JPH09510618A - 真菌類におけるリボフラビン生合成 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、真菌類アシュビア・ゴシッピイにおけるリボフラビン生合成のための遺伝子、およびこの遺伝子および遺伝子生産物を使用することによりリボフラビンを製造するための遺伝子工学的方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 真菌類におけるリボフラビン生合成 本発明は、真菌類におけるリボフラビン生合成のための遺伝子、それによって コード化されたタンパク質ならびにこの遺伝子および遺伝子生産物を使用するこ とによりリボフラビンを製造するための遺伝子工学的方法に関する。 真菌類、例えばエレモテシウム・アシュビイイ（Eremothecium ashbyii）また はアシュビア・ゴシッピイ（Ashbya gossypii）の発酵によるリボフラビンの製 造は、開示された（The Merck Index，Windholz他、Merck & Co.編、第１１８３ 頁（１９８３））。 欧州特許第４０５３７０号明細書には、枯草菌Bacillus subtilisからのリボ フラビン生合成遺伝子の形質転換によって得られた、リボフラビンを過剰生産す る菌株が記載されている。 細菌類と真核生物におけるリボフラビン生合成の遺伝学は、異なるものである ので、枯草菌からの上記遺伝子は、アシュビア・ゴシッピイのような真核生産体 の生物体を使用することによりリボフラビンを製造するための組換え方法には不 適当である。 酵母菌のサッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）のリボ フラビン生合成遺伝子のク ローン化は、１９９２年１１月１９日付けでドイツ特許庁に出願された１つの特 許明細書中に記載された。 しかし、常用のハイブリッド化法によってサッカロミセス・セレビシアエrib 遺伝子を使用することによりアシュビア・ゴシッピイリボフラビン生合成遺伝子 をクローン化することは、不可能であり；明らかにサッカロミセス・セレビシア エとアシュビア・ゴシッピイからのrib遺伝子の相同性は、ハイブリッド化に十 分である程大きくはなかった。 本発明の目的は、こうして真核生産体の生物体中でリボフラビンを製造するた めの組換え方法を得るために、真核生物からリボフラビン生合成遺伝子を単離す ることである。 この目的は、ＧＴＰから出発するリボフラビン生合成の酵素をコード化する子 嚢菌類のアシュビア・ゴシッピイ中に見い出される６個の遺伝子（rib遺伝子） の単離によって達成されることが見い出された。 本発明は、次のＤＮＡ配列に関する： ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコー ド化するか或いは本質的にポリペプチドの酵素活性を減少させることなしに、１ 個またはそれ以上のアミノ酸が欠失され、他のアミノ酸が添加されたかまたは他 のアミノ酸によって代替されたＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２で示されるポリペプチド の同族体もしくは誘導体をコード化するＤＮＡ配列。 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：４で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコー ド化するか或いは本質的にポリペプチドの酵素活性を減少させることなしに、１ 個またはそれ以上のアミノ酸が欠失され、他のアミノ酸が添加されたかまたは他 のアミノ酸によって代替されたＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：４で示されるポリペプチド の同族体もしくは誘導体をコード化するＤＮＡ配列。 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：６で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコー ド化するか或いは本質的にポリペプチドの酵素活性を減少させることなしに、１ 個またはそれ以上のアミノ酸が欠失され、他のアミノ酸が添加されたかまたは他 のアミノ酸によって代替されたＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：６で示されるポリペプチド の同族体もしくは誘導体をコード化するＤＮＡ配列。 