JPH09507165A - 有機溶媒を用いないリポソーム製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （１）水性溶媒、親水性末端基及びＣ₂〜Ｃ₁₆炭化水素鎖を有する界面活性剤、ステロール及び／または膜タンパク質、及び／または封入するべき物質を混合してステロール及び／または封入するべき物質を溶解させ、（２）得られた組成物を脂質界面活性剤と混合して均質なラメラ液畠相または液晶相の水中懸濁液を生成させ、（３）液晶相または液晶相懸濁液をリポソームに変換することによってリポソームを製造する方法。

Description

【発明の詳細な説明】 有機溶媒を用いないリポソーム製造方法 本発明は、有機溶媒を用いずにリポソームを製造する方法に係わる。 リポソームは通常、脂質界面活性剤並びにコレステロール及び／または封入さ れた１種以上の活性物質を含む。コレステロール（より一般的にはステロール） はリン脂質と結合して、脂質膜の弾性及び不透過性を改善する。コレステロール または封入するべき活性物質を脂質及び水性溶媒と直接混合すると、混合物は均 質とならない。例えば、数日後にコレステロールが小型結晶の形態で残存するこ とが観察され得、この結晶は大過剰量の水を添加したとしても組成物中に溶解し ない。この問題を克服するべく‘噴射法’として知られた方法が用いられ（ヨー ロッパ特許出願公開第８７ ９９３号参照）、この方法は様々な構成成分を水性 媒質中に用いる前に有機溶媒（通常はクロロホルムやジクロロメタンなどの塩素 化溶媒で、メタノールも用いられる）に混入することを含む。上記溶媒の蒸発に よって粉末を生成させ、この粉末を直接リポソーム製造工程に用いる（例えばヨ ーロッパ特許出願公開第０ １０７ ５５９号 参照）。この方法の欠点は、噴射ステップを経ることによって最終製品中に微量 （僅かだが除去不能な量）の溶媒が残存する恐れが有ることである。そのような 微量の溶媒が健康に及ぼす有害な作用を考慮すれば、有機溶媒を用いないリポソ ーム製造を達成することが不可欠である。 リポソームに膜タンパク質、即ち膜に可溶性であるが水には難溶性であるタン パク質を含有させるのにも同様の方法が用いられる。 本発明は、噴射ステップを経ることのないリポソーム製造方法を提供すること を目的とする。本発明の方法の新規性は、コレステロールや封入するべき活性物 質を有機溶媒を用いずに溶解させることを可能にする補助界面活性剤を厳選して 用いることに基づく。 従って本発明は、 １）水性溶媒、親水性末端基（ｈｅａｄ）及びＣ₂〜Ｃ₁₆炭化水素鎖を有する界 面活性剤、ステロール及び／または膜タンパク質、及び／または封入するべき物 質を混合してステロール及び／または封入するべき物質を溶解させ、 ２）前記のようにして得られた組成物を脂質界面活性剤と混合して均質なラメラ 液晶相または液晶相の水中懸濁液を 生成させ、 ３）液晶相または液晶相懸濁液をリポソームに変換する ことを含むリポソーム製造方法を提供する。 液晶相のリポソームへの変換は場合によっては自然に生起することに留意する べきである。 自然のリポソームの大きさは典型的には１００〜５００ｎｍ、より一般的には ５０〜５，０００ｎｍである。得られる自然のリポソームは多重ラメラリポソー ムであり、このリポソームは通常水層と（親水性及び親油性）界面活性剤層とを 交互に、リポソームの中心部まで含めて１０〜１０，０００個有する。 しかし、本発明は、上記第二のステップで得られる液晶相または液晶相懸濁液 も提供する。 本発明を以下に詳述する。 