JPH09511494A - 超活性ｖｉｐアンタゴニスト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、血管作用性腸管ポリペプチド(VIP)の神経伝達、神経向性及び細胞分裂を媒介する多数のレセプタを識別するように設計された構造式（Ｉ）のVIPの拮抗作用をコードする一群のペプチドに関する。本発明は同様に、VIP 関連活性及び機能を拮抗するためにこれらのペプチドを使用する方法にも関する。本発明はさらに、VIP 関連活性を阻害するよう設計された薬学組成物にも関する。構造式（Ｉ）中、Ｒ¹及びＲ²は、そのうちの少なくとも１方が水素であることを条件として、水素、Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキル及びＣ₁〜Ｃ₂₀アシルから成るグループの中から独立して選択された１員であり；Ｘ¹及びＸ²は、天然に発生するアミノ酸及びアミノ酸擬似体から成るグループの中から独立して選択された一員である。

Description

【発明の詳細な説明】 超活性VIP アンタゴニスト 発明の分野 本発明は、一般に一群のポリペプチドに関する。より特定的には、本発明は、 血管作用性腸管ポリペプチド(VIP)のアンタゴニストである一群のポリペプチド に関する。さらに、本発明は、VIP 関連活性を阻害するためのこれらのポリペプ チドの使用に関する。 発明の背景 血管作用性腸管ポリペプチド(VIP)は、胃腸分泌、胃腸、血管及び呼吸器の平 滑筋の弛緩、脂肪細胞内の脂肪分解、脳下垂体ホルモンの分泌及び中枢神経系内 への注射後の興奮及び高体温を含めたさまざまな生理学的応答を媒介する広く分 布したペプチドホルモンである。（Snedecor and Cochran、統計的方法（Ames， Iowa；ISU Press，p508〜509(1967)）；Said，Gut Hormones（消化官ホルモン） 中(Bloom and Polak(編集)第２版、p379〜384、ニューヨーク；Churchill-Livin gston，Inc．(1981))。VIP は、170のアミノ酸残基から成るプレプロホルモンと して合成される（Cuttitta et al，J．Clin．Endo．Met.，67：576-583(1988)） 。アミド化されたＣ末端を伴う28のアミノ酸のペプチドであるVIP は、翻訳後処 理の結果得られるものである(Said & Mutt，Science，69．1217-1218(1970))。V IP ペプチドは、少なくとも２つの機能的領域すなわちレセプタ特異的結合に関 与する領域と生物活性に関与する領域を含んでいることが立証されてきた（Goze s and Brenneman、分子神経生物学、201-236(1989)）。 VIP のもう１つの生物学的機能は、中枢神経系(CNS)及び末梢神経におけるモ ジュレータ作用物質としてのものである(Said & Mutt，Science，69：1217-1218 (1970))。ラットの脳の中で、VIP はcAMPレベルを高め、皮質、線条、視床下部 、海馬、視床及び中脳の中のアデニル酸シクラーゼを刺激する。（Deschodt-Lan ckman，et al.，FEBS Lett.，83：76-80（1977）；Etgen and Browning，J．Neu rosci.，3：2487-2493；Kerwin，et al.，J．Pharm．Pharmacol.，32：561-566 （1980）；Quick，et al.，Biochem．Pharmacol.，27：2209-2213(1978)）。さ らにVIP は、陰茎勃起を媒介する神経伝達物質のためのいくつかの基準を満たし ている。これは、海綿状平滑筋及び血管を神経支配する神経繊維の中に存在し、 勃起中上昇する(Ottesen et al，Br．Med．J.，288：9（1984）；Dixon et al. ，J．Endocrinol.，100：249(1984))。外因性VIP の注射は、男性の勃起を誘発 し(Ottesen et al.，Br．Med．J.，288：9(1984))、陰茎レベルは、インポテン スの男性においては減少していることが立証されてきた（Gu et al.，Lancet，2 ；315(1984)）。VIP は、勃起形成において重要であると思われることから(Ande rson et al．J．Physiol.，350；209(1984))、その投与は、陰茎機能不全を緩和 する上で一助となるということがわかった（例えば、Gozes，et al.，Endocrlno logy，125（4）：2945-2949；U．S．特許 No．5,147,855 and U．S.特許 No．5, 217,953）。を参照のこと）。 VIP は同様に、哺乳動物の肺の中で生物学的に活性であり、肺の中でコリン作 動性神経細胞に同時に存在が特定されることがわかってきた(Shimosegawa et al .，Reg，Peptides，2：181(1989))。内因性VIP は、気道平滑筋ならびに腺に供 給する神経内及び正常な成人の肺内の肺血管の中に存在する（Ley，et al，Cell Tissue Re s.，220；238(1981)）。VIP は、肺の中で気管支拡張薬として機能する（Diamon d，et al.，Am．Rev．Respir．Dis.，128：827-832（1983）；Grssnburg，et al .，Thorox，40：715（1985）；Morice，et al.，Lancet，1：457-458(1984)）。 VIP は気管支ぜん息患者の気道内には欠如していることがわかっている(Lebacq- Uetheyden et al.，J．Cell．Biochem.，36：85-96(1988))。 VIP によりひき起こされた作用は、特異的レセプタによって媒介されうる。VI P レセプタは、当初、脳ホモジネートを用いてCNS 内で検出され（Robbere cht et al．Eur．J．Biochem.，90：147-154(1978)）、より最近では、オートラジオ グラフィ研究により大脳皮質、線条、視床下部の視索上核、松果体及び最後野と いった離散的脳部域にレセプタの存在が特定された。（Besson，et al.，Peptld es，5：339-340（1984）；DeSouza，et al.，Neloosci．Lett.，56：113-120（1 985）；Shaffer and Moody，Peptides，7：283-288(1986)）。VIP レセプタは同 様に、肝臓膜内(Bataille et al，Endocrinology(内分泌学)、95：713-721(1974 ))及びすい臓腺房細胞内（Christophe et al．J．Biol．Chem.，251：4629-4634 (1976)）でも特徴づけされた。 肺の中のVIP の生物学的作用は同様にラット、マウス、モルモット及びヒトの 肺から誘導された原形質膜を用いた結合検定において検出されたVIP レセプタに よっても媒介され得る（Christophe，et al.，Peptides，2：253-258（1981）； Dickinson，et al.，Peptides 7：791-800（1986）；Robberecht，et al.，Pepr ldes，4：241-250(1982)）。インビボオートラジオグラフィ技術及び肺切片を用 いて、VIP レセプタは、ラットの肺の肺胞及び上皮そしてヒトの肺の肺動脈平滑 筋及び肺胞壁に存在が特定された。（Leroux，et al.，Endocrinology，114：15 06-1512（1984）；Leys，et al.， FEBS Lett.，199：198-202(1984)）。肺のVIP レセプタは、架橋技術を用いて特 徴づけされ、67KDa という見かけの分子量を有することがわかった(Lebacq-Verh eyden et al.，Mol．Cell．Biol.，8：3129-3135(1988))。さらに、VIP が肺内 のアデニル酸シクラーゼ活性を正に調節することも実証されている（Oilerensha w et al.，N．Engl．J．Med.，320；1244-1248(1989)）。 最近、VIP レセプタが悪性肺（ガン）の中に存在することが確認された（Shaf fer et al.，ペプチド、8：1101-1106(1987)）。肺ガンは、米国で年間約15万人 を死に至らしめる重大な公衆衛生問題である（Minna et al.，「ガン：腫瘍学の 原則と実践」（De Uita，et al.(編)、p507〜599(1985)中）。従来、肺ガンは、 化学及び／又は放射線療法で治療されているが、新しい療法様式の開発に伴って 、より生存率を高めることが可能であるかもしれない。肺ガンは、肺ガン症例の 約25％を占める小細胞肺ガン（SCLC）と非小細胞肺ガン(NSCLC)に分けることが できる。NSCLC は、各々肺ガン症例の約25％を占める腺ガン、大細胞ガンそして 扁平上皮ガンにさらに細分することができる。SCLCは、自己分泌増殖因子として ボンベシン／ガストリン放出ペプチド（BN/GRP）を用いる(Cuttitta et al.，Na ture，316：828-825(1985))。かくしてSCLCはBN/GRPを合成し分泌し、BN又はGRP は細胞表面レセプタに結合し、SCLCの成長を刺激する。さらに、NSCLC は、形質 転換成長因子アルファ(すなわち TGF−alpha)を合成、分泌し、これは今度細胞 表面表皮成長因子（EGF）レセプタに結合し、NSCLC 成長を刺激する（Imanishi ，et al.，J．Natl．Cancer Inst.，81：220-223(1989)）。これとは対照的に、 VIP レセプタは、SCLC及び（全てNSCLC の一員である３つの主要なタイプの肺ガ ンすなわち大細胞ガン、扁平上皮細胞ガン及び腺ガンから誘導された細胞の中に 存在する（Shaffer et al.，ペ プチド、8：1101-1106(1987)）。 最近、Gozes et al が、血管作用性腸管ペプチドの機能を変えるために有用で あることが証明されたVIP アンタゴニストを開発した。このVIP アンタゴニスト は、そのレセプタに対するVIP の結合特性を保持するものの、他の因子の中でも 位置６のフェニルアラニン残基を必要とすると信じられている生物活性にとって 必要なアミノ酸配列が欠如するように設計されていた。未変性VIP のアミノ酸１ −６は、従って、未変性VIP の生物活性を変性し、ペプチドの膜透過性を変更す るためニューロテンシンの１セグメントによって置換された。ニューロテンシン 内に添加された６つのアミノ酸のうち３つが塩基性である。このことは、この領 域内で塩基性残基を全く含まずただ１つの酸性残基しか含んでいない未変性VIP とは好対照を成す。実際、両端に塩基性アミノ酸をもちＮ末端アミノ酸に隣接し てプロリン残基をもつテトラペプチドが膜透過性に対する高い活性にとって不可 欠であるという概念は、ニューロテンシン及びその他のペプチドについても正し いものであることが証明されてきた。このように、Gozes et al.により開発され たVIP アンタゴニストは、VIP レセプタ結合に必要なアミノ酸配列（すなわちVI P のアミノ酸７−28）及びニューロテンシンの一部に対応するＮ末端アミノ酸配 列を含むハイブリッド分子である。 研究により、このVIP アンタゴニストがVIP 関連活性を有効に拮抗することが 示された。より特定的に言うと、このVIP アンタゴニストが、哺乳動物の性的行 動に対するVIP の効果を阻害することがわかった（Gozes et al．Endocrinology ，125（4）：2945-2949；及び米国特許第5217953 号参照）。ハイブリッドVIP アンタゴニストが強力にVIP 結合(VIP自体よりも高い親和力での)を阻害し、VIP で刺激されるcAMPの蓄積を減衰させ、組織培養内での神経細胞の 死滅を誘発することも発見された。（例えばGozes et al.，J．Pharmacol．Exp ．Ther.，257（8）：959-966(1991)を参照のこと）。さらに、このVIP アンタゴ ニストが、例えば肺腫瘍細胞（すなわちNSCLC 細胞）といった腫瘍細胞を支持す るVIP レセプタの成長を阻害することも発見された（米国特許第5217953 号参照 ）。 このVIP アンタゴニストはVIP 関連活性を有効に拮抗するものの、Gozes et a l.によって開発されたVIP ハイブリッドアンタゴニストよりもさらに効力が高く かつ細胞内に存在するさまざまなVIP レセプタの間で弁別することのできるVIP アンタゴニストに対する必要性がなおも存在する。本発明はこのようなアンタゴ ニストを提供することによって、これらの必要性を軽減するものである。 発明の要約 本発明は、一群のポリペプチドに関する。より特定的に言うと、本発明は、血 管作用性腸管ポリペプチド(VIP)のアンタゴニストであってしかもR¹-Lys-Pro-Ar g-Arg-Pro-Tyr-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-X¹-Ala-X²-Lys-Lys- Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-AsnNH-R²。というアミノ酸配列を含むアンタゴニスト である一群のポリペプチドに関する。 上述の構造式中、Ｒ¹及びＲ²は、独立して選択され、そのうちの少なくとも１ 方が水素であることを条件として水素、Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキル及びＣ₁〜Ｃ₂₀アシル を含む（ただしこれに限られるわけではない）官能基であり得る。