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：８で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコー ド化するか或いは本質的にポリペプチドの酵素活性を減少させることなしに、１ 個またはそれ以上のアミノ酸が欠失され、他のアミノ酸が添加されたかまたは他 のアミノ酸によって代替されたＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：８で示されるポリペプチド の同族体もしくは誘導体をコード化するＤＮＡ配列。 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１０で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコ ード化するか或いは本質的にポリペプチドの酵素活性を減少させることなしに、 １個またはそれ以上のアミノ酸が欠失され、他のアミ ノ酸が添加されたかまたは他のアミノ酸によって代替されたＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ：１０で示されるポリペプチドの同族体もしくは誘導体をコード化するＤＮＡ配 列。 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコ ード化するか或いは本質的にポリペプチドの酵素活性を減少させることなしに、 １個またはそれ以上のアミノ酸が欠失され、他のアミノ酸が添加されたかまたは 他のアミノ酸によって代替されたＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１２で示されるポリペプ チドの同族体もしくは誘導体をコード化するＤＮＡ配列。 遺伝子およびその遺伝子生産物（ポリペプチド）は、一次構造が列記されてい る配列で示されかつ以下のように指定されている： ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： １：ｒｉｂ １ 遺伝子 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ２：ｒｉｂ １ 遺伝子生産物（ＧＴＰシクロヒドロラ ーゼＩＩ） ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ３：ｒｉｂ ２ 遺伝子 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ４：ｒｉｂ ２ 遺伝子生産物（ＤＲＡＰデアミナーゼ ） ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ５：ｒｉｂ ３ 遺伝子 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ６：ｒｉｂ ３ 遺伝子生産物（ＤＢＰシンターゼ） ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ７：ｒｉｂ ４ 遺伝子 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ８：ｒｉｂ ４ 遺伝子生産物（ＤＭＲＬシンターゼ） ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ９：ｒｉｂ ５ 遺伝子 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１０：ｒｉｂ ５ 遺伝子生産物（リボフラビンシンター ゼ） ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１１：ｒｉｂ ７ 遺伝子 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１２：ｒｉｂ ７ 遺伝子生産物（ＨＴＰレダクターゼ） グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）は、ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ（ｒｉｂ１ 遺伝子生産物）によって２，５−ジアミノ−６−リボシルアミノ−４（３Ｈ）− ピリミジノン５−リン酸に変換される。その後に、この化合物は、ｒｉｂ７遺伝 子生産物によって２，５−ジアミノリビチルアミノ−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ピ リミジン５−リン酸に還元され、次いでｒｉｂ２遺伝子生産物によって５−アミ ノ−６−リビチルアミノ−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ピリミジンジオンに脱アミノ される。