上記第一のステップで用いる界面活性剤は、枝分かれしているかまたはしてい ないＣ₂〜Ｃ₁₆炭素鎖、好ましくはＣ₆〜Ｃ₁₄炭素鎖を有する。 親水性末端基は通常アルコールまたはエトキシル化アルコールであるが、カル ボン酸や、脂肪酸塩、第四級アンモニウム、スルホネートもしくはサルフェート 、または他の 任意の極性非イオン性もしくはイオン性基であってもよい。 第一のステップにおいて、水性溶媒、界面活性剤、コレステロール及び／また は膜タンパク質、及び／または封入するべき物質を適当な比率で混合する。通常 、界面活性剤は１〜５０重量％、好ましくは５〜２５重量％の比率で用い、コレ ステロールは０〜２５重量％の比率で用いる。攪拌後、混合物を通常１〜２時間 放置する。場合によってはこの混合物にコレステロールを、（４０〜１０００℃ への）加熱及び攪拌を行ないながら、または行なわずに溶解させ得る。この溶解 には数時間から数日掛かることもある。界面活性剤が液体（アルコール、エトキ シル化アルコール等）であれば、コレステロールをまず界面活性剤に溶解させ、 これに水性溶媒を添加することが可能な場合も有る。 第二のステップにおいて、第一のステップで得られた組成物に脂質界面活性剤 を、液晶相、または液晶相の水中懸濁液の生成に必要な比率で添加する。典型的 には１〜５０重量％、好ましくは５〜２５重量％の脂質界面活性剤を添加する。 好ましくは、脂質界面活性剤は第一のステップで用いる界面活性剤の量を上回る 量で添加する。脂質界面活性剤はリポソームの製造に通常用いられるものの中か ら選 択し、通常はリン脂質とする。混合物を通常５〜４８時間穏やかに攪拌する。必 要であれば、混合物を約６０〜８０℃と比較的高温に維持して溶解を促進するこ とも可能である。後に、混合物は室温に戻す。場合によっては、封入するべき物 質をこの時点で、脂質界面活性剤を添加する直前に添加し得る。 このようにして、均質なラメラ液晶相、または液晶相を過剰量の水中に懸濁さ せた懸濁液が得られる。これには、コレステロール及び／または封入するべき活 性物質の組み合わせが溶解している。このペーストは、通常の方法（超音波処理 、押出）に従って、またはフランス特許出願公開第２，６８９，４１８号に開示 された方法に従い一定剪断（ｃｏｎｓｔａｎｔ ｓｈｅａｒｉｎｇ）によってリ ポソームを製造するのに用い得る。 先に指摘したように、場合によっては付加的なステップを設けなくとも自然に 球形粒子（ｓｐｈｅｒｕｌｉｔｅｓ）が生成する。この球形粒子は、十分に大型 であれば位相差顕微鏡や通常の光学顕微鏡での観察によって、及び／または低温 破断（ｃｒｙｏｆｒａｃｔｕｒｅ）及び電子顕微鏡観察によって容易に特徴を解 明できる。配合の結果自 然に球形粒子が生じる場合は第二のステップ後に得られたクリームを直接水性溶 液で稀釈し得、その際初め密に堆積した状態に有るリポソームは分離し、まばら に懸濁した状態となる。活性物質を第一のステップで添加した場合、該物質はリ ポソーム内に見出される。 得られるリポソームが油相中に分散可能であることにも留意するべきである。 その場合、分散液は数分間攪拌すれば均質となる。しかし、その後数時間が経過 するとリポソームは沈澱してしまうが、単に攪拌することによって再懸濁可能で ある。用い得る油性相は、特に鉱油または植物油とし得る。 本発明による方法は、その特性に応じて含有させ得る、医薬品または化粧品成 分として活性な物質を水性部分に、または界面活性剤が構成する部分に含有させ ることを可能にする。 