上述の構造式 内のＸ¹及びＸ²は、Ｘ²がメチオニンでないことを条件として、天然に発生する アミノ酸及びアミノ酸擬似体から成るグループの中から独立して選択される。 上述の構造式の範囲内で、或る種の血管作用性腸管ポリペプチド アンタゴニストが好まれる。すなわち、Ｒ¹がＨであり、Ｒ²がＨであり、Ｘ¹が ノルロイシン残基であり、Ｘ²がバリン残基であるアンタゴニストである（以下 「NL−ハイブリッドVIP アンタゴニスト」と呼ぶ）。同様に好まれるのは、Ｒ¹ がCH₃(CH₂)₁₆CO−；Ｒ²がＨ；Ｘ¹がノルロイシン残基；Ｘ²がバリン残基であるV IP アンタゴニストである（以下「SNL−ハイブリッドVIP アンタゴニスト」と呼 ぶ）。同様に好まれるのは、Ｒ¹がCH₃(CH₂)₁₆CO−；Ｒ²がＨ；Ｘ²がメチオニン 残基であり；Ｘ²がバリン残基であるVIP アンタゴニストである（以下「Ｓ−ハ イブリッドVIP アンタゴニスト」と呼ぶ。さらに同様に好まれるのは、Ｒ¹がＣ₁ 〜Ｃ₂₀アルキルであり、Ｒ²がＨで、Ｘ²がノルロイシン残基であり、Ｘ²がバリ ン残基であるVIP アンタゴニストである。ただし、Ｒ¹，Ｒ²，Ｘ¹及びＸ²は、本 発明のVIP アンタゴニストが Lys-Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-A rg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn。とい うアミノ酸配列以外を有するように選択されるということに留意すべきである。 本発明のVIP アンタゴニストは長さが比較的短かく、標準的には28アミノ酸以 下である。従って、溶液方法及び固相方法の両方を含め当業者には周知の数多く の化学的ペプチド合成技術のいずれかを使用してこのようなVIP アンタゴニスト を調製することが可能であり、中でも現在好まれているのは固相合成である。本 発明のVIP アンタゴニストは、好ましくは上述のもののような化学的ペプチド合 成を用いて調製されるが、当業者ならば、例えば組換え技術を含めたその他の手 段でこれらを調製することも可能であるということを理解するだろう。 VIP が、cAMP形成の刺激に結びつけられるものと神経細胞の生存の増大に関わ るものという、中枢神経系に特異的な２つの離散的結 合部位を介して作動する、ということが知られている。さらに特定的に言うと、 研究により、低親和力のアデニル酸シクラーゼ関連レセプタ及びVIP の生存促進 活性に関連する低発生量の高親和力レセプタの存在が示された。上述の神経細胞 生存検定及びVIP 誘発のcAMP形成検定の両方から、今や、本発明のVIP アンタゴ ニストがcAMP関連VIP レセプタと神経細胞生存関連VIP レセプタを識別すること ができるということが発見された。より特定的に言うと、NL−ハイブリッドVIP アンタゴニストがcAMP関連VIP レセプタと神経細胞生存関連VIP レセプタの両方 について親和力をもつことが発見された。同様に、Ｓ−ハイブリッドVIP アンタ ゴニスト及びＳ−NLハイブリッドVIP アンタゴニストがVIP の神経細胞生存促進 活性に関連するVIP レセプタに対しより高い親和力を有することも発見された。 さまざまなVIP レセプタを区別し弁別する能力をもつことから、本発明のVIP ア ンタゴニストは、CNS 中のVIP の生理学的機能及びその挙動に対する影響を詳述 するべくインビボ研究において使用することができる。 さらに、驚くべきことに、本発明のVIP アンタゴニストが、Gozes et al.によ って以前に開発されたVIP アンタゴニストよりも高いレベルで（すなわちより高 い効力で）VIP 関連活性を阻害することが発見された。より特定的に言うと、ハ イブリッドVIP アンタゴニストの位置17でのメチオニン残基がノルロイシン残基 で置換された場合、VIP 関連活性の阻害においてもとのハイブリッドVIP アンタ ゴニストよりも10倍も効力が高いVIP アンタゴニスト（すなわち「NL−ハイブリ ッドアンタゴニスト」）が産生されることが発見された。同様に、ハイブリッド VIP アンタゴニストのＮ末端にアシルラジカル（すなわち例えばステアリルラジ カルといったような脂肪親和性半分）が添加された場合、VIP 関連活性を阻害す る上でハイブ リッドVIP アンタゴニストよりも10倍も効力の高いVIP アンタゴニスト（すなわ ち「Ｓ−ハイブリッドアンタゴニスト」）が産生されるということも発見された 。その上、ハイブリッドVIP アンタゴニストの位置17のメチオニン残基がノルロ イシン残基で置換されさらにVIP アンタゴニストのＮ末端にアシルラジカル（す なわち脂肪親和性半分）が添加された場合、VIP 関連活性を阻害する上でハイブ リッドVIP アンタゴニストより1000倍も効力の高いVIP アンタゴニスト（すなわ ち「Ｓ−NL−ハイブリッドアンタゴニスト」）が産生されるということが発見さ れた。 かくして、本発明のVIP アンタゴニストは哺乳動物におけるVIP 関連活性を阻 害すなわち拮抗するのに使用することができる。従って、本発明は、哺乳動物に おけるVIP 関連活性を拮抗する方法において、拮抗作用をもたらすのに充分な量 の血管作用性腸管ポリペプチド(VIP)アンタゴニストを哺乳動物に投与する段階 を含んで成る方法であって、このアンタゴニストが R¹-Lys-Pro-Arg-Arg-Pro-Ty r-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-X¹-Ala-X²-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn- Ser-Ile-Leu-AsnNH-R²。というアミノ酸配列を含んでいる拮抗方法を提供する。 以上及び以下の両方で示すＲ¹，Ｒ²，Ｘ¹及びＸ²に関する論述は、本発明のこ の方法において使用されるVIP アンタゴニストにも充分に適用でき、従ってかか る論述はここでは繰返さない。 より特定的には、１つの態様で本発明は、腫瘍細胞を含むVIP レセプタの成長 を阻害する方法において、阻害をもたらすのに充分な量の血管作用性腸管ポリペ プチド(VIP)アンタゴニストと腫瘍細胞を接触させることを含む方法であって、 このアンタゴニストが、R¹-Lys-Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg -Leu-Arg-Lys-Gln-X¹-Ala-X²-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-AsnNH-R²。と いうアミノ酸配列を含んでいる阻害方法を提供する。 以上及び以下の両方で示すＲ¹，Ｒ²，Ｘ¹及びＸ²に関する論述は、本発明のこ の方法において使用されるVIP にも充分に適用可能であることから、かかる論述 はここでは繰り返さない。しかしながら上述の方法の範囲内で、或る種の血管作 用性腸管ポリペプチドアンタゴニストすなわちＲ¹がＨで、Ｒ²がＨで、Ｘ¹がノ ルロイシン残基で、Ｘ²がバリン残基であるものが好まれるということも指摘し ておかなくてはならない。同様に好ましいのは、Ｒ¹がCH₃(CH₂)₁₆CO−で、Ｒ²が Ｈで、Ｘ¹がノルロイシン残基で、Ｘ²がバリン残基であるVIP アンタゴニストで ある。 さらにもう１つの態様では、本発明は、神経細胞の死滅を誘発する方法におい て、神経細胞の死滅をもたらすのに充分な量の血管作用性腸管ポリペプチド(VIP )アンタゴニストと神経細胞を接触させる段階を含んで成る方法であって、アン タゴニストが R¹-Lys-Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg- Lys-Gln-X¹-Ala-X²-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-AsnNH-R²。というアミノ 酸配列を含んでいる方法を提供する。 以上及び以下の両方で示すＲ¹，Ｒ²，Ｘ¹及びＸ²に関する論述は、本発明のこ の方法において使用されるVIP にも充分に適用可能であることから、かかる論述 はここでは繰り返さない。しかしながら上述の方法の範囲内で、或る種の血管作 用性腸管ポリペプチドアンタゴニストすなわちＲ¹がＨで、Ｒ²がＨで、Ｘ¹がノ ルロイシン残基で、Ｘ²がバリン残基であるものが好まれるということも指摘し ておかなくてはならない。同様に好ましいのは、Ｒ¹がCH₃(CH₂)₁₆CO−で、Ｒ²が Ｈで、Ｘ¹がノルロイシン残基で、Ｘ²がバリン残基であるVIP アンタゴニストで ある。又同様に好まれるのは、Ｒ¹がCH₃(CH₂)₁₆CO−で、Ｒ²がＨで、Ｘ²がメチ オニン残基で 、Ｘ²がバリン残基であるVIP アンタゴニストである。 さらにもう１つの態様では、本発明は、哺乳動物物体内でのVIP 誘発されるcA MP形成を阻害する方法において、阻害をもたらすのに充分な量の血管作用性腸管 ポリペプチド(VIP)アンタゴニストを哺乳動物に投与する段階を含んで成る方法 であって、このアンタゴニストが R¹-Lys-Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-Thr-Asp-Asn-Ty r-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-X¹-Ala-X²-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-AsnN H-R²。というアミノ酸配列を含んでいる方法を提供している。 以上及び以下の両方で示すＲ¹，Ｒ²，Ｘ¹及びＸ²に関する論述は、本発明のこ の方法において使用されるVIP にも充分に適用可能であることから、かかる論述 はここでは繰り返さない。しかしながら上述の方法の範囲内で、或る種の血管作 用性腸管ポリペプチドアンタゴニストすなわちＲ¹がＨで、Ｒ²がＨで、Ｘ¹がノ ルロイシン残基で、Ｘ²がバリン残基であるものが好まれるということも指摘し ておかなくてはならない。 さらにもう１つの態様では、本発明は、哺乳動物の体内の概日リズムを阻害す る方法において、阻害をもたらすのに充分な量の血管作用性腸管ポリペプチド(V IP)アンタゴニストを哺乳動物に投与する段階を含んで成る方法であって、この アンタゴニストが、R¹-Lys-Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu -Arg-Lys-Gln-X¹-Ala-X²-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-AsnNH-R²。という アミノ酸配列を含んでいる方法を提供している。 以上及び以下の両方で示すＲ¹，Ｒ²，Ｘ¹及びＸ²に関する論述は、本発明のこ の方法において使用されるVIP にも充分に適用可能であることから、かかる論述 はここでは繰り返さない。しかしながら上述の方法の範囲内で、或る種の血管作 用性腸管ポリペプチドアンタゴニストすなわちＲ¹がＨで、Ｒ²がＨで、Ｘ¹がノ ルロイ シン残基で、Ｘ²がバリン残基であるものが好まれるということも指摘しておか なくてはならない。同様に好ましいのは、Ｒ¹がCH₃(CH₂)₁₆CO−で、Ｒ²がＨで、 Ｘ¹がメチオニン残基で、Ｘ²がバリン残基であるVIP アンタゴニストである。 さらにもう１つの態様では、本発明は、神経芽細胞腫細胞分裂を阻害する方法 において、阻害をもたらすのに充分な量の血管作用性腸管ポリペプチド(VIP)ア ンタゴニストと神経芽細胞腫細胞を接触させる段階を含んで成る方法であって、 このアンタゴニストが R¹-Lys-Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg- Leu-Arg-Lys-Gln-X¹-Ala-X²-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-AsnNH-R²。とい うアミノ酸配列を含んでいる方法を提供する。 以上及び以下の両方で示すＲ¹，Ｒ²，Ｘ¹及びＸ²に関する論述は、本発明のこ の方法において使用されるVIP にも充分に適用可能であることから、かかる論述 はここでは繰り返さない。しかしながら上述の方法の範囲内で、或る種の血管作 用性腸管ポリペプチドアンタゴニストすなわちＲ¹がＨで、Ｒ²がＨで、Ｘ¹がノ ルロイシン残基で、Ｘ²がバリン残基であるものが好まれるということも指摘し ておかなくてはならない。同様に好ましいのは、Ｒ¹がＨで、Ｒ²がＨで、Ｘ¹が メチオニン残基で、Ｘ²がバリン残基であるVIP アンタゴニストである。又同様 に好ましいのは、Ｒ¹がCH₃(CH₂)₁₆CO−で、Ｒ²がＨで、Ｘ¹がメチオニン残基で 、Ｘ²がバリン残基であるVIP アンタゴニストである。 最後に、本発明は、VIP 関連活性を阻害するのに充分な量の上述のVIP アンタ ゴニストの１つ及び薬学的に受容可能な希釈剤、担体又は賦形剤を含む、薬学組 成物を提供する。このような組成物は、哺乳動物体内でのVIP 関連活性及び機能 を有効に阻害するのに使用することができる。 本発明のその他の利点、目的、特徴及び実施態様は、以下の記述から明らかに なることだろう。 図面の簡単な説明 図１。一群の VIP−ニューロテンシンハイブリッドアンタゴニストで処理され た脊髄培養内で神経細胞の生存が減少させられた。平板固定から９日目に解離さ れた脊髄細胞に対してハイブリッドアンタゴニスト（白丸）、NL−ハイブリッド アンタゴニスト（黒丸）、Ｓ−ハイブリッドアンタゴニスト（白三角）、Ｓ−NL −ハイブリッドアンタゴニスト（黒三角）を添加した。処理期間は、９日間で、 培地交換はなかった。処理期間の終結時点で、神経細胞を、神経細胞特異的エノ ラーゼに対する抗血清で免疫細胞化学的に同定した。各々0.5mm²の 100フィール ド内で免疫陽性細胞（神経細胞）を計数した。各々の値は４皿の平均である。誤 差棒線はSEN である。