JPH09508067A - 中空マイクロカプセルの製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 (i)タンパク質を水性溶媒に溶解した溶液を準備し、(ii)この溶液をガス中に噴霧して、水性溶媒が蒸発するようにすることによって、中空マイクロカプセルを形成させることを含むマイクロカプセルの形成法であって、水溶液が水より揮発性の大きな液体を含むことを特徴とする、方法。タンパク質は好ましくはアルブミンであり、揮発性液体は好ましくはエタノールである。マイクロカプセルは、超音波エコー源性コントラスト剤として用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】 中空マイクロカプセルの製造 本発明は、中空のタンパク質マイクロカプセルの製造に関する。これらのマイ クロカプセルの一つの用途は、超音波画像形成を向上させることである。 体内の気泡を超音波心臓検査法に用いることができることは、かなり以前から 知られている。 ＷＯ９２／１８１６４号公報明細書には、壁形成材料、好ましくはアルブミン のようなタンパク質の溶液を噴霧乾燥して、マイクロカプセルを形成させること が開示されている。ＷＯ／９４／０８６２７号公報明細書では、加熱した室に溶 液を噴霧する圧力を減少させて一層大きなマイクロカプセルを形成させ、または 噴霧する溶液に界面活性剤を添加することによって血流中のマイクロカプセルの 半減期を増加させ、または例えばマイクロカプセルを帯電した化合物の溶液に懸 濁することによって、マイクロカプセルを身体の選択された部分に向けている。 ＵＳ−Ａ−４４２０，４４２号(Sands; PQ Corpn)には、フィルム形成性固形 物の分散液に有機溶媒を加えた後、懸濁液を噴霧乾燥して中空ミクロスフェアを 形成させることが開示されているが、溶媒（例えば、セロソルブ(cellosolve)ま たはジグリム(diglyme)は水より揮発性が低かった。 本発明者らは、噴霧乾燥する水溶液に揮発性化合物を添加することによって、 特性が改良された、粒度分布がより狭くかつ外殻が薄いマイクロカプセルを高収 率で形成させることができることを見いだした。 本発明の一つの態様は、(i)水溶性材料を水性溶媒に溶解した溶液を準備し、( ii)この溶液をガス中に噴霧して、水性溶媒が蒸発するようにすることによって 、中空マイクロカプセルを形成させることを含むマイクロカプセルの形成法であ っ て、水溶液が水よりも揮発性が高い液体を含むことを特徴とする、方法を提供す る。 好適な揮発性液体としては、エタノール（好ましい揮発性液体）（沸点７８． ３℃）、メタノール（沸点６４．５℃）、およびアセトン（沸点５６℃）などが 挙げられる。揮発性液体は、壁形成材料の溶媒として作用し、用いられる比率で 水と混和できる必要がある。 揮発性液体である水溶液の比率は、揮発性化合物が何であるか、壁形成材料の 濃度および何であるか、溶液を噴霧する温度および圧力、および所望なマイクロ カプセル生成物によって変化する。典型的には、溶液の０．１％〜８０％（容量 ／容量）、好ましくは１〜５０％（容量／容量）、最も好ましくは５〜３０％（ 容量／容量）、例えば約２０％（容量／容量）が揮発性液体である。揮発性液体 の混合物を用いることができ、この場合にはこれらの百分率は揮発性液体の総含 量を表す。 噴霧−乾燥は、所望なマイクロカプセル生成物を直ちに提供するような一段階 工程であることができる。あるいは、直接生成物を更に工程段階に付し、例えば 加熱を行ない、マイクロカプセルのタンパク質外殻を更に架橋して不溶化するこ とができる。これは、二段階工程を構成している。 例えば、超音波診断法中のエコー源性コントラスト剤（これはこの生成物の一 つの目的とする用途である）としてヒトの血流中に注射しようとする生成物につ いては、総ての工程は無菌条件下で行なうのが好ましい。従って、タンパク質溶 液は無菌で発熱性物質を含まず、室（chamber）中のガスを最初に０．２μｍフ ィルターを通過させ、噴霧−乾燥機を最初にオートクレーブ処理などを行なう。 あるいは、または同様に、最終生成物を例えばイオン化放射線に暴露することに よって滅菌することもできる。 壁形成材料は水溶性材料であり、好ましくはタンパク質（この用語は天然には 存在しないポリペプチドおよびポリアミノ酸を包含するのに用いられる）である 。例えば、それはコラーゲン、ゼラチンまたは（血清）アルブミンであり、それ ぞれの場合に（マイクロカプセルがヒトに投与しようとするときには）好ましく はヒト起源のもの（すなわち、ヒトに由来するもの、またはヒトタンパク質に構 造が対応するもの）、またはポリリシンあるいはポリグルタメートであることが できる。それは、献血物由来のまたは形質転換しまたはトランスフェクションし てヒト血清アルブミン（ＨＡ）を発現した微生物（細胞系を包含する）の醗酵に 由来するＨＡであることができる。あるいは、単純または複合糖質、単純アミノ 酸または脂肪酸、例えばリジン、マンニトール、デキストラン、パルミチン酸ま たはベヘン酸を用いることもできる。 ＨＡ（この用語は、ヒトアルブミンの類似体およびフラグメント、例えばＥＰ −Ａ−３２２０９４号明細書に記載されているもの、およびモノマー性アルブミ ンのポリマーを包含する）を発現するための手法は、例えばＥＰ−Ａ−２０１２ ３９号明細書およびＥＰ−Ａ−２８６４２４号明細書に開示されている。総ての 文献は、本明細書に引用によって包含される。ＨＡの「類似体およびフラグメン ト」としては、(i)本発明の方法においてマイクロカプセルを形成することがで き、かつ(ii)アミノ酸配列の少なくとも５０％（好ましくは少なくとも７５％、 ８０％、９０％または９５％）の連続領域が、天然のものと同じヒトアルブミン の少なくとも５０％（好ましくは７５％、８０％、９０％または９５％）の連続 領域と少なくとも８０％相同性のある（好ましくは少なくとも９０％、９５％ま たは９９％相同性の）総てのポリペプチドなどが挙げられる。組換えＤＮＡ技術 によって製造されるＨＡを用いることができる。従って、ＨＡは、酵母または別 の微生物中でＨＡ−コードヌクレオチド配列を発現させ、当該技術分野で知られ ている方法によって生成物を精製することによって産生させることができる。