その後に、ｒｉｂ４遺伝子生産物によって触媒される１つの反応におい て、Ｃ４化合物ＤＢＰは、添加され、その結果６，７−ジメチル−８−リビチル ルマジン（ＤＭＲＬ）が生じ、このＤＭＲＬからｒｉｂ５遺伝子生産物によって 触媒される反応においてリボフラビンが製造される。Ｃ４化合物ＤＢＰ（Ｌ−３ ，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン４−リン酸）は、ｒｉｂ３遺伝子生産物によ って触媒される反応におい てＤ−リブロース５−リン酸から形成される。 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１、３、５、７、９、１１に記載されたＤＮＡ配列は、 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２、４、６、８、１０、１２に記載されたポリペプチドを コード化する。 また、配列表に記載されたものは別として、適当なＤＮＡ配列は、遺伝子コー ドの縮重の結果として、１つの異なるＤＮＡ配列を有しているがしかし同じポリ ペプチドをコード化するものである。 また、本発明は、遺伝子生成物がなお本質的に配列表に記載された遺伝子生成 物と同じ生物学的性質を有している限り配列表に詳説されたもの以外の一次構造 を有する１つの遺伝子生成物（ポリペプチド）をコード化するようなＤＮＡ配列 に関する。生物学的性質とは、殊にリボフラビンの生合成を引き起こす酵素活性 を意味する。 本質的に同じ生物学的性質を有するこのように修飾された遺伝子生成物は、１ つまたはそれ以上のアミノ酸またはペプチドの欠失または付加によって得ること ができるかまたは他のアミノ酸によるアミノ酸の代替によって得ることができる か、或いはアシュビア・ゴシッピイ以外の有機体から単離されることができる。 修飾された遺伝子生成物をコード化するＤＮＡ配列は、概して配列表に示され たＤＮＡ配列をもって８０％またはそれ以上の程度の相同性を有している。この ようなＤＮＡ配列は、例えば常用のハイブリッド化法またはアシュビア・ゴシッ ピイ以外の真核生物からのＰＣＲ技術を用いてＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１、３、５ 、７、９、１１に記載されたＤＮＡ配列から出発して単離されることができる。 これらのＤＮＡ配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１、３、５、７、９、１１に記載 されたＤＮＡ配列で標準条件下にハイブリッド化する。 標準条件とは、例えば０．１〜１×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ：ＮａＣｌ ０．１５ モル、クエン酸ナトリウム１５ミリモル、ｐＨ７．２）の濃度を有する緩衝水溶 液中の４２〜５８℃の温度を意味する。ＤＮＡハイブリッド化のための実験条件 は、遺伝子工学の教科書、例えばサムブルック（Sambrook）他著、“モレキュラ ー・クローニング（Molecular Cloning）”，Cold Spring Harbor Laboratory， １９８９に記載されている。 また、本発明は、適当なポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列の５′方向の 上流に位置している制御配列、殊にプロモーター配列にも関する。この制御配列 は、配列表に記載されかつ以下に詳説されている。 ｒｉｂ１遺伝子のための制御配列： ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１ ヌクレオチド１〜２４２ ｒｉｂ２遺伝子のための制御配列： ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３ ヌクレオチド１〜４５０ ｒｉｂ３遺伝子のための制御配列： ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：５ ヌクレオチド１〜３１４ ｒｉｂ４遺伝子のための制御配列： ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：７ ヌクレオチド１〜２７０ ｒｉｂ５遺伝子のための制御配列： ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：９ ヌクレオチド１〜５２４ ｒｉｂ７遺伝子のための制御配列： ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１１ ヌクレオチド１〜３５２ 制御配列は、機能の点で無視してよい減少を伴って５′および／または３′の 方向で端が切り取られていてもよい。 