JPH09505076A - 生理的関門の透過性を調節するためにチロシンリン酸化を調節する作用物質の使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 脳血液関門及び他の生理的関門の透過性がタンパク質のチロシンリン酸化の程度により調節（モジュレート）され得る。チロシンタンパク質脱リン酸化を促進する作用物質は脳血液関門の透過性を減少し、リン酸化を促進するものは透過性を増加する。脳血液関門透過性を増加することは中枢神経系への望ましい効果を有する薬を届けるのに有用である；脳血液関門透過性及び他の生理的関門透過性を減少することは、ＣＮＳに望ましからざる化合物が到達することを防止すること及びある臨床状態において有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 生理的関門の透過性を調節するために チロシンリン酸化を調節する作用物質の使用 本発明は脳血液関門及び他の生理的関門の透過性の制御に係わる。 脳血液関門は血液の分子、イオン及び細胞の環境を脳のそれから分離するに役 立つ。大きな程度で、この分離は高い電気抵抗をもつ内皮間の密着結合により達 成され、これは大いに傍細胞フラックス(para-cellular flux)を少なくする。脳 血液関門の密着結合の透過性は不変でないことは明らかである。むしろ、透過性 は動的規制を、特に第二メッセンジャー経路により受ける様に思われる。 脳血液関門の密着結合の透過性を操作する能力は多数の理由で重要であり、そ の中には次のものがある： （ｉ）脳血液関門の密着結合を閉じることにより脳浮腫を生ずる発作を減少す る： （ii）脳血液関門の密着結合を可逆的に開くことにより脳へ血液から生じた、 膜不透過性の薬剤を届けること；及び （iii）多発硬化症において生起する様な免疫応答、及び腫瘍を形成し得る転 移性癌細胞を取り次ぐ白血球の脳内への進入を遮断すること。（内皮を横切る細 胞トラフィッキング(trafficking)の間、遊走する細胞は密着結合を通過し、そ れ故結合部透過性に影響する内皮間メカニズムをトリガー(trigger)すると信じ られる。） 又密着結合を含む他の生理的関門の透過性をうまく操作することが望ましい。 分子レベルにおいて密着結合複合体の構成要素のあるものが同定されている。 これらはＺＯ−１(Stevenson et al.，1986；Willot et al.，1993)、α⁺及びα^- isoforms(Willot et al.，1992；Balda 及びAnderson，1993)、ＺＯ−２(Gumbi ner et al.，1991)、cingulin(Citi et al.，1988)及び７Ｈ６アンチゲン(Zhong et al.，1993)を含み、その凡ては未だ十分決定されていない態様で密着結合の 細胞質表面と結合されている。又ＺＯ−１及びＺＯ−２と未特定の態様で結合す る様に思われる130kDaリンタンパク質が最近記載されている(Balda et al.，199 3)。最後に密着結合に局在するオクルーディン(occludin)と名付けられた細胞膜 内タンパク質も又同定されている(Furuse et al.，1993)。 内皮及びある上皮において密着結合の傍細胞フラックスを制限する能力が不変 でないことは明らかである。むしろ密着結合のこのゲート機能は動的規制が可能 である(Madara，1988；Rubin，1992)、特に、レセプターリガンド又は特定の膜 透過モジュレーターの何れかによる信号導入経路の活性化は傍細胞経路の透過性 に著しい効果を有し得る。例えば、タンパク質キナーゼＣ活性化はＭＤＣＫ細胞 中の密着結合、即ち、一つの上皮細胞ラインの透過性において実質的増加を惹起 する。環状ＡＭＰの上昇(elevation)は培養中の脳内皮細胞内の透過性を減少さ せる(Rubin et al.，1991)。環状ＡＭＰは又末梢内皮細胞における密着結合透過 性を減少させる(Stelzner et al.，1989；Langeier et al.，1991)。 密着結合の透過性性状は又接着(adherens)結合の一体性(integrity)に依存す る。細胞外Ｃａ⁺の除去による接着結合の分裂はＭＤＣＫ細胞中(Martinez-Palom o et al.，1980；Gumbiner及びSimons，1986) 及び内皮細胞中(Rutten et al.，1987)の密着結合の開放へと導く。タンパク質 キナーゼはＭＤＣＫ中の密着結合一体性のこの間接の調節中に包含されている様 に思われる。接着結合複合体のＣａ²⁺感受性成分はキャドヘリン(cadherins)で ある（Geiger及びAvalonによる評論，1992）。これらの膜内外のタンパク質はそ れらの細胞外ドメインを経由してＣａ²⁺依存性の、同種親和性の態様で細胞間接 着性を媒介する。キャドヘリンの細胞質ドメインはα−，β及びγ−キャテニン (catenin)と名付けられた三つの他のタンパク質と結合し(Ozawa et al.，1989) 、これらはキャドヘリンをアクチン細胞骨格へ連結し、キャドヘリン接着性のた めに必要とされる（Hirano et al.，1987；Nagafuchi及びTakeichi，1988；Ozaw a et al.，1990；Kintner，1992；Stappert及びKemler，1993を見よ）。 最近、細胞のチロシンホスファターゼ抑制剤又はチロシンキナーゼｐｐ60^{v-sr c} の過大表現である過バナジウム酸塩による細胞の処理は、キャドヘリン／キャ テニン複合体の成分のチロシンリン酸化を生じたことが報告された(Matsuyoshi et al.，1992；Behrens et al.，1993；Hamaguchi et al.，1993)。かかる増大 せるリン酸化は減少せるキャドヘリン−依存性細胞接着性と結び付けられた(Mat suyoshi et al.，1992；Behrens et al.，1993；Hamaguchi et al.，1993)。密 着結合に関しては、タンパク質チロシンリン酸化と構造との間の関係は研究され ているが、しかし今までは、否定的結果であった。Warren及びNelson(1987)はＭ ＤＣＫ細胞と低レベルのｐｐ60^v-srcとのトランスフェクションは接着結合の破 裂を生じたが、しかし電子顕微鏡により明らかにされる様に、明らかに密着結合 に影響しなかった。Volberg et al.(1992)は過バナジウム酸塩はＭＤＣＫ細胞中 の接着結合におい てチロシンリン酸化を引き出したか、しかし、本発明者等の発見とは対照的に、 又ＺＯ−１分布の免疫細胞化学検査により決定される如く、密着結合には何ら効 果を持たなかった。 実験は又密着結合透過性のチロシンリン酸化の効果を調査するために、ウシの 脳微細管内皮細胞（ＢＢＥＣｓ）を脳血管関門の組織培養モデルとして用いて行 われた(Rubin et al，J．Cell Biol．115，1725-1735(1991))。上皮細胞の密着 結合の透過性もまた規制を受けることは明らかであるから、本発明まで導く研究 もまたMadin-Darby犬の腎臓（ＭＤＣＫ）の株Ｉの細胞、即ち高い固有(intrinsi c)電気抵抗(数千Ω−cm²)の密着結合を所有する上皮細胞ラインを使用した。両 方のケースにおいて、細胞はフィルター上で生育され、密着結合の透過性は細胞 内外の電気抵抗（ＴＥＲ）を測定することにより決定され得る様にした。細胞が この様に生育される時、分子及び細胞の単層を横切る運動もまた研究され得る。 他の調査員はタンパク質チロシンリン酸化と密着結合の透過性との間の関係を 調べたが、否定的結果であった。Warren及びNelsonのMol.Cell．Biol．7 1326-1 337(1987)はＭＤＣＫ細胞の低レベルのチロシンキナーゼｐｐ60^v-srcとのトラン スフェクションは接着結合の破裂を生じたが、しかし明らかに電子顕微鏡により 明示される如く、密着結合には影響を及ぼさなかった。ＭＤＣＫ細胞を用いて、 Volberg et al.,のEMBO J．11 1733-1742(1992)は過バナジウム酸塩、即ち接着 結合においてタンパク質のチロシンリン酸化を引き出したが、タンパク質と結合 する密着結合の免疫染色(immunostaining)により決定される様に、密着結合には 何の効果ももたなかった(S．Citi，J．Cell Biol.121 485-489(1993)による密着 結合については評論を参照)。 本発明は、対照的にチロシンタンパク質リン酸化が上皮及び内皮細胞の両者に おいて密着結合の透過性の制御に対し決定的であるという驚くべき発見に基づい ている；チロンシタンパク質リン酸化はそれ故脳血液及び他の生理的関門の透過 性を制御するために操作され得る。チロシンタンパク質リン酸化の程度を減少す ることは脳血管又は他の関門の透過性を減少させ、他方チロシンタンパク質リン 酸化の程度を増加させることは透過性を増加する。 本発明の第１の観点によれば、脳血液関門の様な生理的関門の透過性を減少す るための薬剤の調製においてチロシンタンパク質脱リン酸化を促進する作用物質 (agent)の使用を提供する。それ故本発明は脳血液関門の如き生理的関門の透過 性を減少する方法に用途を有し、その方法は対象に対しチロシンタンパク質脱リ ン酸化を促進する作用物質の有効量を投与することからなる。 本発明の第２の観点によれは、脳血液関門の如き生理的関門の透過性を増加す るための薬剤の調製においてチロシンタンパク質リン酸化を促進する作用物質の 使用を提供する。それ故本発明は又脳血液関門の如き生理的関門の透過性を増加 する方法において用途を有し、その方法は対象に対しチロシンタンパク質リン酸 化を促進する作用物質の有効量を投与することからなる。 生体内のチロシンホスファターゼはチロシン残基において適当なタンパク質の 脱リン酸化を惹起し、又チロシンキナーゼは対応するリン酸化を惹起する。直接 又は間接にチロシンタンパク質ホスファターゼを活性化し、及び／又は直接又は 間接にチロシンキナーゼを抑制する化合物は、それ故チロシンタンパク質脱リン 酸化の促進剤として、又従って脳血液関門の如き生理的関門の透過性を減少する 作用物質とし て有用である。逆に、直接又は間接にチロシンタンパク質ホスファターゼを抑制 し、及び／又は直接又は間接にチロシンキナーゼを活性化する化合物はチロシン タンパク質リン酸化の促進剤として、従って脳血液関門の如き生理的関門の透過 性を増加するための作用物質として有用である。凡てのケースにおいて効果が可 逆的であるか、又は不利な毒性の問題を回避するに十分に可逆的であることが好 ましいであろう。本発明の好ましい実施態様が次に添付の図面に関連して述べら れるであろう。図面中： 第１ａ，１ｂ及び１ｃ図はグラフ的に過バナジウム塩(pervanadate)が株Ｉ Ｍ ＤＣＫ細胞の細胞透過(transcellular)電気抵抗を減少し（そして暗に透過性を 増加する）ことを示す； 第２ａ及び２ｂ図はグラフ的にフェニルアルシン(phenylarsine)オキシドがＭ ＤＣＫ Ｉ細胞の細胞透過電気抵抗を減少し（そして暗に透過性を増加する）こ とを示す； 第３ａ及び３ｂ図はチロシンホスファターゼ抑制剤により誘発された細胞透過 電気抵抗における減少を可逆的にグラフ的に示す； 第４ａ，４ｂ，４ｃ及び４ｄ図は過バナジウム酸塩及びフェニルアルシンオキ シドが脳毛細管内皮細胞の細胞透過電気抵抗を減少し（そして暗に透過性を増加 する）ことを示す； 第４.１図はＰＡＯ及び過バナジウム酸塩がＭＤＣＫ細胞中でショ糖の傍細胞( paracellular)フラックスを増加することを示す。 第５ａ，５ｂ，５ｃ及び５ｄ図は、過バナジウム酸塩がＭＤＣＫ株Ｉ細胞及び ＢＢＥＣｓ中の多くのタンパク質のチロシンリン酸化を、フェニルアルシンオキ シドの不連続の効果と比較して、増加することを示すルミノグラム(luminogram) であり；そして 第５.１図はＰＡＯがＭＤＣＫ細胞中の細胞内接合部においてタンパク質のチ ロシンリン酸化を増加することを示し、又過バナジウム塩の効果との比較を示す 。 第５.２図はＰＡＯが脳内皮細胞中の細胞内接合部においてタンパク質のチロ シンリン酸化を増加することを示し、又過バナジウム塩の効果との比較を示す。 第６図はＰＡＯがＭＤＣＫ細胞中のＥ−キャドヘリン／キャテニン複合体の成 分のチロシンリン酸化を刺激することを示す。 第７図はＰＡＯがＭＤＣＫ細胞中の密着結合に結び付けられたタンパク質のチ ロシンリン酸化を刺激することを示す。 第８図はHerbimycin ＡがＭＤＣＫ細胞中の細胞透過電気抵抗におけるＰＡＯ 誘発減少を弱めることを示す。 第９図はHerbimycin ＡがＭＤＣＫ細胞中のタンパク質チロシンリン酸化にお けるＰＡＯ誘発増加を弱めることを示す。 第１０図は中大脳動脈閉塞（卒中モデル）が、閉塞により損傷された区域付近 の小血管と結合された脳毛細血管内皮細胞内のチロシンリン酸化のレベルを高め ることを示す。 第１１図は抗−ｐ120及び２Ｂ12免疫反応性の特性付け(characteri-zation)を 示す。 第１２図はｐ120 タンパク質が抗−ｐ120 抗体により認識され、２Ｂ12抗体と 交叉反応し、一方、ｐ100は抗−ｐ120によってのみ認識されることを示す。 第１３図はＭＤＣＫ及びＣaco-２細胞からの抗−ｐ120及び抗−Ｅ−キャドヘ リンのイムノプレシピテート(immunoprecipitates)の比較を示す。 第１４図は抗−Ｅ−キャドヘリンのイムノプレシピテート中の抗−ｐ120反応 性物質及び抗−ｐ120のイムノプレシピテート中のＥ−キャドヘリンの検知を示 す。 第１５図はウシの脳内皮細胞の一次培養からの抗−β−キャテニン、抗−ｐ12 0及び２Ｂ12のイムノプレシピテートの比較を示す。 第１６図の人間の臍静脈内皮細胞（パネルＡ）及びＥＣＶ304細胞（パネルＢ ）からのβ−キャテニンのイムノプレシピテート中のｐ120／ｐ100及び抗−ｐ12 0イムノプレシピテート中のβ−キャテニンの検知を示す。 第１７図はＭＤＣＫ細胞及び脳内皮細胞中の抗−ｐ120反応性及びβ−キャテ ニンの位置確認を示す。 第１８図はラットの脳及び骨格筋組織内の抗−ｐ120免疫反応性の分布を示す 。 第１９図は人間のｐ100に対し得られた部分的アミノ酸シーケンスデータをマ ウスｐ120からの対応する既知のシーケンスデータとの比較を示す。