JPH09509063A - 鎖形成による標的配列との連鎖能を有する環化用核酸プローブ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、試料を検出可能なプローブと接触させて、プローブを標的配列にハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしたプローブを検出することによる試料中の標的核酸配列の検出方法に関する。該方法は、ａ）標的配列の２つの少なくとも実質的に隣接する領域に相補的であり、該領域にハイブリダイズする能力を有する２つの遊離核酸末端部分を有する検出可能なプローブを準備し、ｂ）ハイブリダイジング条件下、該プローブ末端を標的配列にハイブリダイズさせ、ｃ）ハイブリダイズしたプローブの末端をお互いに共有連結させて、鎖形成により標的分子と連鎖する環化した構造を形成し、ｄ）標的配列を非ハイブリダイジング条件および／またはエキソヌクレアーゼ活性に付して、標的配列から環化プローブを取り出し、これにより、標的分子に結合した環状プローブだけを保持し、ｅ）所望により、工程ｂ）〜ｄ）を１回以上繰り返し、ｆ）標的核酸配列の存在の表示として残存プローブの存在、および、所望によりその位置を検出する工程からなる。本発明は、当該方法で使用するための検出試薬またはプローブおよびキットに関するものでもある。

Description

【発明の詳細な説明】 鎖形成による標的配列との連鎖能を有する環化用核酸プローブ 本発明は、特定の核酸配列の新規検出方法ならびにそのための検出試薬および キットに関する。 別々のＤＮＡ分子を連結することができる酵素の単離は、組換えＤＮＡ技術の 研究にとって重要であった。これらの酵素、いわゆるリガーゼを用いると、異な るゲノムから誘導された遺伝素子を微生物中で一緒に発現させることができる。 リガーゼ補助反応（ligase-assisted reactions）は、遺伝子検出において増加 する役割を果たすようにもなった。かかる反応において用いられる原理は、並列 に位置した標的配列に相補的な２つのプローブセグメントが、ＤＮＡリガーゼの 作用により隣接プローブ配列に連結されるということてある。これは、単一プロ ーブの標的配列へのハイブリダイゼーションが遊離プローブ分子の除去後に検出 される、より慣用的な検出スキームとは対照的である。 リガーゼ補助検出法の１つのタイプは、ＵＳ−Ａ−４,９８８,６１７に開示さ れており、これは、配列の少なくとも１つの標的ヌクレオチド位置における既知 の起こり得る突然変異を有する核酸試験物質の領域において核酸配列を決定する ためのアッセイに関する。該アッセイは、２つのオリゴヌクレオチドプローブを 、すぐ隣りの、セグメント連結部の近くに起こり得る突然変異を含有する実質的 に相補的な試験ＤＮＡまたはＲＮＡ分子のセグメントとアニーリングさせ、連結 剤、通常、リガーゼを添加することからなる。該条件は、標的ヌクレオチドが正 しく塩基対合している場合、該プローブが共有的に連結し、セグメント連結部の 近くでミスマッチヌクレオチドのために正しく塩基対合していない場合、プロー ブがリガーゼによって共有的に連結されるのが不可能であるように選択される。 連結の存在または不在は、標的ヌクレオチドの配列の表示として検出される。 ＥＰ−Ａ−１８５ ４９４には、同様のリガーゼ補助検出法が開示されている 。しかしながら、この方法では、ライゲーション生成物の形成は、前記ＵＳ−Ａ − ４,９８８,６１７におけると同様に適正に機能するためのリガーゼについての連 結領域における正しい塩基の対合の必要条件よりも高いストリンジェンシー条件 下での２つの隣接プローブのハイブリダイゼーション能に左右される。リガーゼ 補助検出に関する他の文献は、例えば、ＥＰ−Ａ−３３０ ３０８、ＥＰ−Ａ− ３２４ ６１６、ＥＰ−Ａ−４７３ １５５、ＥＰ−Ａ−３３６ ７３１、ＵＳ− Ａ−４,８８３,７５０およびＵＳ−Ａ−５,２４２,７９４である。 他の分子遺伝的検出反応に比べてリガーゼベースの検出ストラテジーの重要な 利点は、少なくとも３つある： （ｉ） 該反応は、本質的に、非常に特異的である。ライゲーション反応は、 標的配列上の２つの異なるプローブ配列の同時発生（coincidence）に基づいて おり、これは、非ストリンジェント反応条件下でさえ適切な標的分子の不在下で 生じる見込みがない。この理由のために、該反応は、標準化された自動化スキー ムにおいて適当である。 （ii） 該ライゲーション反応を用いて、２つのプローブ間の連結部のすぐ周 囲の位置でハイブリダイゼーションの正確さを評価することができる。リガーゼ の基質要求のために、末端にミスマッチしたプローブは、実質的に減少した割合 で連結される。この方法では、対立遺伝子配列変異体を区別することができる。 （iii）ライゲーションの作用は、アッセイにおいて予め存在しない固有の分 子を生じる。