制御作用について本質的なものは、概して上記の配列範囲からの３０〜１００ 、有利に４０〜７０のヌクレオチドの断片である。 また、この制御配列は、天然の配列を比較して直接的な突然変異誘発によって 機能の点で最適化されることもできる。 本発明による制御配列は、アシュビア・ゴシッピイ中の遺伝子、殊にリボフラ ビン生合成を確実なものにする遺伝子の過剰表現に適している。 また、本発明は、本発明によるＤＮＡ配列１個またはそれ以上を含有する表現 ベクターに関する。このような表現ベクターは、本発明によるＤＮＡ配列に適当 な機能的制御信号を供給することによって得られる。このような制御信号は、表 現を確実なものにするＤＮ Ａ配列、例えばプロモーター、オペレーター、エンハンサー、リボソーム結合部 位であり、かつ宿主有機体によって認められかつ宿主有機体に従うものである。 また、例えば宿主有機体中の組換えＤＮＡの複製または組換えを制御する他の 制御信号を表現ベクターに充当することも可能である。 本発明は、同様に本発明によるＤＮＡ配列または表現ベクターで形質転換され た宿主有機体にも関する。真性有機体は、有利に宿主有機体、特に好ましくはサ ッカロミセス（Saccharomyces）属、カンディダ（Candida）属、ピキア（Pichia ）属、エレモテシウム（Eremothecium）属またはアシュビア（Ashbya）属のもの が宿主有機体として使用される。特に好ましい種は、サッカロミセス・セレビシ アエ、カンディダ・フラベリ（Candida flaveri）、カンディダ・ファマタ（Can dida famata）、エレモテシウム・アシュビイイ（Eremothecium ashbyii）およ びアシュビア・ゴシッピイである。 また、本発明は、リボフラビンを製造するための組換え方法を包含し、この場 合には、本発明による形質転換された宿主有機体を常法で発酵によって培養し、 発酵の間に生産されたリボフラビンを発酵媒体から単離し、必要に応じて精製す る。 ｒｉｂ遺伝子および遺伝子生成物は、実施例中および配列表中に記載されたよ うに単離されかつ特性決定 されることができる。 例１ アシュビア・ゴシッピイのリボフラビン生合成遺伝子の単離（ｒｉｂ遺伝子） ａ．アシュビア・ゴシッピイｃＤＮＡバンクの構成 ＹＥＰＤ媒体上での培養後の後期対数増殖期でリボフラビンを過剰生産する菌 株のアシュビア・ゴシッピイＡＴＣＣ１０１９５のミセリウム（mycelium）から ＲＮＡを完全に抽出した（Sherman他、“Methods in yeast genetics”，Cold S pring Harbor，New York，1989）。 オリゴ（ｄＴ）セルロース上での吸着およびオリゴ（ｄＴ）セルロースからの 溶出によってポリ（Ａ）⁺ＲＮＡを２回精製した（AvivおよびLeder，Proc．Natl ．Acad．Sci．USA 69，1972，1408〜1412）。ｃＤＮＡをグブラー（Gubler）お よびホフマン（Hoffmann）の一般的な方法（Gene 25，1983，263）によって単離 し、合成ＥｃｏＲＩアダプターを平滑断端を有するｃＤＮＡ分子の端部に添加し た。その後に、ＥｃｏＲＩでの切断後のｃＤＮＡ断片をＴ４ポリヌクレオチドキ ナーゼを使用することによりリン酸化し、ＥｃｏＲＩで切断された脱リン酸化ベ クターｐＹＥｕｒａ３にクローン化した。ｐＹＥｕｒａ３（Clonetech Laborato ries，Inc.，California）は、ガラクトース誘発性ＧＡＬ１およびＧＡＬ１０プ ロモーターならびにＵＲＡ 、ＣＥＮ４およびＡＲＳ１を含有する１つの酵母表現ベクターである。この酵母 要素は、酵母細胞中でクローン化されたＤＮＡ断片の形質転換および表現を可能 にする。 連結反応からのアリコートを高度に受容能のある（Hanahan，DNA Cloning，D. M．Glover編；IRL Press，Oxford 1985，109）大腸菌ＸＬ１−ブルー（Bullock 他、Biotechniques 5（1987）376〜378）を形質転換するために使用し、形質転 換体をアンピシリン耐性に基づいて選択した。 アンピシリン耐性細胞約３×１０⁵を合わせ、かつ増幅させ、プラスミドＤＮ Ａを該細胞から単離した（BirnboimおよびDoly，Nucleic Acids Res．7，1979， 1513）。 ｂ．リボフラビン生産酵素をコード化するアシュビア・ゴシッピイｃＤＮＡクロ ーンの単離 リボフラビン生産酵素をコード化するアシュビア・ゴシッピイからのｃＤＮＡ クローンをリボフラビン生合成に包含されるサッカロミセス・セレビシアエ突然 変異体の機能的相補によって単離した。 