与えられた 文字は、任意のアミノ酸を指示する“Ｘ”とは別に、標準の単文字アミノ酸コー ドに基づく。 最初の実験において、細胞はチロシンホスファターゼの非選択的であるが、強 力な抑制剤であるバナジウム酸塩で処理された。ＭＤＣＫ細胞中でバナジウム酸 塩のみではＴＥＲにおける減少を惹起しなかった。しかしながらバナジウム酸塩 で予備処理された細胞へのＨ₂Ｏ₂の添加はＴＥＲにおける急速な減少（第１ａ図 ）を惹起し、これは密着結合の増大された透過性を表す。バナジウム酸塩は比較 的に膜透過性であるが、Ｈ₂Ｏ₂はバナジウム酸塩を膜透過性の過バナジウム酸塩 へと酸化し、これは次いで細胞に入ってチロシンホスファターゼを抑制 する（例えば、Fantus et al，Biochemistry 28 8864-8871(1989)；Volberg e t al，Cell Regulation 2 105-120(1991)； O'Shea et al，Proc．Natl．Acad． Sci．USA．89 10306-10310(1992)）。実に、予め形成された過バナジウム酸塩は ＴＥＲにおける減少を引き出した（第1b図）。長期間にわたって、バナジウム酸 塩のみはＴＥＲにおける減少（第1c図）を惹起したが、恐らく、その細胞中への 偶発的進入によるのであろう。 チロシンホスファターゼのより選択的な抑制剤はフェニルアルシンオキシド（ ＰＡＯ）である。それはホスファターゼの密な間隔のスルヒドリル(sulphydryl) 基と共有的に(covalently)反応することにより抑制する(Levenson and Blackshe ar，J．Biol．Chem．264 19984-19993(1989)；Garcia-Morales et al，Proc．na tl．Acad．Sci．USA．87 9255-9259(1990)；Pronk et al，J．Biol．Chem．267 24058-24063(1992)参照)。ＰＡＯは又ＭＤＣＫ株Ｉ細胞のＴＥＲにおいて減少を 惹起し得ることが見出された（第２ａ図）。ＰＡＯ作用はジチオール、2,3−ジ メルカプトプロパノールによりブロックされるが、β−メルカプトエタノールに よってはされない（第2b図）が、これはスルヒドリルの適当な相対配置を経由す るＰＡＯ媒介の抑制に対し予期される如くである。ジメルカプトプロパノールは Ｃａ²⁺キレート化剤ビス−（Ｏ−アミノフェノキシ）−エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ',Ｎ '−テトラ酢酸（ＢＡＰＴＡ）により引き出されたＴＥＲにおける減少をブロッ クせず、これはＰＡＯ作用の抑制における選択性を指示する（第２ｂ図）。しか しながら、両還元剤共過バナジウム酸塩の作用を、恐らく過バナジウム酸塩から バナジウム酸塩への単なる還元によりブロックした（第２ｂ図）。 過バナジウム酸塩（第３ａ図）又はＰＡＯ（第３ｂ図）により誘発されたＴＥ Ｒにおける減少は、還元剤により、もし十分早く添加されるならは、それぞれ部 分的に逆転されるか、又は完全に逆転され得る。かくして、チロシンホスファタ ーゼ抑制剤はＭＤＣＫ株Ｉ細胞中の密着結合の可逆的開放を引き出す。 ＢＢＥＣsにおいては、過バナジウム酸塩及びＰＡＯは同様にＴＥＲにおいて 投与量依存性で且つ急速な減少を惹起した（第４ａ乃至４ｄ図）。環状ＡＭＰが ＢＢＥＣｓにおいて、並びに人間の脳から由来する内皮細胞においてＴＥＲを増 加する、即ち密着結合の漏出性を減少することは以前に示された(Rubin et al， J．Cell．Biol．115 1725--1735(1991))。ＴＥＲにおける過バナジウム酸塩−及 びＰＡＯ−誘発の減少は環状ＡＭＰで処理した又はそれ無しで処理したＢＢＥＣ ｓにおいて観察された（第４ａ，ｃ図と第４ｂ，ｄ図）。 正常の細胞において、タンパク質のチロシンリン酸化の程度はチロシンキナー ゼとチロシンホスファターゼの活性のバランスを反映する。チロシンホスファタ ーゼの抑制により、過バナジウム酸塩及びＰＡＯは活性なキナーゼを通じて増大 せるタンパク質チロシンリン酸化を惹起するに違いない。ホスファターゼ抑制剤 がＴＥＲを減少するメカニズムを調べるために、チロシンリン酸化タンパク質の 準細胞（sub-cellular）的位置確認が最初に決定された。これは抗−ホスホチロ シン抗体(ＰＹ20)(ICN Biomedicals，Ltd.)を用いて免疫染色(immuno-staining) により達成された。この工程において、細胞はパラホルムアルデヒド中に無傷の (intact)細胞中に見出される様なタンパク質の組織(organization)及び共有結合 修飾(covalent modification)を保持する様固定される。膜透過性化(membrane-p ermeabilisation)の後、 固定された細胞は抗体と共に培養され、結合された抗体の部位（サイト）は蛍光 色素−共役二次抗体を用い、続いて蛍光顕微鏡検査により検知される。 ＭＤＣＫ細胞及びＢＢＥＣｓの両者において、100μＭの過バナジウム酸塩が 最初に細胞間境界における接着結合における染色において増加を生じた。この染 色のパターンは以前に報告されたものと似ている(Volberg et al，Cell Regulat ion 2 105-120(1991)；Volberg et al，EMBO J．11 1733-1742(1992)参照)。対 照的にＰＡＯ（10μＭ）は減少したＴＥＲの時においてＭＤＣＫ株Ｉ細胞の境界 染色における増加のみを生じた。ＢＢＥＣｓにおいては、ＰＡＯ（10μＭ）は細 胞の境界染色における一過性の増加を生じた。これらの観察はチロシンキナーゼ に対する基質が細胞間結合に存在せねばならないことを指示する。しかしながら 、これらの研究はチロシンリン酸化タンパク質の同一性(identity)については何 の情報も与えない。 個々のタンパク質のチロシンリン酸化は抗−ホスホチロシン抗体を用いる免疫 ブロット法により調べられた。当初、全細胞溶解物におけるタンパク質のリン酸 化がホスファターゼ抑制剤の作用の選択性を測るために調べられた。過バナジウ ム酸塩はＭＤＣＫ細胞において（第５ａ図）及びＢＢＥＣｓにおいて（第５ｂ図 ）共に多くのタンパク質のチロシンリン酸化における増加を生じた。対照的にＴ ＥＲにおける減少を生じたＰＡＯの濃度は、ＭＤＣＫ細胞において（第５ｃ図） 及びＢＢＥＣｓにおいて（第５ｄ図）共に僅かのタンパク質しかリン酸化を引き 出さず、ずっと別個の効果を有した。 密着結合透過性を制御するタンパク質の同一性を決定するためには、密着結合 の透過性が接着結合(adherens junction)の一体性(integrity) により影響されることが知られていることを知ることが必要である。細胞外のＣ ａ²⁺の除去は恐らく接着結合の切断により、密着結合の透過性における増加へと 導く(Gumbiner et al，J．Cell Biol．107 1575-1587(1988)参照)。結合複合体 のＣａ²⁺−感受性成分はキャドヘリン(cadherins)である。これらの膜内外の(tr ansmembrane)タンパク質はそれらの細胞外ドメインを経由してＣａ²⁺−依存性、 同種親和性(homophilic)のやり方において細胞間接着を媒介する。キャドヘリン の細胞質ドメインはα−，β−及びγ−キャテニン(catenins)と名付けられた三 つのその他のタンパク質と結合し、これらはキャドヘリンを細胞骨格へとリンク する（Stappert and Kemler，Curr．Opinion in Neurobiol．3 60-66(1993)）。 最近、過バナジウム酸塩処理又はｐｐ60^v-srcの過剰発現(over-expression)はそ の結果キャドヘリン／キャテニン複合体のチロシンリン酸化を生じたことが報告 された(Matsuyoshi et al,J．Cell Biol．118 703-714(1992)；Behrens et al， J．Cell Biol．120 757-766(1993)；Hamaguchi et al，EMBO J.12 307-314(1993 ))。かかる増大したリン酸化は減少したキャドヘリン依存性の細胞接着性と結び 付けられた(Matsuyoshi et al，J．Cell．Biol．118 703-714(1992)；Behrens e t al，J．Cell Biol．120，757-766(1993)；Hamaguchi et al，EMB0 J．12 307- 314(1993))。 過バナジウム酸塩及びＰＡＯがキャドヘリン／キャテニン複合体の成分のチロ シンリン酸化を惹起することにより、密着結合の透過性を増加することは可能で ある。それ故、ＭＤＣＫ株Ｉ細胞におけるこの複合体のチロシンリン酸化への過 バナジウム酸塩及びＰＡＯの効果をより密に調べることが決定された。複合体は Ｅ−キャドヘリンを認識するマウスの単一クローン抗体であるｒｒ１を用いて予 め存在するタ ンパク質相互作用を保持する様に溶解化された細胞から免疫沈殿(immunoprecipi tate)された(Gumbiner et al，J．Cell Biol．102 457-468(1986))。免疫沈殿さ れたタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離され、チロシンリン酸化は抗−ホ スホチロシン抗体及び増強されたケミルミネッセンスを用いる免疫ブロット法に より検知された。 １．キャテニンチロシンキナーゼ基質 （ｉ）α−ではなく、β−キャテニンがＰＡＯに応答してリン酸化される様に思 われる。 過バナジウム酸塩はＥ−キャドヘリン(120kDa)及び結合されたキャテニン（分 子量(molecular mass)範囲、〜80−102kＤａ：第６Ａ図）から予想される分子量 をもつ抗−Ｅ−キャドヘリンのイムノプレシピテート(immunoprecipitates)中の 数個のタンパク質のチロシンリン酸化における増加を生じた。しかしながら、Ｐ ＡＯはキャテニンの只一つのみのチロシンリン酸化を主として刺激し、これは見 掛けの分子量の基礎においてα−又はβ−キャテニンであり得る。 ＰＡＯに応答してリン酸化されたキャテニンの同一性の問題に向かうために、 ペプチドに向けられた(peptide-directed)抗体が特にα−又はβ−キャテニンを 認識するために育成された。ＰＡＯ−処理された細胞はＳＤＳ中で溶解(lyse)さ れ、次いで加熱によりタンパク質複合体を解離する。これらの条件下で、チロシ ンリンタンパク質と結合したタンパク質ではなく、個々のチロシンリン酸化タン パク質のみが抗−リンチロシン抗体を用いて免疫沈殿(イムノプレシピテート)さ れる。かかるイムノプレシピテートにおいて、β−キャテニンはＰＡＯ又は予期 される如く過バナジウム酸塩の何れかによる細胞の処理に応答して急速に増加さ れる（第６Ｂ図）。しかしながら、α−キャテニ ンはリンチロシンイムノプレシピテート中で検知可能でなかった（第６Ｃ図）。 更にＰＡＯ又は過バナジウム酸塩でさえこれらに刺激されたα−キャテニンのチ ロシンリン酸化はα−キャテニンイムノプレシピテート（第６Ｄ図）中に検知さ れ得なかった（第６Ｅ図）。かくしてβ−キャテニンリン酸化のチロシンリン酸 化はＰＡＯに応答して増加され、これはそのリンチロシン抗体による免疫沈殿（ イムノプレシピテート）を説明する。更に、この増加したリン酸化はα−キャテ ニンがチロシンリン酸化される様には見えないということにおいて、むしろ選択 的である様に見える。 （ii）キャテニンリン酸化の可逆性 ＴＥＲに対するＰＡＯの効果は還元剤により逆進され得るから、キャテニンリ ン酸化が同様に逆進されるかどうが定められた。細胞はキャテニンのチロシンリ ン酸化を刺激するためＰＡＯで15分間処理され、次いで2,3−ジメルカプトプロ パノールと共に、又はそれなしに更に45分間処理された（第３図）。15分で観察 されたキャテニンのチロシンリン酸化は60分までの間持続した（第６Ｆ図）。し かしながら、2,3−ジメルカプトプロパノールの添加は、イムノプレシピテート の中身(content)は比較的不変であった（第６Ｇ図）からキャテニンチロシンリ ン酸化を逆進させ、凡ての条件下での複合体の定量的に成功したイムノプレシピ テーションを指示する。かくしてＰＡＯにより誘発されたＴＥＲ中の可逆的減少 は可逆的キャテニンチロシンリン酸化と相関した。 （iii）密着結合と結びついたタンパク質がチロシンリン酸化される。密着結合 透過性は接着結合(adherens junction)に依存していることが知られ、あるリン 酸化はＴＥＲ中の減少と相関していることがＰＡ Ｏを用いて示されているければも、密着結合と結びついたタンパク質は又チロシ ンキナーゼに対する基質であり得ることが可能である。それ故ＭＤＣＫ細胞中の 密着結合と結びつくタンパク質がＰＡＯに応答してチロシンリン酸化される可能 性が調べられた。ＺＯ−１及びその組み合わせタンパク質ＺＯ−２が抗ＺＯ−１ 抗体を用いてイムノプレシピテートされ、チロシンリン酸化が免疫ブロット法に より調べられた。ＰＡＯは明らかにＺＯ−１のチロシンリン酸化を刺激し、又Ｚ Ｏ−２のそれをより少ない程度に刺激した（第７図）。過バナジウム酸塩は明ら かにＺＯ−１、ＺＯ−２のチロシンリン酸化を結果し、ずっと少ない程度で130k Daのタンパク質（第７図）のそれを結果し、このタンパク質は恐らくBalda，M.S .，Gonzalez-Mariscal，L.，Matter,K.，Cereijido，M．and Anderson,J．M.，1 993，Assembly of the tight junction：the role of diacylglycerol．J．Cell Biol.，123：293-302により同定されたものと同じタンパク質である。これらの データは密着結合タンパク質並びにキャテニンはＰＡＯに応答してリン酸化され 、密着結合透過性の調節(modulation)が間接に接着結合接着性における変化を通 じて、及び／又は密着結合透過性の直接な調節により達成され得る可能性を高め る。 それ以外のデータがあとで提示され、これらに基づきキャドヘリン／キャテニ ン複合体と結びついたあるタンパク質も又チロシンリン酸化され得ることを示す 。 ２．チロシンキナーゼ抑制剤のherbimycin ＡがＰＡＯの効果を減ずる。 （ｉ）密着結合透過性 herbimycin ＡによるＭＤＣＫ細胞の前処理は引き続くＰＡＯの添 加により引き出された細胞透過電気抵抗における減少を弱めた（第８図）。 （ii）タンパク質チロシンリン酸化 Herbimycin Ａはタンパク質チロシンリン酸化を増加するＰＡＯの能力を弱め （第９図）、これは密着結合透過性へのその効果と相関している（第８図）。こ のherbimycin Ａの抑制効果はチロシンホスホターゼの抑制を経るＰＡＯ作用と 調和しており、チロシンキナーゼ抑制剤が密着結合透過性の調節に有用であり得 ることを示唆する。 ３．中大脳動脈（ＭＣＡ）閉塞後のラットの脳内皮細胞の抗チロシン標識(label ) （ｉ）卒中(stroke)及び卒中モデル 卒中は脳内に（通常）限局性の虚血を惹起する減少した血液供給の結果である 。これは血管の破裂（出血性卒中）又は血餅(blood clot)による血管の閉塞（閉 塞性卒中）の何れかにより惹起され得る。卒中からの回復は最初の発作後間もな く始まり、数日続く浮腫(oedema)の発生により危険にさらされる。この浮腫は、 もし拡がれば、増大せる頭蓋内圧を惹起し、脳を傷つけ、回復の程度を減少し得 る。卒中後最初の時間に見られる浮腫は細胞毒性である様に思われ、損傷の区域 内の細胞要素の膨潤により惹起される。しかしながら、浮腫は次の数日間尚存在 しており、この保持された浮腫は血管原性(vasogenic)であり、即ち脳毛細管内 皮細胞の増大せる透過性の結果である。増大した透過性をもつ血管は梗塞の区域 に隣接した異なる動脈により供給される微小血管である様に思われ、これらの血 管の内層をなす内皮細胞は近くの虚血組織から局部的に放出される因子に応答す ることが可能である。このケースにおいてこれらの局部的に放出される因子の作 用に 干渉する作用物質は、それらが脳血液関門の完全性の損失を防止し、卒中後の長 引く浮腫を改善し、患者の回復の程度と速度を改良することにおいて、潜在的な 治療的価値を有する。 人間において、最も屡々遭遇する卒中症候群は中脳大動脈（ＭＣＡ）のテリト リーの区域内の梗塞と組み合わされている。ＭＣＡは表面の分枝を通じて皮質の 大きな区域に対し、そしてより小さな穿通する分枝を通じて数個のより深い構造 へと血液を供給する。酷い卒中の通常用いられる生体の(in vivo)モデルは成体 のラットにおけるＭＣＡ閉塞である。 ここで、限局性脳虚血は成体のSprague Dawleyラット（ＳＤラット）の左ＭＣ Ａの、腐蝕(cauterization)による、永久的閉塞により誘発された。24時間後、 ラットは更に手術を行わず犠牲にされるか、又は犠牲にされる30分前にエバンス ブルー染料（下記参照）で静脈注射された。脳は直ちに除去され、凍結された。 ＭＣＡにより供給される脳の区域は閉塞後24時間可視的に膨潤された。 （ii）脳血液関門一体性(integrity)の分析 エバンスブルー(Evan's blue)：血液タンパク質アルブミンは無傷の脳血液関 門を有する血管の内腔(lumen)に限定されるが、脳血液関門機能が失われる時、 アルブミンは血管を去り、脳実質(parenchyma)に入る。エバンスブルー染料は血 液中のアンブミンと結合し、アルブミンが組織中に漏出する時、アルブミンに結 合した染料は蛍光顕微鏡分析により検知され得る。非固定組織の凍結区分が脳実 質中へのエバンスブルーの溢出(extravasation)のために調べられた。ＭＣＡ閉 塞はエバンスブルーを脳実質中へ左の皮質の部分に漏出する様にさせ、これは24 時間以内に検知され得る。標識をつけられた(labelled)区域 における大きな形態的変化は、脳が手術に続いて酷く損傷させたことを指示した 。損傷された区域から離れた組織（例えば、右の皮質における）はエバンスブル ーでは標識がつけられなかった。 アルブミン：脳血液関門の破裂は又ラットアルブミンに対する抗体と共に区分 を培養することにより検知され、アルブミンの漏出を示す。この様にして標識の つけられた脳の区分は又損傷の部位の近くで（血管の外側で）実質の増加した標 識づけ(labeling)を示したが、他方、非損傷区域は再び標識はつけられず、これ は閉塞により冒された部位における脳血液関門機能の局部的損失を指示する。 （iii）脳血液関門毛細管内皮細胞へのＭＣＡ閉塞の効果 先に論じた様にタンパク質チロシンリン酸化のレベルの制御は機能的密着結合 の維持のために必須である様に見える。多くの（生理活性の）因子がチロシンキ ナーゼ又はチロシンホスファターゼの活性の何れかを変えることを通じて、チロ シンリン酸化のレベルを変え得るレセプターを通じて作用する。もし虚血の間に 放出された因子がタンパク質チロシンリン酸化のレベルの変更に依存するメカニ ズムにより内皮細胞透過性を増加するならば、その時はそれらの作用がタンパク 質チロシンリン酸化の上昇を防止する薬を通じて制御され得ることが可能である 。このアプローチの利点は、第一にもし増加した透過性がチロシンリン酸化の制 御に収束する異なる経路を通って作用する多くの因子により惹起されるならば、 その時は一つの薬が多くの放出された因子の作用を制御するために用いられ得る ことである。第二に有効な処理は活性な作用物質の同定及び引き続く特定の拮抗 物質(antagonist)の開発を待つ必要としないであろう。 これらの実験において、脳の区分がリンチロシンへの抗体（単クロ ーン抗体４Ｇ10）で標識をつけられ、又血管のアウトラインを描くためコラーゲ ン(collagen)タイプIVへの多クローン抗体で標識をつけられた。疑似手術をされ た(sham operated)動物において、４Ｇ10ラベルは血管の内層の細胞の境界にお けるタンパク質のチロシンリン酸化と調和する染色のパターンをもって、いくつ かの大きな周辺に位置する血管に制限された。ＭＣＡ閉塞の24時間後、４Ｇ10ラ ベルにおける増加は酷く損傷された組織の縁に位置された微細血管と組み合わさ れて見られた（第１０図）。４Ｇ10ラベルにおける増加は損傷(lesion)の区域内 の血管に制限されたが、しかし凡ての血管が標識がつけられたのではなかった。 微細血管中の４Ｇ10分布は成体のラットからの脳組織が過バナジウム酸塩、即ち チロシン脱リン酸化に責任のある酵素を抑制することによりリンチロシンのレベ ルを上昇させる薬に露出される時に見られるそれと同様である。しかしながら、 過バナジウム酸塩は小さい及び大きい血管の両者において増大したリンチロシン を誘発し、他方、ＭＣＡ閉塞の24時間後、微細血管のみが増加したリンチロシン のレベルを示した。 制御実験においては、４Ｇ10結合(binding)は抗体のリンチロシンとの予備培 養により防止され、これは４Ｇ10のリンチロシンの特定の結合を指示する。 上記データは脳微細血管内皮細胞境界におけるチロシンリン酸化のレベルはＭ ＣＡ閉塞後24時間上方へ規制される(upregulate)ことを示唆する。卒中後に見ら れる脳血液関門漏出性は内皮細胞タンパク質チロシンリン酸化の上昇により作用 する虚血組織からの因子の放出により惹起される様に思われる。リンチロシン上 昇を防止する薬は脳血液関門の一体性の損失を減少させ、それにより神経細胞へ の引き続いて 起こる永久的損傷のあるものを防止し得る。 上記に論議した特別なキャテニンに加えて、又キャテニンキャドヘリン複合体 と結合されている他のタンパク質−ｐ100及びｐ120−がチロシンリン酸化される ことが発見された。これらが下記に論議される：ｐ100及びｐ120の議論 各種の異なる細胞の免疫ブロット(immunoblot)分析は抗−ｐ120単クローン抗 体２Ｂ12(Kanner et al.，1990)は約120kＤaの広いバンドを認識したことを開示 した。ｐ120のＣ末端部に対して育成(raise)された他の抗−ｐ120単クローン抗 体は２Ｂ12と同じバンドを認識し、加うるに、100kＤaにおいて他のバンド群(cl uster)を認識した。120ｋＤａ及び100ｋＤａにおけるバンドの多数性に対する理 由は明らかではないが、明らかにそれらは免疫的に関連している。これらの多数 のバンドの出現のパターンは又細胞のタイプに依存していた。例えば、ＭＤＣＫ 細胞においては、バンドは非常に拡散していたが、一方、ＭＤＢＫ細胞において はそれらは明らかに分解されており、特にフルオログラフィー試薬の不存在下に 〔³⁵Ｓ〕メチオニン標識化（ラベリング）により視覚化される時そうであった。 リン酸化及びミリストイル化(myristoylation)の如き翻訳後変性(post-translat ional modi-fication)は多数のバンドの出現を説明し得る可能性がある。免疫学 の関係とは別に、ｐ120とｐ100との間の関係は未だ明らかではない。Reynolds e t al．(1992)により述べられたノーザン(Northern)ブロットはｐ120関連の遺伝 子産物又は選択的に接合された転写物(alter-natively spliced transcripts)の 可能性を示唆した。更にサザーン(Southern)分析は明らかに一又はより多くのｐ 120関連遺伝子が存在 することを指示した。ｐ120に対応するバンド群及びｐ100に対する同様な群は又 それぞれｐ100及びｐ120の接合変異体(splice variant)を代表し得ることがそれ に伴う。試料は変性バッファー(denaturing buffer)中で調製され、イムノプレ シピテーションはプロテアーゼの広いスペクトルの抑制剤の存在において実施さ れたけれどもｐ100は又単にｐ120の分解生成物を代表し得ることも可能である。 吾々の結果はｐ120／ｐ100がキャドヘリン／キャテニン複合体と結合するとい う証拠を提供する。かくして、ＴＸ−可溶化された上皮細胞細胞から、抗−ｐ12 0抗体が〔³⁵Ｓ〕メチオニン標識化(labelled)タンパク質をイムノプレシピテー トし、これはキャドヘリン抗体によりイムノプレシピテートされたものと共に遊 走した(comigrated)（第１３図）。免疫ブロット分析はこれらのタンパク質の正 体(identity)をキャドヘリン及びキャテニンとして確認した（第１４図）。同様 に、抗−ｐ120反応性タンパク質はＭＤＣＫ細胞からの抗Ｅ−キャドヘリンイム ノプレシピテート中に見られたが、但し、易動度(mobility)のベースにおいてこ れは主としてｐ100を代表し、ｐ120ではない様に思われる（第１４図）。しかし ながら、ｐ120免疫反応性タンパク質は、２Ｂ12抗体のキャテニンタンパク質と の乏しい反応性のため、ＭＤＣＫ細胞中で無条件には同定されなかったことが注 目さるべきである。ｐ120／ｐ100及びキャドヘリン／キャテニン複合体の間のこ の明らかな結合は、上皮細胞に限定されなかった。それは同様な結果が内皮細胞 を用い〔³⁵Ｓ〕メチオニン標識化（第１５図）及び免疫ブロット分析（第１６図 ）の両者によって得られたからである。しかしながら、吾々の結果は明らかに内 皮細胞中でのキャテニン及びｐ120／ｐ100間の相互作用を示すけれども、吾々は 抗ｐ120イムノプレシ ピテート中でキャドヘリンを同定しなかった。上皮及び内皮細胞中のタンパク質 複合体の生化学分析の解釈は更に免疫細胞化学研究により支持される。培養され た細胞中及び組織区分中で、抗120免疫反応性は強く細胞間結合と結び付けられ 、抗β−カテニン抗体で得られたものと顕著に類似した位置確認(localisation) を展示する（第１７及び１８図）。ここで吾々はｐ120又はｐ100の何れか、又は 両者を認識し得るかも知れない抗ｐ120抗体を使用することに制限された。 勿論、抗−ｐ120抗体がキャドヘリン／キャテニン複合体をイムノプレシピテ ートする能力に対する一つの説明は、それが複合体の公知の成分の一つと交叉反 応するということである。しかしながら、これは次の理由でありそうにない。細 胞のＴＤＳ溶解(lysis)はα−キャテニン及びγ−キャテニンをキャドヘリン及 びβ−キャテニン複合体から分離する(McCrea and Gumbiner，1991参照)。ＴＤ Ｓバッファー中に溶解されたＭＤＣＫ細胞からの抗−Ｅ−キャドヘリンイムノプ レシピテート中では、抗−ｐ120抗体はＥ−キャドヘリン又は共沈殿するβ−キ ャテニンと反応するに失敗した。ＴＤＳバッファー中に溶解したＭＤＣＫ細胞か らのキャテニンイムノプレシピテート中では、抗−ｐ120抗体はα−キャテニン と反応するのに失敗した（結果は示さず）。第１６図に示した様に、ＴＤＳ−溶 解内皮細胞からのβ−キャテニンイムノプレシピテートは、明らかにβ−キャテ ニンを含み、恐らくキャドヘリンを含むが、抗−ｐ120反応性を含まなかった。 γ−キャテニン、即ち約85ｋＤａのタンパク質との交叉反応性は、第１１図に示 した免疫ブロットが100ｋＤａ以下のタンパク質との反応性を示すのに失敗して いるから、ありそうにない。 取り組まれるべき一つの課題はＴＸ溶解細胞からのキャドヘリンイ ムノプレシピテート中のｐ120／ｐ100に対応する明白な〔³⁵Ｓ〕メチオニン−標 識化バンドの全くの欠如に関する。かくして第１３図に示される如く、ｒｒ１及 びＭＤＣＫ細胞からの抗ｐ120イムノプレシピテートは顕著に類似して見える。 しかしながら、ＴＤＳ溶解細胞からの抗−ｐ120イムノプレシピテートから、抗 ｐ120反応性物質は広いバンドとして移動し、その大部分はα−及びβ−キャテ ニンの間を移動し、残余はα−キャテニンよりも僅かに遅く移動する。抗−ｐ12 0免疫反応性物質の一部のみがｒｒ１によりイムノプレシピテートされることを 示す、第１４図に示した免疫ブロット分析、及びもし定常状態の標識化が想定さ れるならば、ｐ120がα−及びβ−キャテニン中のメチオニンの数の約半分を含 むという事実と組合わせると、その時はｒｒ１イムノプレシピテート中に抗−ｐ 120免疫反応性物質に対応する何らかの標識を見ることは困難であろうことは明 らかである。同様に脳内皮細胞についての実験に関して（第１５図）、使用され た抽出条件下では、キャドヘリン／キャテニン複合体のプールの一部のみがｐ10 0と結合し、それより少なくがｐ120と結合すると思われる。かくして、β−キャ テニンイムノプレシピテート中にｐ120及びｐ100に対応するバンドの標識化を見 ることは、このゲルの領域が既に他の主要なバンドにより占められているから困 難であろう。又抗−ｐ120又は２Ｂ12イムノプレシピテートの何れかの中のβ− キャテニンイムノプレシピテート中に見られるキャドヘリンに対応するバンドを 見つけることはｐ120の標識化の優勢のために困難である（第１５図）。 