この環境は、例えばライゲーション時に増加したハイブリダイゼー ション安定性を利用することによって、用いることができる。 ＪＰ−Ａ−４２６２７９９およびＪＰ−Ａ−４３０４９００には、共に、標本 試料中の標的核酸配列を検出するために増幅反応と組合せたライゲーション反応 の使用が開示されている。該方法は、リガーゼの存在下、該試料を、標的核酸配 列の存在の結果として環化される（cyclizedまたはcircularized）ように設計さ れた配列を有する直鎖状プローブポリヌクレオチトと接触させることからなる。 次いで、環化されたポリヌクレオチドが酵素的重合反応において鋳型として用い られる。環化されたプローブに少なくとも部分的に相補的であるプライマーを核 酸ポリメラーゼおよびヌクレオチド三リン酸と一緒に添加することによって、プ ローブに相補的であり、かつ、鋳型に少なくとも部分的に相補的な反復配列を有 する一本鎖核酸が形成される。次いで、増幅において取り込まれた標識核酸三リ ン酸を弁して、または、増幅産生物へのハイブリダイジング能を有する添加した 標識核酸プローブによって、増幅産生物が検出される。 この従来技術は、前記で検討されたように、自体高い特異性のために準備する リガーゼベースの検出工程からなり、該方法の特異性は、むしろ、増幅産生物の 発生および検出における特異性に左右されるであろう。 対照してみると、本発明は、環化可能なＤＮＡプローブの有効な特異性および 結合安定性が完全に利用されるプローブ環化に基づく方法を提供するものである 。 かくして、本発明の概念によると、有効な使用は、標的配列の存在下で環化さ れるように設計されたプローブが、標的含有核酸鎖、例えばＤＮＡまたはＲＮＡ の周囲で閉じられ、その結果、環状プローブが、検出されるべき標的核酸と連鎖 し（interlock）、これにより該標的核酸に有効に連結されるであろうという事 からなっている。すなわち、ＤＮＡなどの二本鎖核酸の螺旋性のために、環化さ れたプローブは、標的鎖の周囲で螺旋状をなし、「南京錠（padlock）」と同様 の方法で、連形成（catenation）によりプローブを標的分子に位相的に連結する であろう。プローブ分子の標的配列へのかかる共有的鎖形成により、厳しい洗浄 条件に耐えるハイブリッドが形成され、さらに以下に説明するような遺伝的アッ セイにおいて非特異的シグナルを減少させるのに供する。したがって、非特異的 方法でハイブリダイズするプローブは、標的を非ハイブリダイジング条件および ／またはエキソヌクレアーゼ活性に付すことによって有効に除去される。該環状 プローブが正確に検出可能であり、例えば、適当に標識されているという条件で 、該環状プローブが検出されて、標的分子の存在を示すことができる。該標的は 、増幅されないが、非特異的シグナルの有効な減少により非常に感度の良い検出 が可能である。 前記ストラテジーの変形例では、該プローブは、プローブ末端間に空間を持っ て標的配列にハイブリダイズするように設計され、空間を持って標的配列をハイ ブリダイズするように設計される少なくとも１つの他のまたは中間のプローブが 準備される。次いで、これらのプローブを相互連結させて、環化された分子を形 成する。 別の変形例では、該プローブは、プローブ末端間に１個〜数個のヌクレオチド の小さなギャップを持って標的配列にハイブリダイズするように設計される。次 いで、このギャップを、当該技術分野で自体公知であるように、プローブ末端を お互いに連結させる前に、例えばＤＮＡポリメラーゼによるような酵素補助伸長 反応によって充填する。かかるギャップが４つのヌクレオチド全てを含有するわ けではない場合、増加した特異性が得られることは容易に明らかである。 前記変形例は、共に、検出の増加した特異性を提供するであろう。 本発明のこの提案された方法は、前記の従来技術の方法よりも高い特異性を有 しているが、より容易に行われる。さらに、当該新規方法は、プローブ分子の一 部分のみが標的分子を有する剛直な二本鎖ＤＮＡ分子を形成するために必要であ るので、非常に短い合成プローブを用いてさえ行われるが、一方、プローブ分子 の残りは、非常に可撓性であり、所望により枝分かれしていてもよい一本鎖ＤＮ Ａまたは他のスペーサー物質である。対照するに、従来技術におけると同様に、 複製されるてあろうプローブは、１００ヌクレオチドより多くの長さを必要とし 、非ヌクオチドセグメントを有さず、かつ、分枝位置を有しないことを必要とす ると思われる。 