菌株ＡＪ８８（Mata leu2 his3 rib::URA3 ura3-52）、ＡＪ１１５（Matalpha leu2 inos1 rib2::URA3 ura3-52）、ＡＪ７１（Matalpha leu2 inos1 rib3::UR A3 ura3-52）、ＡＪ１０６（Matalpha leu2 inos1 rib4::URA3 ura3-52）、ＡＪ ６６（Mata canR inos1 ri b5::URA3 ura3-52）およびＡＪ１２１（Matalpha leu2 inos1 rib7::URA3 ura3- 52）は、サッカロミセス・セレビシアエにおけるリボフラビン生合成に包含され る６個の遺伝子（rib1〜rib5およびrib7）の中の１個を破壊することによって生 産された突然変異菌株である。 これらの菌株をそれぞれアシュビア・ゴシッピイｃＤＮＡバンクからのｃＤＮ Ａ２５μｇで形質転換し、かつリボフラビンなしにガラクトース含有媒体上に置 いた。約１週間の増殖後、ｒｉｂ＋形質転換体を培養皿から分離した。 それぞれ形質転換された突然変異体（Rib1⁺，Rib2⁺，Rib3⁺，Rib4⁺，Rib5⁺お よびRib7⁺）からの１つの突然変異体をそのつど分析し、全ての場合にＲｉｂ⁺表 現型はガラクトース媒体中でのみ表現され、グルコース媒体中では表現されない ことを見い出した。 この結果は、Ｒｉｂ⁺表現型がプラスミド上に位置したガラクトース誘発性Ｇ ＡＬ１０プロモーターの制御下に表現されることを証明している。 プラスミドＤＮＡを大腸菌の形質転換によるＲｉｂ１⁺、Ｒｉｂ２⁺、Ｒｉｂ３⁺ 、Ｒｉｂ４⁺、Ｒｉｂ５⁺およびＲｉｂ７⁺の突然変異体から単離し、かつｐＪＲ ７１５、ｐＪＲ６６９、ｐＪＲ７８８、ｐＪＲ７３３、ｐＪＲ６８１およびｐＪ Ｒ８２７と呼称した。 前記プラスミド中に存在するｃＤＮＡ挿入断片の部 分配列により、このｃＤＮＡ挿入断片がサッカロミセスからのｒｉｂ遺伝子生産 物のタンパク質に類似しているタンパク質をコード化することが確認された。 ｃ．リボフラビン生産酵素をコード化するアシュビア・ゴシッピイのゲノムクロ ーンの単離 アシュビア・ゴシッピイのリボフラビン生産遺伝子のゲノムコピーを単離する ために、アシュビア・ゴシッピイＡＴＣＣ １０１９５のゲノムバンクをコスミ ド超Ｃｏｓ１（Stratagene Cloning Systems，California）中で構成させ、かつ アシュビア・ゴシッピイのｒｉｂ１、ｒｉｂ２、ｒｉｂ３、ｒｉｂ４、ｒｉｂ５ およびｒｉｂ７の遺伝子のｃＤＮＡコピーから誘導された³²Ｐ標識化された試料 を用いてスクリーニングした。 ｒｉｂ１、ｒｉｂ２、ｒｉｂ３、ｒｉｂ４、ｒｉｂ５およびｒｉｂ７のＤＮＡ を有するコスミドクローンをコロニーハイブリッド化によって単離した（Gruste inおよびHogness，Proc．Natl．Acad．USA 72，1975，3961〜3965）。更に、同 じｒｉｂ特異性ｃＤＮＡ試料を使用することにより酵素的に切断されたコスミド ＤＮＡのサザン分析により、アシュビア・ゴシッピイのｒｉｂ１、ｒｉｂ２、ｒ ｉｂ３、ｒｉｂ４、ｒｉｂ５およびｒｉｂ７の遺伝子を含有する定義された制限 断片を同定することができた。 ３．１ｋｂの長さでありかつＧＴＰシクロヒドラー ゼＩＩをコード化するアシュビア・ゴシッピイの完全ｒｉｂ１遺伝子を含有する ＢａｎＨＩ−ＣｌａＩ ＤＮＡ断片を見い出した。この断片をアガロースゲルか ら単離し、ＢａｍＨＩおよびＣｌａＩで切断されたｐブルースクリプトＫＳ（＋ ）ファージミド（phagemid）にクローン化し、こうしてプラスミドｐＪＲ７６５ を得た（図２）。 １３２９ｂｐの長さでありかつ５′−非コード化領域の９０６ｂｐ、２４２ｂ ｐおよび３′−非コード化領域の１８１ｂｐのｒｉｂ１開放読み枠を含有するＤ ＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１）を得た。 ＤＲＡＰデアミナーゼをコード化する完全アシュビア・ゴシッピイｒｉｂ２遺 伝子を、３．０ｋｂの長さでありかつｐブルースクリプトＫＳ（＋）にクローン 化されプラスミドｐＪＲ７５８を生じるＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ断片上に見い出し た（図３）。 ｒｉｂ２の開放読み枠１８３０ｂｐ、５′−未翻訳領域４５０ｂｐおよび３′ −未翻訳領域３４７ｂｐを有するＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ挿入断片からの長さ２６ ２７ｂｐの領域を配列した（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３）。 ＤＢＰシンターゼをコード化する完全アシュビア・ゴシッピイｒｉｂ３遺伝子 を、１．