活性物質の例としては、 ─ジヒドロキシアセトン（ＤＨＡ）、 ─α−ヒドロキシ酸［果酸（ｆｒｕｉｔ ａｃｉｄ）］、 特にグリコール酸、乳酸、酒石酸及びサリチル酸、 ─水溶性及び油溶性日焼け防止剤、 ─精油、 ─非鹸化性化合物、 ─ヒアルロン酸ナトリウム、 ─超微粉ＴｉＯ₂、 ─セラミド、 ─カフェイン、 ─ビタミンＡ、Ｅ及びＣ を挙げることができる。 本発明を、以下の実施例によって詳述する。実施例１ Ｎｉｋｋｏｌ社から入手したペンタオキシエチレンラウリルエーテル（Ｃ１２ Ｅ５）１．５ｇを７ｇの水に溶解させる。０．１４ｇのコレステロール（Ｍｅｒ ｃｋ）を添加する。混合を行ない、この時溶解しないコレステロール結晶を目で 、及び光学顕微鏡によって明らかに見ることができる。混合物を１２時間８０℃ に維持し、それによってコレステロールを水−Ｃ１２Ｅ５混合物に完全に溶解さ せる。場合によっては、混合物を時々または連続的に攪拌してコレステロール溶 解時間を短縮することも可能である。得られた均質混合物を室温に戻す。次に、 １．３５ｇの大豆レ シチン（Ｓｉｇｍａ）を添加して混合し、１２時間待った後に均質なラメラ液晶 相を得る。 純粋なクリームに対して稀釈後に光学顕微鏡観察を行なうか、または低温破断 及び電子顕微鏡観察を行なうことによって、混合物が半径約２００〜５００ｎｍ の濃縮リポソームから成ることが確認できる。寸法の均一性を改善するべく、得 られた混合物を（稀釈前に）直接、フランス特許出願公開第２，６８９，４１８ 号に開示された方法に従って処理してもよい。実施例２ 実施例１と同様の操作を同じ順序で行ない、ただしその際物質量を Ｃ１２Ｅ５ ２．５ｇ、 レシチン２．１ｇ、 コレステロール０．４ｇ、 水５ｇ とする。 第二のステップが完了すると自然にリポソームが得られる。実施例３ 実施例１と同様の操作を行ない、ただしその際物質量を Ｃ１２Ｅ５ ０．５ｇ、 大豆レシチン２．５ｇ、 コレステロール０．２５ｇ、 水６．７５ｇ とする。 この例の場合、水、Ｃ１２Ｅ５及びコレステロールの均質混合物を得るには６ ０℃で少なくとも２４時間待たなくてはならない。 第二のステップが完了すると自然にリポソームが得られる。実施例４ 操作は実施例１と同様とするが、Ｎｉｋｋｏｌ社から入手したＣ１２Ｅ５をｗ ｉｔｃｏ社から入手した（主にＣ１２Ｅ５から成る）Ｌａｕｒｏｐａｌに替え、 かつ物質量を Ｌａｕｒｏｐａｌ ０２０５ １．１ｇ、 大豆レシチン１．９ｇ、 コレステロール０．２ｇ、 水６．８ｇ とするか、または Ｌａｕｒｏｐａｌ ０２０５ ０．４ｇ、 大豆レシチン２．６ｇ、 コレステロール０．２５ｇ、 水６．８ｇ とする。実施例５ 操作は実施例１と同様とするが、別のノニオン界面活性剤、即ちＷｉｔｃｏ社 から入手した（主にＣ１２Ｅ４から成る）Ｌａｕｒｏｐａｌ ４を用い、かつ物 質量を Ｌａｕｒｏｐａｌ ４ １．５ｇ、 大豆レシチン２．５ｇ、 コレステロール０．２５ｇ、 水６ｇ とするか、または Ｌａｕｒｏｐａｌ ４ ０．７ｇ、 大豆レシチン３．３ｇ、 コレステロール０．３３ｇ、 水６ｇ とする。実施例６ 操作は実施例１と同様とするが、別のノニオン界面活性剤、即ちＣＥＣＡ社か ら入手した（主にＣ１２Ｅ３から成る）Ｒｅｍｃｏｐａｌ １２１を用い、かつ 物質量を Ｒｅｍｃｏｐａｌ １２１ ０．７ｇ、 大豆レシチン３ｇ、 コレステロール０．３３ｇ、 水６ｇ とするか、または Ｒｅｍｃｏｐａｌ １２１ ０．５ｇ、 大豆レシチン３ｇ、 コレステロール０．３５ｇ、 水６ｇ とする。実施例７ 操作を実施例１と同様とし、物質量を オレイン酸カリウム（Ａｌｄｒｉｃｈ）１ｇ、 大豆レシチン３ｇ、 コレステロール０．３ｇ、 水６ｇ とするか、または オレイン酸カリウム０．