したがって、本発明の１つの態様は、試料を検出可能なプローブと接触させて 、プローブを標的配列にハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしたプローブを検 出することによる試料中の標的核酸配列の検出方法であって、 ａ）標的配列の２つの少なくとも実質的に隣接する領域に少なくとも部分的に 相補的であり、かつ、該領域へのハイブリダイズ能を有する２つの核酸末端部分 を有する、所望により枝分かれしていてもよい検出可能なプローブを準備し、 ｂ）ハイブリダイジング条件下、該プローブを標的配列にハイブリダイズさせ 、 ｃ）ハイブリダイズしたプローブの末端をお互いに共有的に連結して、鎖形成 により標的分子と連鎖する環化した構造を形成し、 ｄ）標的配列を非ハイブリダイジング条件および／またはエキソヌクレアーゼ 活性に付して、環化したプローブを標的配列から取り出し、これにより、標的分 子に結合した環化したプローブだけを保持し、 ｅ）所望により、工程ｂ）〜ｄ）を１回以上繰り返し、 ｆ）標的核酸配列の存在の表示として残存プローブの存在、および、所望によ りその位置を検出すること からなることを特徴とする、試料中の標的核酸配列の検出アッセイ方法に関する 。 本発明の他の態様は、少なくとも１つの検出可能なタグで標識された中間部分 、ならびに環化した構造を形成するように標的核酸配列の２つの少なくとも実質 的に隣接する各領域に少なくとも部分的に相補的かつ該領域へのハイブリダイズ 能を有する２つの核酸末端部分を有する構築物からなる核酸検出薬、またはプロ ーブに関する。 好ましくは、該プローブは、約２００塩基（すなわち、ヌクレオチド）以上を 含有せず、例えば、約１０〜約１００塩基、好ましくは、約２０〜約１００塩基 を含有する。 該プローブは、完全にＤＮＡもしくはＲＮＡまたは類似体からなるが、しかし ながら、そのハイブリダイジング末端だけが核酸または類似体からなることで充 分である。プローブ分子の残り、すなわち、中間部分は、他の所望の組成物を非 常によく有する。 該プローブ分子は、遊離していても固相に固定化されていてもよい。後者の場 合、本発明の方法は、溶液から標的核酸配列を選択的に単離するためにも用いら れる。これは、ＤＮＡまたはＲＮＡライブラリーをスクリーニングするためなど の調製的目的のために用いられる。 本発明のさらに別の態様は、前記核酸試薬、および標的配列へのハイブリダイ ゼーション後に該試薬末端をお互いに結合させ合うためのライゲート手段からな る、試料中の標的核酸配列の検出用キットに関する。 以下、添付図面を引用して、本発明をより詳細に説明する。 第１図は、本発明に従って、標的核酸配列にハイブリダイズされ、環化された プローブ系を示す略図である。 第２図は、標的配列に鎖形成した環化したプローブの略図である。 第３図は、２つのプローブからなる検出カセットの例示的な図である。 第４図は、単一のプローブからなる検出カセットの例示的な図である。 第５図は、本発明の方法に従った、および、他の条件下でのプローブの標的分 子へのハイブリダイゼーションの結果を示す４つのブロッティング膜の写真であ る。 第６図は、プローブとハイブリダイズし、種々の条件下で処理した標的分子を 有する８つのブロッティング膜を示す第５図と同様の写真である。 第７図は、環化可能なプローブ、または該環化可能なプローブの各ハイブリダ イジング末端セグメントに対応する２つの直線プローブとハイブリダイズした４ つのブロッティング膜の写真である。 第８図は、第６図において用いられたプローブが、第６図における標的分子の 制限フラグメントに環化されたブロッティング膜の写真である。 第１図では、プローブ１およびプローブ３と記される、検出薬の２つの末端セ グメントを介して、ＤＮＡ鎖などの標的核酸配列にハイブリダイズした本発明の 検出薬を示し、該プローブ１および３は、標的分子の２つの各非隣接配列に相補 的である。プローブ２と記されるさらなるプローブは、プローブ１およびプロー ブ３に並列に位置するプローブ末端を用いて標的分子の中間セグメントにハイブ リダイズされる。図示したケースでは、検出薬は、任意のスタビライザー配列に よって安定化されて、プローブ１およびプローブ３の末端が直接お互いに接触す るのを防止する。該プローブ間の検出試薬のセグメントは、フルオロフォアなど の少なくとも１つの検出可能な素子を含んでもよい。 プローブ１、２および３が標的分子にハイブリダイズした後またはそれと同時 に、該プローブ末端は、お互いに連結して、例えば、リガーゼによってライゲー トされて、共有的に閉じられた環状分子を形成する。リガーゼの例は、Ｔ４ Ｄ ＮＡリガーゼ、Ｔ７ ＤＮＡリガーゼ、イー・コリ（Ｅ.coli）ＤＮＡリガーゼ、 およびサーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）ＤＮＡリガーゼであ る。かかる共有的閉鎖の別の方法は、例えば、リボゾームおよび化学的結合で ある。検出薬の長さおよびプローブセグメントの合わせた長さを適当に選択する ことによって、形成された分子円は、標的分子の周囲に巻き付き、該分子と連結 するであろう。次いで、円形化された分子は、標的分子の周囲で螺旋状をなし、 連鎖するであろう。