キャドヘリン／キャテニン複合体をイムノプレシピテートするための２Ｂ12及 び抗−ｐ120抗体の能力に関しては又明らかな定量的差異があることが強調され る。２Ｂ12のキャニン(canine)タンパク質との 乏しい反応性のために、これはＭＤＣＫ細胞でアドレスされ得ない。ウシの脳内 皮細胞において抗−ｐ120抗体はキャドヘリン／キャテニン複合体をイムノプレ シピテートしたが、抗−β−キャテニン抗体と同様ではなかった。２Ｂ12は抗− ｐ120により尚有効性が少なかった。抗−ｐ120はｐ120及びｐ100を認識し、２Ｂ 12はｐ120のみであるから、イムノプレシピテートされた複合体の量における差 異はキャテニンとのｐ100のより大きな結びつきに原因を帰し得る。吾々が語り 得る限りでは、イムノプレシピテーションにおける抗120及び２Ｂ12の有効性は この実験において同様であった（ＴＸバッファー中に溶解された細胞からの抗− ｐ120及び２Ｂ12イムノプレシピテート中のｐ120に対応するバンドの同様な強度 においては第１５図参照）。これらのデータは又ｐ100及びｐ120の個々の複合体 がキャテニンと共に存在し、むしろ、それはキャテニン／ｐ100／ｐ120複合体で あることを指示する。もし後者のケースであったならば、２Ｂ12は抗−ｐ120抗 体と同量のキャテニンをイムノプレシピテートすることが予期されるであろう。 吾々の研究はｐ120／ｐ100と接着結合タンパク質との間にリンク(link)を提供 する。かかる恐らくｓｒｃ、ｌｙｎ及びｙｅｓの如き調節キナーゼの影響を経由 する(Tsukita et al.，1991)かかる相互作用は、キャドヘリン機能及びそれによ り接着結合によって影響される他の細胞機能の調節にある役割を演じることが可 能であるリン酸化に関しては、チロシンホスファターゼ抑制剤であるフェニルア ルシンオキシドがＭＤＣＫ細胞中の密着結合透過性における増加を生ずることが 発見された(Staddon et al.，J．Cell Sci．印刷中)。この抑制剤は、ＳＤＳ溶 解液(lysates)からの抗−ｐ120イムノプレシピテートの抗 −120免疫ブロット法により分析すると、これらの細胞中の抗−ｐ120免疫反応性 物質（大ｐ100バンド、小ｐ120バンド）のチロシンリン酸化を増加した（結果は 示さず；Staddon et al.，J．Cell Sci.参照、印刷中）。ｐ120／ｐ100タンパク 質は又キャドヘリン及びアクチンベースの細胞骨格との間の相互作用に巻き込ま れ得る。ｐ120／ｐ100は又細胞の内部に対する細胞−細胞接着性の状態について の情報を伝達するシグナル発生カスケードの一部であり得る。 β−キャテニンはアームタンパク質(arm protein)であり(McCreaet al.，1991 )、キャドヘリン及びＡＰＣ遺伝子産物と結合でき(Rubinfeld et al.，1993；Su et al.，1993)、これ又アームタンパク質である(Pefer et al.，1994)。ｐ120 はアームタンパク質であり(Reynolds et al.，1992；Peifer et al.，1994)、又 吾々がここで述べる様に、ｐ100は免疫学的に関連したタンパク質である。これ らのタンパク質はβ−キャテニンと相互反応し得る。ｐ120／ｐ100とキャテニン との間の相互作用の正確な性質はまだ確立されていない。これらのタンパク質は キャドヘリンの細胞骨格ドメインの異なる領域と直接相互作用するか、又は結合 し得る。他のリンクする又は中間に結びつく(intermediary binding)タンパク質 も又巻き込まれ得る。明らかに、アームタンパク質間に多様な相互作用がある様 に見え、細胞内シグナル発生におけるアームモチーフの重要性を示唆している。 総合して、吾々の研究はｐ100をｐ120関連タンパク質として同定する。吾々は これらのタンパク質がキャドヘリン／キャテニン複合体と相互作用するという証 拠を提供する。細胞形質転換及びｐｐ60^src基質としてのｐ120の同定の重要性を 与えられると、これはｐ120／ｐ100が細胞成長制御及び細胞−細胞接着への影響 を経由する密着結 合透過性制御の如き他のプロセスにおいてある役割を演じ得ることを示唆する。 他のグループは又キャドヘリン／キャテニン複合体の成分の増大せるチロシン リン酸化を、しかし、ここに述べられたものとは異なる条件下で観察した。ｐｐ 60^v-srcで形質転換(トランスフェクト)されたラットの３Ｙ１細胞、即ち繊維芽 細胞ライン(fibroblast cell line)において、バナジウム塩はＥ−又はＰ−キャ ドヘリン及びβ−キャテニンのチロシンリン酸化を誘発した(Matsuyoshi et al. ，J．Cell Biol．118 703-714(1992))。ニワトリの胚繊維芽細胞(chicken embry o fibroblast)において、ｐｐ60^v-srcはＮ−キャドヘリン及びα−及びβ−キャ テニンのチロシンリン酸化を惹起した。ＭＤＣＫ細胞中のｐｐ60^v-src活性はＥ −キャドヘリン及びβ−キャテニンの急速な（10−30分）チロシンリン酸化を結 果した(Behrens et al.，J．Cell Biol．120 757-766(1993))。Behrens et alは 又ｐｐ60^v-srcはＭＤＣＫ細胞のＴＥＲにおける減少を結果したことを報告した 。しかしながら、ＴＥＲにおける減少はＥ−キャドヘリン／β−キャテニンのチ ロシンリン酸化の４時間後に観察された。更に、ｐｐ60^v-srcは上皮から繊維芽 細胞様への細胞形態における大きな変化を結果した。Behrens et al.の結果(199 3)は現在の結果とは、ＴＥＲにおける非常に急速な減少が細胞形態における何ら の大きな変化も存在しないでここに示されているということにおいて異なってい る。 吾々のデータはキャドヘリン／キャテニン複合体（特にβ−キャテニン）の成 分、及び／又はこの複合体と連結されたある種のタンパク質（特にｐ120及びこ こで“ｐ100”として言及されたタンパク質）の成分のチロシンリン酸化は、密 着結合の透過性を鋭敏に規制するの に役立ち得ることを示唆する。かくして細胞内キナーゼ媒介チロシンリン酸化は 、細胞外Ｃａ²⁺の除去と同様、接着結合の急速な結合解離(uncoupling)へと導き 得る。従って、これは密着結合の開放へと導く。 キャドヘリンの保全された(conserved)細胞質ドメインはα−，β−及びγ− キャテニンと名付けられた三つのタンパク質と結合することが知られており(Oza wa et al.，1989)、これらはキャドヘリンをアクチンベースの皮質細胞骨格へリ ンクするのに役立つ(Hirano et al.,1987)。キャドヘリンのキャテニンとの結合 は細胞間Ｃａ²⁺−依存接着性にとって必須である（Nagafuchi and Takeichi，19 88；Ozawa et al.，1990；Kintner，1992）。α−キャテニンはビンキュリン(vi nculin)の同族(homologuous)であり(Herrenknecht et al.，1991；Nagafuchi et al.，1991)、それをアクチンベースの細胞骨格との相互作用に対し良い候補者 としている(Ozawa et al.，1990；Hirano et al.，1992参照)。β−キャテニン はしょうじょうばえ(Drosophila)セグメント方向性遺伝子(segment polarity ge ne)armadilloと同族であり、脊髄動物における発生シグナリング(developmental signalling)における役割を示唆する(McCrea et al.，1991)。γ−キャテニン は恐らくプラコグロビン(plakoglobin)と同一であり（Knudsen and Wheelock，1 992；しかし、Piepenhagen and Nelson，1993参照）、これは再びarmadilloと同 族である(Franke et al.，1989；Peifer and Wieschaus，1990参照)。本当にβ −キャテニン及びプラログロビンは多重遺伝子家族を形成する様に思われる(Pei fer et al.，1992)。 armadillo中に最初に同定された繰り返しの42アミノ酸モチーフは(Riggieman et al.，1989)又βキャテニン及びプラコグロビンを含めて数個の他のタンパク 質中で、多様な機能をもって見出された(Peifer et al.，1994)。これらはＡＰＣ遺伝子産物、腫瘍サプレッサータンパク質(Kinz ler et al.，1991)、ｐ120、ｐｐ60^src基質(Reynolds et al.，1992)、ｓｍｇ ＧＤＳ、ｒａｓ関連Ｇタンパク質に対する交換因子(Kikuchi et al.，1992)、酵 素中のＲＮＡポリメラーゼＩ突然変異のサプレッサー(Yano et al.，1992；1994 )及びバンド６タンパク質、主たる細胞間橋成分(desmosomal constituent)(Hatz feld et al.，1994)を含む。これらのアームタンパク質における反復(repeat)の 機能は未知である。興味あることは、ＡＰＣ遺伝子産物はβ−キャテニンと結合 し(Rubinfeld et al.，1993；Su et al.，1993)、細胞成長を規制する細胞内プ ロセスにおけるキャテニンに対する重要な役割を支持する。更に、これはキャド ヘリンがキャテニンの占有的細胞パートナーではなく、キャテニン、キャドヘリ ン及びアームタンパク質の間に、多様な生物学的プロセスにおいて重要な他の相 互作用の可能性を引き起こす。 ｐ120は当初チロシンキナーゼｐｐ60^srcの数個の基質の一つとして同定された (Reynolds et al.，1989；Kanner et al.，1990)。それは膜と結合しており(mem brane-associated)、ミリストリル化され得るが、グリコシル化される様には思 われない(Kanner et al.，1991)。突然変異分析はｐ120のチロシンリン酸化はｐ ｐ60^src−媒介細胞形質転換のそれのために必要であることを示唆した(Lindler and Burr,1988；Reynolds et al.，1989)。ｐ120のチロシンリン酸化は又表皮成 長因子、血小板由来成長因子、コロニー形成促進因子１に応答して観察され、又 ポリオーマウイルスミドルＴ抗原−転換細胞中に観察された(Downing and Reyno lds，1991；Kanner et al.，1991)が、しかし細胞生理学及び病理学におけるｐ1 20の正確な役割は未だ確立さ れていない。 吾々のデータは密着結合の透過性は、決定的にキャドヘリン／キャテニン複合 体及び／又はそれらと結合するある種のタンパク質のリン酸化を決定するチロシ ンキナーゼ及びチロシンホスファターゼのバランスに依存していることを示唆す る。チロシンキナーゼの適当な刺激（又はチロシンホスファターゼの抑制）はそ れ故密着結合を包含する脳血液関門又は他の関門を開放するべきである。逆に内 皮細胞チロシンキナーゼの抑制（又はチロシンホスファターゼの活性化）は例え ば卒中に引き続く増大せる脳血液関門漏出性から結果する浮腫の量を少なくし、 脳腫瘍と結合する浮腫を少なくし、又は防止するであろう。同様に、脳血液関門 を横切る細胞の往来(trafficking)を包含する状況の間、内皮細胞チロシンキナ ーゼの抑制が細胞の移動を防止すべきである。 利用し得るチロシンキナーゼ抑制剤は次のものを含む：ゲニスタイン(geniste in)、ハービマイシン(herbimycin)Ａ、ラベンダスティン(lavendustin)Ａ；メチ ル−2,5−ジヒドロキシ−シンナメート；スタウロスポリン(staurosporine)及び チルホスチン(tyrphostins)。 チロシンキナーゼ活性化剤は適当なチロシンキナーゼと結合するレセプターを 活性化する、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ及びＶＥＧＦの如き各種のリガンドを包含する。 又、虚血の間、リガンドが内皮細胞チロシンキナーゼを活性化するグリア(glial )又は神経細胞から放出され、それにより脳血液関門の開放を惹起させるのかも 知れない；このリガンドの遮断薬（ブロッカー）は卒中の治療において特に有用 であろう。 チロシンホスファターゼ抑制剤はバナジウム酸塩及びフェニルアルシンオキシ ドを包含し、その後者はそのより特別の活性のため好まし い。 チロシンタンパク質脱リン酸化を促進し、それ故脳血液関門の如き生理的関門 の閉鎖を促進する作用物質は、多数の方法で有用である。かかる薬剤は卒中に引 き続く脳浮腫又は脳腫瘍と結する脳浮腫を減少すること及び脳中に多発性硬化症 において生起する様な免疫応答を仲介する白血球及び腫瘍を形成し得る転移性癌 細胞の両者の進入を閉塞するのに有用である。かかる薬剤は又高度肺浮腫の如き 末梢浮腫を防止又は軽減するため末梢内皮細胞中のチロシンタンパク質脱リン酸 化を促進するのに有用である。かかる薬剤に対するその他の用途は弛い密着結合 により悪化され得る、胃潰瘍を処理するため胃の上皮細胞中のチロシンタンパク 質脱リン酸化を促進することであるだろう(Ohkusa et al．Gut 34 86-89(1993)) 。 チロシンタンパク質リン酸化を促進し、それ故脳血液関門の如き生理的関門の 開放を促進する作用物質は又多数の方法で有用である。かかる薬剤は末梢腫瘍へ の化学療法剤の送出を増加するため内皮細胞チロシンタンパク質リン酸化を促進 するのに有用である（末梢腫瘍は脳血液関係の如く密着した関門を有しないけれ ども、腫瘍の中心はしばしばよく血管化(vascularized)されていない。）。かか る薬剤は又、好ましくは吸入器を用いて投与される時、肺上皮細胞チロシンタン パク質リン酸化を促進するのに有用であり、それにより密着結合が流体に対し漏 出性になり、これは次いで航空路において粘液の蓄積を稀釈する様に作用し得る 。 本発明の第三の観点によればチロシンタンパク質リン酸化を促進する作用物質 の使用と、脳又は身体の他の部分へ関門を横切って薬を送出するための薬剤の調 製における脳血液関門又は他の生理的関門不浸 透性の薬の使用が提供される。 薬は通常脳血液又は他の生理的関門に対し不浸透性であるか又は少なくとも不 十分に浸透性である、薬学的に、獣医学的に又は診断的に有用な如何なる有用な 化合物又は化合物の組成物であり得る。