こ のような材料は、血清由来の材料に伴う脂肪酸を欠いている。好ましくは、ＨＡ は脂肪酸を実質的に含まず、すなわち、これは血清由来材料の脂肪酸濃度の１％ 未満である。好ましくは、脂肪酸はＨＡでは検出されない。 水性溶液または分散液は、特に材料がアルブミンであるときには、好ましくは 、０．１〜５０％（重量／容量）、更に好ましくは、約１．０〜２５．０％（重 量／容量）または５．０〜３０．０％（重量／容量）のタンパク質である。約５ 〜１５％（重量／容量）が最適である。壁形成材料の混合物を用いることができ 、この場合には最後の二つのセンテンスにおける割合は、壁形成材料の総含量に 関するものである。 噴霧を行なう調剤は、壁形成材料、水および揮発性液体以外の物質を含むこと ができる。例えば、水性相は、安定剤として糖類およびポリマーのような水溶性 の親水性化合物、例えばポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリド ン（ＰＶＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ゼラチン、ポリグルタミン 酸、および澱粉、デキストラン、寒天、キサンタンなどの多糖類を１〜２０重量 ％含むことができる。 Ｘ線コントラスト剤（例えば、Hexabrix（イオキサグル酸(ioxaglic acid)） 、Optiray（イオベルゾール(ioversol)）、Omnipaque（イオヘキソール(iohexol )）、またはIsovice（イオパミドール(iopamidol)）、または磁気共鳴画像形成 剤（例えば、コロイド状酸化鉄またはガドリニウムキレート化合物、例えば、ガ ドペンテト酸(gadopentetic acid)）のような官能剤を、例えば、１．０〜４０ ．０％（重量／重量）含むことができる。 同様な水性相を、最終的なマイクロカプセル生成物を使用前に懸濁させる担体 液体として用いることができる。界面活性剤を用いることができ（０．１〜５重 量％）、ほとんどの生理学的に許容可能な界面活性剤、例えば、卵レシチンまた は大豆レシチン、または飽和した合成レシチンのような合成レシチン、例えば、 ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、 またはジステアロイルホスファチジルコリン、またはジオレイルホスファチジル コリンまたはジリノレイルホスファチジルコリンのような不飽和の合成レシチン が挙げられる。他の界面活性剤としては、遊離脂肪酸、脂肪酸とポリオキシプロ ピレングリコールおよびポリオキシエチレングリコールのようなポリオキシアル キレン化合物とのエステル、脂肪アルコールとポリオキシアルキレングリコール とのエーテル、脂肪酸とポリオキシアルキル化ソルビタンとのエステル、石鹸、 グリセロール−ポリアルキレンステアレート、グリセロール−ポリオキシエチレ ンリシノレエート、ポリアルキレングリコールのホモ−およびコポリマー、ポリ エトキシル化大豆油およびヒマシ油並びに水素化誘導体、スクロースまたは他の 炭水化物と脂肪酸、脂肪アルコールとのエーテルおよびエステルであって、場合 によってはポリオキシアルキル化されたもの、飽和または不飽和脂肪酸のモノ− 、ジ−およびトリグリセリド、グリセリドまたは大豆油およびスクロースが挙げ られる。しかしながら、担体液体は界面活性剤を含まないのが好ましい。 添加剤をマイクロカプセルの壁に配合して、分散性、弾性および水透過性のよ うな物性を改質することができる。 有用な添加剤としては、壁を「疎水化」して水透過性を減少させることができ る脂肪、ワックスおよび高分子量炭化水素のような化合物を挙げることができる 。注射用液体−担体中でのマイクロカプセルの分散性を増加する添加剤は、リン 脂質のような両親媒性化合物であり、これらは水透過性および生物分解性の速度 も増加する。しかしながら、少なくともマイクロカプセルがアルブミンからでき ているときには、本発明者らはそれらが不必要であることを見いだしているので 、これらのマイクロカプセルはその分散性を増加する添加剤を含まないのが好ま しい。 壁に配合される添加剤の量は、必要に応じて非常に変化する。場合に因っては 、添加剤は全く用いられないが、他の場合には、壁の約４０．０重量％に達する こ とがある添加剤の量が可能である。 壁形成材料の溶液は、直径が０．０５〜５０．０μｍの不連続な(discrete)マ イクロカプセルを生成する任意の適当な手法によって噴霧および噴霧−乾燥され る。これらの数値は、直径をCoulter Multisizer IIで測定した場合のマイクロ カプセルの容量の少なくとも９０％に相当する。「マイクロカプセル」という用 語は、空間が入っている中空粒子を意味し、この空間にはガスまたは蒸気が満た されているが、固形材料は全く入っていない。「Maltesers」（登録商標）とし て英国で発売されている砂糖菓子に類似の蜂の巣状粒子は形成されない。空間を 完全に取り囲むこと（これは好ましいが）は必要でなく、またそれは通常は球状 であるが、精確に球状であることも必要ない。マイクロカプセルが球状でない場 合には、前記の直径は、同じ質量を有しかつ球状でないマイクロカプセルと同じ 容量の中空空間を取り囲んでいる対応する球状のマイクロカプセルの直径に関す るものである。 噴霧は、例えば調剤を加圧下で少なくとも一つのオリフィスを通して暖い空気 または他の不活性ガスの室(chamber)中に押し進めることによって、または暖い 空気または他の不活性ガスの室中で遠心噴霧器を用いることによって、製剤のエ アゾールを形成することを含んでいる。この室は、十分な大きさを有しており、 噴射された最大の小滴が乾燥前に壁に打ち当たらないものであるべきである。マ イクロカプセルを診断用画像形成の目的で血流中に注射しようとする場合には、 室内のガスまたは蒸気は清浄（すなわち、好ましくは無菌および発熱性物質不含 ）であり、超音波心臓検査法でマイクロカプセルの投与に付随する量で血流中に 投与する際に毒性を持たないものである。タンパク質製剤からの液体の蒸発速度 は、中空マイクロカプセルを形成するのに十分な高さであるべきであるが、マイ クロカプセルを破裂させるほどの高さであるべきではない。