５ｋｂの長さでありかつｐブルースクリプトＫＳ（＋）にクローン化さ れプラスミドｐＪＲ７９０を生じるＰｓｔＩ−Ｈｉｎ ｄＩＩＩ断片上に見い出した（図４）。 ｒｉｂ３の開放読み枠６３９ｂｐ、５′−未翻訳領域３１４ｂｐおよび３′− 未翻訳領域１２９ｂｐを有するＰｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ挿入断片からの長さ１ ０８２ｂｐの領域を配列した（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：５）。 ＤＭＲＬシンターゼをコード化するアシュビア・ゴシッピイｒｉｂ４遺伝子を 、３．２ｋｂの長さでありかつｐブルース・クリプトＫＳ（＋）にクローン化さ れプラスミドｐＪＲ７６２を生じるＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ断片上に見い出した（図 ５）。 ｒｉｂ４の開放読み枠５１９ｂｐ、５′−未翻訳領域２７０ｂｐおよび３′− 未翻訳領域２０７ｂｐを有するＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ挿入断片からの長さ９９６ｂ ｐの領域を配列した（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：７）。 リボフラビンシンターゼをコード化する完全アシュビア・ゴシッピイｒｉｂ５ 遺伝子を、２．５ｋｂの長さでありかつｐブルースクリプトＫＳ（＋）にクロー ン化されプラスミドｐＪＲ７３９を生じるＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ断片上に見い出し た（図６）。 ｒｉｂ５の開放読み枠７０８ｂｐ、５′−未翻訳領域５２４ｂｐおよび３′− 未翻訳領域２７９ｂｐを有するＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ挿入断片からの長さ１５１１ ｂｐの領域を配列した（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：９）。 最後に、ＨＴＰレダクターゼをコード化するアシュ ビア・ゴシッピイｒｉｂ７遺伝子を、４．１ｋｂの長さでありかつｐブルースク リプトＫＳ（＋）にクローン化されプラスミドｐＪＲ８４５を生じるＥｃｏＲＩ −ＥｃｏＲＩ断片上に見い出した（図７）。 ｒｉｂ７の開放読み枠７４１ｂｐ、５′−未翻訳領域３５２ｂｐおよび３′− 未翻訳領域５０３ｂｐを有するＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ挿入断片からの長さ１５ ９６ｂｐの領域を配列した（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１１）。 例２ アシュビア・ゴシッピイｒｉｂ遺伝子のｍＲＮＡ分析 ｒｉｂ特異性転写物を同定するためにノーザン分析を実施した。全ＲＮＡを例 １の記載と同様にアシュビア・ゴシッピイ菌株ＡＴＣＣ １０１９５から単離し た。菌株からのＲＮＡ試料（５μｇ）をアガロースホルムアルデヒドゲル０．８ ％上での電気泳動法によってＲＮＡサイズマーカーと一緒に分別し、かつ真空中 でナイロン膜上でブロットした（Thomas，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，77，19 80，5201〜5205）。 ナイロン膜を４２℃で５×ＳＳＣ中でホルムアミド５０％の存在下に³²Ｐ−標 識化されたｒｉｂ特異性ＤＮＡ試料を用いて別個にハイブリッド化した。アシュ ビア・ゴシッピイｒｉｂ１遺伝子をヌクレオチド約１１５０個の独特のメッセー ジとして表現し、これをプラスミドｐＪＲ７６５からの長さ０．７ｋｂのＳｍａ Ｉ−ＳａｃＩ試料によって双方の菌株中で検出した（図８）。 同様に、独特のヌクレオチドの長さ１９００個のｒｉｂ２、ヌクレオチドの長 さ９００個のｒｉｂ３、ヌクレオチドの長さ８００個のｒｉｂ４、ヌクレオチド の長さ１０５０個のｒｉｂ５およびヌクレオチドの長さ１０００個のｒｉｂ７の 転写物を、ｐＪＲ７５８からの長さ０．５ｋｂｐのＳｍａＩ−ＳｍａＩ断片、ｐ ＪＲ７９０からの長さ０．６ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＫｐｎＩ断片、ｐＪＲ７ ３９からの長さ０．５ｋｂｐのＳｃａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片およびｐＪＲ８４ ５からの長さ０．３ｋｂｐのＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ断片を特異的試料として使用す ることによりブロットして検出した。 