薬の薬理的性質はその他は重要でない。 本発明はそれ故脳血液関門の如き生理的関門を横切る広い範囲の薬の送出に有用 である。しかしながら、本発明のこの観点による送出のための主たる候補は次の ものであろう：メトトレクセート(methotrexate)、アドリアマイシン(adriamyci n)及びシスプラテイン(cisplatin)の如き抗潰瘍物質；ＮＧＦ、ＢＤＮＦ及びＣ ＮＴＦの如き、神経変性疾患を処理するために使用される成長因子；イメージ剤 (imaging agent)、特に抗体をベースとするもの；及び脳血液関門を貫通しない 神経伝達物質の拮抗薬又は作用薬（ある種のＮＭＤＡレセプターブロッカーの如 き）。 本発明の第４の観点によれば、チロシンタンパク質リン酸化を促進する作用物 質及び脳血液関門の如き生理的関門を横切って送出さるべき薬を含む組成物が提 供される。組成物は又薬学的に又は獣医学的に許容され得るキャリアーを含み得 る。 脳血液関門の如き生理的関門を横切る薬の送達において有用であることに加え て、本発明は又ある種の望ましくない薬が関門を横切るのを、もしそれらの関門 を横切る通過が密着結合を経由するのであれば、防止するのに有用である。 本発明の組成物及び本発明に有用な作用物質は任意の適当な手段、経口(enter al)又は非経口、での投与に適合され得る。注射又は輸注の如き非経口投与のた めの組成物は一般に無菌であろう。任意の特定の作用物質の供与量は多数の因子 に依存し、実験的又は臨床的試行に より最適化されるであろう。如何なる場合にも、特定の患者又は対象に対する適 当な供与量は、各ケースにおける責任ある医師又は臨床医により決定されるであ ろう。 本発明の各観点の好ましい特性は、各他の観点に対しても必要な変更を加えて 同様である。 本発明は次に例のみにより説明されるであろう。 以下の実施例において、下記に論議される物質及び方法が利用される。 実施例１乃至１０のための物質及び方法 物質及び試薬 組織培養処理した、ポリカーボネートトランスウェル(Transwell)フィルター( 0.4μＭ)はコスター(Costar)からであった。凡ての組織培養物質は、Lampire Bi ological Laboratories(Pipersville，PA)から来たプラズマ由来のウマ血清を除 いて、ギブコ(Gibco)からであった。バナジウム酸塩はシグマ(Sigma)から、フェ ニルアルシンオキシド（ＰＡＯ）はコダック(Kodak)からであった。ゲル電気泳 動試薬はビオーラッド(Bio-Rad)からであった。他の使用された試薬は市販入手 可能な最高等級のものであった。抗 体 α−及びβ−キャテニンに対する抗体はグルタルアルデヒドによりキーホール リンペットヘモシアニン(Pierce)に結合された合成ペプチドを用いてウサギ中で 育成された。α−キャテニンに対するペプチドはマウスαＥ−キャテニン(Herre nknecht et al.，1991)のアミノ酸890-901に対応し、β−キャテニンに対するペ プチドはマウスβ−キャテニン(Butz et al.，1992)のアミノ酸751-781に対応し た。β− キャテニンペプチドはタンパク質中にはない、結合のための付加的Ｃ末端リジン を含有した。Ｒｉｂｉアジュバントシステム(RIBI Immuno-chem Research，Inc. )を用いて３週間の間隔での皮内及び皮下免疫処理の数ラウンドの後、特定の抗 体がペプチド−ε−カーボキシヘキサノイル(ＥＣＨ)−Sepharose(Pharmacia)コ ラム（それぞれ、Pharmaciaにより述べられる如くＥＣＨ-Sepharose ４Ｂの１ml に結合されたα−キャテニン及びβ−キャテニンペプチドの６及び15mg）上のア フィニティクロマトグラフィーにより分離された。 ラットの単クローン抗−ＺＯ−１抗体（Ｒ40、76）はDr．Bruce Stevenson(De partment of Anatomy and Cell Biology，University of Alberta，Edmonton，C anada)からであった。マウス単クローン抗−Ｅ−キャドヘリン抗体ｒｒ１はDr． Barry Gumbiner(Memorial Sloan-Kettering Cancer Center，New York，NY)から であった。ラット単クローン抗α−キャテニン(α-18)はProf．Shoichiro Tsuki ta及びDr.Akira Nagafuchi(Department of Information Psysiology，National Institute for Physiological Sciences，Okazaki，Japan)。単クローン抗−ホ スホチロシン抗体ＰＹ20はICN Biomedicalsからであった。ホースラディッシュ ペルオキシダーゼコンジュゲート抗−ホスホチロシン抗体ＲＣ20ＨはTransducti on Laboratoriesからであった。アガローズ(agarose)に対しコンジュゲートされ たホスホチロシン抗体（４Ｇ10）はUpstate Biotechnology Inc.からであった。 ＦＩＴＣコンジュゲートのヒツジ抗ラット及び抗マウスＩｇＧはJackson Immuno -research Ltd．からであった。細胞培養 凡ての細胞は加湿された空気中で５％ＣＯ₂の下に37℃に維持され た。Dr．Barry GumbinerからのＭＤＣＫ細胞（株Ｉ）は10％ＦＣＳを含むＭＥＭ 中に維持された。実験的使用のため、培地の0.2ml中10⁵細胞が6.5mmのTranswell フィルター上にプレートされた(plated)。基底外側のチャンバーは培地(medium )の0.75mlを含んでいた。細胞は平板培養(plating)後４及び７日の間に用いられ た。 ウシの脳内皮細胞の一次培養は本質的にRubin et al.(1991)により述べられた 様に調製された。細胞は50％の星状膠細胞馴化培地中で連続的に成育された。6. 5mmのコラーゲン塗被Transwell フィルター上で2.5×10⁴細胞をプレート後、細 胞は２−３日間、Rubin et al.(1991)により述べられた如く、250μＭ 8−(４− クロロフェニルチオ)ｃＡＭＰ（ＣＰＴ−ｃＡＭＰ）プラスホスホジエステラー ゼ抑制剤Ｒｏ20-1724(Calbio-chem)の17.5μＭの不在及び存在において保持され た。実験プロトコル及び耐性(resistance)測定 ＭＤＣＫ細胞を含む実験のための、培養培地は使用前少なくとも２時間0.5％ の子ウシ血清を含むＭＥＭで置き換えられた。脳内皮細胞については、添加は細 胞が培養された培地に対し直接なされた。最初の耐性測定はMillicell-ＥＲＳ耐 性システム(Millipore)を用いてなされた。水溶液は100倍に濃縮されたストック 溶液からTranswellの先端及び基底外側のチャンバーへ添加された。バナジウム 酸塩はｐＨ７の0.1Ｍストック溶液として調製された。ＰＡＯはＤＭＳＯ中に溶 解され、培地へ1000倍濃縮ストックから直接添加された。耐性測定は引き続いて 指示された如くなされた。凡てのケースにおいて適当な溶媒コントロールは耐性 には何ら影響を有しなかった。傍細胞フラックス(Paracellular flux) 培養培地が0.5％の子ウシ血清(0.1ml／先端チャンバー；0.5ml／基底外側チャ ンバー）を含む重炭酸イオンを含まない、Hepes-緩衝のＭＥＭ(ICN Biochemical s)により置換され、Transwellsが次いで37℃において加湿空気雰囲気下で２時間 培養された。この培養培地への転換それ自体はＭＤＣＫ細胞の耐性には影響しな かった。添加はチャンバーに対し指示した如くなされ、そして直ちに培養培地10 μｌ中〔Ｕ−¹⁴Ｃ〕シュークローズ(621 Ci/mol；Amersham)の１μＣｉが先端チ ャンバーに対し添加された。Transwellsは次いでLuokham Ｒ100ロータリーシェ ーカー(Denley Instruments Ltd.，West Sussex，UK)上でセッティング４におい て震盪され、基底外側チャンバーのアリコットがシンチレーション・カウンティ ングのため指示された如く除去された。免疫細胞化学 細胞は0.5mＭ ＣａＣｌ₂及び0.5mＭ ＭｇＳＯ₄を含むＰＢＳ中に作られた(mad e up)３％パラホルムアルデヒド中に固定された。室温で15分後、固定された細 胞は洗滌され、次いでＰＢＳ中0.5％ TritonＸ-100で培養(incubation)により透 過性にされた。洗滌後、細胞は10％子ウシ血清プラス0.1Ｍリジンを含むＰＢＳ 中で30分間培養された。一次抗体での培養は室温で１時間か又は４℃で一晩かの 何れか、10％子ウシ血清を含むＰＢＳ中であった。洗滌後、細胞は次いで30〜60 分間室温で、ＦＩＴＣ−共役ヒツジ抗マウス又は抗−ラットＩｇＧの１：100稀 釈をもって、適切には、10％子ウシ血清を含むＰＢＳ中で培養された。要求され た時には、ローダミンファロイジン(rhodaminephalloidin)（２Ｕ／ml：Molecul ar Probes，Inc.）が二次抗体と共に包含された。洗滌後、フィルターはCitiflo ur(Citiflour Products, Canterbury，UK)と共に据え付けられ、40ｘ及び60ｘ対物レンズが取り付けられ たNikon Microphot-ＦＸＡ蛍光顕微鏡を用いて検査された。写真がKodak Ｔ-Ｍ ＡＸフィルム(400ＡＳＡ)を用いて撮られた。ノムノプレシピテーション 24mm Transwells 上の細胞の合流する単層が氷冷ＰＢＳ(0.9ｍＭＣａＣｌ₂及 び0.5ｍＡ ＭｇＣｌ₂を含む)をもって洗滌された。適当なバッファーの0.5ml中 での溶解後、フィルターは穏やかに掻きとられ、溶解産物は次いで14,000xgで遠 心分離された。上澄液は溶解バッファー中で15分間、10％(w/v)タンパク質Ａ-Se pharoseで予めクリアーされた(precleared)。適当な一次抗体が溶解産物に添加 され、免疫複合体が必要に応じ家兎二次抗体及びタンパク質Ａ-Sepharoseを用い て分離された。珠(beads)は溶解バッファーで５回洗滌され、結合されたタンパ ク質はＳＤＳ−サンプルバッファー(Laemmli，1970)中に溶解化され、続いて100 ℃で５分間加熱された。 使用されたプロテアーゼ抑制剤は次のものであった：ロイペプチン(leupeptin )，10μｇ／ml；α−マクログロブリン，0.1Ｕ／ml；大豆トリプシン抑制剤，10 μｇ／ml；ＰＭＳＦ，１ｍＭ。キャドヘリン／キャテニン複合体は４℃で次のも のを含むバッファーを用いて分離された：20ｍＭイミダゾール，ｐＨ 6.8；100 ｍＭ ＫＣｌ：10ｍＭＥＧＴＡ；２ｍＭ ＭｇＣｌ₂；300mＭシュークローズ；0.2 ％トリトン(Triton)Ｘ-100；１ｍＭバナジウム酸塩：１ｍＭ ＮａＦ；25mＭＰＡ Ｏ；0.02％ＮａＮ₃；プロテアーゼ抑制剤。変性タンパク質は細胞を次のものに 溶解後イムノプレシピテーションにより分離された：１％ＳＤＳ：Hepes,ｐＨ 7 .4；25mＭ ＮａＦ；１ｍＭバナジウム酸塩；25μＭ ＰＡＯ；２ｍＭ ＥＤＴＡ。 溶解産物は100℃で５分間加 熱された。ＤＮＡは23Ｇ針を用いて剪断され、サンプルは次いで次のものを含む 氷冷バッファー中に稀釈された：３％トリトンＸ-100；0.1Ｍ ＮａＣｌ；Hepes, ｐＨ 7.4;25mＭ ＮａＦ；１ｍＭバナジウム酸塩：25μＭ ＰＡＯ；２ｍＭ ＥＤ ＴＡ；プロテアーゼ抑制剤。ＺＯ−１及び組み合わせのタンパク質は４℃におい て本質的にGumbiner et al.(1991)により述べられた如く次のものを含むバッフ ァーを用いて分離された：１％トリトンＸ-100；0.5％デオキシコール酸ナトリ ウム塩；0.2％ＳＤＳ；0.15Ｍ ＮａＣｌ；10mＭ Hepes，ｐＨ 7.4；25ｍＭ Ｎａ Ｆ；25μＭ ＰＡＯ；２ｍＭ ＥＤＴＡ；プロテアーゼ抑制剤。電気泳動及び免疫ブロット法 全細胞溶解産物が培地をＳＤＳサンプルバッファー(Laemmli，1970)で急速に 置換し、続いて100℃で５分間加熱することにより調製された。ＳＤＳサンプル バッファー中の細胞抽出物即ちイムノプレシピテートはＳＤＳ−ＰＡＧＥ(Laemm li，1970)により分解された。厚板状(slab)ゲルは次いで48ｍＭ Tris，39ｍＭグ リシン、20％メタノール及び0.03％ＳＤＳを含むバッファー中で均衡化された。 タンパク質はニトロセルロースフィルター(Hybond ECL，Amersham)へ移され、こ のフィルターはPonceau Ｓで染色され、次いでＰＢＳ中５％無脂ドライミルク中 で遮断（ブロック）された。0.05％Tween-20を含むＰＢＳ中で洗滌後、フィルタ ーはホースラディッシュペルオキシダーゼ−共役抗−ホスホチロシン抗体（ＲＣ 20Ｈ）又は他の記述された如き非共役抗体で探査（プローブ）された。洗滌後、 非共役抗体は適当なホースラディッシュペルオキシダーゼ−共役二次抗体と反応 された。フィルターは次いで広範に洗滌され、そして免疫反応性バンドが増強さ れた ケミルミネッセンス(Amersham)により製造者のインストラクションに従って探知 された。実施例１１乃至１８のための物質及び方法 抗 体 Gumbiner及びSimons(1986)により開発された抗−キャニンＥ−キャドヘリン抗 体ｒｒ１がBarry Gumbiner(Memorial Sloan-Kettering Cancer Center，NY)によ り提供されるか、又は Department of Pharmacology and Molecular Sciences ，Johns Hopkins University School of Medicines，Baltimore，ＭＤ 21205及 びDepartment of Biological Sciences，University of Iowa，Iowa City，ＬＡ 52242により維持されたDevelopmental Studies Hybridoma BankからＮＩＣＨＤ からの契約N01-ＨＤ-2-3144の下に得られた。抗−ヒトＥ−キャドヘリン抗体Ｈ ＥＣＤ-1(Shimoyama et al.，1989)はTakara Bio-medicals(Shiga，Japan)から であった。