全ての濃度又は10^-10Ｍ（Ｐ＜0.01）以上のアンタゴニス トで、対照からの有意な減少が観察された。 図２。VIP で刺激されたcAMP形成が、一群のVIP アンタゴニストの存在下で阻 害された。１μＭのVIP を用いて10分間、星状膠細胞培養をインキュベートし、 放射線免疫検定法により、cAMPの蓄積を決定した(Gozes et al．J．Pharmacol． & Exp．Therap.，257：959(1991))。VIP の添加の５分前に星状膠細胞培養内に 増大する濃度のアンタゴニストを入れた。１皿あたり 0.3mgのタンパク質の割合 で、35mmの組織培養皿の中に星状膠細胞を維持した。各々の値は、４回の実験か らの８〜10回の測定値の平均である。図１で比較されたものと同じ類似体がここ で比較されている。誤差棒線はSEM である。 図３。大グリア細胞からの放射線標識付けされた¹²⁵Ｉ−VIP の 移動を介したさまざまなVIP アンタゴニストの結合能力の比較。図１で比較され たものと同じ類似体、すなわちハイブリッドアンタゴニスト（白丸）、NL−ハイ ブリッドアンタゴニスト（黒丸）、Ｓ−ハイブリッドアンタゴニスト（白三角） 、Ｓ−NL−ハイブリッドアンタゴニスト（黒三角）がここで比較されている。 図４。VIP 拮抗作用は、cAMP媒介メカニズムを介して生物時計を混乱させた。 ラット新生児(Spragne-Dawley、現地飼育、Yoxheam，Israel)に、連続28日間、V IP 類似体を、慢性的に注射した（皮下、一日50μｌあたり各類似体５μｇずつ ）。注射のビヒクルは、0.01Ｍの酢酸が15％のジメチルスルフォキシド（脂肪親 和性ペプチド）のいずれかであった。21日目に、動物を各々別々のカゴの中に入 れ、その歩行活動を連続的に測定した。歩行活動パターンは、７日間赤外線検出 器を備えた動物監視システムを用いて測定した（Ａ，Ｃ，Ｅ，Ｇ，Ｉ）。活動デ ータ内のスペクトルリズム周期は、コンピュータサンプリング周期が短かいこと を理由として、特殊な統計的方法により検出した。この方法は、異なる周期（３ 〜40時間）と正弦波を適合させる確率（Ｐ）を使用し、有意なリズム周期を強調 するためログ・スケールでＩ／Ｐを使用する（Ｂ，Ｄ，Ｆ，Ｈ，Ｊ。又公示のた め提出されたTicher．A.，及びI．E．Ashkenazi；Mattes et al，Chronobiology Int'l，8：460（1991）を参照のこと）。Ａ．Ｂ．対照動物；Ｃ，Ｄ，NL−ハイ ブリッド処理；Ｅ，Ｆ，NL−ハイブリッド＋NL−VIP 処理、Ｇ，Ｈ，NL−VIP； Ｉ，Ｊ，Ｓ−NL−ハイブリッド処理。各処理グループには少なくとも４匹の動物 が含まれていた。 図５。VIP は、神経芽細胞腫(NMB)の細胞分裂（細胞計数により測定）を増大 させる。神経芽細胞腫(NMB)細胞は、５％の CO₂，95％の空気から成る湿雰囲気 内で、RPMIすなわち10％のウシ胎児血清 及びゲンタマイシン（培地 100mLあたり原液１mlにつき40mgを10μl）で補足さ れた1640培地、を用いて培養中で成長させられていた。４日に一度0.02ＭのEDTA 及び0.25％のトリプシンを含むPuckの食塩水で細胞を収穫し、遠心分離し、１回 につき 0.6〜0.7 ×10⁶の細胞の密度で直径60mmの組織培養皿(CORNING)内にこの 細胞を播種した。 分裂促進検定のためには、RPMIすなわち1640培地に10％のウシ胎児血清を加え たものの中で、１回あたり 0.2×10⁶の細胞の密度で直径35mmの組織培養皿(CORN ING)の中にヒトNM細胞を播種した。播種から一日後に、VIP を培地の中に導入し た。VIP 処置から２日目（24時間後）に、生活能力についてトリパンブルー染色 を用いて、血球計数器で細胞計数を行なった。グラフ上に示されている結果は１ 回あたりの細胞数×1000である。誤差棒線は標準誤差を表わす。各データポイン トについて３−６の複製が計数され、実験は独立して３回くり返された。EC₅₀＝ ５×10^-7Ｍ。 図６。VIP は神経芽細胞腫細胞内へのチミジンの取込みを増大させる。細胞を 、図５に記述された通りに成長させた。播種から１日後、細胞を、24時間のイン キュベーション期間中、³Ｈ−チミジン（４μCi／皿）とVIP の両方に露呈した 。その後、培地を除去し、0.2ＮのNaOHを35mmの組織培養皿に添加し(0.5mL／皿) 、約20分間インキュベートした。細胞懸濁液を、0.3％のポリエチレンイミンに 予め浸したGF／Ｃろ紙を通してろ過した。フィルターを25mLのH₂O と５mLのエタ ノールで洗浄し、乾燥させ、放射能について計数した。１データポイント、１実 験あたり10もの複製を用いて、実験を３回くり返した。誤差棒線は標準誤差を表 わす。グラフに示されている結果（取込み）は CPM×10⁵である。EC₅₀＝５×10^{- 7} Ｍ。 図７。神経芽細胞腫(NMB)細胞上のVIP レセプタ。0.1％のウシ 血清アルブミンを含むリン酸緩衝溶液(PBS)を用いて４℃で無傷細胞に対し、VIP の結合及び変位実験を行なった。以前の研究作業により、VIP に対する短期間 の露呈の結果、分単位の半減期でペプチドレセプタ複合体が透明なエンドソーム 小胞内に内在化されるということが示された（Gozes et al.，前出、（1991）； Rasselin，et al.，前出（1988））。VIP は、リソソーム内で分解されたか又は 、細胞内エフェクタとして役立ったかもしれない。大部分のVIP レセプタは、細 胞表面に再循環された。内在化は組織特異的であり、４℃で遮断された。従って 、全ての結合研究は、無傷の細胞上で４℃で行なわれた。経時的実験は、細胞培 養中の50pMの¹²⁵Ｉ標識付けされたVIP(35mmの組織培養皿につき 0.3mgのタンパ ク質)を用いた１時間のインキュベーションの間に平衡結合が達成された、とい うことを示していた。 標識付けされたリガンドは、tyr−22での¹³⁵Ｉ−VIP（2000Ci／mmol，Amersha m Corp．Arlington Heights，III）であるか又はNEN(Boston，MA)から購入した 類似の活性をもつtyr¹⁰ならびにtyr²²で標識づけされたヨウ素化VIP であった。 代替的には、VIP は、Werner et al．（Biochem．Biophys，Res．Common，133： 228-232(1982)）によって記述されている手順に従ってヨウ素化された。細胞は 、50pMの¹²⁵Ｉ−VIP の添加に先立ち30分間、テスト済みペプチド（10μＭ−１p M）でインキュベートさせた。(Gozes et al、前出、(1991))。標識づけされたリ ガンドを、１時間培養と共にインキュベートした。その後、培地を除去し、１mL のPBS の添加及び急速な除去（４℃で）により細胞を３回洗浄した。次に標識づ けされた細胞を0.2ＮのNaOH内で溶解させ、放射能計数のために移した。少なく とも３回実験をくり返し、その各々が３セットを含んでいた。誤差棒線は、標準 誤差を表わす。細胞を24時間（丸）及び48時 間（三角形）成長させた。より早い時点（平板固定から22時間後）は、平板固定 から24時間後に得られるものと同じ結果を表わし、それ以前では細胞はまだ丸く １組織培養平板に適切に付着していなかった）、結合は同じ要領で行なうことが できない。結合分析はACCUFIT プログラム、Lundon−２競合分析（LUNDONソフト ウェアInc.，Chargin Falls，Ohio，USA）によって決定された。曲線適合分析は 、最も適合した単一の部位、及び24時間成長させた細胞については0.2μＭのKd そして48時間成長させた細胞については２μＭのKdを示した。計算上のＢ_maxは 、それぞれ48時間成長させた細胞に比べ24時間成長させた細胞について、1.5×1 0^-14モル／mgと６×10^-14モル／mgであった。 図８。神経芽細胞腫細胞内のVIPmRNA の同定。RNAsol方法を用いて、平板固定 から24時間後にNMB 細胞から全RNA を調製した（Ginna/Biotex Labs．Internati onal Inc.，Friendswood，TX）。次に、ヒト VIP−エキソン特異的リボプローブ （前述の³²Ｐ−UTP 標識づけされたもの(Gozes、前出(1987)）を用いて、RNA を アガロースゲル電気泳動とノーザンブロットハイブリダイゼーションに付した。 結果として得られたオートラジオグラムが示されている。対照として、ブロット を15分間３回、0.1％のSDS，75mM のNaCl，7.5mM のNaCitrate を含む沸とう溶 液中で洗浄し、前回のとおり28ＳのrRNAオリゴヌクレオチドプローブで再度ハイ ブリッド形成させた（Burbu，et al.，Nucleic Acid．Res．17；7115(1989)）。 図９。ハイブリッドVIP アンタゴニストは、VIP 誘発された神経芽細胞腫の細 胞分裂を阻害する。（Ａ）対照；（Ｂ）１μＭのVIP；（Ｃ）10μＭのハイブリ ッドVIP アンタゴニスト；及び（Ｄ）１μＭのVIP 及び10μＭのハイブリッドVI P アンタゴニスト。神経芽細胞腫細胞を図５で記された通りに成長させ、図６で 記された通り チミジン取込みを測定した。 図10。ハイブリッドVIP アンタゴニストは、VIP 誘発された神経芽細胞腫の細 胞分裂を、用量依存的に阻害する。VIP について図６で記されたものと同じ実験 を、今、ハイブリッドVIP アンタゴニストを用いて行なう。唯一の修正は、この 実験においてはより多くのチミジンが当初添加されたということである。 定義づけ 「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「オリゴペプチド」というのは、１つのア ミノ酸のα炭素のカルボキシル基ともう１つのアミノ酸のα炭素のアミノ基の間 の擬縮反応により形成されたペプチド結合を通して連鎖されたα炭素をもつアミ ノ酸（標準的にはＬ−アミノ酸）の鎖である。鎖の１つの端部にある末端アミノ 酸（すなわちアミノ末端）は、遊離アミノ基を有し、一方鎖のもう１方の端部に ある末端アミノ酸（すなわちカルボキシ末端）は、遊離カルボキシル基をもつ。 かくして「アミノ末端」という語（Ｎ末端と略される）は、ペプチドのアミノ末 端にあるアミノ酸上の遊離アミノ基、又はペプチド内の任意のその他の場所にあ るアミノ酸のα−アミノ基（ペプチド結合に参与する場合のイミノ基）のことを 言う。同様に「カルボキシ末端」（Ｃ末端と略される）という語は、ペプチドの カルボキシ末端にあるアミノ酸上の遊離カルボキシル基又は、そのペプチド内の 任意のその他の場所にあるアミノ酸のカルボキシル基のことを言う。 標準的には、１つのポリペプチドを作り上げているアミノ酸は、アミノ末端か ら始めてポリペプチドのカルボキシ末端の方向に増大していくように順番に番号 づけされる。従って、１つのアミノ酸がもう１つのアミノ酸に「続く」と言われ た場合、そのアミノ酸は、「先行する」アミノ酸よりもポリペプチドのカルボキ シ末端に近い ところに位置づけされている。 ここで使用される「残基」という語は、アミド結合又はアミド結合擬似体によ りペプチド内に取込まれているアミノ酸又はアミノ酸擬似体のことを言う。従っ て、アミノ酸は、天然に発生するアミノ酸であってもよいし、又は相反する制限 のないかぎり、天然に発生するアミノ酸に類似の要領で機能する天然アミノ酸の 既知の類似体（すなわちアミノ酸擬似体）を包含することもできる。さらに、ア ミド結合擬似体には、当業者には周知のものであるペプチドバックボーン修飾が 含まれる。 「生物学的に活性な」という語は、天然に発生する生物学的分子と相互作用し インビトロ又はインビボでのこれらの分子の機能を活性化するか又は阻害するこ とになるペプチド配列のことを言う。「生物学的に活性な」という語は、本書で は、最も一般的には、インビトロ又はインビボの両方でVIP 関連活性を不活性化 又は阻害する血管作用性腸管ポリペプチド(VIP)アンタゴニストを指すべく使用 されている。 「本質的に〜から成る」という語句は、ここでは、この語句が指すVIP アンタ ゴニストの本質的特性を実質的に変えることになるあらゆる要素を除外するため に使用されている。従って、「本質的に…から成る」ポリペプチドという記述は 、このポリペプチドの生物活性を実質的に変えることになるあらゆるアミノ酸置 換、添加又は欠失を除外するものである。 「接触する」という語句は、ここでは、「〜と組合わされた」、「〜に添加さ れた」、「〜と混合された」「〜の上を通過させられた」、「〜とインキュベー トされた」、「〜の上を流れた」などと、互換的に用いられる。さらに本発明の VIP アンタゴニストは、例えば、非経口、経口、局所及び吸入経路といった従来 のあらゆる方 法によって「投与する」ことができる。 「充分な量」又は「有効な量」というのは、問題のVIP 関連活性を拮抗するか 又は阻害するか又は臨床医又はその他の有資格オブザーバが認知するような客観 的に識別できる改善または疾状の客観的軽減のいずれかを提供する、一定の与え られたVIP アンタゴニストの量である。用量範囲は、使用されるVIP アンタゴニ スト、拮抗されるべきVIP 関連特性、投与経路及び特定のアンタゴニストの効力 に応じて変動する。 「特異的に結合する」という語は、アンタゴニストがその活性の経過中に通常 露呈されるその他の分子にではなく特定の分子に対してVIP アンタゴニストが結 合することを意味する。 「神経芽細胞腫」という語は、主に神経芽細胞から成り、ほとんどの場合最高 10才までの幼児及び小児が患う神経系由来の肉腫のことを言う。このような腫瘍 の大部分は、自律神経系（交感神経芽腫）又は副腎髄質内に発生する。 「概日リズム」という語は、例えば完全に暗所に隔離された場合といったよう に環境の日々のリズム変化から隔離されたときに生体が経験する約24時間の周期 性を伴う基本的リズムのことを言う。このリズムは、器官がもつ時間を測定する 能力を実証するものである。 