蒸発速度は、ガス流 速、タンパク質製剤中のタンパク質の濃度、液体担体の性質、溶液の供給速度、 およ び最も重要なことであるが、エアゾールと遭遇するガスの温度を変化させること によって調節することができる。粒度分布は、低流速の供給原料と非常に高濃度 の噴霧および乾燥空気との組み合わせがある噴霧−乾燥によって小さくすること ができる。この効果は非常に限定された大きさで狭い大きさの分布のマイクロカ プセルを製造することである。何名かの研究者らは、空気ノズルの平均小滴粒度 を画定する方程式をデザインしており、平均液滴粒度に影響を及ぼす各種のパラ メーターを単純に表したものは下記の通りである。 Ｄ＝Ａ／（Ｖ²・ｄ）^a＋Ｂ・（Ｍ_air／Ｍ_liq）^-b 式中、 Ｄ＝平均小滴粒度 Ａ＝ノズルデザインに関する定数 Ｂ＝液体の粘土に関する定数 Ｖ＝液体およびノズルの間の相対空気速度 ｄ＝空気密度 Ｍ_airおよびＭ_liq＝空気および液体流の質量 ａおよびｂ＝ノズルデザインに関する定数 （不明確さを避けるため、Ｖを二乗し、（Ｖ²・ｄ）をａ乗し、（Ｍ_air／Ｍ_liq ）を−ｂ乗する）。 いずれの所定のノズルデザインに対しても、液滴粒度はノズルでの相対速度お よび同時に空気対液体の質量比によって最も影響されることは明らかである。ほ とんどの普通の乾燥用途に対しては、空気対液体比は０．１〜１０の範囲にあり 、これらの比率では、平均液滴粒度は１５〜２０μｍであると見られる。本明細 書に記載の粒度範囲のマイクロカプセルを製造するため、本発明者らは、一般的 には２０〜１０００の範囲の空気対液体比を用いている。この効果は、比較用標 準では極めて小さいのに対して高比率でかつ極めて狭い粒度分布で粒子を製造す る ことである。低めの空気対液体の比率で生産されるマイクロカプセルについては 、若干大きめの粒子が製造されるが、それでもなお粒度分布は狭く、エマルジョ ン法によって製造されるマイクロカプセルより優れている。 アルブミン濃度が水中で５．０〜２５．０％では、入口ガス温度は少なくとも 約１００℃、好ましくは少なくとも１１０℃で、一般的には中空性を確保するの に十分であり、温度は２５０℃程度とすることもでき、カプセルの破裂はない。 約１８０〜２４０℃、好ましくは約２１０〜２３０℃、最も好ましくは約２２０ ℃が、少なくともアルブミンには最適である。この温度は、本発明の方法の一段 階法では、壁形成材料の少なくとも一部（通常は外側）、頻繁には壁形成材料の 実質的に総てを不溶化するのに十分であることがある。エアゾールと遭遇したガ スの温度はエアゾールを放出する速度およびタンパク質製剤の液体含量によって 変化するので、出口温度を監視して、室に適当な温度を確保することができる。 ４０〜１５０℃の出口温度が好適であることが分かった。 二段階工程では、壁形成材料がタンパク質であるときには、中間体マイクロカ プセルは典型的には９６〜９８％のモノマータンパク質を含んでなり、壁形成材 料自身と同じ水溶解性を保持する。これらは、超音波画像形成のイン・ビボ寿命 が限定されている。しかしながら、それらは超音波画像形成に用いることができ 、またはそれらを保存し、輸送した後、二段階工程の第二段階を行なうことがで きる。従って、それらは本発明のもう一つの態様を形成する。 この工程の第二段階では、第一段階で調製された中間体マイクロカプセルを固 定して(fixed)水溶解性を低くして、一層長く持続するが生物学的分解性ではな くなるほど不溶性および不活性とはならないようにする。また、この段階ではマ イクロカプセルを強化して、投与、血管中の剪断および心室圧（ventricular pr essure）の過酷さに充分耐え得るようにする。マイクロカプセルが破裂すると、 エコー源性は少なくなる。 Schneiderら(1992)Invest．Radiol.，27，134-139は、先行技術による超音波処 理したアルブミン微小気泡はこの強度を有しておらず、左心室の典型的な圧力を 受けると速やかにそのエコー源性を失うことを示した。この工程の第二段階では 、熱（例えば、マイクロ波熱、放射熱、または例えば通常のオーブンでの加熱空 気）、イオン化放射（例えば、１０．０〜１００．０ｋＧｙ線量のガンマー線に よる）、または例えばホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、エチレンオキシ ド、またはタンパク質の架橋用の他の薬剤などを用いて溶媒中での化学的架橋を 用いることができ、第一段階で形成された実質的に乾燥した中間体マイクロカプ セル上でまたはマイクロカプセルが不溶性である液体、例えば好適な溶媒中での このマイクロカプセルの懸濁液上で行なわれる。この方法の一段階法では、グル タルアルデヒドのような架橋剤を噴霧−乾燥室中に噴霧することができ、または 噴霧手段のすぐ上流のタンパク質製剤中に導入することができる。あるいは、室 の温度を、マイクロカプセルを不溶化するのに十分高くすることができる。 中間体マイクロカプセルと同様にして測定した最終生成物は、所望ならば、直 径が０．１〜５０．０μｍのマイクロカプセルからなることができるが０．１〜 ２０．０μｍ、特に１．０〜８．０μｍの容積範囲が本発明の方法で得られ、超 音波心臓検査法に好ましい。第二段階は、第一段階で生成した粒度の決定におい て、マイクロカプセルの粒度が変更されることがあることを考慮する必要がある 。 本発明の方法を制御して、所望な特性を有するマイクロカプセルを得ることが できることを見いだした。従って、タンパク質溶液を噴霧ノズルに供給する圧力 を変化させて、例えば１．０〜２０．０×１０⁵Ｐａ、好ましくは５．０〜１０ ．０×１０⁵Ｐａ、最も好ましくは約７．５×１０⁵Ｐａとすることができる。同 様に、液体の流速を変化させることができる。他のパラメーターを、本明細書の 上記および下記に開示されているように変化させることができる。この方法では 、新規なマイクロカプセルを得ることができる。本発明者らは、揮発性成 分を含む供給原料から形成されるマイクロカプセルは一層滑らかな表面を有する 一層完全な中空カプセルを提供し、揮発性成分の非存在化で形成されるカプセル より小さいことを見いだした。 特に、壁形成材料の量に対して反射率（reflectivity）の大きな生成物を得る ことができる。