環化した分子は、ハイブリダイズした非環化プローブを放出 または分解する条件下でも標的分子に連結されたままであり、これにより、選択 的に検出可能であり、試料中の標的分子の存在を示すであろう。これにより、不 適切な配列への起こり得るハイブリダイゼーションの影響は、完全に除去される であろう。 ハイブリダイズしているが環化していないプローブを変性または分解する条件 としては、熱、アルカリ、他の変性薬またはエキソヌクレアーゼ活性が挙げられ 、後者は、環化されないプローブの遊離末端を攻撃する。 中間プローブ２は、特異性の観点から優れているが、かかる中間プローブは、 重要ではなく、本発明の方法は、該中間プローブなしで容易に行われ、すなわち 、プローブ１および３は、標的分子上で端と端をつないでハイブリダイズするよ うに設計され、これにより、これらの２つの末端がライゲートして、検出薬を環 化する。 後者の単一プローブのケースは、第２図に示されており、これは、直線プロー ブＰを示し、その末端は、標的配列鎖Ｓの隣接領域に相補的であり、その結果、 それらは、お互いに並列に位置した標的配列にハイブリダイズする。隣接するプ ローブ末端は、リガーゼなどによってジャンクションＴでお互いに結合して、プ ローブＰを環化する。図面から判明するように、ＤＮＡなどの二本鎖核酸の螺旋 性により、プローブのハイブリダイジング部分は、標的鎖の周囲で螺旋状をなし 、これにより、標的鎖に確実に結合され、相補的ＤＮＡ鎖間での塩基の対合を妨 害する条件でさえ除去することができない。記号Ｆは、例えばフォトダイオード またはＣＣＤ検出器などの当該技術分野で知られている好適な検出手段によって 連鎖プローブを検出させるプローブＰ上のフルオロフォアなどの標識を示す。 検出シグナルは、環化工程およびデハイブリダイジングエ程を１回以上繰り返 すことによって増加する。これにより、一方では、対立遺伝子特異的プローブは 、 確実に、標的分子上にあり、そこでライゲートするであろうし、他方では、環化 プローブがデハイブリダイジング工程の間に分子に沿ってある程度動くかまたは さまよい、標的配列を非環化プローブによって新たなハイブリダイゼーションに 利用可能にするので、ある条件下で、ますます、プローブが標的分子上で連続的 に連鎖されることが可能である。環化したプローブのかかる多導入について、も ちろん、標的配列は、標的分子の末端から充分な距離、通常、標的配列が支持体 に結合するかおよび如何に結合しているかに依存して、最も近い末端から少なく とも約２００塩基対であることが必要である。標的配列が溶液中で遊離している 場合、特に長期変性洗浄の場合、長い距離が必要とされる。 ハイブリダイジング条件下で慣用的標識直鎖プローブを検出するよりも、標的 を非ハイブリダイジング条件に付した後に共有的に閉じられた環状分子を検出す る方が優れている点は、２、３ある。第１に、末端にミスマッチしたプローブは 、リガーゼに対して乏しい基質であるので、ライゲーション反応は、全ゲノムＤ ＮＡにおいて単一の合成プローブ分子を用いて検出の顕著な特異性を提供する。 第２に、プローブが標的配列の周囲を回転するかまたは該標的配列と鎖形成し、 標的配列に共有的に連結され、これにより、変性に対して実質的に鈍感になる。 さらに、検出試薬の末端は、洗浄において補助するかまたは洗浄に取って代わる エキソヌクレアーゼ消化に対して利用可能ではなくなる。第３に、１つの分子上 に２つの末端プローブ配列が同時に存在することは、ハイブリダイゼーション工 程で速度的な利点を与える。最後に、対立遺伝子配列変異体は、リガーゼによっ て区別することができる。 検出試薬は、例えば、５’−リン酸化オリゴヌクレオチドである。しかしなが ら、既に前記したとおり、真のプローブセグメントがヌクレオチドまたはＰＮＡ （ペプチド核酸）などの所望により機能的に類似した構築物からなり、一方、既 に前記したとおり、中間体セグメントが全体的または部分的に例えばペプチドま たはタンパクから選択された残基、炭水化物または他の天然もしくは合成ポリマ ーを含む他の化学的組成物を有することは、本発明の目的に対して充分である。 非ヌクレオチド性質を有するかかる中間構築物は、標識またはタグの導入の安定 性および容易さに関して好ましく、また、非ヌクレオチド中間構築物が二次構造 を示さないか、またはミスハイブリダイゼーションの原因とならないので好まし い。 用いる場合、スタビライザー配列は、４０または５０ヌクレオチドのようなプ ローブの合計と同一の長さを有するのが好ましい。次に、第１図に示す湾曲した 、例えば３ヌクレオチドのオーダーのセグメントを必要とするであろう。 プローブ配列の合計の長さは、鎖が１０または１０塩基の倍数離れて同一面上 で二重螺旋のままであるようなものが好ましい。１０塩基は、ＤＮＡ二重螺旋の 約１回転を表す。 検出試薬は、遊離分子であっても、または、支持体に固定化されていてもよい 。 