例３ サッカロミセス・セレビシアエにおけるアシュビア・ゴシッピイｒｉｂ遺伝子の 表現 例１と同様にして、補足的アシュビア酵素をコード化するプラスミドを存在さ せる場合にリボフラビンなしに培地上でのリボフラビン生合成の１つの段階では 不完全である、十分に研究されたサッカロミセス・セレビシアエの突然変異体を 増殖させることは、可能である。アシュビア・ゴシッピイｒｉｂ遺伝子生成物の 機能を試験するために、フラビンを生産する酵素活性を、表現プラスミドのｐＪ Ｒ７１５、ｐＪＲ６６９、 ｐＪＲ７８８、ｐＪＲ７３３、ｐＪＲ６８１およびｐＪＲ８２７の１つを存在さ せるサッカロミセス・セレビシアエ突然変異体からの細胞不含の抽出液中で測定 した。 ｐＹＥｕｒａ３から誘導されかつ例１に記載されている前記プラスミドは、ガ ラクトース誘発性のＧＡＬ１０プロモーターの制御下にアシュビア・ゴシッピイ ｒｉｂ特異性ｃＤＮＡ断片を含有する。 サッカロミセス・セレビシアエからの細胞不含タンパク質抽出液を、液状媒体 中でＯＤ約２の光学密度に増殖した培養液から得た。 細胞を収集し、冷たいトリスＨＣｌ ２０ミリモル、ｐＨ７．５で洗浄し、か つフェニルエチルスルホニルフルオリド１ミリモルで補足された同じ緩衝液中に 再懸濁させた。 細胞溶解物をガラス玉の存在下での渦動および３０００ｇおよび４℃で２０分 間の遠心分離によって調製した。 ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ、ＤＲＡＰデアミナーゼ、ＤＢＰシンターゼ、 ＤＭＲＬシンターゼ、リボフラビンシンターゼおよびＨＴＰレダクターゼ酵素の 活性を刊行物の記載と同様にして測定した（Shavlovsky他、Arch．Microbiol．1 24，1980，255〜259; Richter他、J．Bacteriol．175，1993，4045〜4051; Klei nおよびBacher，Z．Naturforsch．35b，1980，482〜4 84; Richter他、J．Bacteriol．174，1992，4050〜4056; Nielsen他、J．Biol． Chem．261，1986，3661; PlautおよびHarvey，Methods Enzymol．18B，1971，51 5〜538; HollanderおよびBrown，Biochem．Biophys．Res．Commun．89，1979，7 59〜763; Shavlovski他、Biochim．Biophys．Acta，428，1976，611〜618）。 タンパク質をピーターソン（Peterson）法によって定量化した（Anal．Bioche m．83，1977，346〜356）。第１表から明らかなように、プラスミドｐＪＲ７１ ５は、サッカロミセス・セレビシアエ突然変異体ＡＪ８８中でＧＴＰシクロヒド ロラーゼＩＩ活性の表現を引き起こす。更に、この活性は、ガラクトース媒体上 で増殖した細胞中にのみ存在し、このことは、アシュビア・ゴシッピイのｒｉｂ １ｃＤＮＡ表現がガラクトース誘発性のＧＡＬ１０の制御下に生じることを示す 。 それ故、この結果は、ｒｉｂ１がアシュビア・ゴシッピイ中のＧＴＰシクロヒ ドロラーゼＩＩをコード化することを証明する。同様に、前記真菌類において、 ｒｉｂ２はＤＲＡＰデアミナーゼをコード化し、ｒｉｂ３はＤＢＰシンターゼを コード化し、ｒｉｂ４はＤＭＲＬシンターゼをコード化し、ｒｉｂ５はリボフラ ビンシンターゼをコード化し、かつｒｉｂ７はＨＴＰレダクターゼをコード化す ることが示された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 9/06 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 9/14 Ｃ１２Ｒ 1:865） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＣＮ，ＪＰ，ＲＵ，Ｕ Ｓ (72)発明者 マリア アンヘレス サントス ガルシア スペイン国 エ−37009 サンタ マルタ ヴェルサリェス ７