５ｇ、 大豆レシチン３．５ｇ、 コレステロール０．３５ｇ、 水６ｇ とする。実施例８ 実施例４の調製物（第２組成物）の水に１０^-3モル濃度のカルセインを含有さ せる。調製後、コバルトでの吸光により蛍光弱化のキネティックスを測定するこ とによって、蛍光プローブ（カルセイン）が実際に含有されたことを確認できる 。実施例９ ２．５ｇのＲｅｍｃｏｐａｌ １２１（ＣＥＣＡ）及び０．８ｇのコレステロ ール（Ａｌｄｒｉｃｈ）を三角フラスコに入れる。４ｇの水を添加して混合し、 混合物を、コレステロールが完全に溶解するまで６５℃で２〜３時間放置し、混 合物を室温に冷却する。１０ｇのＰｈｏｓｐｈｏｌｉｐｏｎ ９０Ｐレシチン（ Ｎａｔｔｅｒｍａｎｎ）を添加して数分間混合し、ＤＨＡ（Ｍｅｒｃｋ）の４０ 重量％水溶液８．５ｇを滴下し加え、塩酸でｐＨを３に調節する。 均質混合を行なって均質なペーストを得、これを室温で２４時間放置する。 上記ペーストは、ＤＨＡを収容したカプセルの均質懸濁液を得るべく水で稀釈 することができる。その際ｐＨを５に調節すれば、カプセル内のＤＨＡをより酸 性のｐＨに維持しつつｐＨ５の外用カプセル製剤を得ることが可能となる。時間 の関数としてのｐＨ測定及び定量的測定によって、ＤＨＡをマイクロカプセルに 封入すると単なる水溶液の場合に比較してＤＨＡの分解の速度が低下することが 確認できる。実施例１０ ２．５ｇのＲｅｍｃｏｐａｌ １２１及び０．８ｇのコレステロールを三角フ ラスコに入れる。４ｇの水を添加して混合し、混合物を、コレステロールが完全 に溶解するまで６５℃で２〜３時間放置する。混合物を室温に冷却する。１０ｇ のＰｈｏｓｐｈｏｌｉｐｏｎ ９０Ｐレシチン及び１ｇのサリチル酸（Ａｌｄｒ ｉｃｈ）を添加する。数分間混合し、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルのナトリウ ム塩４２ｍｇと、ｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピルのナトリウム塩８９ｍｇと、 ２−フェノキシエタノール（Ａｌｄｒｉｃ ｈ）１２７ｍｇとを含有する水溶液７ｇを滴下し加える。数分間混合し、混合物 を３７℃で２４時間放置する。得られた均質なペーストを水中に分散させれば、 サリチル酸を収容した多重ラメラリポソームを形成することができる。遠心分離 とその後の定量的測定とによって、７０％を越える酸がカプセルに収容されるこ とが示され得る。調製物に呈色指示薬を添加すれば酸／塩基滴定の際に、カプセ ル内部が約２という、外部の値より小さいｐＨ値を有することが示され得る。実施例１１ ２．５ｇのＲｅｍｃｏｐａｌ １２１及び０．８ｇのコレステロールを三角フ ラスコに入れる。４ｇの水を添加して混合し、混合物を、コレステロールが完全 に溶解するまで６５℃で２〜３時間放置し、混合物を室温に冷却する。１０ｇの Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｏｎ ９０Ｐレシチンを添加する。数分間混合し、ヒアル ロン酸ナトリウム（Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ Ｂｏｍａｎｎ）の１％水溶液８． ５ｇを滴下し加える。混合物を２４時間放置する。この混合物は、ヒアルロン酸 ナトリウムを収容したカプセルの水性懸濁液を得るべく水中に分散させ得る。 上記混合物をひまし油中に分散させて均質なカプセル懸濁液を得ることも可能 であり、この懸濁液は後の調製操作に用い得る。