例えば、マイクロカプセル１３μｇ／ｍｌの均質な懸濁液は、３ ．５ＭＨｚの超音波に対して、少なくとも−１．０ｄＢの反射率を提供すること ができる。−０．３より高い反射率は必要ないことがあり、約−０．７〜−０． ５の反射率が好都合である。 好ましくは、マイクロカプセルの壁におけるタンパク質の少なくとも５０％が 架橋している。好ましくは、タンパク質の少なくとも７５％、９０％、９５％、 ９８．０％、９８．５％または９９％は十分に架橋されており、１％ＨＣｌ溶液 で２分間の抽出に耐える。抽出されたタンパク質は、Bradfordのクーマシーブル ータンパク質分析法を用いて検出される。架橋の程度は、タンパク質の加熱、放 射線照射または化学的処理を変化させることによって調節される。架橋工程の際 に、タンパク質モノマーは架橋して、下記の例３に示されるように、ゲル浸透Ｈ ＰＬＣまたはゲル電気泳動によって検出されるように、速やかに単純な分離工程 では入手できなくなる。処理を継続すると、既に架橋した材料が更に架橋して、 前記のＨＣｌ抽出では入手できないようになる。１７５℃での加熱中に、本発明 によるＨＡマイクロカプセルは２０分間でＨＣｌで抽出可能なタンパク質の約９ ９％が失われるが、１５０℃では２０分の加熱では約５％のＨＣｌで抽出可能な タンパク質しか除去されず、３０分ではＨＣｌで抽出可能なタンパク質の４７． ５％、４０分では８３％、６０分では９３％、８０分では９７％が、１００分で は９７．８％が除去される。従って、良好な水準の架橋を達成する目的で、マイ クロカプセルを１７５℃で少なくとも１７〜２０分間、１５０℃で少なくとも８ ０分間、および他の温度では対応する長または短時間加熱することが できる。 本発明のマイクロカプセルは、添加剤の存在下または非存在下で乾燥状態で保 存して、保存を改良し、合体を防止し、または再懸濁を促進することができる。 添加剤としては、マンニトール、ガラクトース、ラクトースまたはスクロースの ような水溶性の生理学的に許容可能な化合物、またはデキストラン、キサンタン 、寒天、澱粉、ＰＶＰ、ポリグルタミン酸、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）お よびゼラチンのような親水性ポリマーの０．１〜２００．０重量％から選択する ことができる。注射可能な液体担体相中のマイクロカプセルの有効寿命、すなわ ち有用な超音波検査信号が観察される期間を調節して、必要に応じて数分間(a f ew minutes)から数か月間(several months)継続させることができ、これは壁の 多孔度、溶解度または架橋度を調節することによって行なうことができる。これ らのパラメーターは、壁形成材料および添加剤を適当に選択することによって、 および噴霧乾燥室での蒸発速度および温度を調整することによって調節すること ができる。 マイクロカプセルの凝集を最少にするため、マイクロカプセルを０．５ｍｍス クリーンを備えたFritsch遠心ピンミルまたはGlen Crestonエアーインパクトジ ェットミルを用いて適当な不活性賦形剤と共に粉砕することができる。適当な賦 形剤は不活性で静脈内で使用するのに好適な微粉砕粉末であり、例えばラクトー ス、グルコース、マンニトール、ソルビトール、ガラクトース、マルトースまた は塩化ナトリウムである。マイクロカプセル／賦形剤混合物は、一旦粉砕してし まえば、水性媒質に懸濁して、非官能性／欠陥マイクロカプセルの除去を促進す ることができ、またはこれを更に加工することなく分配用の最終容器に入れるこ とができる。続いて、水性相で再構成を促進するため、微量の界面活性剤を粉砕 段階でおよび／または水性媒質中に含有させて凝集を防止することができる。こ の目的に好適なアニオン性、カチオン性および非イオン性界面活性剤としては、 ポロキサマー(poloxamers)、ソルビタンエステル、ポリソルベートおよびレシチ ンが挙げられる。 次に、マイクロカプセル懸濁液を浮遊させることができ、または遠心分離を行 なって表面に欠陥を有し使用時に液体が充満してしまい最早エコー源性ではなく なる欠陥粒子を沈降させることができる。 次いで、マイクロカプセル懸濁液を再混合して、均一な粒子分布を確保し、等 張マンニトールのような静脈内注射に好適な緩衝液で洗浄し、再構成することが できる。この懸濁液を、凍結乾燥、および引き続く例えばガンマー線照射、乾熱 、またはエチレンオキシドによる殺菌用に分割することができる。 不溶化または固定されたマイクロカプセルの脱凝集の代替法は、例えばポロキ サマー、ソルビタンエステル、ポリソルベートおよびレシチンなどの好適な界面 活性剤を含む水性媒質中にそれらを直接懸濁することである。次に、脱凝集を、 好適なホモジナイザーを用いて行なうことができる。 次いで、マイクロカプセル懸濁液を浮遊させ、または遠心分離を行なって前記 のような欠陥粒子を沈降させ、更に前記と同様に処理することができる。 本発明の好ましい態様では、熱固定段階の生成物を、前記と同様に粉砕によっ て脱凝集する。 本発明のマイクロカプセルは、更に詳細には、注射後の寿命が限定されるよう にデザインされる場合には、乾燥状態で市販することができるが、既製製剤、す なわち注射の準備の出来た水性液状担体にマイクロカプセルを懸濁したものを販 売することも望ましいことがある。 しかしながら、生成物は一般的には乾燥粉末として供給され、保存され、投与 の直前に好適な無菌の発熱性物質不含液体に懸濁される。この懸濁液は、通常は 肘静脈または他の血管のような好適な静脈に約１．０〜１０．０ｍｌを注射する ことによって投与される。約１．０×１０⁵〜１．０×１０¹²粒子／ｍｌのマイ クロカプセル濃度が好適であり、約５．０×１０⁵〜５．０×１０⁹が好ましい。 超音波画像形成は、各種の動物および人体の器官系に適用することができるが 、その主要な用途の一つは心筋組織および潅流または血流パターンの画像を得る ことにある。 これらの技術は、スキャナーと画像形成装置とからなる超音波走査装置を用い ている。この装置は、所定面積、この場合には人体の心臓領域の可視画像を生成 する。典型的には、トランスデューサーを画像形成を行なう部分の皮膚に直接置 く。スキャナーには、超音波トランスデューサーなどの各種の電子構成要素が収 容されている。