ＤＮＡまたはＲＮＡであって、検出されるべき特異的配列を含有する標的核酸 分子は、環化されたプローブが標的分子と連鎖するかまたは鎖形成することを必 要とする二重螺旋を確実に形成できるように充分な長さを有する。標的分子は、 遊離分子であるが、検出試薬が遊離分子である場合、標的分子は、支持体に固定 化されるのが好ましい。プローブおよび標的分子が共に遊離分子である場合、標 的分子を用いるプローブ環化および鎖形成は、例えば、電気泳動的分離によって 、または、安定な複合体の形成を検出するための当該技術分野において自体公知 である他の技術によって検出される。ハイブリダイゼーションにおいて、標的分 子は、一本鎖形態で提供されるのが好ましい。 第３図および第４図は、本発明の検出試薬からなる「検出カセット」の２つの 特定の実施例を示す。第３図では、検出試薬は、中間１７−ｍｅｒと一緒に環化 されるべき安定化した９２−ｍｅｒであり（第１図におけると同様）、一方、第 ４図では、検出試薬は、端と端をつないで環化されるべき７０−ｍｅｒである。 標識またはタグは、例えば、フルオロフォア、色素、酵素、発光体、放射性標 識または親和性基などの、当該技術分野で慣用的に用いられるものである。プロ ーブが枝分かれの位置を含有する場合、検出可能な基は、環化プローブから突出 している枝に結合するのが好都合である。核酸分枝の場合、かかる枝は、検出可 能な基を環化された分子に鋳型依存性で高特異性でかつ共有的に付加させるであ ろう。 本発明の検出試薬および方法の使用により、組織切片における、または、細胞 学的調製物における、ならびに分裂中期もしくは細胞分裂間期染色体におけるin situでの標的配列が検出される。高い特異性のために、空間的な情報を保存し 、対立遺伝子配列変異体の間で分別する能力を有する多くの標的配列が同時に分 析される。したがって、本発明の方法は、染色体または染色糸のレベルで診断的 スクリーニングのために有用であろう。増加したシグナルは、検出可能な分子の 、結合したプローブのリンカーセグメントへの二次的ライゲーションによって得 られる。 前記のとおり、発明の概念は、特定の標的配列を有するクローンを単離するた めに、核酸ライブラリーをスクリーンする調製的目的のためにも用いられる。こ のために、検出試薬またはプローブは、膜などの固相に固定化される。該プロー ブは、例えば、第一アミンで修飾されたヌクレオチド炭素（Ｃ）残基が間に入っ たエチレングリコール残基のもののような、第一アミン基を含有する非ヌクレオ チドセグメントによって分離された２つの標的相補性領域からなる。プローブ上 のこれらのアミノ基は、膜と反応し、高い密度で共有結合する。 標的相補性領域についてスクリーンされるべき核酸ライブラリーは、Ｍ１３ベ クターにおいて、または環状プラスミドとして挿入体を刺激させるプラスミドも しくはファファージミド（phagemid）ベクターにおいて、クローン化されたＤＮ Ａである。 一本鎖または二本鎖環状分子のかかるライブラリーをスクリーンするために、 該ライブラリーをプローブ含有膜と一緒にインキュベートし、洗浄後、特異的に ハイブリダイズしたプローブ末端をライゲートする。非特異的に結合した分子を 除去する非常にストリンジェントな洗浄の後、プローブの１本の腕を、例えば酵 素的に切断し、次の変性工程で標的配列含有分子を放出する。標的配列含有分子 が一本鎖化されると、これらは、例えば、プライマー、Ｔ７ポリメラーゼおよび Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて溶液中で修復され、次いで、これを用いて、細菌 を形質転換する。次いで、これらの細菌は、特異的な標的配列を増殖するであろ う。 本発明で用いられる環化可能な試薬またはプローブが全ヒトＤＮＡにおける固 有の配列の位置を検出するのに充分な特異性を提供し、それらが非常に小さな標 的配列を認識するという事実により、非増幅ゲノムＤＮＡ分子の性質の研究が可 能になり、悪性化の研究に関係するメチル化などの特性の検出を可能にする。 本発明は、以下の限定されない特定の実施例によって、単なる例として、説明 されるであろう。 実施例１ Ｍ１３ｍｐ１８ポリリンカーの検出 市販のＤＮＡシンセサイザーを用いて、以下の配列：５’Ｐ−ＴＧＧ ＴＧＴ ＴＴＣ ＣＴＡ ＴＧＡ（ＴＴＣ^*ＴＴ）₁₀ＡＡＧ ＡＡＡ ＴＡＴ ＣＡＴ ＣＴＴ −ＯＨ３’（ここで、Ｃ^*は、ヘキサメチレンジアミン連鎖を介してビオチニル 化されたシトシン残基である）を有するオリゴヌクレオチドを合成した。該オリ ゴヌクレオチドの２つの末端は、一本鎖の環状バクテリオファージＭ１３ｍｐ１ ８のポリリンカーを用いてお互いに隣接して塩基対合する能力を有していた。 前記オリゴヌクレオチド０.１pmolを、１０μl中に５mＭ ＡＴＰ、Ｏne-Ｐhor -Ａllバッファー（１０mＭ トリス−Ａc、pＨ７.