「日周期リズム」という語は、規則的な明暗周期が存在する24時間サイクルに 基づく活動パターンのことを言う。 「生物時計」又は「体内時計」という語は、多くの植物及び動物が時間の感覚 を保つことができるようにし、かくしてリズミカルな挙動パターンを可能にする 内的メカニズムのことを言う。数多くの生体が、約24時間（概日リズム）の活動 サイクルを生成するこのような時計を有しているが、このサイクルは時計をセッ トする外部の 影響（例えばトレーニング）によって影響され得る。生物時計は、睡眠といった ような生体活動全体のみならず、変動する代謝率といったような細胞活性パター ンにも影響を与える。 本書で言及されているアミノ酸は、以下の通りの簡略呼称により記述される。 発明の詳細な説明及び好ましい実施態様 １つの態様において、本発明は、以下のアミノ酸配列を含む血管作用性腸管ポ リペプチド(VIP)アンタゴニストを提供する：R¹-Lys-Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-Thr- Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-X¹-Ala-X²-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Il e-Leu-AsnNH-R²。 上述の構造式中、Ｒ¹及びＲ²は、独立して選択され、そのうちの少なくとも１ つが水素であることを条件として、水素、Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキル及びＣ₁〜Ｃ₂₀アシ ルを含む（ただしこれらに制限されるわけではない）官能基であってよい。「独 立して選択される」という語は、ここでは、２つのＲ基つまりＲ¹及びＲ²が同一 であっても異なるものであってもよいということを表わすために用いられている （例えばＲ¹及びＲ²の両方が水素であってもよいし、又Ｒ¹がＣ₁₆アシルラジカ ルでＲ²が水素であってもよい等々、）。「アルキル」という語は、ここでは、 一価の脂肪族炭化水素ラジカルである置換基を指すものとして用いられる。アル キル基は、直鎖であっても有枝鎖であってもよいが、直鎖アルキル基（すなわち 、Ｃ₁〜Ｃ₂₀）が好ましい。適当なアルキルラジカルの例としては、次のような ものがあるが、これらに限られるわけではない：メチル、エチル、プロピル、ブ チル、ペンチル、ヘキシル、ペプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル 、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタ デシル、オクタデシル、ノナデシル及びイコシル。 「アシル」という語は、ここではヒドロキシ基の除去により有機酸から誘導さ れる有機ラジカルのことを指して用いられる。例えば、アシルラジカル又は「ブ チリル」基は、ヒドロキシ基の除去により酪酸から誘導される。同様にして、ア シル基「ステアリル」は、ヒドロキシル基の除去により、ステアリン酸から誘導 される。本発明に従うと、アシル基は飽和又は不飽和であってよく、１〜20の炭 素原子（すなわちＣ₁〜Ｃ₂₀）をもつアシル基が好ましい。「飽和した」アシル 基というのは、２重又は３重結合を全くもたないものであり、一方、「不飽和」 アシル基は、２重又は３重結合をもつものである。適切なアシル基としては、ブ チリル、ヘキサノイル、オ クタノイル、ラウリル、ミリスチル、パルミチル、ステアリル、アラシジル、リ ノセリルなどが含まれるが、これに限られるわけではない。前述のものに加えて 、ヒドロキシル基の除去によりさまざまな有機酸から多くのその他のアシル基を 誘導できるということは当業者には直ちに明白になることだろう。 上述の構造式中のＸ¹及びＸ²は、Ｘ²がメチオニンでないことを条件として、 天然に発生するアミノ酸及びアミノ酸擬似体から成るグループの中から独立して 選択される。「独立して選択される」という語はここでは、２つのＸ基すなわち Ｘ¹及びＸ²が同一であっても異なるものであってもよい（例えばＸ¹及びＸ²の両 方がバリンであってもよい）ということを表わすために使用されている。前述の とおりＸ¹及びＸ²は、天然に発生するアミノ酸か又は、天然に発生するアミノ酸 と類似の要領で機能する天然のアミノ酸の既知の類似体（すなわちアミノ酸擬似 体）のいずれであってもよい。本発明のアンタゴニストを形成するために使用で きる適切なアミノ酸としては、上述の表Ｉに列挙されているものが含まれるが、 これらに限られるわけではない。 以上の構造式の範囲内で、或る種の血管作用性腸管ポリペプチドアンタゴニス ト、すなわち、Ｒ¹がＨで、Ｒ²がＨで、Ｘ¹がノルロイシン残基で、Ｘ²がバリン 残基であるものが好まれる。同様に好まれるのは、Ｒ¹がCH₃(CH₂)₁₆COで、Ｒ²が Ｈで、Ｘ¹がノルロイシン残基でＸ²がバリン残基であるVIP アンタゴニストであ る。同様に好ましいのは、Ｒ¹がCH₃(CH₂)₁₆CO−；Ｒ²がＨで、Ｘ¹がメチオニン 残基で、Ｘ²がバリン残基であるVIP アンタゴニストである。さらに同様に好ま しいのは、Ｒ¹がＣ₁〜Ｃ₂₀アルキルで、Ｒ²がＨで、Ｘ¹がノルロイシン残基で、 Ｘ²がバリン残基であるVIP アンタゴニストである。さらに、その他の好ましいV IP アンタ ゴニストは、Ｘ¹及びＸ²が、疎水性をもつアミノ酸及びアミノ酸擬似体であるも のである。このようなアミノ酸には、ロイシン、ノルロイシン、フェニルアラニ ン及びバリンが含まれるが、これらに限られるわけではない（例えば、Ｘ¹がロ イシン、バリン又はフェニルアラニンであり、Ｘ²がロイシン、ノルロイシン又 はフェニルアラニンである）。しかしながら、本発明のVIP アンタゴニストが以 下の組成物以外のものを有するように、Ｒ¹，Ｒ²，Ｘ¹及びＸ²が選択されるとい うことも留意すべきである：Lys-Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Ar g-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn。 さらに、本発明のVIP アンタゴニストは、例えば生物活性を増大するためとい ったその用途においていくつかの利点を提供する可能性かある場合に、保存的で あれ非保存的であれ挿入、欠失及び置換といったさまざまな変更を受けることが できる、ということは当業者には直ちに明らかになることだろう。保存的置換と いうのは、例えば１つの疎水性残基をもう１つのものに、又は１つの極性残基を もう１つのものにといったように、１つのアミノ酸を生物学的及び／又は化学的 に類似であるもう１つのものと置換することを意味する。置換には、例えばGly ，Ala；Val，Ile，Leu；Asp，Glu；Asn，Gln；Ser，Thr，Lys，Arg；及びPhe，T yrといった組合せが含まれる。VIP アンタゴニストの生物活性を失なうことなく 修飾できる残基は、当業者にとっては既知のものである従来の技術を用いた単一 アミノ酸置換、欠失又は挿入によって同定でき、このことは、長さが比較的短か いことを理由に、本発明のVIP アンタゴニストに特に言えることである。さらに 、残基の側鎖がもたらす寄与は、特定されたアミノ酸(例えばAla)での体系的走 査を介して詳しく調べることができる。 本発明のVIP アンタゴニストは、長さが比較的短かく、標準的にその長さはア ミノ酸28個以下である。従って、溶液方法及び固相方法の両方を含め当業者にと っては周知のものである数多くの化学的ペプチド合成技術のいずれかを用いて、 このようなVIP アンタゴニストを調製することが実現可能であるが、現在のとこ ろ固相合成が好まれている。 特に、ペプチド配列のＣ末端アミノ酸が不溶性支持体に付着され、それに続い て配列内に残りのアミノ酸が順次添加される固相合成は、本発明のVIP アンタゴ ニストを調製するための好ましい方法である。固相合成のための技術は Barany and Merrifield，Solid-Phase Peptids Synthests，in ペプチド：その分析、合 成、生物学、（Gross and Meienhofer(eds.)，Academic press，N．Y.，vol．２ ，pp．3-284(1980)）；Merrifield，et al.，J．Am．Chem．Soc．85，2149-2156 （1963）；and Stewart，et al.，固相ペプチド合成(２nd ed.，Pierce Chem．C o.，Rockford，III(1984))、によって記述されており、これらの教示は本書に参 考として内含されている。 固相合成は、適当な固体支持体に対するそのカルボキシ基を介しての保護され たアミノ酸のカップリングにより、ペプチドのカルボキシ末端（例えはＣ−末端 ）から開始される。使用される固体支持体は、ペプチド合成手順で利用される試 薬に対し実質的に不活性な状態にとどまる一方でカルボキシ基に結合することが できるということを条件として、本発明の重要な特徴ではない。例えば、出発材 料は、クロロメチル化樹脂又はヒドロキシメチル樹脂に対するベンジルエステル リンケージを介してか又はベンズヒドリルアミン(BHA)樹脂又はｐ−メチルベン ズヒドリルアミン（MBHA）樹脂に対するアミド結合を介してアミノ保護されたア ミノ酸を付着させることに よって調製することができる。固体支持体として我々にとって適切な材料は、当 業者には周知のものであり、以下のものを含むが、これらに限られるわけではな い：クロロメチル樹脂又はブロモメチル樹脂といったハロメチル樹脂；ヒドロキ シメチル樹脂；４−（α−〔２，４−ジメトキシフェニル〕−Fmoc−アミノメチ ル）フェノキシ樹脂といったフェノール樹脂；第３−アルキルオキシカルボニル −ヒドラジド化樹脂など。このような樹脂は、市販されており、その調製方法は 、当業者には既知のものである。 本発明のペプチドの酸性形態は、固体支持体としてベンジルエステル樹脂を用 いて固相ペプチド合成手順によって調製することができる。対応するアミドは、 固体支持体としてベンズヒドリルアミン又はメチルベンズヒドリルアミン樹脂を 用いることによって生成できる。当業者ならば、BHA 又はMBHA樹脂が使用される とき、固体支持体からポリペプチドを分割するための無水弗化水素酸での処理が 末端アミノ基をもつポリペプチドを生成する、ということを認識するだろう。 合成に用いられる各アミノ酸のα−アミノ基は、反応性α−アミノ酸の機能が 関与する副反応を防ぐため、カップリング反応中保護されていなければならない 。或る種のアミノ酸は同様に、ポリペプチド合成の間その部位で化学反応が起こ るのを防ぐため適切な保護基で保護されていなくてはならない反応性側鎖官能基 （例えばスルフヒドリル、アミノ、カルボキシ、ヒドロキシルなど）を内含して いる。保護基は、当業者にとって周知のものである。例えば、ペプチド：その分 析、合成、生物学、第３巻：ペプチド合成における官能基の保護（Gross and Me ienhofer（編），Academic Press，N．Y．(1981)）を参照されたい（なおその教 示は、本書に参考として内含されている）。 適切に選択されたα−アミノ保護基は、カップリング反応中αアミノ機能を不 活性にし、側鎖保護基を除去しない条件下でカップリング後に容易に除去でき、 ペプチドフラグメントの構造を変更せず、カップリング直前の活性化の時点での ラセミ化を防ぐことになる。同様に、側鎖保護基は、合成中側鎖官能基を不活性 にするように選択されなくてはならず、α−アミノ保護基を除去するのに用いら れる条件下で安定していなければならず、ポリペプチドの構造を変えない条件下 でポリペプチド合成の完了後除去できなくてはならない。 α−アミノ基のための保護基の例としては以下のものが含まれるが、これらに 限られるわけではない：芳香族ウレタン型基、例えばフルオレニルメチルオキシ カルボニル（Fmoc）、カルボベンズオキシ(Cbz)、及びｐ−クロロベンジルオキ シカルボニル、ｏ−クロロベンジルオキシカルボニル、２，４−ジクロロベンジ ルオキシカルボニル、２，６−ジクロロベンジルオキシカルボニルなどを含む置 換されたベンジルオキシカルボニル；脂肪族ウレタン型基、例えばブチルオキシ カルボニル(Boc)、ｔ−アミルオキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニ ル、２−（ｐ−ビフェニリル）−イソプロピルオキシカルボニル、アリルオキシ カルボニルなど；及びシクロアルキルウレタン型基、例えばシクロペンチルオキ シカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル、シクロヘプチルオキシカルボ ニル、アダマンチルオキシカルボニル（Adoc）など。現在好ましい実施態様では 、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Fmoc）が使用されるα−アミノ保護基 である。 リシン(Lys)内に存在する側鎖アミノ基については、α−アミノ基の保護のた めの上述の保護基のいずれもが適している。その上、その他の適切な保護基とし ては、以下のものが含まれるが、これら に限られるわけではない：ブチルオキシカルボニル(Boc)、ｐ−クロロベンジル オキシカルボニル、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル、ｏ−クロロベンジル オキシカルボニル、２，６−ジクロロベンジルオキシカルボニル、２，４−ジク ロロベンジルオキシカルボニル、ｏ−ブロモベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニ トロベンジルオキシカルボニル、ｔ−ブチルオキシカルボニル、イソプロピルオ キシカルボニル、ｔ−アミノオキシカルボニル、シクロペンチルオキシカルボニ ル、シクロヘキシルオキシカルボニル、シクロヘプチルオキシカルボニル、アダ マンチルオキシカルボニル、ｐ−トルエンスルフォニルなど。