抗−ｐ120及び抗−限局性接着(focal adhesion)キナーゼ(ＦＡＫ)抗 体はTransduction Laborato-ries(Lexington，KY)からであった。抗−ｐ120抗体 ２Ｂ12(kannar et al.，1990)は J．T．Parsons(University of Virginia，Char iottes-ville，UA)からのギフトであった。α−及びβ−キャテニンに対するペ プチド−指向抗体(Staddon et al.，J．Cell Sci．印刷中)は親切にKurt Herren knecht(Eisai Research Laboratories Ltd.，University College London，Lond on UK)により提供された。イムノプレシピテーション及び免疫細胞化学に用いら れた凡ての二次抗体は Jackson Laboratories Inc.(West Grove，PA)からであっ た。免疫ブロット法に用いられたＨＲＰ−共役二次抗体はAmersham(Buckinghams hire，UK)からであった。細 胞 次の細胞が100Ｕ／mlペニシリン及び100μｇ／mlのストレプトマイシンを含む 培地中で37℃で培養された：Caco-２（ヒト間代性潰瘍から誘導された上皮細胞 ：５％ＣＯ₂，ＭＥＭ，10％ＦＣＳ，１％可欠アミノ酸，１μｇ／mlインシュリ ン）；ＥＣＶ（ヒト臍静脈内皮細胞から誘導された細胞株：５％ＣＯ₂，Ｍ199， 10％ＦＣＳ）；ＬＬＣ−ＰＫ１（ブタ腎臓から誘導された上皮細胞）；５％ＣＯ₂ ，Ｍ199,10％ＦＣＳ）；ＭＤＢＫ（ウシ腎臓から誘導された上皮細胞：５％Ｃ Ｏ₂，ＭＥＭ，10％ＦＣＳ）；株Ｉ ＭＤＣＫ細胞（イヌ腎臓から誘導された上皮 細胞；５％ＣＯ₂，ＭＥＭ，10％ＦＣＳ）；ＲＢＥ４細胞(不死化したラット脳内 皮細胞(Duriece-Trautmann et al.，1993を参照)；５％ＣＯ₂，α−ＭＥＭ：Ham 's Ｆ10(１：１)，10％ＦＣＳ，0.3mg／mlゲネチシン(geneticin),１ng／ml ｂ ＦＧＦ)；スイス３Ｔ３繊維芽細胞（10％ＣＯ₂，ＤＭＥＭ，10％ＦＣＳ），Ｃac o-2，ＥＣＶ304，ＬＬＣ−ＰＫ１及びＭＤＢＫ細胞はEuropean Collection of A nimal Cell Cultures(Salisbury，UK)から得られた。ＭＤＣＫ細胞はBarry Gumb inerにより提供された。ＲＢＥ４細胞はPierre Couraud(Universife Paris VII ，Paris，France)及びSwiss ３Ｔ３繊維芽細胞はEnrique Rozengurt(Imperial C ancer Research Fund，London，UK)からであった。ヒト臍静脈内皮細胞はClonet ics(Palo Alto，CA)からであり、製造者のインストラクションに従って培養され た。 ウシ又はブタの脳内皮細胞の一次培地はRubin et al.(1991)により記述される 如く育成された。実験の目的で、Ｃaco-２，ＭＤＢＫ，ＭＤＣＫ及び脳内皮細胞 は組織培養−処理した、ポリカーボネートTranswellフィルター（ポリカーボネ ート，0.4μｍ；Costar，Cam- bridge，MA）上に定置された。他の細胞は組織培養プラスチック上で育成された 。免疫ブロット法及びイムノプレシピテーション 0.5％血清中に16−20時間保持された培養からの全細胞溶解産物が培地を５ｍ Ｍ ＥＤＴＡで補足された熱Laemmliサンプルバッファー(Laemmli，1970)で急速 に置換し、引き続き100℃で５分間加熱することにより調製された。タンパク質 はスラブーゲル電気泳動によりLaemmli(1970)により述べられた如く分解された 。ゲルは48ｍＭ Tris,39ｍＭグリシン，0.03％ＳＤＳ(w/v)及び20％メタノール( v/v)を含むバッファー中で均衡化され、次いでニトロセルロースフィルター(Hyb ond ECL，Amersham)へ移された。Ponceau Ｓ染色後、フィルターはＰＢＳ中５％ (w/v)脱脂粉乳中で４℃において16−18時間ブロックされた。フィルターは次い で一次抗体と共に0.05％Tween-20及び１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で培養され、次 いで適当なＨＲＰ−共役二次抗体及びケミルミネッセンス（ＥＣＬ，Amersham） による検知を行った。 イムノプレシピテーションは４℃で行われた。培養はＰＢＳでリンスされ、次 いでＴＸバッファー（１％(v/v)Triton Ｘ-100，25ｍＭHepes, ２ｍＭ ＭＥＤ ＴＡ， 0.1Ｍ ＮａＣｌ，25ｍＭ ＮａＦ，１ｍＭバナジウム酸塩，25μＭフェニ ルアルシンオキシド，ｐＨ 7.6（ＮａＯＨで調節），１ｍＭ ＰＭＳＦ，10μｇ ／ml大豆トリプシン抑制剤，0.1Ｕ／ml α２−マクログロブリン，10μｇ／mlロ イペプチン(leupeptin))又は 0.5％(w/v)デオキシコール酸ナトリウム及び 0.2 ％(w/v)ＳＤＳを補足した以外はＴＸバッファーと同一であるＴＤＳバッファー のどちらか中に溶解された。細胞は溶解(lysis)バッファで10−15分間培養され 、次いで掻取られた。溶解産物は集めら れ、14,000xgで20分間遠心分離された。上澄液はProtein Ａ Sepharose(Pharmac ia，UK)で１−２時間予め清澄化(preclear)され、次いで一次抗体と共に１時間 培養され、次いでもう１時間家兎抗体の場合にはProtein Ａ Sepharoseのみで、 又マウス単クローン抗体に対しては家兎抗−マウス抗体と一緒に培養された。溶 解バッファー中で５回洗滌後、免疫複合体はLaemmliサンプルバッファーの添加 により解離され、引き続いて100℃で５分間加熱された。タンパク質分析はＳＤ Ｓ−ＰＡＧＥ及び上述の免疫ブロット法によってなされた。 ｛³⁵Ｓ｝メチオニンラベリング(labelling)に対しては、培養は0.5％ＦＣＳで 補足されたメチオニンフリーのＭＥＭ中で２回洗滌された。細胞は16−18時間、 50μＣｉ／ml｛³⁵Ｓ｝メチオニン(＞1000Ｃi/mmol,Amersham)を含みこの培地中 で培養された。タンパク質分析はＳＤＳ−ＰＡＧＥによりなされ、引き続き25％ メタノール／10％酢酸中で固定(fixation)がなされた。ラベル付けされたタンパ ク質は室温での直接のオートラジオグラフィー又は−80℃におけるフルオログラ フィーの何れかにより検出され、引き続きゲルのAmplify(Amersham)による含浸 がなされた。免疫細胞化学 細胞は0.5mＭ ＣａＣｌ₂及び0.5mＭ ＭｇＳＯ₄を含むＰＢＳ中に作られた３％ パラホルムアルデヒド中に15分間固定された。固定された細胞は洗滌され、次い でＰＢＳ中0.5％ Triton Ｘ-100と共に10分間の培養により透過性にされた。洗 滌後細胞は10％子ウシ血清及び0.1Ｍリジンを含むＰＢＳ，ｐＨ 7.4中で30分間 培養された。洗滌後、細胞は次いで30−60分間、蛍光体共役の抗−マウス又は抗 −家兎ＩｇＧを適宜、10％子ウシ血清を含むＰＢＳに１：100で稀釈したも のの中で培養された。洗滌後、フィルターがCitifluor(Citifluor Products，Ca nterbury，UK)と共に据え付けられ、40ｘ及び60ｘ対物レンズが取り付けられたN ikon Microphot-ＦＸＡ蛍光顕微鏡を用いて検査された。写真がKodak Ｔ−ＭＡ Ｘフィルム(400ＡＳＡ)を用いて撮られた。 細胞切片(section)の調製のためには、ＣＯ₂窒息されたラットからの脳及び骨 格筋が取り出され、液体窒素中で急速に冷凍された。組織ブロックがTissue Tek (R．Lamb，London，UK)中に据え付けられ、５−10μｍ厚さの切片がBrightクリ オスタット上で切断され、空気乾燥され、−20℃で４週間まで貯蔵された。解凍 後、切片は上述の如く固定され且つ透過性化された。切片は次いで洗滌され、10 ％子ウシ血清を含むＰＢＳでブロックされ、10％子ウシ血清を含むＰＢＳ中に稀 釈された一次抗体と共に２時間培養された。洗滌後、それらは10％の子ウシ血清 を10％ヤギ血清か又は10％のロバ血清の何れかを二次抗体の宿主として適宜含む ＰＢＳと共に15分間培養された。それらは次いでＰＢＳ中に希釈された二次抗体 と共に１時間培養された。切片は上述の如く洗滌され、据え付けられそして検査 された。実施例１ 過バナジウム酸塩はＭＤＣＫＩ細胞の細胞透過電気抵抗を減少する。株Ｉ Ｍ ＤＣＫ細胞は6.5mm，0.4μｍ孔の、TRANSWELL^TMフィルター(CostarカタログNo.3 413)上で育成された。細胞はフィルター当たり10⁵で置かれ、加湿された５％Ｃ Ｏ₂培養器中で37℃において４−７日間培養された。これらの条件下で株Ｉ ＭＤ ＣＫ細胞は2000−5000Ω-cm²の細胞透過電気抵抗値を与えた。その結果が第１ａ 図にグラフ的に示されている実験において、バナジウム塩は（ナトリウム塩ｐＨ ７ として）、最終濃度0.01ｍＭ（■）0.1ｍＭ（●）又は1.0ｍＭ（▲）へと添加さ れた。細胞透過電気抵抗（ＴＥＲ）が対照（コントロール）細胞(□)について、 Millipore(UK)リミテッドからのMILLICELL-ERS^TMシステムを用いて、指示された 時間において測定された。３時間後、Ｈ₂Ｏ₂が２ｍＭの最終濃度（矢印）まで添 加された。その結果が第１ｂ図にグラフ的に示されている実験において、バナジ ウム塩とＨ₂Ｏ₂は細胞への添加以前に予備培養され、過剰なＨ₂Ｏ₂はカタラーゼ により除去された。過バナジウム塩は次いで細胞に対し0.01ｍＭ（■），0.03m Ｍ(●)又は0.1ｍＭ(▲)の最終濃度を与える様添加され、そしてＴＥＲが対照細 胞（□）及びＣａ²⁺キレート剤ＢＡＰＴＡが添加された細胞（○，2.5ｍＭ最終 濃度）に関して決定された。その結果が第１ｃ図に示されている実験においては 、細胞は0.1ｍＭ（■）又は1.0ｍＭ（●）バナジウム塩と共に培養され、ＴＥＲ が対照細胞（□）に関して決定された。凡てのケースにおいて、抵抗値は当初の 抵抗に関連して表示された。実施例２ フェニルアルシンオキシドはＭＤＣＫ Ｉ細胞の細胞透過電気抵抗を減少する 。株Ｉ ＭＤＣＫ細胞は実施例１に述べた条件下でTRANSWELLフィルター上で育成 された。その結果がグラフ的に第２ａ図に示される実験において、フェニルアル シンオキシドは１μＭ(■),３μＭ(●),10μＭ（▲）又は30μＭ（◆）の最終濃 度へ添加され、そしてＴＥＲは対照細胞(□)に関連して表示された。その結果が 第２ｂ図にグラフ的に示される実験においてフェニルアルシンオキシド（ＰＡＯ ）又はＢＡＰＴＡはそれぞれ10μＭ及び3ｍＭの最終濃度まで、200μＭβ−メル カプトエタノール（βＭＥ）又は100μＭ 2,3−ジメルカプ トプロプラノール（ＤＭＰ）で10分間予備培養された細胞に対して添加された。 示された値は二つのフィルターの平均であったＢＡＰＴＡ測定に対するものは除 き、三重の(triplicate)TRANSWELLフィルターから誘導された値の平均±S.D.で ある。過バナジウム酸塩（ＰＶ）は500μＭのβ−メルカプトエタノール又は250 μＭ 2,3−ジメルカプトプロパノールの不在又は存在において10分間予備培養さ れた細胞に対し、0.1ｍＭの最終濃度へ添加された。ＴＥＲは30分後に決定され た。示した値は二つのTRANSWELLフィルターからの決定の平均である。実施例３ チロシンホスファターゼ抑制剤により誘起された細胞透過電気抵抗における減 少の可逆性。株Ｉ ＭＤＣＫ細胞がTRANSWELLフィルター上で実施例１に述べられ た様に育成された。その結果が第３ａ図に示される実験において、細胞は100μ Ｍ過バナジウム酸塩の不在（□）又は存在（■，▲，●）において処理された。 2,3−ジメルカプトプロパノール(250μＭ)が過バナジウム酸塩の後10分（■）， 20分（▲）又は30分（●）で添加された。ＴＥＲは指示された時間において決定 された。その結果が第３ｂ図に示される実験において、細胞は10μＭフェニルア ルシンオキシドの不在（□）又は存在（■，●，▲）において処理された。ジメ ルカプトプロパノール(100μＭ)がフェニルアルシンオキシドの後15分（■），3 0分（●），又は45分（▲）で添加された。ＴＥＲは指示された時間において決 定された。示された値（三重 TRANSWELLフィルターの平均±S.D.）は当初のＴＥ Ｒと関連して表示された。 実施例４ 過バナジウム酸塩及びフェニルアルシンオキシドは脳毛細管内皮細 胞の細胞透過電気抵抗を減少する。ウシの脳毛細管内皮細胞がTRANSWELLフィル ター上で育成され、２日間ＣＰＴ−ｃＡＭＰ／Ｒo 20−1724の不在（第４ｂ及び ４ｄ図）又は存在（第４ａ及び４ｃ図）において、Rubin et al.，J．Cell Biol ．115 1725-1735により述べられた如く処理された。第４ａ／４ｂ図及び第４ｃ ／４ｄ図中のデータは異なる当初の抵抗値を与える細胞の二つの独立した調製か ら誘導された。 第４ａ／４ｂ図において細胞は過バナジウム塩の不在（□）又は１μＭ(■)， ３μＭ（●），10μＭ（▲），30μＭ（◆）又は100μＭ（▼）の存在において 培養された。第４ｃ／４ｄ図において細胞はフェニルアルシンオキシドの不在（ □）又は0.3μＭ（■），１μＭ（●），３μＭ(▲),10μＭ（◆），30μＭ（▼ ）の存在において処理された。ＴＥＲは指示された時間において決定された。実施例４.１ ＰＡＯ及び過バナジウム酸塩はＭＤＣＫ細胞中でスクロースの傍細胞(paracel lular)フラックスを増加する。スクロースフラックスは物質及び方法の下に述べ られた如く決定された。 10μＭ ＰＡＯ， 100μＭ過バナジウム酸塩（ＰＶ）又は４ｍＭＢＡＰＴＡに 応答するフラックス（平均±S.E.，ｎ＝４−６）が対照細胞（対照）に関して決 定された（第４.１図参照）。実施例５ 過バナジウム塩はＭＤＣＫ株Ｉ細胞及びＢＢＥＣｓ中の多くのタンパク質のチ ロシンリン酸化を増加する：フェニルアルシンオキシドのはっきりした効果との 比較。ＭＤＣＫ株Ｉ細胞（第５ａ図）又は環状ＡＭＰ処理ＢＢＥＣｓ（第５ｂ図 ）が100μＭ過バナジウム酸塩（ＰＶ）の不在（対照）又は存在において30分間 処理された。