トランスデューサーは、超音波を生成し、これが心臓領域のセク タースキャンを行なう。超音波は心臓領域の各種の部分で反射されて、受容トラ ンスデューサーによって受けとられ、当該技術分野で知られているパルス−エコ ー法に従って加工処理される。加工処理の後、信号は画像形成装置（これもまた 当該技術分野で周知である）に送られて、検査される。 本発明の方法では、患者を「準備させ(prepped)」、スキャナーを所定部位に 置いた後、マイクロカプセル懸濁液を例えば腕静脈などから注射する。コントラ スト剤は静脈中を心臓の右静脈側へと流れ、主肺動脈を通って肺に至り、毛細管 を通って肺を横断して、肺静脈に入り、最後に心臓の左心房および左心室腔へと 至る。 本発明のマイクロカプセルを用いると、血液が肺を通過するのに要する時間、 血流パターン、左心房の大きさ、（左心房と左心室とを分けている）僧帽弁の能 力(competence)、左心室腔の室の大きさ、および壁運動の異常の量に関して観察 および診断を行なうことができる。左心室からコントラスト剤を噴出する際に、 大動脈弁の能力並びに左心室から放出される噴出画分または容積比を分析するこ ともできる。最後に、組織におけるコントラストパターンにより、若しあるとす れば、どの領域が適正に潅流していないかが示される。 要約すれば、このような画像のパターンにより、心臓内部の異常な血流特性、 弁能力、室の大きさ、および壁運動の診断が容易になり、心筋潅流の有力な指標 が提供される。 マイクロカプセルは、静脈注射により左心臓の画像形成を行なうことができる 。アルブミンマイクロカプセルは、末梢静脈に注射すると、肺静脈通過(transpu lmonary passage)が可能である。これにより、左心室（ＬＶ）腔並びに心筋組織 が超音波心臓検査法で不透明になる。 前記に略記したスキャナーの他に、他の超音波スキャナーもあり、その例は米 国特許第４，１３４，５５４号明細書および第４，３１５，４３５号明細書に開 示されている。基本的には、これらの特許明細書は、運動している器官の動的可 視化を可能にするのに十分なフレーム率での超音波エネルギーによる動物または ヒトの解剖学的構造の横断面スライスの連続的二次元画像を生成するための動的 横断面超音波検査法（ＤＣＥ）などの各種の技術に関するものである。ＤＣＥで 用いられる装置の種類は一般的にはＤＣＥスキャナーと呼ばれており、狭いビー ムまたはラインの形態の短い音波パルスを伝達しおよび受け取る。反射信号の強 度は時間の関数であり、名目の音速を用いて一つの位置に変換され、レーダーま たはソナーディスプレイと幾分類似した方法で陰極線管または他の好適な装置上 に表される。ＤＣＥを用いて肝臓、胆嚢、膵臓および腎臓などの多くの器官系の 画像を生成させることができるが、これは心臓の組織および主要血管の可視化に 用いられることが多い。 マイクロカプセルは、末梢静脈部位に注射したときでも、広汎な領域を画像形 成するのに用いることができる。これらの部位としては（制限なしに）、(1)心 臓への静脈ドレナージ系、(2)運動踏み車試験などの際の心筋組織および潅流特 性、および(3)組織への血流を増加させるようにデザインした薬剤を経口摂取ま たは静脈内注射した後の心筋組織が挙げられる。また、これらのマイクロカプセ ルは、(1)冠状動脈血管移植、(2)冠状動脈血管形成（狭くなった動脈のバルーン 拡張）、(3)冠状動脈の凝血を溶解する目的での血栓分解剤（例えば、ストレプ トキナーゼ）の使用、または(4)最近の心臓発作による潅流の欠陥または変化な どの干渉による心筋組織の潅流の変化を描写するのに用いることもできる。 更に、冠状血管造影（またはデジタル・サブトラクション・血管造影(digital subtraction angiogram)）の時点において、マイクロカプセルを注射すること によって組織潅流特性に関するデーターを提供して、血管の解剖学的構造のみ同 定される血管像影法から得られるデーターを増加させまたは補足することができ る。 本発明のマイクロカプセルを使用することによって、現在は超音波技術によっ て画像形成されている肝臓、脾臓および腎臓などの心臓以外の器官系は、それら の現在得ることができる画像および／または先行技術による超音波画像法を用い る画像形成を以前は受け難かった潅流および流特性を示す新たな画像の画質を向 上させるのに好適である。 本発明の好ましい態様を、実施例および本発明の方法の第一段階について好適 な噴霧−乾燥装置の前および一側部からのカッタウェイ透視図である図１に関し て記載する。例１ 噴霧−乾燥装置 適当な噴霧乾燥装置（図１）は、「モービル・マイナー(Mobile Minor)」の商 品名でA/S Niro Atomizer、ソエボルグ、デンマークから発売されている。この 噴霧乾燥装置は、タンパク質溶液の溜め１、および気流パターンを効果的に調節 することができるシーリング・エア攪拌機(ceiling air disperser)２を含んで なる。渦流空気を、最小限でも４．０バールから最大６．０バールまでの空気圧 で空気タービンによって駆動される回転噴霧装置またはノズル噴霧装置３（例え ば、M-02/B Minor型）の回りに向ける。６．０バールでは、噴霧装置のホイール 速度は約３３，０００ｒｐｍに達する。噴霧装置に対する圧縮空気のスイッチの 開閉は、計器盤９に配置された弁によって行なう。噴霧装置への圧縮空気の最大 消費量は、６．０バールの圧力で１７Ｎｍ³／時である。液体原材料および粉末 と接触する総ての部分は、ステンレス鋼ＡＩＳＩ３２９製であり、高い遠心力に 耐えるようにしたポンプ供給管および噴霧装置ホイールを除き、ステンレス鋼Ａ ＩＳＩ３１６で作られている。 この装置は、室の最上部へ接近するための梯子(steps)５と、室の蓋を上げる ときに空気吊り上げ装置を活性化するための空気弁のスイッチ６を備えている。 乾燥室は、ステンレス鋼ＡＩＳＩ３１６製であってRockwool（登録商標）で十 分に絶縁された内側と、軟鋼シート材料で被覆された外側を有している。乾燥室 の屋根は、内側がステンレス鋼ＡＩＳＩ３１６で作られ、外側がステンレス鋼Ａ ＩＳＩ３０４で作られている。 ステンレス鋼ＡＩＳＩ３０４製の空気攪拌機は、乾燥室の空気を分布させ、最 良の可能な乾燥効果を得るために用いられる。