現在好ましい実施 態様においては、Lys のための側鎖アミノ保護基はブチルオキシカルボニル(Boc )である。 アルギニン(Arg)のグアニジノ基の保護の場合、適切な保護基の例としては以 下のものがあるが、これらに限られるわけではない：ニトロ、トシル(Tos)、カ ルボベンズオキシ(Chz)、アダマンチルオキシカルボニル（Adoc）、ブチルオキ シカルボニル(Boc)、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルフォ ニル(Mtr)及び２，２，５，７，８−ペンタメチルクロロマン−６−スルフォニ ル(PMC)。現在好まれている実施態様では、４−メトキシ−２，３，６−トリメ チル−ベンゼンスルフォニル及び２，２，５，７，８−ペンタメチルクロロマン −６−スルフォニルが、Arg のために使用される保護基である。 セリン(Ser)、トレオニン(Thr)又はチロシン(Tyr)の側鎖上のヒドロキシル基 は、例えばメチル、エチル及びｔ−ブチルといったようなＣ₁〜Ｃ₄アルキルによ って、又は例えばｐ−メトキシベンジル、ｐ−ニトロベンジル、ｐ−クロロベン ジル、ｏ−クロロベンジル及び２，６−ジクロロベンジルといった置換されたベ ンジルによって保護され得る。Ser，Thr及びTyr のための好ましい脂肪族ヒ ドロキシル保護基は、ｔ−ブチルである。 アスパラギン酸(Asp)のカルボキシル基は、例えば、ベンジル、ｔ−ブチル、 シクロヘキシル、シクロペンチルなどといった基を用いたエステル化によって保 護することができる。Asp については、ｔ−ブチルが現在好まれる保護基である 。 ヒスチジン(His)中の塩基性イミダゾール環は、例えばｔ−ブトキシメチル(Bo m)、ブチルオキシカルボニル(Boc)そしてフルオレニルメチルオキシカルボニル （Fmoc）により保護され得る。好ましい実施態様においては、ｔ−ブトキシメチ ル（Born）が、使用される保護基である。 アミノ酸のカップリングは、当業者には既知のものであるさまざまな化学によ り達成できる。標準的なアプローチには、カルボキシル基をポリペプチドフラグ メントの遊離Ｎ末端アミノ基との反応をより受けやすくすることになる誘導体へ とアミノ酸を変換することか、又は、例えばＮ，Ｎ′−ジクロロヘキシルカルボ イミド(DCC)又はＮ，Ｎ′−ジイソプロピルカルボジイミド（DIPCDI）といった 適切なカップリング剤を使用することが関与している。頻繁に、これらのカップ リング反応における触媒としてヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）が利用さ れる。適当な合成化学は、共に本書に参考として内含されている「ペプチド：そ の分析、構造、生物学、第１巻：ペプチド結合形成方法(Gross and Meienhofer fer（編），Academic Press，N．Y．（1979）；及びIzumiya et al.，ペプチド 合成(Maruzen Publishing Col.，Ltd.，(1975))に開示されている。 一般に、ポリペプチドの合成は、固体支持体に対してフルオレニルメチルオキ シカルボニル（Fmoc）といった保護基によりＮα−アミノ位置で保護されている Ｃ−末端アミノ酸をまずカップリングすることによって開始される。Fmoc−Asn のカップリングに先立って 、Fmoc残基を重合体から除去しなければならない。例えばFmoc−Asn は、撹拌し ながら約２時間約25℃でＮ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボイミド(DCC)及びヒ ドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）を用いて４−（α−〔２，４−ジメトキシ フェニル〕−Fmoc−アミノ−メチル）フェノキシ樹脂にカップリングされ得る。 Fmocで保護されたアミノ酸の樹脂支持体に対するカップリングの後、α−アミノ 保護基は、室温でDMF 中の20％のピペリジンを用いて除去される。 α−アミノ保護基の除去後、残りのFmoc−保護されたアミノ酸は、望ましい順 序で段階的にカップリングされる。適切に保護されたアミノ酸は、数多くの供給 業者から市販されている（例えばNova（スイス）又はBachem（カリフォルニア） ）。個々のアミノ酸の段階的添加に対する代替案として、複数のアミノ酸から成 る適切に保護されたペプチドフラグメントを同様に「成長する」ポリペプチドに カップリングさせることができる。以上で説明したような適切なカップリング試 薬の選択は、当業者には周知のことである。本発明のVIP アンタゴニストは比較 的短かいことから、この後者のアプローチ（すなわちセグメント縮合方法）は、 最も効率の良いペプチド合成方法ではない。 保護された各々のアミノ酸又はアミノ酸配列は余剰に固相反応装置内に導入さ れ、カップリングは、ジメチルホルムアミド(DMF)、塩化メチレン（CH₂Cl₂）又 はその混合物の培地中で行なわれる。カップリングが不完全である場合、Ｎα− アミノ基の保護解除及び次のアミノ酸の添加の前にくり返すことができる。カッ プリング効率は、当業者には周知の数多くの手段によって監視できる。カップリ ング効率を監視する好ましい方法は、ニンヒドリン反応によるものである。ポリ ペプチド合成反応は、数多くの市販されたペプチド合成装置を使用して自動的に 行なうことができる（例えばBiosearch 9500，Biosearch，San Raphacl，CA）。 約20〜90分間好ましくは60分間、約０℃でアニソール及びジメチルスルフィド の存在下で無水液体フッ化水素（HF）の中で不溶性担体又は固体支持体を撹拌さ せること、選択された保護基に応じてほぼ室温で60〜360 分間トリフルオロ酢酸 (TFA)の１mg／10mL懸濁液を通して連続的に臭化水素(HBr)をバブリングさせるこ と、又は約30〜60分間、90％のトリフルオロ酢酸、５％の水及び５％のトリエチ ルシランと共に、固相合成のために使用される反応カラムの内部で固体支持体を インキュベートすることによって、ペプチドを分割させ、保護基を除去すること ができる。当業者にとって周知のものであるその他の保護解除方法も、使用する ことができる。 ポリペプチドすなわち本発明のVIP アンタゴニストは、当業者には周知のもの であるペプチド精製を用いて反応混合物から分離及び精製することができる。例 えば、逆相HPLC、ゲル浸透、イオン交換、サイズ排除、アフィニティ、分配又は 向流分配といった既知のクロマトグラフィ手順を用いて、ポリペプチドを精製す ることができる。本発明のVIP アンタゴニストを合成し精製するのに使用される 方法及びプロトコルについての詳細な記述に関しては、以下の例の節を参照され たい。 本発明のVIP アンタゴニストは、好ましくは上述のような化学的ペプチド合成 技術を用いて調製又は生成されるが、当業者であれば、例えば組換え型技術を含 むその他の手段によってもこれを調製することができるということが理解できる であろう。 もう１つの態様では、本発明は、哺乳動物の体内でVIP 関連活性を拮抗する方 法において、拮抗作用をもたらすのに充分な量の血管作用性腸管ポリペプチド(V IP)アンタゴニストを哺乳動物に投与する段階を含んで成る方法であって、この アンタゴニストが R¹-Lys- Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-X¹-Ala-X²-Ly s-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-AsnNH-R²。というアミノ酸配列を含んでいる方 法を提供している。 上述の構造式中、Ｒ¹及びＲ²は、独立して選択され、そのうちの少なくとも１ つが水素であることを条件として、水素、Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキル及びＣ₁〜Ｃ₂₀アシ ルを含む（ただしこれらに制限されるわけではない）官能基であってよい。「独 立して選択される」という語は、ここでは、２つのＲ基つまりＲ¹及びＲ²が同一 であっても異なるものであってもよいということを表わすために用いられている （例えばＲ¹及びＲ²の両方が水素であってもよい）。「アルキル」という語は、 ここでは、一価の脂肪族炭化水素ラジカルである置換基を指すものとして用いら れる。アルキル基は、直鎖であっても有枝鎖であってもよいが、直鎖アルキル基 （すなわち、Ｃ₁〜Ｃ₂₀）が好ましい。適当なアルキルラジカルの例としては、 次のようなものがあるが、これらに限られるわけではない：メチル、エチル、プ ロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ペプチル、オクチル、ノニル、デシル、 ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシ ル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル及びイコシル。 「アシル」という語は、ここではヒドロキシ基の除去により有機酸から誘導さ れる有機ラジカルのことを指して用いられる。例えば、アシルラジカル又は「ブ チリル」基は、ヒドロキシル基の除去により酪酸から誘導される。同様にして、 アシル基「ステアリル」は、ヒドロキシル基の除去により、ステアリン酸から誘 導される。本発明に従うと、アシル基は飽和又は不飽和であってよく、１〜20の 炭素原子（すなわちＣ₁〜Ｃ₂₀）をもつアシル基が好ましい。「飽和した」アシ ル基というのは、２重又は３重結合を全くもたないも のであり、一方、「不飽和」アシル基は、２重又は３重結合をもつものである。 適切なアシル基としては、ブチリル、ヘキサノイル、オクタノイル、ラウリル、 ミリスチル、パルミチル、ステアリル、アラシジル、リノセリルなどが含まれる が、これに限られるわけではない。前述のものに加えて、ヒドロキシル基の除去 によりさまざまな有機酸から多くのその他のアシル基を誘導できるということは 当業者には直ちに明白になることだろう。 上述の構造式中のＸ¹及びＸ²は、Ｘ²がメチオニンでないことを条件として、 天然に発生するアミノ酸及びアミノ酸擬似体から成るグループの中から独立して 選択される。「独立して選択される」という語はここでは、２つのＸ基すなわち Ｘ¹及びＸ²が同一であっても異なるものであってもよい（例えばＸ¹及びＸ²の両 方がバリンであってもよい）ということを表わすために使用されている。前述の とおりＸ¹及びＸ²は、天然に発生するアミノ酸か又は、天然に発生するアミノ酸 と類似の要領で機能する天然のアミノ酸の既知の類似体（すなわちアミノ酸擬似 体）のいずれであってもよい。本発明のアンタゴニストを形成するために使用で きる適切なアミノ酸としては、上述の表Ｉに列挙されているものが含まれるか、 これらに限られるわけではない。 上述の方法の範囲内で、或る種の血管作用性腸管ポリペプチドアンタゴニスト 、すなわち、Ｒ¹がＨで、Ｒ²がＨで、Ｘ¹がノルロイシン残基で、Ｘ²がバリン残 基であるものが好まれる。同様に好まれるのは、Ｒ¹がCH₃(CH₂)₁₆COで、Ｒ²がＨ で、Ｘ¹がノルロイシン残基でＸ²がバリン残基であるVIP アンタゴニストである 。同様に好ましいのは、Ｒ¹がCH₃(CH₂)₁₆CO−；Ｒ²がＨで、Ｘ¹がメチオニン残 基で、Ｘ²がバリン残基であるVIP アンタゴニストである。さらに同様に好まし いのは、Ｒ¹がＣ₁〜Ｃ₂₀アルキルで、Ｒ² がＨで、Ｘ¹がノルロイシン残基で、Ｘ²がバリン残基であるVIP アンタゴニス トである。さらに、その他の好ましいVIP アンタゴニストは、Ｘ¹及びＸ²が、疎 水性をもつアミノ酸及びアミノ酸擬似体であるものである。このようなアミノ酸 には、ロイシン、ノルロイシン、フェニルアラニン及びバリンが含まれるが、こ れらに限られるわけではない（例えば、Ｘ¹がロイシン、バリン又はフェニルア ラニンであり、Ｘ²がロイシン、ノルロイシン又はフェニルアラニンである）。V IP アンタゴニストが以下の組成物以外のものを有するように、上述の方法にお いて使用されているVIP アンタゴニストのＲ¹，Ｒ²，Ｘ¹及びＸ²が選択されると いうことも留意すべきである：Lys-Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr- Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn。 さらに、本発明のVIP アンタゴニストは、例えば生物活性を増大するためとい ったその用途においていくつかの利点を提供する可能性がある場合に、保存的で あれ非保存的であれ挿入、欠失及び置換といったさまざまな変更を受けることが できる、ということは当業者には直ちに明らかになることだろう。保存的置換と いうのは、例えば１つの疎水性残基をもう１つのものに、又は１つの極性残基を もう１つのものにといったように、１つのアミノ酸を生物学的及び／又は化学的 に類似であるもう１つのものと置換することを意味する。置換には、例えばGly ，Ala；Val，Ile，Leu；Asp，Glu；Asn，Gln；Ser，Thr，Lys，Arg；及びPhe，T yrといった組合せが含まれる。VIP アンタゴニストの生物活性を失なうことなく 修飾できる残基は、当業者にとっては既知のものである従来の技術を用いた単一 アミノ酸置換、欠失又は挿入によって同定でき、このことは、長さが比較的短か いことを理由に、本発明のVIP アンタゴニストに 特に言えることである。さらに、残基の側鎖がもたらす寄与は、特定されたアミ ノ酸(例えばAla)での体系的走査を介して詳しく調べることができる。 