第５ｃ 図においては、細胞中のＭＤＣＫ株が10μＭフェニルアルシンオキシドと共に指 示された時間培養された。第５ｄ図においては環状ＡＭＰ処理ＢＢＥＣｓがフェ ニルアルシンオキシドの指示された濃度で60分間処理さた。凡てのケースにおい て、細胞はＳＤＳ含有バッファーで溶解された。可溶化されたタンパク質はＳＤ Ｓ−ＰＡＧＥにより分離され、ニトロセルロースへ移された。チロシンリン酸化 はホースラディッシュペルオキシダーゼに共役された抗ホスホチロシン抗体を用 い、引き続いて増強されたケミルミネッセンスを用いて検知された。第５ａ及び ５ｂ図に示した結果を得るための露出時間（秒）は第５ｃ及び５ｄ図における結 果を得るためのそれ（分）よりも可なり短かった。ＢＢＥＣｓに関しては：同様 な結果が、もし細胞が環状ＡＭＰと共に又はなしに処理されたならば得られた。実施例５.１ ＰＡＯはＭＤＣＫ細胞中の細胞間結合においてタンパク質のチロシンリン酸化 を増加する：過バナジウム酸塩の効果との比較；ＭＤＣＫ細胞は過バナジウム酸 塩又はＰＡＯの不存在(Ａ，Ｆ)又は100μＭ過バナジウム酸塩の15(Ｂ，Ｇ)又は3 0分(Ｃ，Ｈ)又は10μＭ ＰＡＯの15（Ｄ，Ｉ）又は30分（Ｅ，Ｊ）の存在におい て処理された。細胞は抗−ホスホチロシン抗体（Ａ−Ｆ）又は物質及び方法の項 に述べられた如く、抗−ホスホチロシン抗体（Ａ−Ｆ）で又は抗−キャドヘリン 抗体（Ｇ−Ｉ）で染色された。露出時間はパネルＡ−Ｆ．Bar，20μｍ（第５.１ 図参照）に対し一定であった。実施例５.２ ＰＡＯは脳内皮細胞中の細胞間結合においてタンパク質のチロシンリン酸化を 増加する：過バナジウム酸塩との比較。フィルター育成脳 皮細胞はＣＰＴ−ｃＡＭＰ／Ｒo 20−1724で２時間Rubin et al.(1991)により述 べられた如く処理された。細胞は次いでＰＡＯ又は過バナジウム塩の不存在（Ａ ，Ｅ）又は10μＭ ＰＡＯ ５分間（Ｂ）10分間（Ｃ）又は30分間（Ｄ）又は100 μＭ過バナジウム酸塩５（Ｆ），10（Ｇ）又は30分（Ｈ）の何れかの存在で培養 された。細胞は次いで固定され、物質及び方法で述べた如く抗−リン酸チロシン 抗体で染色(stain)された。露出時間はパネルＡ−Ｄに対しては一定であり、又 パネルＥ−Ｈ，Bar，20μｍでは一定であったがより少なかった（第５.２図参照 ）。実施例６ ＰＡＯはＭＤＣＫ細胞中Ｅ−キャドヘリン／キャテニン複合体の成分のチロシ ンリン酸化を刺激する。 第６Ａ図：フィルター育成した細胞は非処理（対照）又は10μＭＰＡＯで30分 間又は100μＭ過バナジウム酸塩（ＰＶ）と共に培養された。細胞はTriton Ｘ-1 00を含むバッファー中に溶解され、Ｅ−キャドヘリン／キャテニン複合体は抗− Ｅ−キャドヘリン抗体を用いてイムノプレシピテートされた。タンパク質はＳＤ Ｓ−ＰＡＧＥにより分解され、チロシンリン酸化は抗−ホスホチロシン抗体での 免疫ブロット法により検知された。明らかにＰＡＯは約分子量100ｋＤａのキャ テニンのチロシンリン酸化を刺激する。過バナジウム酸塩は数個のキャテニン並 びにＥ−キャドヘリンのチロシンリン酸化を刺激する。第６Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ：Ｍ ＤＣＫ細胞は10μＰＡＯ又は100μＭ過バナジウム酸塩（ＰＶ）と共に指示され た時間培養された。細胞は変性バッファー（ＳＤＳを含む）中に分離されたタン パク質複合体へと溶解され、個々のチロシンホスホタンパク質はホスホチロシン 抗体を用い てイムノプレシピテートされた。イムノプレシピテートはβ−キャテニン（矢印 ，第６Ｂ図）含量のため、又はα−キャテニン（矢印，６Ｃ図）含量のため免疫 ブロット法でブロットされた。同一の溶解物はペプチド指向α−キャテニン抗体 を用いてイムノプレシピテートされ、同じ抗体でブロットされ（第６Ｄ図）、イ ムノプレシピテーション又はホスホチロシン抗体の成功を確認した。矢印はα− キャテニンの移動を指示する。第６Ｃ及び６Ｅ図に示した否定的結果を得るため の露出時間は第６Ａ図における結果を得るために用いたものと同様であった。明 らかにＰＡＯ又は過バナジウム酸塩で処理した細胞からのホスホチロシンイムノ プレシピテートのβ−キャテニン含量は増加され（第６Ｂ図）、対照的にα−キ ャテニン含量はそうではない（第６Ｃ図）。同様に、α−キャテニンイムノプレ シピテート（第６Ｄ図）のチロシンリン酸化（第６Ｅ図）は検知され得なかった 。第６Ｆ図及び６Ｇ図：ＭＤＣＫ細胞は非処理（対照）か、10μＭ ＰＡＯと共 に15分間又は次いで100μＭ 2,3−ジメルカプトプロパノールと共に更に45分間 の何れかで培養された（ＰＡＯ 15′／ＤＭＰ 45′）。Ｅ−キャドヘリン／キャ テニンイムノプレシピテートはホスホチロシン（第６Ｆ図）又はα−キャテニン 含量（第６Ｇ図）に対して免疫ブロット法により分析された。第６Ｇ図における 矢F旧よα−キャテニンの移動を指示する。キャテニンのチロシンリン酸化は2,3 −ジメルカプトプロパノールの引き続く添力旧こより逆転される（第６Ｆ図）。 イムノプレシピテート中のα−キャテニンの一定の含量（第６Ｇ図）は、凡ての ケースにおける定量的に成功したイムノプレシピテーションを指示する。実施例７ ＰＡＯはＭＤＣＫ細胞中の密着結合に結合したタンパク質のチロシンリン酸化 を刺激する。ＭＤＣＫ細胞は10μＭ ＰＡＯ又は100μＭ過バナジウム酸塩で指示 された時間処理された。細胞は Triton Ｘ-100、ＳＤＳ及びデオキシコール酸ナ トリウムを含むバッファー中に溶解された。ＺＯ−１及び結合されたタンパク質 はＺＯ−１抗体を用いてイムノプレシピテートされ、免疫ブロット法によりホス ホチロシン含量に対し分析された。明らかに、ＰＡＯ処理はＺＯ−１(220kＤa) のチロシンリン酸化を結果した。過バナジウム酸塩も又ＺＯ−１、並びにＺＯ− ２(160ｋＤａ)のチロシンリン酸化を刺激した（第７図参照）。実施例８ Herbimycin ＡはＭＤＣＫ細胞中の細胞透過電気抵抗におけるＰＡＯ−誘導の減 少を軽減する。二つの独立の実験において、培養(culture)はチロシンキナーゼ 抑制剤Herbimycin Ａの不存在又は存在（○，対照；●， 2.5μＭ herbimycin Ａ：□，対照；■，10μＭ herbimycin Ａ）で16−18時間培養され、その後抵抗 測定が行われた。herbimycin Ａのみの添加は抵抗に影響しなかった。ＰＡＯは 次いで指示された最終濃度を与える様に添加され、更に30分の培養後抵抗に対す る効果が決定された。抵抗値は当初の値に関連して表示された（第８図参照）。実施例９ Herbimycin ＡはＭＤＣＫ中のタンパク質チロシンリン酸化におけるＰＡＯ− 誘導の増加を軽減する。実施例８において10μＭ herbimycinＡの効果をテスト するデータを生み出すために用いられた培養はＳＤＳサンプルバッファー中に溶 解され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離された。タンパク質チロシンリン酸化は抗 −ホスホチロシン抗体を 用いて免疫ブロットすることにより検知された。HA，herbimycin Ａ（第９図参 照）。実施例１０ 中大脳動脈閉塞（卒中モデル）は閉塞により損傷された地域の近くの小さな血 管と結合した細胞中のチロシンリン酸化のレベルを高める。卒中モデル 成体雄Sprague-Dawleyラットの左の中大脳動脈が開頭により露出され、焼灼に より閉塞された。これは有用な卒中モデルを与える。手術後24時間で、エバンス ブルー(Evan's blue)（ＰＢＳ中４％、グラム体重当たり６μｌ）が静脈注射さ れた。30分後、動物は麻酔され、血液はＰＢＳと共に流出し、脳が取り出され、 粉状のドライアイス中で直ちに凍結された。固定されていない組織の切片はBrig ht OTFクリオスタットを用いてつくられた。エバンスブルー 切片（24μｍ）がゼラチンが塗工されたガラススライド上で空気乾燥され、10 分間メタノール中で−20℃において固定され、ＰＢＳ（食塩カロリン酸緩衝液） 中で洗滌され、Citifluor中に据え付けられた。免疫細胞化学 切片は空気乾燥され、95％エタノールで−95℃で30分間、次いでアセトンによ り室温で１分間により透過性にされた。抗体培養及び洗滌の凡ては５×10^-4Ｍの バナジウム酸ナトリウムを含むＰＢＳを用いた。切片はＰＢＳ中で洗滌され、１ ％ＢＳＡ（ウシの血清アルブミン）で15分間ブロックされ、一晩４℃において10 μｇ／ml抗−ホスホチロシン抗体（４Ｇ10）又はコントロール抗体(１：100)の 何れかを抗−コラーゲンタイプIV（１：40,000）と一緒に培養された。切片は次 いで 15分間１％ＢＳＡ及び0.1％ Triton-Ｘ100を含むＰＢＳ／バナジウム酸塩中でブ ロックされ、ＦＩＴＣ−共役抗マウスＩｇＧ２ｂ(１：100)及びTexas Red−共役 抗−家兎Ｉｇ(１：100)と共に１時間室温で培養され、Citifluor中に据え付けら れた。ある切片に対しては、抗−ラットアルブミン抗体(１：200)が４Ｇ10抗体 を置換し、このケースではＦＩＴＣ−共役抗−ヒツジＩｇＧ(１：100)が抗−マ ウスＩｇ２ｂの代わりに用いられた。抗 体 抗−ホスホチロシン抗体４Ｇ10はUpstate Biotechnology Inc.(TCSBiological s，Buckingham，UK)から、ヒツジ抗ラットアルブミンはBiogenesis(Bournemouth ，UK)から、コントロールマウスＩｇＧ２ｂはZymed(Cambridge Bioscience，Cam bridge，UK)から、コラーゲンタイプ−IVはBiognesis から、ＦＩＴＣ−共役抗 マウスＩｇＧ２ｂはNordic Immunological Laboratories Ltd.(Maidenhead，UK) から、そしてTexas Red−共役抗家兎Ｉｇ及びＦＩＴＣ−共役抗ヒツジＩｇＧはJ ackson Immunoresearch Laboratories Inc.(Stratech．Luton．UK)からであった 。顕微鏡検査 切片はNikon Microphoto ＦＸＡ顕微鏡上で、位相又はNormarski光学を用いて 形態(morphology)を決定し、蛍光体を可視化するためエピフルオレセンス(epifl uoresence)をもって観察された。Texas Red及びエバンスブルーの励起(Excitati on)は510−560nmにおいてであり、ＦＩＴＣは495nmにおいてであった。ホスホチロシンでの４Ｇ10ブロック ４Ｇ10抗体は15分間３−40mＭのホスホチロシン(Sigma Chemical Company Ltd.，Poole，UK)と共に切片を上述の如く染色する前に培養された。 第１０Ａ，Ｃ及びＥ図：コラーゲンタイプIV。コラーゲンタイプIVは内皮及び 平滑筋細胞のまわりの基底膜内にあり、抗体が血管の輪郭を描いている。 第１０Ｂ，Ｄ及びＦ図；第１０Ａ，Ｃ及びＥ図に示された同じ切片のホスホチ ロシンラベル(label)。ホスホチロシンは手術されたラットの右の皮膚の正常組 織中の毛細血管中には検知可能でないが（第１０Ｂ図）、しかし同じ脳の左側上 の皮膚内の損傷域に近い血管内では増加される（第１０Ｄ図）。過バナジウム酸 塩を用いるホスホチロシンのレベルの人工的上昇は大きな及び小さな血管の両者 においてホスホチロシンの検出可能なレベルを誘導する（第１０Ｆ図（第１０Ｆ 図は上下逆転されていることに注意））。実施例１１ 抗−ｐ120及び２Ｂ12免疫反応性の特性付け(characterization)。ウシの脳内 皮細胞の種々の細胞株及び一次培養(Brain EC)がＳＤＳサンプル緩衝液中に溶解 され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、引き続き抗−ｐ120抗体（パネルＡ）又は２Ｂ1 2抗体（パネルＢ）で免疫ブロットすることにより分析された。露出時間はパネ ルＡに対しては１分（10秒であったＭＤＢＫ細胞に対するそれとは別に）及びパ ネルＢに対しは15分であった。ｐ120(○)及びｐ100(●)の移動が指示された（第 １１図参照）。実施例１２ ｐ120タンパク質が抗−ｐ120抗体により認識され、２Ｂ12抗体と交叉反応し、 一方ｐ100は抗−ｐ120によってのみ認識される。ＭＤＢＫ 細胞はＴＤＳバッファー中に溶解された。イムノプレシピテーションは抗−ｐ12 0抗体又は２Ｂ12を用いて行われ、引き続き交叉ブロット法により行われた（パ ネルＡ）。ＭＤＢＫ細胞はｐ120及びｐ100がＳＤＳ−ＰＡＧＥによりよく分離さ れ、又両抗体と反応するために選ばれた。パネルＢにおいて、ＭＤＢＫ細胞は〔³⁵ Ｓ〕メチオニンとラベル付けされ、ＴＤＳバッファー中に溶解され、次いで抗 −ｐ120又は２Ｂ12を用いてイムノプレシピテートされた。タンパク質はＳＤＳ −ＰＡＧＥにより分離され、オートラジオグラフィーにより検出された。明らか に免疫ブロット法により検出されたｐ120及びｐ100に対応する広いバンド（パネ ル12Ａ及び第11Ａ図参照）は、複数のバンドとして分解される。２Ｂ12イムノプ レシピテート（○）中に見られる同じバンドは、抗−ｐ120イムノプレシピテー ト中に見られる。抗−ｐ120イムノプレシピテート中において、ｐ100に対応する 追加のバンド（●）も又観察される（第１２図参照）。実施例１３ ＭＤＣＫ及びＣaco-２細胞からの抗−120及び抗−Ｅ−キャドヘリンイムノプ レシピテートの比較。パネルＡ：ＭＤＣＫ細胞は〔³⁵Ｓ〕メチオニンでラベル付 けされ、次いでＴＸバッファー又はＴＤＳバッファーの何れかの中に溶解された 。イムノプレシピテーションは抗−ｐ120又は抗−Ｅ−キャドヘリン（ｒｒ１） を用いて実行された。タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、次いでフルオログ ラフィー(fluorography)により分離された。Ｅ−キャドヘリン（Ｅ）、α−（α ）及びβ−キャテニン（β）に対応するバンドは強くｒｒ１イムノプレシピテー ト中に見られるが、図に示されている。主たる抗−ｐ120反応性バンドはほぼｐ1 00のそれの位置で移動する（第１１Ａ 図参照）。２Ｂ12バンドはキャニンタンパク質と反応する様には見えず（第１１ Ｂ図参照）、ｐ120の積極的位置同定を困難にする。