反応混合物を第一反応容器から第二反応容器に移 すこと、 （ｃ）磁性粒子に不動化された第二の生体触媒を、前記第一の反応容器から移 された前記生体触媒反応混合物を含有する第二の反応容器に添加することにより 、前記第一の生体触媒反応とは完全に独立した第二の生体触媒反応を行い、さら に、 （ｄ）前記の段階ａ）からｃ）を繰り返し、別個の独立した一連の生体触媒反 応群を完成して、それぞれ対応する出発化合物改変物を産生すること、を含むも のである請求項１記載の薬剤の同定方法。 １１．粒子に不動化された生体触媒を用いて生体触媒反応を行うとともに、前記 生体触媒が遠心分離または濾過によって生体触媒反応混合物から除去されるもの である、請求項１０記載の薬剤の同定方法。 １２．（ａ）付属ＸＹＺピペッティングブームを有するＸＹテーブル（ここで当 該ブームは、前記ＸＹテーブル上に位置する反応容器群からの酵素、基質、コフ ァクター、溶媒溶液、およびアッセイ試薬の容積量を、同じ前記ＸＹテーブル上 に位置する反応およびアッセイ容器に添加する）、 （ｂ）前記ＸＹテーブルに取り付けられたＸＹＺ反応容器移動ブームであって 、前記ＸＹテーブル上に位置する反応およびアッセイ容器を、同じ前記ＸＹテー ブル上の異なった位置に移動するために用いられるＸＹＺ反応容器移動ブーム、 （ｃ）前記ＸＹテーブルに取り付けられて反応およびアッセイ容器をインキュ ベーション期間中内包するとともに反応混合物の温度を制御する温度インキュベ ーションブロック、 （ｄ）前記ＸＹテーブルに取り付けられた磁気分離ブロックであって、外部磁 界を適用することによって磁気粒子上に不動化された生体触媒を生体触媒混合物 から分離し、前記磁性粒子を前記磁界源に引きつけ凝集させて、効果的に磁性粒 子を生体触媒反応混合物のバルクから分離するものである磁気分離ブロック、お よび （ｅ）ＸＹＺピペッティングブーム、ＸＹＺ反応容器移動ブーム、温度ブロッ クおよび磁気分離ブロックのそれぞれと接続されたプログラム可能なマイクロプ ロセッサであって、生体触媒反応を引き起こして出発化合物の改変物を産生する にあたってのこれらの機能的ユニットの運動と操作の全て、および希望の活性を 決定するためのアッセイを精密に制御しかつ調整するマイクロプロセッサ、 を包含する自動化ロボット装置を使用するものである請求項１記載の薬剤の同定 方法。 １３．次の（ａ）〜（ｇ）： （ａ）出発薬剤化合物のモル濃度の約１／２で高親和性のレセプターを出発薬 剤化合物と混合して、基本的に当該高親和性レセプターの全てが当該出発薬剤化 合物に結合するとともにほぼ等モル量の出発薬剤化合物が溶液中に遊離の形態で 残存して生体触媒による改変に利用可能であるようになすこと、 （ｂ）前記出発薬剤化合物とレセプターの間の生体触媒反応によって、前記出 発薬剤化合物よりも高い結合親和性を有する改変薬剤化合物を生成すること、 （ｃ）前記出発薬剤化合物を、改変薬剤化合物によって前記レセプターから排 除すること、 （ｄ）前記結合した改変薬剤化合物をさらなる生体触媒反応から保護すること 、 （ｅ）前記改変薬剤化合物とレセプターとの複合体を各成分部分に解離するこ と、 （ｆ）解離された改変出発薬剤化合物の化学組成を決定すること、および （ｇ）上記の段階ａ）〜ｅ）を繰り返し、出発薬剤化合物に対し一連の生体触 媒反応を行って、より高い結合親和性を有する改変薬剤化合物のライブラリーを 生成すること、 を含むことを特徴とする迅速な薬剤開発方法。 １４．前記高親和性レセプターが、生きた細胞表面上若しくは生きた細胞内に存 在するかまたは天然若しくは人工支持体に不動化されて存在するものである、請 求項１に記載の迅速な薬剤開発方法。 １５．前記生体触媒反応が表ＩＩに掲載した反応群から選択される、請求項１に 記載の迅速な薬剤開発方法。 １６．改変された出発化合物群のライブラリーの試験が表ＶＩに掲載したアッセ イ群から選択される、請求項１に記載の迅速な薬剤開発方法。 １７．前記生体触媒反応が、磁性粒子に不動化されて磁性生体触媒を形成してい る生体触媒を用いて行い、ここにおいて、 （ａ）前記不動化された生体触媒を、基質（群）、コファクター（群）、およ び特異的生体触媒反応に用いられる溶媒／バッファー条件と組合せることによっ て生体触媒反応を開始して前記生体触媒反応混合物を形成し、 （ｂ）前記磁性生体触媒を前記生体触媒反応混合液から除去して前記生体触媒 反応を停止するにあたり、外部磁界を印加して生体触媒が不動化された磁性粒子 を磁界源に引きつけ、凝集させることによって効果的に磁性生体触媒をバルクの 生体触媒反応混合物から分離し、これによって磁性生体触媒を第一反応容器に残 しつつ、磁性生体触媒が除去された反応混合物を第一反応容器から第二反応容器 に移し、 （ｃ）磁性粒子に不動化された第二の生体触媒を、前記第一の反応容器から移 された前記生体触媒反応混合物（前記第一の生体触媒反応で用いられた前記磁性 生体触媒を第一の生体触媒反応で除いた後のもの）を含有する第二の反応容器に 添加することにより、前記第一の生体触媒反応とは完全に独立した第二の生体触 媒反応を開始し、 （ｄ）前記の生体触媒反応サイクルを繰り返し、別個の独立した一連の生体触 媒反応群を完成して、それぞれ対応する出発化合物改変物を産生し、 （ｅ）前記生体触媒反応混合物から、磁性粒子に不動化された前記生体触媒を 分離するために、前記同一のＸＹテーブルに取り付けられた磁性分離ブロックに よって外部磁界を印加し、磁性粒子を磁界源に引きつけ凝集させることによって 効果的に磁性生体触媒をバルクの生体触媒反応混合物から分離し、さらに （ｆ）前記ＸＹＺピペッティングブーム、前記ＸＹＺ反応容器移動ブーム、前 記温度ブロックおよび前記磁気分離ブロックのそれぞれと接続されたプログラム 可能なマイクロプロセッサを用いて、生体触媒反応の遂行によって出発化合物の 改変物を産生するにあたってのこれらの機能的ユニットの運動と操作の全て、お よび希望の活性を決定するためのアッセイを精密に制御しかつ調整すること、 を含む請求項１記載の迅速な薬剤開発方法。 １８．前記出発化合物が反応混合物中で溶解可能である、請求項１、３、４およ び１３記載の方法。 １９．前記出発化合物およびこれに由来する誘導体が溶解可能であって、スクリ ーニング操作中の使用時において溶解した形態のままである、請求項１８記載の 方法。 ２０．希望の活性を有する改変された出発化合物を生成する特異的な生体触媒反 応の同定が、前記ライブラリーの一部を産生するために用いる生体触媒反応の個 々のものを系統的に構築することによって行われる請求項１記載の方法。