上述のとおり、本発明のVIP アンタゴニストは、VIP 関連活性及び機能を阻害 するすなわち拮抗するために使用することができる。より特定的に言うと、本発 明のVIP アンタゴニストは、腫瘍細胞を含むVIP レセプタの成長を阻害するため 、神経細胞の死滅を誘発するため、VIP で誘発されたcAMPの形成又は蓄積を阻害 するため；哺乳動物における概日リズムを阻害するため；そして神経芽細胞腫の 成長（すなわち細胞分裂）を阻害するためなどに使用することができる。VIP 関 連活性／機能を阻害するために本発明のVIP アンタゴニストを使用するさまざま な方法の各々について、以下でさらに詳細に説明する。これらの例から、当業者 であれば、多数のVIP 関連活性を阻害するために本発明のVIP アンタゴニストを 類似の要領で使用することができるということを理解することだろう。 従って、１つの態様では、本発明は、腫瘍細胞を含むVIP レセプタの成長を阻 害する方法において、阻害をもたらすのに充分な量の血管作用性腸管ポリペプチ ド(VIP)アンタゴニストと腫瘍細胞を接触させる段階を含む方法であって、この アンタゴニストが、R¹-Lys-Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu -Arg-Lys-Gln-X¹-Ala-X²-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-AsnNH-R²。という アミノ酸配列を含んでいる方法を提供している。 Ｒ¹，Ｒ²，Ｘ¹及びＸ²に関する前述の論述は、本発明のこの方法で使用される VIP アンタゴニストにも充分適用できるものであり、従ってこの特定の方法に関 して再度反復することはしない。しかしながら、上述の方法において使用される VIP アンタゴニストのＲ¹，Ｒ²，Ｘ¹及びＸ²は、VIP アンタゴニストが以下の組 成物 以外を有するように選択される、ということにも留意すべきである。Lys-Pro-Ar g-Arg-Pro-Tyr-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Ly s-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn。 さらに、上述の方法の範囲内では、或る種の血管作用性腸管ポリペプチドアン タゴニスト、すなわちＲ¹がＨで、Ｒ²がＨで、Ｘ¹がノルロイシン残基でＸ¹がバ リン残基であるものが好まれる。同様に好まれるのは、Ｒ¹がCH₃(CH₂)₁₆CO−で 、Ｒ²がＨで、Ｘ²がノルロイシン残基でＸ²がバリン残基であるVIP アンタゴニ ストである。 本発明のVIP アンタゴニストは、アンタゴニスト活性を示すためには、VIP レ セプタを活性化することなくこのレセプタに結合できなくてはならない。従って 、一定の与えられたVIP アンタゴニストのアンタゴニスト活性を評価するために は、結合親和力と同時に結合したレセプタを不活性化するアンタゴニストの能力 について検定することが望ましい。 細胞表面タンパク質（すなわちVIP レセプタ）に対する特定のリガンド（すな わちVIP アンタゴニスト）の結合親和力について検定する手段は、当業者には周 知のものである。標準的な結合検定においては、推定上のアンタゴニストは固定 化され、標識づけされたリガンドに露呈されるか又は代替的には固定化されたレ セプタが、標識づけされたリガンド又はアンタゴニストに露呈される。固定化さ れた半分は、未結合の材料があればそれを除去するべく洗浄され、標識は検出さ れる。固定化された標識の量はレセプタと推定上のアンタゴニストの間の結合の 度合に比例する。 好ましい一実施態様においては、VIP レセプタ含有細胞が分離され、固定支持 体（例えばポリ塩化ビニル板、Dynatch，Arlington，VA）に結合される。放射性 （例えば¹²⁵Ｉを用いた）の又は螢光的 （例えばフルオレセイン又はローダミンを用いた）な標識で標識づけされたアン タゴニストは、結合されたVIP レセプタを含有する細胞に露呈される。洗浄後、 細胞は分離され、結合したアンタゴニストの量は、例えばシンチレーションカウ ンタの中で放射能を測定することによって決定される。 結合は、直接的にか又は未変性VIP と競合して決定される。直接的決定におい ては、VIP アンタゴニストは標識づけされ、結合したVIP アンタゴニストの量は 直接測定される。検定が競合的阻害として行なわれる場合、未変性VIP が標識づ けされる。VIP レセプタ含有細胞はこのとき、変動する量の標識づけされていな いVIP アンタゴニストの存在下で標識づけされたリガンドに露呈される。VIP ア ンタゴニストがVIP レセプタに対し高い親和力を有する場合、これは未変性VIP に超過競合し、その結果、未変性VIP による結合が減少することになる。 かくして、本発明のアンタゴニストとVIP レセプタの間の相互作用は、VIP レ セプタ含有腫瘍細胞について行なわれたVIP 結合研究において調査された。かか る研究の結果は以下の表IIと図３の中で記されており、これにより、Ｓ−ハイブ リッドアンタゴニスト及びＳ−NL−ハイブリッドアンタゴニストが、NSCLS 細胞 （例えばNCI−H838細胞）内に存在するVIP レセプタに対する¹²⁵Ｉ−VIP 結合を 阻害する上でハイブリッドアンタゴニストよりも６倍及び25倍効力が高いという ことが明らかにされている。VIP アンタゴニストを中枢神経系において比較した 場合にはさらに複雑な結果が得られ、この場合、ステアリルアンタゴニスト（す なわちＳ−ハイブリッドVIP アンタゴニスト及びＳ−NL−ハイブリッドVIP アン タゴニスト）がcAMP（低親和力）VIP レセプタに対するより低い親和力を有し（ 図２及び３及び以下の論述を参照）かつVIP 神経生存関連レセプ タに対するより高い親和力を有する（図１及び以下の論述を参照のこと）ことが 発見された。 さらに、天然に発生するVIP は、数多くの細胞の中で潜在的な分裂促進因子で ある。例えば、VIP レセプタは、さまざまな細胞型(例えばNSCLC)上で検出可能 であり、これは細胞増殖の強化によりVIP に応答することがわかった。Carpente r，Ann，Rev．Biochem.，56-881-914(1987)。従って、本発明のVIP アンタゴニ ストのアンタゴニスト活性は、単に適当なVIP レセプタを支持する細胞を不活性 化するアンタゴニストの能力を測定することによって決定できる。活性化又代替 的には不活性化を測定する手段は、当業者には周知のものである。 好ましい実施態様においては、活性化又代替的には不活性化は、露呈した細胞 によるトリチウム標識チミジンの摂取率を決定することによって測定される。代 謝的に活性な細胞は、より大量のチミジンを取り込み、従ってより強いシグナル を呈する。代替的には、特定の標的細胞の成長速度に対するアンタゴニストの効 果を測定することによりVIP アンタゴニストの分裂促進活性を検定することがで きる。細胞成長を行なう方法は、当業者にとって周知のものである。例えばCohe n and Carpenter，Proc．Natl．Acad．Sci．(USA)，7 2：1317-1321(1975)を参照のこと。簡単に言うと、この種の検定には、適当なVI P レセプタを支持する細胞系統の培養を樹立することが必要である。細胞は、適 当な時間中、推定上のVIP アンタゴニストの存在下又は不在下のいずれかで培養 される。当業者にとって周知のものである数多くの手段のいずれかによって周期 的に細胞計数をとる。（例えば、サブサンプリング及び手作業計数又はコールタ 計数器などを介しての自動式計数）。相対的な分裂促進活性は、細胞増殖速度の 比較又はアンタゴニスト無しの細胞培養とアンタゴニストを含む培養中の最終的 細胞計数の比較によって決定することができる。 肺腫瘍細胞(例えばNSCLC)といったようなVIP レセプタ含有腫瘍細胞の成長を 阻害することに関しては、本発明のVIP アンタゴニストがかかる細胞の成長を有 効に阻害することが発見された。その上、驚くべきことに、本発明のVIP アンタ ゴニストは、Gozes et al.により以前に開発されたVIP アンタゴニスト（以下「 ハイブリッドVIP アンタゴニスト」と呼ぶ）よりも高いレベルで（すなわちより 高い効力で）VIP レセプタ含有腫瘍細胞の成長を阻害することが発見された。よ り特定的に言うと、ハイブリッドVIP アンタゴニストの位置17にあるメチオニン 残基がノルロイシン残基と置換された場合、VIP レセプタ含有腫瘍細胞の成長を 阻害する上でVIP ハイブリッドアンタゴニストよりも10倍効力の高いVIP アンタ ゴニスト（以下「NLハイブリッドアンタゴニスト」と呼ぶ）が産生されるという ことが発見された。 非小細胞肺ガン(NSCLC)のコロニー形成に対するハイブリッドアンタゴニスト 及びNL−ハイブリッドアンタゴニストの効果が比較され、３つのNSCLC 細胞系統 研究のうちの２つにおいて、NL−ハイブリッドアンタゴニストが細胞成長（すな わち細胞分裂）を阻害する 上でもとのハイブリッドアンタゴニストよりも10倍効力が高いということが発見 された。以下の表IIに記されている結果は、VIP が、細胞成長の指標である。寒 天中の（２〜３倍）のNSCLC コロニー形成の刺激を行なうことを明らかにしてい る。もとのVIP ハイブリッドアンタゴニストは、細胞系統 NCI−H1299 及び NCI −H226中で約50％のを、又細胞系統 NCI−H727中で約98％の細胞成長を阻害する 。これとは対照的に、同じ濃度のアンタゴニストを用いて、NL−ハイブリッドア ンタゴニストは、細胞系統 NCI−H129内で 100％の細胞成長を、又、細胞系統 N CI−H226内で92％の細胞成長を、そして細胞系統 NCI−H727内で88％の細胞成長 を阻害する。 さらに、ｃ−fos mRNAを刺激するVIP 及びＳ−ハイブリッドVIP アンタゴニス トの能力が検査された。ｃ−fos mRNAはガン細胞増殖についてのマーカーである 。このようにしながら、VIP がｃ−fos mRNAを刺激することが発見された。対照 的に、VIP アンタゴニストの存在は、ｃ−fos mRNAを有効に阻害する。このこと は、VIP アンタゴニストがVIP と同時投与されるか或いは単独で投与されるかと は無関係に言えることである。（下表IV参照）。 かくして、本発明のVIP アンタゴニストの１つ（例えばNL−ハイブリッドVIP アンタゴニスト）とVIP レセプタ含有腫瘍細胞を接触させることにより、VIP レ セプタ含有腫瘍細胞（例えばNSCLC，SCLC など）の成長を有効に阻害する、すな わち拮抗することができる、ということは容易に明らかとなる。 さらにもう１つの態様においては、本発明は、神経細胞の死滅を誘発する方法 において、神経細胞の死滅をもたらすのに充分な量の血管作用性腸管ポリペプチ ド(VIP)アンタゴニストと神経細胞を接触させる段階を含んで成る方法であって 、このアンタゴニストが R¹-Lys-Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Ar g-Leu-Arg-Lys-Gln-X¹-Ala-X²-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-AsnNH-R²。と いうアミノ酸配列を含んでいる方法を提供している。 Ｒ¹，Ｒ²，Ｘ¹及びＸ²に関する前述の論述は、本発明のこの方法で使用される VIP アンタゴニストにも充分適用できるものであり、従ってこの特定の方法に関 して再度反復することはしない。しかしながら、上述の方法において使用される VIP アンタゴニストのＲ¹，Ｒ²，Ｘ¹及びＸ²は、VIP アンタゴニストが以下の組 成物 以外を有するように選択される、ということにも留意すべきである。Lys-Pro-Ar g-Arg-Pro-Tyr-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Ly s-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn。 さらに、上述の方法の範囲内では、或る種の血管作用性腸管ポリペプチドアン タゴニスト、すなわちＲ¹がＨで、Ｒ²がＨで、Ｘ¹がノルロイシン残基でＸ²がバ リン残基であるものが好まれる。同様に好まれるのは、Ｒ¹がCH₃(CH₂)₁₆CO−で 、Ｒ²がＨで、Ｘ²がノルロイシン残基でＸ²がバリン残基であるVIP アンタゴニ ストである。同様に好まれるのは、Ｒ¹がCH₃(CH₂)₁₆CO−で、Ｒ²がＨで、Ｘ¹が メチオニン残基で、Ｘ²がバリン残基であるVIP アンタゴニストである。 神経細胞機能の検定特に神経細胞の生存に対するVIP アンタゴニストの効果の 検定については、例えば細胞培養検定、器官培養検定、全胚半ビボ及びインビボ 検定を含め、数多くの異なる検定を使用することができる。これらのさまざまな 検定は、一般的代謝活性、神経細胞特異的活性（例えば神経伝達物質の合成及び 分解）、電気生理機能、細胞の形態及び生存を評定するのに使用することができ る。インビボ検定は、付加的な挙動上の様相を提供する。VIP は、以前に、上述 の検定の全てを用いて評定されてきた。（例えばGozes and Brenneman，Molec． Neurobiol.，3：1（1989）；Gozes and Brenneman，J．Molec．Neurosci.，4：1 （1993）及びGressens，et al.，Nature，362：155(1993)を参照のこと）。 例えば、神経細胞の生存に対するVIP アンタゴニストの効果を評定するために は、解離したマウスの脊髄培養（12日目の胚から得たもの）を、上述の方法を用 いて利用した。（例えば、Brenneman et al.，Dev．Brain Res.，9：13（1983） ；Brenneman，et al.