５、１０mＭ Ｍg（Ａc）₂、５ ０mＭ ＫＡc；ファルマシア・エルケイビー・バイオテクノロジー・アクチボラ ゲット（Ｐharmacia ＬＫＢ Ｂiotechmology ＡＢ）、スウェーデン国ウプサラ ）１μl、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（５Ｕ／μl、ファルマシア・エルケイビー・バ イオテクノロジー・アクチボラゲット）１μlを含有する溶液中０．３６pmolで 添加したＭ１３ｍｐ１８のポリリンカーにハイブリダイズさせた。一晩インキュ ベートした後、非ハイブリダイジング条件下で洗浄を行い、放射性標識の存在を 検出して、オリゴヌクレオチドが一本鎖Ｍ１３分子に強く連結していることが判 明した。 実施例２ ＣＦ突然変異デルタ５０８の検出 Ａ．慣用の方法で、ＣＦ突然変異デルタ５０８またはこの配列の正常な変異株 を含むＤＮＡフラグメントをｐＵＣ１９ベクター中でクローン化させた。得られ た２つの組換えプラスミドを、ドット当たり３５ngのブラスミド（正常または突 然変異株）ならびに膜ストリップ当たり２つのドット、すなわち、正常なＤＮＡ についてのドットおよび突然変異ＤＮＡについてのドットの慣用のドット−ブロ ット法によって、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨと記した４つの膜ストリップに結合させた 。膜の上に沸騰水を注ぎ、最終濃度０.１％までＳＤＳを添加することによって 、該膜を洗浄した。次いで、該膜を１０分間放置し、次いで、該膜を、リン酸塩 緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中、室温で１０分間すすいで、膜に固定化されなか ったプラスミドを除去した。 自体慣用的な方法で、スペーサーセグメントを含有し、以下の配列を有する３ ０ntのビオチン標識オリゴヌクレオチドプローブを調製した：５’Ｐ−ＴＧＧ ＴＧＴ ＴＴＣ ＣＴＡ ＴＧＡ−Ｘ−ＡＡＧ ＡＡＡ ＴＡＴ ＣＡＴ ＣＴＴ ３’ （ここで、Ｘは、結合構造−（ＰＥＧ）₂−ＣＢ−（ＰＥＧ）₂−ＣＢ−（ＰＥＧ ）₂−ＣＢ−（ＰＥＧ）₂−ＣＢ−（ＰＥＧ）₂−であり、ここで、ＰＥＧは、ポ リエチレングリコール残基を表し、ＣＢは、シー・サンド（Ｃ.Ｓund）ら［Ｎuc leos.Ｎucleot.７、６５５（１９８８）］によって開示されているようなビオチ ン残基がビオチン−ＮＨＳエステル［クローンテク・ラボラトリーズ（Ｃlonete ch Ｌaboratories）］によってカップリングされるアミノ機能（ＮＨ₂）を有す る炭素（Ｃ）残基を表す）。 （Ｔetrahedron Ｌett.）３４（２）、３０１−４（１９９３）］によって開示 されているようなＰＥＧホスホルアミダイト法を用いて、オリゴヌクレオチド合 成の間に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）残基を導入した。該分子を、酵素 Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによって分子の５’−末端に³²Ｐ基を付加するこ とによって放射性標識化した。 プローブのＤＮＡ末端を、１００ｂｐ標的正常配列を用いて端と端をつないで 塩基対合するように設計した。対照的に、突然変異標的は、プローブセグメント のジャンクションに対応して３つのヌクレオチドを欠いており、これらの酵素的 連結を支持していない。該プローブ１５pmolを、５００μg／mlの一本鎖プラス ミドＤＮＡ（サケ精子ＤＮＡ）、５ ｘ ＳＳＰＥ（１ ｘ ＳＳＰＥ＝１８０mＭ ＮaＣl、１０mＭ ＮaＨ₂ＰＯ₄、１mＭ ＥＤＴＡ、pＨ７.４）、および５ ｘ デ ンハート（Ｄenhardt）ブロッキング溶液［マニアティス（Ｍaniatis）ら、モレ キュラー・クローニング；ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍolecular Ｃlonin g；Ａ Ｌaboratory Ｍanual）、コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Ｃo ld Ｓpring Ｈarbour Ｐress）１９８２に定義されている］を含有する５００μ lの容量の水中で３０分間、標的配列とハイブリダイズさせた。 ０.２Ｍ ＮaＣl、１mＭ ＡＴＰ、１ ｘ Ｏne-Ｐｈor-Ａllバッファー［ファル マシア・エルケイビー・バイオテクノロジー・アクチボラゲット］、および０. １５Ｕ／μl Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ［ファルマシア・エルケイビー・バイオテク ノロジー・アクチボラゲット］の５００μl中、膜ストリップＥおよびＧを用い てライゲーションを行った。 