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２で示されるアミノ酸配列（ＧＴＰシクロヒドロラ ーゼＩＩ）を有するポリペプチドをコード化するか或いは本質的にポリペプチド の酵素活性を減少させることなしに、１個またはそれ以上のアミノ酸が欠失され 、他のアミノ酸が添加されたかまたは他のアミノ酸によって代替された ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２で示されるポリペプチドの同族体もしくは誘導体をコード化す るＤＮＡ配列、この場合ポリペプチドの同族体または誘導体のＤＮＡ配列は、少 なくとも８０％程度がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１と類似している。 ２．ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：４で示されるアミノ酸配列（ＤＲＡＰデアミナーゼ ）を有するポリペプチドをコード化するか或いは本質的にポリペプチドの酵素活 性を減少させることなしに、１個またはそれ以上のアミノ酸が欠失され、他のア ミノ酸が添加されたかまたは他のアミノ酸によって代替された ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：４で示されるポリペプチドの同族体もしくは誘導体をコード化するＤＮＡ 配列、この場合ポリペプチドの同族体または誘導体のＤＮＡ配列は、少なくとも ８０％程度がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３と類似している。 ３．ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：６で示されるアミノ酸配 列（ＤＢＰシンターゼ）を有するポリペプチドをコード化するか或いは本質的に ポリペプチドの酵素活性を減少させることなしに、１個またはそれ以上のアミノ 酸が欠失され、他のアミノ酸が添加されたかまたは他のアミノ酸によって代替さ れた ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：６で示されるポリペプチドの同族体もしくは誘導体 をコード化するＤＮＡ配列、この場合ポリペプチドの同族体または誘導体のＤＮ Ａ配列は、少なくとも８０％程度がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：５と類似している。 ４．ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：８で示されるアミノ酸配列（ＤＭＲＬシンターゼ） を有するポリペプチドをコード化するか或いは本質的にポリペプチドの酵素活性 を減少させることなしに、１個またはそれ以上のアミノ酸が欠失され、他のアミ ノ酸が添加されたかまたは他のアミノ酸によって代替された ＳＥＱ ＩＤ Ｎ ｏ：８で示されるポリペプチドの同族体もしくは誘導体をコード化するＤＮＡ配 列、この場合ポリペプチドの同族体または誘導体のＤＮＡ配列は、少なくとも８ ０％程度がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：７と類似している。 ５．ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１０で示されるアミノ酸配列（リボフラビンシンタ ーゼ）を有するポリペプチドをコード化するか或いは本質的にポリペプチドの酵 素活性を減少させることなしに、１個またはそれ以上のアミノ酸が欠失され、他 のアミノ酸が添加されたかまたは他のアミノ酸によって代替された ＳＥＱ Ｉ Ｄ Ｎｏ：１０で示されるポリペプチドの同族体もしくは誘導体をコード化する ＤＮＡ配列、この場合ポリペプチドの同族体または誘導体のＤＮＡ配列は、少な くとも８０％程度がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：９と類似している。 ６．ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１２で示されるアミノ酸配列（ＨＴＰレダクターゼ ）を有するポリペプチドをコード化するか或いは本質的にポリペプチドの酵素活 性を減少させることなしに、１個またはそれ以上のアミノ酸が欠失され、他のア ミノ酸が添加されたかまたは他のアミノ酸によって代替された ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１２で示されるポリペプチドの同族体もしくは誘導体をコード化するＤＮ Ａ配列、この場合ポリペプチドの同族体または誘導体のＤＮＡ配列は、少なくと も８０％程度がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１１と類似している。 ７．請求項１から６までのいずれか１項に記載の１個またはそれ以上のＤＮＡ 配列を含有する表現ベクター。 ８．請求項７記載の表現系で形質転換された宿主有機体。 ９．リボフラビンを製造するための組換え法において、請求項８記載の宿主有 機体を使用することを特徴とする、リボフラビンを製造するための組換え法。