ステンレス鋼ＡＩＳＩ３１６製の 空気ダクト４は、排気および粉体をステンレス鋼ＡＩＳＩ３１６製で粉体と空気 とを分離するようにデザインされたサイクロン７の側部に輸送する。 これもまたステンレス鋼ＡＩＳＩ３１６製でシリコーンゴムのガスケットを有 する蝶型弁の種類の閉止弁を用いて、サイクロンの下に粉体を排出させてバネ装 置によってサイクロンの下に密着して設置されている粉体収集用ガラスジャー８ に入れる。 シルミン製で、三相カゴ型電動機０．２５ｋＷおよびベルトガードを有するＶ 型ベルトを有する遠心排気ファン１０によって、乾燥室およびサイクロンを通っ て空気および粉体を引く。ダンパー11によって、気流を調節する。 空気加熱器12では、電気（総消費量７．５ｋＷｈ／時、無限に変化可能）によ って乾燥空気が加熱され、取り入れ空気温度を約３５０℃までとすることができ るが、これは通常は本発明のマイクロカプセルの製造には高すぎる。 蒸発容量 ステンレス鋼ＡＩＳＩ３１６製でノズルホルダーを有する入口管とノズルから なる２液ノズル噴霧用の装置を加えて、乾燥室の天井に配置することができる。 この装置は、油／水分離装置、２液ノズルに対する圧縮空気用の減速弁および圧 力ゲージを含んでいる。圧縮空気の消費量：０．５〜２．０バール（０．５〜２ ．０×１０⁵Ｐａ）の圧力で８〜１５ｋｇ／時。 壁形成製剤を噴霧装置に輸送するのに好適な原材料ポンプは、蠕動ポンプであ る。このポンプは、モーター（１×２２０Ｖ、５０Ｈｚ、０．１８ｋＷ）と手動 調整のための連続可変ギヤとを備えている。シリコーンホースでできている原材 料管は、原材料タンク（局部供給）から供給ポンプを通って噴霧装置に続いてい る。 プレフィルター、ステンレス鋼製のフィルター本体および絶対空気フィルター からなる絶対空気フィルターを用いて、入ってくる乾燥空気を処理して完全に清 浄にする。工程 無菌で発熱性物質を含まないｒＨＡを２５．０％（容量／容量）エタノールを 含む（注射用に好適な）発熱性物質不含水に溶解した１０．０％（重量／容量） 溶液を、前記の市販の噴霧乾燥ユニットに配設した２液ノズル噴霧装置のノズル に送液した。蠕動ポンプ速度を約４．０ｇ／分の速度に保持して、取入れ空気温 度が２２０℃では取出し空気温度が９５℃に保持されるようにした。 圧縮空気を、２．０〜１０．０バール（２．０〜６．０×１０⁵Ｐａ）で２液 噴霧ノズルに供給した。この範囲では、平均粒度が２．０〜３．０μｍのマイク ロカプセルが得られる。 典型的には、（噴霧圧の減少による）平均粒度の増加によって粒度が１０μｍ を上回るマイクロカプセルの量が増加した（表１を参照されたい）。 ５．０×１０⁵ｐａの圧力を用いて、この具体例でマイクロカプセルを生成さ せた。 この工程の第二段階では、マイクロカプセル５ｇをGallenkampファン付きオー ブンを用いてガラスビーカー中で加熱した。１７５℃の温度で１時間は、 ＨＰＬＣで測定したところ、１００％固定のマイクロカプセルを生成するのに十 分であった。この熱固定の効果は、イン・ビトロでのエコー源性半減期を数分か ら３０分を超過するまで増加することであった。インキュベーションの温度およ び長さを変化させることによって、固定度を約５％〜１００％の間で変化させる ことが可能である。 熱固定の後にマイクロカプセルを脱凝集して、２つの方法の一方で水に分散し た。方法１は、熱固定した球を同重量の微粉砕ラクトース（平均直径５μｍ）と 最初に混合することを含んでいた。 次に、混合物を、０．５ｍｍスクリーンと１２枚歯ローターを有するFritsch 遠心ミルを通過させた。粉砕した球を回収し、二回目のミルを通過させて完全な 混合が起こるようにした。次いで、粉砕した粉体を１ｍｇ・ｍｌ^-1のPluronic F 68（登録商標）を含む水に再懸濁した。典型的には、マイクロカプセルおよびラ クトース１０ｇを、水およびPluronic F68１００ｍｌに加えた。脱凝集の方法２ は、熱−固定したマイクロカプセル５ｇをPluronic F68１００ｍｇを含む水１０ ０ｍｌに加えることを含んでいる。このマイクロカプセルを、Silversonホモジ ナイザー（２．５４ｃｍの管状ホモジナイズ用プローブと高剪断スクリーンとを 有するＬ４Ｒ型）を用いて分散させて、６０秒間ホモジナイズした。 再懸濁した球を、浮遊法を用いて無傷（ガスを含む）と破損した球とに分離し た。ガスを含む球は１時間で表面まで浮遊することがみられ、必要なガスを含ん でいない沈んでいる画分から傾瀉した。 分離工程は遠心分離によって促進することができる。５０００×ｇでの３０秒 間の遠心分離は２つの画分を分離するのに十分である。 分離の後に、無傷のマイクロカプセルをラクトースおよびPluronic F68の存在 下で凍結乾燥した。凍結乾燥の最適条件は、ラクトース５０ｍｇおよびPluronic F68５ｍｇを含む水５ｍｌにマイクロカプセル３０ｍｇを再懸濁することを含ん でいた。凍結乾燥したマイクロカプセルは、液体（例えば水、塩水）に再分散し て単分散分布を生じることができる。例２ マイクロカプセルを、下記の詳細な条件を除き例１と同様にして調製した。 無菌の発熱性物質不含血清由来のヒトアルブミンを２５％（重量／重量）エタ ノールを含む発熱性物質不含水（注射用に好適）に溶解した１００±１０ｍｇ／ ｍｌ溶液を、噴霧乾燥原材料として用いた。 蠕動ポンプを用いて、アルブミン原材料を４±１．５ｇ／分の速度で供給し、 ２２０±０．５℃の取入れ口(inlet)温度で、８０±１０℃の取出口(outlet)温 度を保持するようにした。 その他の噴霧−乾燥条件は下記の通りであった。空気流、５０±２％；噴霧圧 、８．０±０．５ｂａｒｇ；乾燥気流、９±２ｍｍＨ₂Ｏ。 生成したマイクロカプセルは、２５０ｍｌステンレス鋼ビーカー中で５±１ｇ ずつ１７６±２℃の温度で５５±５分間熱固定した。 熱固定の後、マイクロカプセルを脱凝集した。グルコースをプールしたマイク ロカプセルに２：１の割合で加え、混合して、Glen Creston空気衝撃ジェットミ ルで粉砕した。 脱凝集したマイクロカプセルをガラスバイアル瓶に充填して、バイアル瓶を窒 素で置換し、シールして、蓋をした。生成物を、最後に２５〜３５ｋＧｙの線量 を照射することによって殺菌した。