次いで、膜ストリップＧおよびＨを１mlの１ ｘ ＳＳＰＥ、２％ＳＤＳ中で３ ０分間洗浄し、一方、膜ストリップＥおよびＦを５００μlの０.２Ｍ ＮaＯＨで ５分間処理して、ＤＮＡを変性させた。次いで、膜を１mlの１ ｘ ＳＳＰＥ、２ ％ＳＤＳ中で３０分間洗浄し、次いで、０.１μg／５００μlのストレプトアビ ジン−ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート［シグ マ（Sigma）］をも含有する溶液（５ ｘ ＳＳＰＥ、５ ｘ デンハート・ブロッ キング溶液）中に５分間浸漬した。ＰＢＳ中で３０分間すすいだ後、膜を、溶液Ｂ ［アマーシャム（Ａmersham）、イギリス国］と混合したＥＣＬ溶液Ａの溶液 中に１分間おき、次いで、３ＭＭ紙上で数秒間放置して乾燥させた。次いで、膜 をプラスチックフィルム中におき、Ｘ−ｏｍａｔ−Ｓフィルム上におき、１秒間 −１分間曝露した。結果を第５図に示す。ここで、該図面において、正しい標的 配列についてのドットは、右であり（Ｎと記す）、突然変異配列についてのドッ トは、左である（Ｍと記す）。 第４図から、非変性洗浄条件下で処理された膜ストリップ（ストリップＧおよ びＨ）上で、標的配列の両方の対立遺伝子変異体がリガーゼ処理されたか否かを 検出したことが判明する。 しかしながら、膜をアルカリ変性剤で洗浄すると、唯一の正しいシグナル、す なわち、正常なＤＮＡの検出が得られたが（リガーゼ処理膜Ｅ）、一方、リガー ゼを添加しなかった場合、アルカリ処理後に標的配列も検出されなかった（膜Ｆ ）。 かくして、リガーゼの添加によるハイブリダイゼーションおよび変性剤による 洗浄により、望ましい、すなわち、正常なＤＮＡ配列だけが確実に検出された。 Ｂ．３５ngプラスミドの２つのドット（正常または突然変異体）を用いて８つ の膜ストリップ（番号１−８）を調製し、実質的に前記に従って、種々のハイブ リダイジング／洗浄条件に付した。膜１−５を、各々、１、５、１０および１５ pmolのプローブとハイブリダイズさせ、次いで、膜５以外をリガーゼで処理し、 ５分間、０.２Ｍ ＮaＯＨで洗浄した。膜６−８を全て、１５pmolのプローブと ハイブリダイズし、リガーゼで処理し、次いで、各々、異なる薬物、すなわち、 沸騰している０.５ ｘ ＳＳＰＥ（６）、沸騰している０.１％ＳＤＳ（７）また は０.２Ｍ ＮaＯＨ（８）で洗浄した（１０分間）。結果を第５図に示す。ここ で、正しい標的配列についてのドット（Ｎ）は、図面の右側のものであり、一方 、突然変異標的配列についてのドット（Ｍ）は、左側のもののである。 第６図に示すとおり、検出は、膜をアルカリまたは沸騰ＳＤＳで洗浄した場合 、リガーゼ依存性であるが、一方、非ストリンジェント洗浄（膜６）は、正しく ない標的配列にハイブリダイズしたプローブを除去しなかった。 Ｃ．各々、正常なプラスミドドットおよび突然変異プラスミドドットを用いて ４つの膜ストリップを調製し、前記セクションＡで調製したビオチン標識プロー ブ（ストリップ１および２）およびプローブの２つのオリゴヌクレオチドセグメ ントに対応する２つの線状プローブ（ストリップ３および４）とハイブリダイズ させた。次いで、膜ストリップ１および３をリガーゼで処理し、次いで、全ての 膜を０.２Ｍ ＮaＯＨで洗浄した。結果を第６図に示す。「Ｎ」および「Ｍ」は 、各々、正常なプラスミドおよび突然変異プラスミドを記す。第７図から明らか なように、洗浄後、リガーゼ処理した環化されたプローブだけが膜上に残存した 。 実施例３ 標的配列から標的分子の末端までの距離の効果 実施例２における標的分子を、制限酵素によって、分子末端から、各々、約８ ５０、６５０、５５０および２００塩基対の距離にある標的配列を有するフラグ メントに切断した。実施例２Ａに記載したと同様の場合、プラスミドをナイロン 膜上に固定化し、実施例２における環化可能なオリゴヌクレオチドとのハイブリ ダイゼーションによってプローブし、ライゲーション工程に付すかまたは付さず 、次いで、０.２Ｍ ＮaＯＨにおける変性洗浄に付した。結果を第８図に示す。 ここで「∞」は、切断されなかった分子を示し、「Ｎ」および「Ｍ」は、各々、 正常なプラスミドおよび突然変異プラスミドを示す。結果は、標的分子の末端ま での距離が約２００塩基対より小さい場合、環化されたプローブは、洗浄工程の 間に標的分子から滑り落ちる傾向にあるであろう。 本発明は、もちろん、前記に詳細に説明した、および図面に示された具体例に 制限されるものではなく、多くの変形および変更は、以下の請求の範囲に定義さ れたような本発明の概念の範囲内で行われることができる。