，Dev．Brain Res．15：211（1984）；Brenneman et al.， ペプチド、 6（2）：35（1985）；Brenneman et al.，J．Pharmacel．Exp．Therap.，233：4 02(1985)を参照のこと）。簡単に言うと、細胞を、MEM 中の10％のウマ血清、10 ％のウシ胎児血清の中で細胞を平板固定した。平板固定から１日後、培地を規定 の培地成分で補足した５％のウマ血清と交換した。インビトロで９日間経過後、 培養を培地交換し、テトロドトキシンの不在下でVIP アンタゴニストで処理した 。処理時間は、９日〜14日であり、その後、培養をNSE(神経細胞特異的エノラー ゼ、つまり充分定義づけされた神経細胞マーカー)についての免疫細胞化学のた めに固定した。合計面積50mm²の100のフィールドについて細胞計数を行なった。 神経細胞は、処理タイプを知らない状態で計数した。 神経細胞の死滅を誘発することに関しては、驚くべきことに、本発明のVIP ア ンタゴニストが、Gozes et al.により以前に開発されたVIP アンタゴニスト（す なわち「ハイブリッドVIP アンタゴニスト」）よりも高いレベル（すなわちより 大きい効力で）神経細胞の死滅を誘発することが発見された。より特定的に言う と、ハイブリッドVIP アンタゴニストの位置17にあるメチオニン残基がノルロイ シン残基で置換された場合、神経細胞の死滅を誘発する上でもとのハイブリッド VIP アンタゴニストより10倍高い効力をもつVIP アンタゴニスト（以下「NL−ハ イブリッドアンタゴニスト」と呼ぶ）が産生されるということが発見された。NL −ハイブリッドVIP アンタゴニストを用いると、10^-10Ｍで最大の効果が観察さ れ、一方ハイブリッドVIP アンタゴニストを使用した場合に類似の効果を達成す るためには、さらに10倍のアンタゴニストが必要であった。（図１参照）。従っ て、単一のアミノ酸を変えることにより、中枢神経系において生物活性の10倍の 増大が達成される。 同様に、アシルラジカル（すなわち例えばステアリルラジカルと いった脂肪親和性半分）がハイブリッドVIP アンタゴニストのＮ末端に添加され た場合、ハイブリッドVIP アンタゴニストよりも神経細胞の死滅を誘発する上で 10倍高い効力をもつVIP アンタゴニスト（以下「Ｓ−ハイブリッドアンタゴニス ト」）が産生されるということも発見された。従って、Ｓ−ハイブリッドVIP ア ンタゴニストは、神経細胞の死滅を誘発するその能力に関して、NL−ハイブリッ ドアンタゴニストと類似していることがわかった。 その上、ハイブリッドVIP アンタゴニストの位置17にあるメチオニン残基がノ ルロイシン残基と置換されアシルラジカル（すなわち脂肪親和性半分）がVIP ア ンタゴニストのＮ末端に添加された場合、神経細胞の死滅を誘発する上でハイブ リッドVIP アンタゴニストよりも 100倍高い効力をもつVIP アンタゴニスト（以 下「Ｓ−NL−ハイブリッドアンタゴニスト」と呼ぶ）が産生される、ということ が発見された（図１参照）。従って２つの変化（すなわち位置17のノルロイシン 残基及びＮ末端のアシル残基）の組合せの結果、Gozes et al(前出)により開発 されたもとのハイブリッドVIP アンタゴニストに比べ神経細胞を死滅させる上で 100倍高い効力と有効性をもつ分子が得られることになる。 さらにもう１つの態様においては、本発明は、哺乳動物の体内でのVIP 誘発さ れたcAMPの形成を阻害する方法において、阻害をもたらすのに充分な量の血管作 用性腸管ポリペプチド(VIP)アンタゴニストを哺乳動物に投与する段階を含んで 成る方法であって、このアンタゴニストが R¹-Lys-Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-Thr-As p-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-X¹-Ala-X²-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile- Leu-AsnNH-R²。というアミノ酸配列を含んでいる方法を提供している。 Ｒ¹，Ｒ²，Ｘ¹及びＸ²に関する前述の論述は、本発明のこの 方法で使用されるVIP アンタゴニストにも充分適用できるものであり、従ってこ の特定の方法に関して再度反復することはしない。しかしながら、上述の方法に おいて使用されるVIP アンタゴニストのＲ¹，Ｒ²，Ｘ¹及びＸ²は、VIP アンタゴ ニストが以下の組成物以外を有するように選択される、ということにも留意すべ きである。Lys-Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gl n-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn。 さらに、上述の方法の範囲内では、或る種の血管作用性腸管ポリペプチドアン タゴニスト、すなわちＲ¹がＨで、Ｒ²がＨで、Ｘ¹がノルロイシン残基でＸ²がバ リン残基であるようなVIP アンタゴニストが好まれる。 VIP で刺激されたアデニル酸シクラーゼ活性は、中枢神経系のさまざまな部域 の中で観察されてきた（Auik et al，Biochem．Pharmacol.，27：2209-2213(197 3)；及びDeschodt Lanckman et al.，FEBS Lett.，93：76-80（1977）。VIP は 、例えば生殖細胞及び脳細胞を含むさまざまな組織内でcAMPレベルの増大を生む ということがわかっている（Said、「血管作用性腸管ペプチド」、Advancs in P eptide Hormone Secies(ペプチドホルモンの進歩シリーズ)(Raven Press，New Y ork(1982)）；Magistrotti，et al.，Nature，308：280（1984）；Carmera，et al.，Biochem．Biophys．Acta．763：414(1983))。さらに、Gozes et al.により 以前に開発されたハイブリッドVIP アンタゴニストは、VIP 刺激を受けたグリア 細胞内の環式AMP(すなわちcAMP)の蓄積を阻害するすなわち減少させるというこ とがわかった（Gozes et al.，J．Pharmacol．& Exp．Therap.，257：959(1971) ）。 以上のことをかんがみ、本発明のVIP アンタゴニストがVIP 刺激されたcAMP形 成に対してもつ効果を比較するために、大グリア細胞 が利用された。cAMPの決定については、一般的プロトコルには、アデニル化シク ラーゼ活性の測定か又は、Gozes et al.によって以前に記述された（J．Pharmac ol．Exp．Therap.，257-959(1991)）NEN（New England Nuclear，Boston，MA） からのcAMP決定キットを利用するcAMPに関する放射性免疫検定法の使用のいすれ かが関与している。テストのためには、0.5ＭのNaOHで中和されたHCl(0.05Ｍ)抽 出物を利用することができる。 さまざまなVIP アンタゴニストを比較するにあたり、NL−ハイブリッドVIP ア ンタゴニストが、ハイブリッドVIP アンタゴニストと同様に、VIP 誘発されたcA MP形成を有効に阻害することがわかった。これとは対照的に、Ｓ−ハイブリッド VIP アンタゴニスト及びＳ−NL−ハイブリッドVIP アンタゴニストは、VIP 誘発 されるcAMP形成を有効に阻害しないということがわかった。実際、Ｓ−NL−VIP アンタゴニストが、ハイブリッドVIP アンタゴニスト又はNL−ハイブリッドVIP アンタゴニストに比べ、VIP に誘発されたcAMPの形成を阻害する上で100分の１ の効力しかもたないことがわかった（図２参照）。 その上、VIP が、cAMP形成の刺激に関連するものと神経細胞の生存の増大に関 係するものという、中枢神経に特異的な２つの別々の結合部位を介して作用する ということがわかっている。より特定的に言うと、研究から、低親和力のアデニ ル酸シクラーゼ関連レセプタ及びVIP の生存促進活性に結びつけられる高親和力 レセプタの存在が明らかにされた。この生存促進活性は、VIP の分泌促進活性な らびに分裂促進活性の両方に関連づけられる。 上述の神経細胞生存検定及びVIP 誘発されたcAMP形成検定の両方から、本発明 のVIP アンタゴニストがcAMP関連VIP レセプタと神経細胞生存関連VIP レセプタ を区別することができるということは直 ちに明らかである。より特定的に言うと、NL−ハイブリッドVIP アンタゴニスト が、cAMP関連VIP レセプタと神経細胞生存関連VIP レセプタの両方に対する親和 力を有することがわかった。これとは対照的に、Ｓ−ハイブリッドVIP アンタゴ ニスト及びＳ−NL−ハイブリッドVIP アンタゴニストは、VIP の神経細胞生存促 進活性に結びつけられるVIP レセプタに対してより高い親和力をもつことがわか っている。さまざまなレセプタの間で区別及び弁別する能力をもつことから、本 発明のVIP アンタゴニストは、CNS 内でのVIP の生理学的機能及びその挙動に対 する影響を明確にするためのインビボ研究において使用することができる。 さらにもう１つの態様では、本発明は、哺乳動物における概日リズムを阻害す る方法において、阻害をもたらすのに充分な量の血管作用性腸管アンタゴニスト を哺乳動物に投与する段階を含んで成る方法であって、このアンタゴニストが R¹ -Lys-Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-X¹-Ala -X²-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-AsnNH-R²。というアミノ酸配列を含んで いる方法を提供している。 Ｒ¹，Ｒ²，Ｘ¹及びＸ²に関する前述の論述は、本発明のこの方法で使用される VIP アンタゴニストにも充分適用できるものであり、従ってこの特定の方法に関 して再度反復することはしない。しかしながら、上述の方法の範囲内で、或る種 の血管作用性腸管ポリペプチドアンタゴニスト、すなわちＲ¹がＨで、Ｒ²がＨで 、Ｘ¹がノルロイシン残基でＸ²がバリン残基であるものが好まれるということに 留意すべきである。同様に好まれるのは、Ｒ¹がCH₃(CH₂)₁₆CO−で、Ｒ²がＨで、 Ｘ²がメチオニン残基で、Ｘ²がバリン残基であるVIP アンタゴニストである。 VIP 合成の主要部位が、生体リズムを制御する脳の部域である視 床下部の視床差上核である(Card et al.，Cell and Tissue Res.，252：307(198 8))。その上、VIP mRNAが昼／夜サイクル中に振れて、VIP mRNAのピークレベル が夜間に存在する、ということが見極められた（Gozes et al.，Neurosci．Res ．Comms.，5：83（1989）；Alberts，et al.，Mol．Brain Res.，7：85(1990)） 。本発明のレセプタ弁別VIP アンタゴニストを用いて、今や、生物時計の維持の ためにはVIP に刺激されたcAMP形成が必要とされるということが発見された。 VIP が生物時計の確認に直接関与しているか否かという問題は、さまざまなVI P アンタゴニストを慢性的に毎日注射（皮下）することによってVIP 機能を特異 的に阻害することにより調査された。図４は、活動データに異なる正弦曲線を適 合させる確率によって示される活動リズムの分光分析を示す。対照動物は24時間 の周期性を示したが（図4A、活動データ；図4B、分光分析）、本発明のNL−ハイ ブリッドVIP アンタゴニストの注射は、動物の活動の全体的増加を伴ってこの24 時間の周期性を廃止した（図4C及び4D）。これは、NL−ハイブリッドVIP アンタ ゴニスト及びNL−VIP の同時投与によって逆転させられた（図4B及び4F）；NL− VIP は単独では有意な効果をもたらさなかった（図4G及び4H）。これとは対照的 に、Ｓ−NL−ハイブリッドVIP アンタゴニストの注射は24時間の周期性でいかな る効果ももたらさなかったが、日周期リズムの幾分かの変化が起こり、動物は、 発散的周期性を伴って幾分かの散発性活動を示した、ということがわかった（図 4I及び4J）。カニューレ挿入及びSCN に対するVIP 類似体の直接投与の後、類似 の結果が得られた。 上述の結果は、生物時計の決定に対するVIP 刺激によるcAMP形成の関与を明確 に実証している。実際、本発明のVIP アンタゴニストを用いて得られた結果は、 インビボでのリズム性の決定に対するVI P 刺激されたcAMPの関与を示している。これらの発見事実は、cAMPがインビトロ でSCN 内の哺乳動物の概日時計をリセットすることができるということを示した 以前の発見事実（Prosser et al.，J．Neurosci.，9：1073（1989）：Prosser a nd Gillette，Bruin Res.，568：185(1991)）と一貫性あるものであった。かく して、本発明のVIP アンタゴニスト（例えばNL−ハイブリッドVIP アンタゴニス ト）を有効量だけ哺乳動物に投与することにより、哺乳動物体内の概日リズムを 有効に阻害すなわち拮抗することができる、ということは容易に明らかとなる。 さらにもう１つの態様においては、本発明は、VIP 誘発型神経芽細胞腫の細胞 分裂を阻害する方法において、阻害をもたらすのに充分な量の血管作用性腸管ポ リペプチド(VIP)アンタゴニストと神経芽細胞腫細胞を接触させる段階を含む方 法であって、このアンタゴニストが、R¹-Lys-Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-Thr-Asp-Asn -Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-X¹-Ala-X²-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-A snNH-R²。