カプセルは数時間後には沈澱す るが、単に攪拌すれば再懸濁可能である。実施例１２ （水溶性日焼け防止剤） １０％のＥｕｓｏｌｅｘ ２３２（Ｍｅｒｃｋ）を含有する水性相即ち相Ａを 調製する。 ２．３ｇのＲｅｍｃｏｐａｌ １２１及び０．８ｇのコレステロールを三角フ ラスコに入れ、４ｇの水を添加して混合し、混合物を、コレステロールが完全に 溶解するまで６５℃で２〜３時間放置し、混合物を室温に冷却する。１１．３ｇ のＰｈｏｓｐｈｏｌｉｐｏｎ ２５Ｐレシチン（Ｎａｔｔｅｒｍａｎｎ）を添加 する。数分間混合し、７ｇの相Ａを滴下し加える。混合物を２４時間放置する。 この調製物は、日焼け防止剤を収容したカプセルの懸濁液を得るべく水中または 油中に分散させ得る。実施例１３ （油溶性日焼け防止剤） ６ｇのＲｅｍｃｏｐａｌ １２１及び１．５ｇのコレステロールを三角フラス コに入れ、８ｇの水を添加して混合し、混合物を、コレステロールが完全に溶解 するまで６５℃ で２〜３時間放置する。混合物を室温に冷却する。１８ｇのＰｈｏｓｐｈｏｌｉ ｐｏｎ ２５Ｐレシチンを添加する。６ｇのメトキシシンナメートを添加し、数 分間混合し、１６ｇの水を滴下し加える。調製物を２４時間放置する。この調製 物は、日焼け防止剤を収容したカプセルの懸濁液を得るべく水中に分散させ得る 。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ラベールサンヌ，ルネ フランス国、33600・ペサツク、アブニ ユ・ドユ・パルク・デスパーニユ．62

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．１）水性溶媒、親水性末端基及びＣ₂〜Ｃ₁₆炭化水素鎖を有する界面活性剤 、ステロール及び／または膜タンパク質、及び／または封入するべき物質を混合 してステロール及び／または封入するべき物質を溶解させ、 ２）前記のようにして得られた組成物を脂質界面活性剤と混合して均質なラメラ 液晶相または液晶相の水中懸濁液を生成させ、 ３）液晶相または液晶相懸濁液をリポソームに変換する ことを含むリポソーム製造方法。 ２．第一のステップで用いる界面活性剤がＣ₆〜Ｃ₁₄炭化水素鎖を有することを 特徴とする請求項１に記載の方法。 ３．第一のステップで１〜５０重量％の界面活性剤及び０〜２５重量％のコレス テロールを含有する混合物を用いることを特徴とする請求項１または２に記載の 方法。 ４．第一のステップで５〜２５重量％の界面活性剤を含有する混合物を用いるこ とを特徴とする請求項３に記載の方法。 ５．第二のステップで１〜５０重量％の脂質界面活性剤を添加することを特徴と する請求項１から４のいずれか１項 に記載の方法。 ６．第二のステップで５〜２５重量％の脂質界面活性剤を添加することを特徴と する請求項５に記載の方法。 ７．脂質界面活性剤を、第一のステップで用いる界面活性剤の量を上回る量で添 加することを特徴とする請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。 ８．得られるリポソームを油性相中に分散させることを特徴とする請求項１から ７のいずれか１項に記載の方法。 ９．液晶相または液晶相懸濁液を生成させる方法であって、 １）水性溶媒、親水性末端基及びＣ₂〜Ｃ₁₆炭化水素鎖を有する界面活性剤、ス テロール及び／または膜タンパク質、及び／または封入するべき物質を混合して ステロール及び／または封入するべき物質を溶解させ、 ２）前記のようにして得られた組成物を脂質界面活性剤と混合して均質なラメラ 液晶相または液晶相の水中懸濁液を生成させる ことを含む方法。