パネルＢ：Ｃaco-２細胞は 〔³⁵Ｓ〕メチオニンでラベル付けされ、ＴＸバッファー中に溶解された。イムノ プレシピテーションは抗−Ｅ−キャドヘリン（ＨＥＣＤ−１）、抗−β−キャテ ニン又は抗−ｐ120抗体を用いて実施された。タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥ、 引き続いてフルオログラフィーにより分離された。凡てのケースにおいて、四つ の主たる共移動する(comigrating)バンドがイムノプレシピテートされ、増加す る可動性の順序にＥ−キャドヘリン、α−，β−及びγ−キャテニンに対応する （第１３図参照）。実施例１４ 抗−Ｅ−キャドヘリンイムノプレシピテート中の抗−ｐ120反応性物質及び抗 −ｐ120イムノプレシピテート中のＥ−キャドヘリンの検出。ＭＤＣＫ細胞がＴ Ｘバッファー中に溶解された。イムノプレシピテーションはＥ−キャドヘリン（ ｒｒ１）に対する抗体、抗−ｐ120抗体又は抗−フォーカル接着(focal adhesion )キナーゼ（抗−ＦＡＫ）の何れかで実行された。疑似(sham)イムノプレシピテ ーションが一次抗体（−）の不在において実行された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる 分離に続き、平行なブロットが次のものを用いて精査された：ｒｒ１（矢じり， Ｅ−キャドヘリン）；抗−β−キャテニン（矢じり，β−キャテニン）；抗−ｐ 120（矢じり，抗−ｐ１２０反応性）；抗−ＦＡＫ（矢じり，ＦＡＫ）。明らか にｒｒ１及び抗−ｐ120抗体はＥ−キャドヘリン及びβ−キャテニンをイムノプ レシピテートした。ｒｒ１は又抗−ｐ120免疫反応性物質をイムノプレシピテー トすることができたが、抗−ｐ120抗体によりイムノプレシピテートされたもの より少ない程 度であった。抗−ＦＡＫはＦＡＫのみをイムノプレシピテートすることができた が、疑似イムノプレシピテーションは何らの検出可能なＥ−キャドヘリン、β− キャテニン又は抗−ｐ120反応物質も結果として生じなかった（第１４図参照） 。実施例１５ ウシの脳内皮細胞の一次培養からの抗−β−キャテニン、抗ｐ120及び２Ｂ12 イムノプレシピテートの比較。細胞は〔³⁵Ｓ〕メチオニンでラベル付けされ、次 いでＴＸバッファー又はＴＤＳバッファー中に溶解された。イムノプレシピテー ションは抗−β−キャテニン、抗−ｐ120及び２Ｂ12を用いて実行された。タン パク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、引き続きフルオログラフィーにより分離され た。ＴＸ溶解細胞からのβ−キャテニンイムノプレシピテーションにおいては、 キャドヘリン（Ｃ）、α−キャテニン（α）及びβ−キャテニン（β）が指示さ れた。ＴＤＳ条件下で、ｐ120に対応するバンド（○）が抗−ｐ120及び２Ｂ12イ ムノプレシピテート中に見られ、その他のバンド（●）はｐ120に対応して、抗 −ｐ120イムノプレシピテート中にのみ見られる（第１５図参照）。実施例１６ ヒトの臍静脈内皮細胞から（パネルＡ）及びＥＣＶ304細胞（パネルＢ）から のβ−キャテニンイムノプレシピテート中のｐ120／ｐ100及び抗−ｐ120イムノ プレシピテート中のβ−キャテニンの検出。細胞はＴＸ又はＴＤＳバッファーの 何れかの中に溶解された。溶解物は抗−β−キャテニン又は抗−ｐ120抗体を用 いてイムノプレシピテートされ、引き続いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び免疫ブロット 法による分析を行った。β−キャテニン（矢じり），ｐ100(●)及びｐ120(○)の 移動が指示されている。ＴＤＳバッファーを用いて得られたβ−キャテニンイム ノプレシピテート中の抗−ｐ120反応性物質の不在に注目せよ。たとえβ−キャ テニン及びｐ100がその抗−ｐ120抗体との反応性により定義される如く、非常に 密接して移動するとしても、それらは明らかに別個のタンパク質である（第１６ 図参照）。実施例１７ ＭＤＣＫ細胞及び脳内皮細胞中の抗−ｐ120反応性及びβ−キャテニンの限局 化(localization)。ＭＤＣＫ細胞（パネルａ，ｂ）及びブタの脳内皮細胞（パネ ルｃ，ｄ）が抗−ｐ120抗体（パネルａ，ｃ）又抗−β−キャテニン抗体（パネ ルｂ，ｄ）で共ラベル付けされた。二次抗体はフルオレセイン共役抗マウス及び ローダミン(rhodamine)共役抗家兎(rabbit)であった。この例において、各二次 抗体はその指定された種の一次抗体に対し絶対的に特異(specific)であった。バ ー(Bar)：20μｍ（第１７図参照）。実施例１８ ラットの脳及び骨格筋組織における抗−ｐ120免疫活性の分布。脳組織には抗 −ｐ120抗体（ａ，ｃ）及び抗−α−キャテニン（ｂ，ｄ）で共ラベル付された 。抗−ｐ120免疫活性及びα−キャテニンは上皮脈絡叢の細胞間結合（矢印，ａ 及びｂ）及び心室上衣細胞（矢じり，ａ及びｂ）に共集中する(co-localise)。 両抗原は又大血管(macro-vascular)起源の血管の内皮間結合に共−集中する（ｃ 及びｄ中の矢印）。脳切片中の微小血管の輪郭は抗−コラーゲンIV抗体（ｆ）で ラベル付けすることにより同定された：抗−ｐ120抗体で共−ラベル付 けすると、内皮間結合での抗原の存在が判明した（矢印ｅ）。これらの微小血管 において、α−キャテニンは抗−ｐ120免疫反応性（図示せず）と共集中した。 筋肉繊維の配置に対し垂直に切られた筋肉組織においては、抗−ｐ120免疫反応 性は血管が位置されている筋肉繊維間の区域に限定される（矢印，ｇ）。より高 い倍率は小さな斑点のある染色パターン（矢印，ｂ）を開示し、これは内皮間結 合における抗−ｐ120免疫反応性を反映する様に思われる。パネルａ，ｃ及びｅ において、ｂｐは脳実質を表す；パネルａにおいて、ｖは心室管腔を、ｃｐは脈 絡叢を；パネルｇにおいてｍは筋肉組織を指す。バー：(ａ，ｇ)，100μｍ；（ ｃ，ｅ，ｈ）25μｍ（第１８図参照）。実施例１９ Ｃaco-２細胞からのｐ120のＬysＣタンパク質分解により誘導されたペプチド のシーケンス分析。Ｃaco-２細胞（20ｘ共流動(cofluent)９cm皿）がＴＸ−バッ ファー中に核溶解(nuclear lysis)を最小にする様溶解された。不溶のタンパク 質は遠心分離により除去された。デオキシコール酸塩及びＳＤＳが上澄み液(sup ernatant)に添加され、0.5％及び0.2％(w/v)の最終濃度を与える様添加された。 これらの洗滌剤の添加はキャドヘリン／キャテニン複合体からのｐ100及びｐ120 の分解を結果する。ｐ120及びｐ100はTransduction Laboratoriesからの抗−ｐ1 20抗体（これを又ｐ100を認識する）、家兎抗マウスＩｇＧ及びタンパク質セフ ァローゼを用いる溶解物からイムノプレシピテートされた。免疫複合体は５回洗 滌され、次いでLaemmliサンプルバッファーを添加し、次いで100℃において５分 間加熱することに より解離された。タンパク質は４倍容量のエタノールの添加及び−20℃での16時 間の梅培養により沈殿された。沈殿はＳＤＳ−ＰＡＧＥ（６％アクリルアミド） により分解され、タンパク質はCoomassie Blueにより可視化された。ｐ100に対 応するタンパク質はゲルから切開され、ＬysＣで消化された。ペプチドはＨＰＬ Ｃにより分離され、配列された(sequenced)、マウスｐ120シーケンスはReynolds et al.,1992により記述された。明らかにヒトｐ100はマウスｐ120に密接に関連 している。 次の参考文献リストはここに言及された論文の詳細を与える。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９５年１２月５日 【補正内容】 請求の範囲 １．内皮細胞間密着結合を含む生理的関門の透過性を減少するため薬剤の調製に おけるチロシンタンパク質脱リン酸化を促進する作用物質の使用。 ２．作用物質がチロシンタンパク質ホスファターゼを直接又は間接に活性化する か、及び／又は直接又は間接にチロシンキナーゼを抑制する、請求項１に請求し た使用。 ３．内皮細胞間密着結合を含む生理的関門の透過性を増加するため作用物質の調 製におけるチロシンタンパク質リン酸化を促進する作用物質の使用。 ４．作用物質がチロシンタンパク質ホスファターゼを直接又は間接に抑制するか 、及び／又は直接又は間接にチロシンキナーゼを活性化する、請求項３に請求し た使用。 ５．作用物質のリン酸化又は脱リン酸化が促進効果が可逆的であるか又は都合の 悪い毒性の問題を回避するに十分可逆的にある、請求項１乃至４の任意の一つに 請求した使用。 ６．作用物質がバナジウム含有塩である請求項４又は５に請求した使用。 ７．作用物質が過バナジウム酸塩である請求項６に請求した使用。 ８．作用物質がフェニルアルンシオキシドである請求項４に請求した使用。 ９．チロシンリン酸化又は脱リン酸化がキャドヘリン／キャテニン複合体(cadhe rin/catenin complex)の一又はより多くの成分を含む請求項１乃至８の任意の一 つに請求した使用。 10．チロシンリン酸化又は脱リン酸化がキャドヘリン(例えば、Ｅ−キャドヘリ ン、Ｎ−キャドヘリン、Ｐ−キャドヘリン、β−キャテニン、ＺＯ−１、ＺＯ− ２、ｐ100又はｐ120)を含む請求項１乃至８の任意の一つに請求した使用。 11．チロシンリン酸化又は脱リン酸化がβ−キャテニン、ＺＯ−１、ＺＯ−２、 ｐ100又はｐ120を含む請求項９に請求した使用。 12．卒中に追従するものの如き又は脳腫瘍と関連する脳浮腫を減少するための薬 剤の調製におけるチロシンタンパク質脱リン酸化を促進する作用物質の使用。 13．高地肺浮腫の如き末梢浮腫を処理又は防止するための薬剤の調製におけるチ ロシンタンパク質脱リン酸化を促進する作用物質の使用。 14．免疫応答を媒介する白血球の脳への進入する閉鎖するための薬剤の調製にお けるチロシンタンパク質脱リン酸化を促進する作用物質の使用。 15．多発性硬化症を処理するための薬剤の調製においてチロシンタンパク質脱リ ン酸化を促進する作用物質の使用。 16．癌転移を防止するための薬剤の調製においてチロシンタンパク質脱リン酸化 を促進する作用物質の使用。 17．関門が内皮細胞間密着結合を含み、薬を関門の他の側にある脳又は身体の他 の部分（潰瘍の如き）へ届けるための薬剤の調製におけるチロシンタンパク質リ ン酸化を促進する作用物質の使用及び脳血液関門又は他の生理的関門不透過性の 薬の使用。 18．チロシンタンパク質リン酸化を促進する作用物質及び内皮細胞間密着結合、 例えば脳血液関門を含む生理的関門を横切って届けらるべき薬を含む組成物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 33/24 ＡＥＤ 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 33/24 ＡＥＤ ＡＧＡ ＡＧＡ (72)発明者 ヘレンクネクト，カート イギリス国ハートフォードシャー，エイエ ル５・４キューユー，ハーペンデン，クロ スウエイ・30 (72)発明者 モーガン，メアリー，ルイーズ イギリス国ロンドンエヌ19・５イーゼッ ト，コーリン・ロード・９

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．脳血液関門の如き生理的関門の透過性を減少するため薬剤の調製におけるチ ロシンタンパク質脱リン酸化を促進する作用物質の使用。 ２．作用物質がチロシンタンパク質ホスファターゼを直接又は間接に活性化する か、及び／又は直接又は間接にチロシンキナーゼを抑制する、請求項１に請求し た使用。 ３．脳血液関門の如き生理的関門の透過性を増加するため作用物質の調製におけ るチロシンタンパク質リン酸化を促進する作用物質の使用。 ４．作用物質がチロシンタンパク質ホスファターゼを直接又は間接に抑制するか 、及び／又は直接又は間接にチロシンキナーゼを活性化する、請求項３に請求し た使用。 ５．作用物質のリン酸化又は脱リン酸化が促進効果が可逆的であるか又は都合の 悪い毒性の問題を回避するに十分可逆的にある、請求項１乃至４の任意の一つに 請求した使用。 ６．作用物質がバナジウム含有塩である請求項４又は５に請求した使用。 ７．作用物質が過バナジウム酸塩である請求項６に請求した使用。 ８．作用物質がフェニルアルンシオキシドである請求項４に請求した使用。 ９．チロシンリン酸化又は脱リン酸化がキャドヘリン／キャテニン複合体(cadhe rin/catenin complex)の一又はより多くの成分を含む請求項１乃至８の任意の一 つに請求した使用。 10．チロシンリン酸化又は脱リン酸化がＥ−キャドヘリン、Ｎ−キャ ドヘリン、Ｐ−キャドヘリン、β−キャテニン、ＺＯ−１、ＺＯ−２、ｐ100又 はｐ120を含む請求項１乃至８の任意の一つに請求した使用。 11．チロシンリン酸化又は脱リン酸化がβ−キャテニン、ＺＯ−１、ＺＯ−２、 ｐ100又はｐ120を含む請求項９に請求した使用。 12．卒中に追従するものの如き又は脳腫瘍と関連する脳浮腫を減少するための薬 剤の調製におけるチロシンタンパク質脱リン酸化を促進する作用物質の使用。 13．高地肺浮腫の如き末梢浮腫を処理又は防止するための薬剤の調製におけるチ ロシンタンパク質脱リン酸化を促進する作用物質の使用。 14．免疫応答を媒介する白血球の脳への進入する閉鎖するための薬剤の調製にお けるチロシンタンパク質脱リン酸化を促進する作用物質の使用。 15．多発性硬化症を処理するための薬剤の調製においてチロシンタンパク質脱リ ン酸化を促進する作用物質の使用。 16．癌転移を防止するための薬剤の調製においてチロシンタンパク質脱リン酸化 を促進する作用物質の使用。 17．薬を脳又は身体の他の部分（潰瘍の如き）へ関門の他の側へ届けるための薬 剤の調製におけるチロシンタンパク質リン酸化を促進する作用物質の使用及び脳 血液関門又は他の生理的関門不透過性の薬の使用。 18．航空路における粘液の蓄積を処理又は防止するための薬剤の調製における肺 上皮細胞のチロシンタンパク質リン酸化を促進する作用物質の使用。 19．胃潰瘍を処理するための薬剤の調製においてチロシンタンパク質 脱リン酸化を促進する作用物質の使用。 20．チロシンタンパク質リン酸化を促進する作用物質及び脳血液関門の如き生理 的関門を横切って届けらるべき薬を含む組成物。