例３： マイクロカプセル中の遊離のモノマー性アルブミンの分析 エタノール１ｍｌの容量を２０ｍｌガラスボトル中でマイクロカプセル１００ ｍｇに加え、３０秒間音波処理を行なった。この懸濁液に、Ｈ₂Ｏを１９ｍｌ加 えた。 混合物を卓上型微量遠心分離機(bench-top microfuge)(Gilson)で２０秒間遠 心分離し、透明な画分を分析した。分析は、Shimadzu LC6A HPLCに画分５０ｍｌ を自動的に採取してリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて１ｍｌ／分 の流速でＴＳＫゲル浸透カラム上でクロマトグラフィ処理を行なうことによって 行なった。 ＨＡモノマーを表すピーク高さを記録し、１〜１０ｍｇ／分のモノマー性ＨＡ の標準曲線を用いてモノマーの濃度を測定するのに用いた。 遊離のモノマー性ＨＡの％割合は、固定されたマイクロカプセル中のモノマー 濃度を測定し、この数値を固定されていないマイクロカプセルのモノマー濃度の 割合として表すことによって計算した。 オーブン（例１に記載したものと同じ）中で噴霧乾燥したマイクロカプセルを 加熱すると、検出することができるモノマーの量が減少する。検出可能なモノマ ーＨＡのこの減少は、モノマーＨＡの変性および架橋により前記のＨＰＬＣ法に よって分析することができない不溶性ポリマーとなることによる。 ＨＰＬＣ法を用いてＨＡモニター水準を評価すると、１５分間のインキュベー ションの後には、ＨＡマイクロカプセル中には遊離のモノマー性ＨＡが存在しな いことが明らかである。しかしながら、更に長時間加熱することによってＨＡマ イクロカプセルを更に架橋することも可能である。 この長時間の加熱により、マイクロカプセルの架橋の程度が増加し、これによ り強度が増加したマイクロカプセルが生成され、これに対応して耐圧性が一層大 きくなる。 インキュベーションの温度および時間を慎重に制御することによって、制御さ れた架橋範囲（従って、耐圧性(pressure resistivity)）を有するマイクロカプ セルを生成させることが可能である。例４： マイクロカプセルの分類 本発明の方法の利点は、マイクロカプセルのメジアン粒度および粒度分布を制 御することができることである。しかしながら、所望ならば、浮遊(flotation) などによって所望な粒度を更に選択することができる。マイクロカプセルの均質 な分散においては、より大きい粒子の方が密度が小さい（空気を一層多く含んで いる）ため、小さい粒子より速く表面に上昇する。従って、分散液を放置するこ とによって、粒度分布は如何なる溶液濃度においても経時的に変化する。 マイクロカプセルを、約１６５ｍｍの液体カラムを生じるガラスボトル中で６ ％（重量／容量）塩化ナトリウムおよび０．１％（重量／容量）Pluronic F68（ 登録商標）を含む水溶液２０００ｍｌに分散させた。サンプリング試験管を上方 の液体表面の５０ｍｍ下に設置して、所定の時間間隔で試料を取出すことができ るようにした。 放置時間および塩化ナトリウム濃度を変化させることによって、各種の粒度分 布を生成させ、マイクロカプセルを下方２μｍまで分類することが可能であった 。 他の湿式分類法としては、流体力学的クロマトグラフィおよびフィールド・フ ロー分別(field flow fractionation)が挙げられる。エル−トリエーションおよ び横流分離(cross flow separation)の原理を用いる「乾式」法が、Microsplit （British Rem.）、Zig-zag(Alpine)、およびTurbo（Nissuin）分級機の形態で 市販されている。例５： ヒト血清アルブミンマイクロカプセルの特性決定 本発明の方法によって製造した中空マイクロカプセルは、平均粒度が小さくか つ外殻特性が向上しているため、製造に用いた壁形成材料の量は以前の製造法で 用いたものよりかなり少なくなることが見いだされた。しかしながら、これにも 拘らず、マイクロカプセルのエコー源性は以前に製造したものより優れている。 この新規な特性を測定し、アルブミンの１μｇ／ｍｌ当たりのエコー源性のデシ ベル（ｄＢ）として表す。エコー源性は、超音波を反射または「後方散乱(backs catter)」する材料の能力として定義することができる。後方散乱の強度は、デ シベルによって画像分析によって定量される。信号の強度が強くなれば、試料は 一層エコー源性が大きくなる。 分析に用いた総ての水は発熱性物質不含であり、使用の２日前に抜き取り、曝 気により脱気した。 ４００ｍｌポリプロピレン試験ビーカー(Fisons Scientific Equipment、英国 )に水３５０ｍｌを加え、使用前に総ての気泡を表面に浮遊させた。 Hewlett Packard Sonos 1000超音波装置を用いて、コントロールを下記のよう に設定した。ＴＧＣ（総利得制御）＃１、＃２、＃３、＃４、＃５、＃６、＃７ 、総て＝１２８；圧縮＝１２８ｄＢ；および透過(transmit)＝６０ｄＢ。３．５ ＭＨｚトランスデューサーを用いて、８ｃｍの深度に設定した。 トランスデューサーを１．５ｃｍの深さまで水に入れ、磁気フォロワーを７５ 回転／分に設定した。後方散乱強度を記録する背景を最初に作成した。画像分析 装置(Seescan、ケンブリッジ、英国）を用いて、超音波スキャンを１．２秒間記 録した後、記録を１０個の個別の時間枠に分割した。それぞれの枠を後方散乱強 度について分析し、統計学的結果を計算した。 均一な容量の懸濁したマイクロカプセルを、気泡が入らないように注意しなが ら加えた。加えた容量は、投与の後、超音波試験セル内のマイクロカプセル濃度 が１×１０⁶／ｍｌとなるようにした。マイクロカプセルを水中に均等に分散さ せた後、画像分析装置を用いて実時間超音波スキャンを「捕らえて」、後方散乱 強度を測定した。 超音波装置は、ステンレス鋼製反射装置(reflector)、およびATS Laboratorie s Inc．、ブリッジポート、ＣＴ０６６０８、米国から供給されるシリコーンゴ ムブロックを模した一連の増加するエコー反射(echoreflective)組織に関して較 正した。較正曲線を引いた後、以下において測定したVideo Display Unitsの測 定値を、生成した較正曲線からｄＢに変換して戻した。