───────────────────────────────────────────────────── 【要約の続き】 ある。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．試料を検出可能なプローブと接触させて、該プローブを標的配列にハイブ リダイズさせ、ハイブリダイズしたプローブを検出することによる試料中の標的 核酸配列の検出方法であって、 ａ）標的配列の２つの少なくとも実質的に隣接する領域に少なくとも部分的に 相補的であり、かつ、該領域にハイブリダイズする能力を有する、２つの遊離核 酸末端部分を有する検出可能なプローブを準備し、 ｂ）ハイブリダイジング条件下、プローブ末端を標的配列にハイブリダイズさ せ、 ｃ）ハイブリダイズしたプローブの末端をお互いに共有連結させて、鎖形成に より標的分子と連鎖する環化した構造を形成し、 ｄ）標的配列を非ハイブリダイジング条件および／またはエキソヌクレアーゼ 活性に付して、環化プローブを標的配列から取り出し、これにより、標的分子に 結合した環化プローブだけを保持し、 ｅ）所望により、工程ｂ）〜ｄ）を１回以上繰り返し、 ｆ）標的核酸配列の存在の表示として、残存プローブの存在、および、所望に よりその位置を検出すること からなることを特徴とする、試料中の標的核酸配列の検出方法。 ２．プローブが、標的分子にハイブリダイズしてプローブ末端間に空間を残す ように設計され、該空間おいて標的分子にハイブリダイズするように設計される 少なくとも１つのさらなるプローブが準備され、ハイブリダイズしたプローブが 共有的に相互連結される請求項１記載の方法。 ３．プローブが、標的分子にハイブリダイズして隣接するプローブ末端間に少 なくとも１つの小さなギャップを残すように設計され、該ギャップが、プローブ 末端を共有的に相互連結する前に、伸長反応によって充填される請求項１または ２記載の方法。 ４．プローブ末端の共有連結が酵素的、リボザイム媒介または化学的ライゲー ション、好ましくは酵素的ライゲーションによって行われる請求項１、２または ３記載の方法。 ５．標的分子がＤＮＡまたはＲＮＡ配列である請求項１〜４のいずれか１項記 載の方法。 ６．プローブがオリゴヌクレオチドである請求項１〜５のいずれか１項記載の 方法。 ７．プローブが、スタビライザーオリゴヌクレオチド配列の、プローブの中間 セグメントへのハイブリダイゼーションによって安定化される請求項６記載の方 法。 ８．プローブが核酸以外の組成物を有する中間セグメントからなる請求項１〜 ５のいずれか１項記載の方法。 ９．中間セグメントがタンパク、ポリペプチド、炭水化物および合成ポリマー 残基から選択される請求項８記載の方法。 １０．プローブが約１０〜約２００塩基の全長を有する請求項１〜９のいずれ か１項記載の方法。 １１．標的配列が一本鎖形態である請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法 。 １２．プローブが固相に固定化される請求項１〜１１のいずれか１項記載の方 法。 １３．標的配列が固相に固定化される請求項１〜１０のいずれか１項記載の方 法。 １４．試料がＤＮＡライブラリーであり、検出工程が、固定化された環化プロ ーブを切断し、プローブ／標的ＤＮＡ複合体を変性条件に付して、標的ＤＮＡ分 子を放出させ、次いで、標的ＤＮＡ分子を用いて細菌を形質転換することからな る請求項１３記載の方法。 １５．環化され、かつ、標的配列と鎖形成することができるように標的核酸配 列の２つの少なくとも実質的に隣接する個々の領域と少なくとも部分的に相補的 であり、かつ、該領域にハイブリダイズする能力を有する２つの遊離核酸末端部 分を有する構築物、ならびに、クロモフォア、フルオロフォア、発光体、放射性 標識、親和性基および酵素から選択される少なくとも１つの検出可能な素子で標 識された中間部分からなる核酸検出試薬。 １６．構築物が、例えば、タンパク、ポリペプチド、炭水化物および合成ポリ マー残基から選択されるような核酸以外の組成物の中間セグメントからなる請求 項１５記載の試薬。 １７．請求項１５または１６記載の試薬、ならびに、標的配列へのハイブリダ イゼーション後に試薬末端をお互いに連結させるためのライゲート手段からなる 標的核酸配列検出用試薬キット。 １８．標的核酸配列の固体支持体への選択的捕捉方法であって、 ａ）標的配列の２つの少なくとも実質的に隣接する領域に少なくとも部分的に 相補的であり、該領域にハイブリダイズする能力を有する２つの遊離核酸末端部 分を有するプローブを準備し（ここで、該プローブは、固体支持体に固定化され ている）、 ｂ）ハイブリダイジング条件下、プローブ末端を標的配列にハイブリダイズさ せ、 ｃ）ハイブリダイズしたプローブの末端をお互いに共有連結させて、鎖形成に より標的分子と連鎖する環化した構造を形成し、 ｄ）捕捉された標的配列を有する支持体を非ハイブリダイジング条件に付して 、鎖形成していない標的配列を支持体から取り出し、所望により、 ｅ）プローブを、該プローブのハイブリダイゼーションに関係しない一部分に おいて切断して、標的分子を放出させること からなる標的核酸配列の固体支持体への選択的捕捉方法。