分析は３回繰り返し、平 均強度測定値を算出した。 ヒト血清アルブミンマイクロカプセルのタンパク質含量は、改良Kjeldahl法を 用いて測定した。この分析法では、マイクロカプセルの試料の窒素含量を測定し た後、これを総タンパク質濃度によって計算し、この結果から一定数のマイクロ カプセルのタンパク質、特にエコー源性分析に加えた試料のタンパク質含量を計 算することができる。 マイクロカプセルを、過酸化水素によって酸化される試料に含まれる炭水化物 と共にTecator Digestion System 12を用いて消化した。総てのタンパク質、従 って含まれている窒素を消化中に硫酸アンモニウムに転換する。次に、これを、 アルカリ性条件下で蒸気蒸留によってアンモニアに転換される。遊離したアンモ ニアを凝縮して、ホウ酸に吸収させ、吸収量を塩酸で滴定することによって測定 する。この手順は、Kjeltec Auto 1030分析装置を用いて自動的に行なった。適 当な標準品を用いて、試料に含まれるタンパク質の量を計算することができる。 総タンパク質分析から、エコー源性試験セルに加えたタンパク質の量を測定し た。投与したマイクロカプセルの数は添加したタンパク質の重量、従って測定し たマイクロカプセルμｇ／ｍｌ当たりのエコー源性として計算した。 例６： 無傷のガス含有粒子の数を最大にするための噴霧乾燥条件の最適化 本発明者らは、上記にエコーコントラスト画像形成に使用する滑らかで、球状 かつ中空の微粒子の製造を記載している。６μｍを上回る粒子の数をできるだけ 少なくし、ガス含有中空粒子の数をできるだけ多くすることが望ましい。一連の 実験を、例１に記載した条件下で行ない、無傷の球状粒子の収率に対する液体供 給速度の影響を検討した。本発明者らは、液体供給速度を増加すると、初期の噴 霧乾燥の際に形成される無傷のマイクロカプセルの数が減少することを見いだし た（表４）。液体流速度を４から１６ｍｌ／分まで増加させると、平均粒度およ び全般的圧力安定性、すなわち殻の厚さは変化しないが、総エコー源性は変化す る。本発明者らは、（高い液体流速で）蒸発速度を遅くすると、無傷のガス含有 粒子の形成が少なくなることを見いだしている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，Ｂ Ｙ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ， ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ (72)発明者 ジョンソン，リチャード アラン イギリス国ノッティンガム、ウェスト、ブ リッジフォード、ケンブリッジ、ロード、 15

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． (i)材料を水性溶媒に溶解した溶液を準備し、(ii)この溶液をガス中に 噴霧して、水性溶媒が蒸発するようにすることによって、中空マイクロカプセル を形成させることを含むマイクロカプセルの形成法であって、水溶液が水より揮 発性の大きな液体を含むことを特徴とする、方法。 ２． 揮発性液体の沸点が大気圧で２０℃〜１００℃の間にある、請求項１に 記載の方法。 ３． 揮発性液体がエタノールまたはメタノールである、請求項１に記載の方 法。 ４． 揮発性液体が水溶液の０．１〜８０．０％（容量／容量）である、請求 項１〜３のいずれか１項に記載の方法。 ５． 揮発性液体が水溶液の５．０〜３０．０％（容量／容量）である、請求 項４に記載の方法。 ６． 材料がタンパク質である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。 ７． タンパク質がアルブミン、コラーゲンまたはゼラチンである、請求項６ に記載の方法。 ８． タンパク質がアルブミンである、請求項７に記載の方法。 ９． 溶液中の材料濃度が１．０〜２５．０％（重量／容量）である、請求項 １〜８のいずれか１項に記載の方法。 １０． 溶液中の材料濃度が５．０〜１５．０％（重量／容量）である、請求 項９に記載の方法。 １１． 溶液がＸ線コントラスト剤または磁気共鳴画像形成コントラスト剤を 更に含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。 １２． マイクロカプセルを使用前に更に加工処理たとえば熱処理を行ってマ イクロカプセルを更に不溶化するか、または放射線を照射してマイクロカプセル を殺菌する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。 １３． 方法を、滅菌した静脈内注射可能な生成物を生成するように行なう、 請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。 １４． 請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法によって製造されるマイ クロカプセル。 １５． 請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法によって得ることができ るマイクロカプセル。 １６． 中空マイクロカプセルを含んでなる超音波コントラスト剤であって、 マイクロカプセルが、２０℃の脱気した水に懸濁して１３．０μｇ／ｍｌの均質 なマイクロカプセル濃度を得るとき、３．５ＭＨｚの超音波に対する反射率が少 なくとも−１．０ｄＢであることを特徴とする、超音波コントラスト剤。 １７． 密封したバイアル瓶中に請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の殺 菌した乾燥マイクロカプセルを含んでなる医薬組成物。 １８． 殺菌した静脈内注射可能な媒質中に懸濁した請求項１４〜１６のいず れか１項に記載の殺菌したマイクロカプセルを含んでなる医薬組成物。 １９． ヒトまたは動物の患者の部分の画像を提供する方法であって、(i)請 求項１４〜１６のいずれか１項に記載のマイクロカプセルを患者に導入し、(ii) 患者に放射線を照射し、(iii)患者の前記部分におけるマイクロカプセルの反射 率、透過度または共鳴に基づいて画像を形成することを特徴とする、方法。