というアミノ酸配列を含んでいる方法を提供している。 Ｒ¹，Ｒ²，Ｘ¹及びＸ²に関する前述の論述は、本発明のこの方法で使用される VIP アンタゴニストにも充分適用できるものであり、従って、この特定の方法に 関してここで再度反復することはしない。しかしながら、上述の方法の範囲内で は或る種の血管作用性腸管ポリペプチドアンタゴニスト、すなわちＲ¹がＨで、 Ｒ²がＨで、Ｘ¹がノルロイシン残基でＸ²がバリン残基であるものが好まれると いうことに留意すべきである。同様に好ましいのは、Ｒ¹がＨで、Ｒ²がＨで、Ｘ¹ がメチオニン残基で、Ｘ²がバリン残基であるVIP アンタゴニストである。同様 に好まれるのは、Ｒ¹がCH₃(CH₂)₁₆CO−で、Ｒ²がＨでＸ¹がメチオニン残基であ り、Ｘ²がバリン残基であるVIP アンタゴニストである。 交感神経系の腫瘍である神経芽細胞腫は、５才未満の小児に最も多い悪性腫瘍 である。これまでの研究は、VIP が神経芽細胞腫細胞系統の細胞分化を誘発する という観察事実に基づいて、VIP が神経芽細胞腫における自己分泌増殖因子であ りうるということを示唆した（O’Dorisio，et al.，Regulatory Peptides(調節 ペプチド)、37：213-226（1992）。さらに、ヒトの神経芽細胞腫細胞系統(NMB) において、VIP は現在、分裂促進活性を有することが立証されている。 神経芽細胞腫細胞系統の細胞分化、すなわち、神経芽細胞腫細胞分裂に対する VIP アンタゴニストの効果を検定するためには、例えば、直接的細胞計数、チミ ジン取込み、有系分裂細胞の指標としてのヌクレオチドBRDUを取り込む細胞の決 定、そしてガン細胞内では軟寒天内でコロニーを形成する能力及びヌードマウス 内での伝幡能力を含めた、数多くの異なる検定を使用することができる。上述の 検定の全てが、最近、数多くの研究において使用されてきた（例えばMoody et a l，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，90：4345（1993）；Wollman et al，Brain Rs .，624：339(1993)；及びGressens et al.，Nature，362：155（1993）を参照の こと）。 ヒト神経芽細胞腫(NMB)細胞は、当初、生後10カ月の女児の骨髄生検中に得ら れた(Brodeur，et al.，Cancer(ガン)、40：2256-2263(1977))。この細胞系統を 予め検査することにより、近四倍体核型及びＮ−myc ガン遺伝子の増幅が明らか になった(Schwab et al.，Nature，305：245-248(1983))。VIP について、神経 芽細胞腫(細胞系統IMR32)の成長の阻害物質としての潜在的役割が提供され、こ の効果全般について調査された。この調査の結果は、VIP での24時間の処理が、 細胞計数及びチミジン取込みにより平板固定から48時間後に測定されるとおり、 用量依存的な形で、神経芽細胞腫 (NMB)の細胞分裂を刺激した、ということを示している（図５及び６を参照、EC_{5 0} ＝５×10^-7Ｍ）。興味深いことに、１μＭの濃度で活性ピークが存在し、これ はその後減少した。この減少は恐らくは、例えば神経細胞の生存促進といったそ の他のVIP 関係活性において以前に観察された現象(Brenneman，et al．前出、1 990；Goze et al.，J．Pharmacol．and Exp．Therap．257：959-966(1991))であ るレセプタ減感作によって説明がつく(Rosselin et al.,：血管作用性腸管ペプ チドと関連ペプチド(Said and Mutt.（編）Annals．of the N．Y．Acad．Sci.， 527：220-237(1988))。 さらに、VIP がこれらの神経芽細胞腫細胞上のレセプタに特異的に結合するこ とがわかり、レセプタ発現が発生的に見極められ、古い細胞（平板固定から48時 間後、２μＭのKd、図７）に比べてより若い細胞では約10倍高い親和力を示した （平板固定から24時間後、0.2μＭのKd）。0.2μＭのKdは、VIP 刺激型細胞増殖 についてのEC₅₀＝５×10^-7Ｍに密に対応している(VIPは平板固定から24時間後に 添加され、さらに24時間インキュベートされた、図５及び図６)。さらに、24時 間経過した培養（Ｂ_max＝６×10^-14モル／mg：図７）に比べ、48時間経過した培 養（Ｂ_max＝1.5×10^-14モル／mg）のＢ_maxには４分の１の減少が見られた。実際 、平板固定から48時間後（すなわち、利用できるレセプタの減少した数かその低 親和力状態にあるとき（図７））にさらに24時間のインキュベーションのために VIP が添加された時点で、それは有系分裂を誘発しなかった。その上、ノーザン ブロットハイブリダイゼーションは、これらの神経芽細胞腫におけるVIP mRNAの 存在を示した。図８では、VIP mRNAを表わす2100塩基のバンド（及びおそらくは VIP mRNA前駆体（Gozes et al.，Mol．Brain Res．2：137-148（1987）；Gozes et al.，Neuroendocrinolog（神経内分泌学），47：27-31（1988）を 表わす高分子量のハイブリッド形成バンドの痕跡）を識別することができる。合 わせて考えると、データーは、VIP が神経芽細胞腫増殖の自己分泌調節物質とし て作用することを示唆している。 さらに、現在、本発明のVIP アンタゴニストが神経芽細胞腫の成長（すなわち 細胞分裂）を阻害するのに使用できるものであることが発見された。さらに特定 的に言うと、ハイブリッドVIP アンタゴニストは、用量依存的な形で神経芽細胞 腫細胞内へのチミジンの取込みを遮断し（図９及び10を参照）、その効果は、レ セプタに対するVIP の親和力がより高いものである場合に、より若い神経芽細胞 腫細胞においてさらに確固としたものであるということが発見された。かくして 、VIP アンタゴニスト（例えばハイブリッドVIP アンタゴニスト又はNL−ハイブ リッドVIP アンタゴニスト）と神経芽細胞腫細胞を接触させることにより、神経 芽細胞腫細胞の成長すなわち細胞分裂を有効に阻害することができる。 さらにもう１つの態様において、本発明は、VIP 関連活性を阻害するのに充分 な量の前述のVIP アンタゴニストの１つと、薬学的に受容可能な希釈剤、担体又 は賦形剤を含んで成る薬学組成物を提供する。本発明の薬学組成物は、さまざま な薬物送り出し系にて使用するのに適している。本発明で使用するのに適した製 剤形態は、本書に参考として内含されているRemington's Pharmaceutical Scien ce(Mack Publishing Company，Phladelphia，PA，第17版(1985))の中に見い出さ れる。さらに、薬物送り出しのための方法についての簡単な再考に関しては、本 書に参考として内含されているLanger，Science 249：1527-1533(1990)を参照の こと。 上述の通り、VIP は、神経芽細胞腫及び数多くのガン(例えばNSCLC)の病因学 と関連性をもち、VIP が腫瘍発生に関わっていることを示唆している。その上、 上述の通り、本発明のVIP アンタゴニス トは、VIP 誘発型の神経芽細胞腫の細胞分裂を阻害し腫瘍細胞を含むVIP レセプ タの成長を阻害することが立証されてきている。かくして、本発明は、薬学的に 受容可能な賦形剤と組合わせて上述されたVIP アンタゴニストの１つを含む治療 用組成物又は薬剤において、VIP アンタゴニストの量が治療効果を提供するのに 充分なものであるような組成物又は薬剤を提供する。 治療的応用分野では、本発明のVIP アンタゴニストは、非経口投与、表面投与 、経口投与、局所投与のために意図された薬学組成物の形で実施される。好まし くは、薬学組成物は、非経口的に、例えば、静脈内、皮下、皮内又は筋内投与さ れる。従って、本発明は、受容可能な担体、好ましくは水性担体内に溶解又は懸 濁された上述のとおりのVIP アンタゴニストの溶液を含む非経口投与のための組 成物を提供する。例えば水、緩衝水、0.4％食塩水、0.3％グリシン、ヒアルロン 酸などを含むさまざまな水性担体を使用することができる。これらの組成物は、 従来の周知の殺菌技術により殺菌することができ、又無菌ろ過することもできる 。結果として得られた水溶液は、その状態のまま使用するよう梱包されてもよい し或いは凍結乾燥させてもよく、凍結乾燥された調製物は投与前に無菌溶液と組 合せられる。組成物は、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウ ム、塩化カリウム、塩化カルシウム、一ラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリ エタノールアミンなどといったpH調整剤及び緩衝剤、緊張性調整剤、加湿薬など を含め、生理条件に近づけるのに必要とされるような薬学的に受容可能な補助物 質を含むことができる。 固体組成物については、例えば薬学グレードのマンニトール、ラクトース、で んぷん、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石、セルロース 、グルコース、スクロース、炭酸マグネ シウムなどを含む従来の非毒性固体担体を使用することができる。経口投与のた めには、一般に有効成分の10〜95％、より好ましくは25％〜75％の濃度で、以上 で列挙した担体といったような通常利用される賦形剤のいずれかを取込むことに よって、薬学的に受容可能な非毒性組成物が形成される。 エアゾル投与のためには、ポリペプチドは好ましくは、表面活性剤及び推進薬 と共に細かく分割された形で供給される。当然のことながら表面活性剤は非毒性 で、好ましくは推進薬中で可溶である。かかる作用物質の代表としては、脂肪族 多価アルコール又はその環式無水物を伴うカプロン酸、カプリル酸、ラウリン酸 、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステアリン酸、 オレイン酸などの、６〜22個の炭素原子を含む脂肪酸のエステル又は部分的エス テルがある。 混合した又は天然のグリセリドといった混合エステルを利用することができる 。例えば鼻腔内送り出しのためのレチシンを用いてのように、望みに応じて担体 を内含することもできる。 治療的応用分野では、本発明のVIP アンタゴニストは、VIP 関連活性を拮抗（ すなわち阻害）するのに充分な量で、患者に投与される。これを達成するのに適 切な量が、「治療上有効な用量」として定義づけされる。この用途にとって有効 な量は、例えば、利用される特定のVIP アンタゴニスト、阻害又は拮抗されるべ きVIP 関連活性、投与方法、患者の体重及び全身健康状態及び処方医の判断によ って左右されることになる。例えば、腫瘍成長の阻害のためには（例えばNSLC又 は神経芽細胞腫）、中実腫瘍内に直接注射される腫瘍 100ｇあたり0.35μｇ〜3. 5 μｇの範囲内に入るVIP アンタゴニストの量が、治療上有効な量となる。概日 リズムの阻害のためには、一日一回（夕方）鼻腔内投与される１〜10mgの用量範 囲内に入るVI P アンタゴニストの量が、治療上有効な量となる。 本発明について以下で特定の例を用いてさらに詳細に記述する。以下の例は、 例示を目的として提供されており、いかなる形であれ本発明を制限又は規定する ことを意図したものではない。 例：一般的手順 Ａ．VIP アンタゴニストの合成 本発明のペプチドすなわちVIP アンタゴニストは、手作業ならびに自動の（AB IMEDAMS422ペプチド合成装置）手順を用いて「ペプチド：その分析、合成、生物 学」（Gross and Molenhofer（編）Academic Press，N．Y．第２巻、ｐ３〜284( 1980)）の中のBarany and Merrifieldの「固相ペプチド合成」で記述されている ように、固相戦略を用いて合成された。 １．ペプチド合成−手作業手順 スイスのNova社から購入した４−（α−〔２，４−ジメトキシフェニル〕Fmoc −アミノメチル）フェノキシ樹脂上で、上述のBarany and Merrifield の固相方 法の一般原則に従って機械的振とう機の中で手動式で対応するペプチド鎖を組立 てた。以下の溶剤は、ドイツの MercK社から購入した分析産物であった：塩化メ チレン（CH₂Cl₂）、Ｎ−メチルピロリドン(NMP)及びジメチルホルムアミド(DMF) 。トリフルオロ酢酸(TFA)、ジイソプロピル−エチルアミン（DIEA）及びＮ，Ｎ ′−ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)は、米国 Aldrich社から購入した。 １−ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）は、スイスのNova社から入手した。 保護されたアミノ酸誘導体（Fmoc−AA）は全てＬ−形態のものであり、スイスの Bachem社から入手した。フルオレニルメトキシカルボニル（Fmoc）基により合成 を通してＮα−アミノ酸官能基が保護された。側鎖官能基は以下のとおり保護さ れた：すなわち、セリン(Ser)、アスパラギン酸( Asp)及びトレオニン(Thr)はｔ−ブチルで、リシン(Lys)はｔ−ブチルオキシカル ボニルで、アルギニン(Arg)はメトキシトリメチルフェニルスルフォニル(Mtr)で 、グルタミン及びアスパラギンはトリチル(Trt)で。 合成は、下記の表IVの段階１及び２に従って（表IV内に概略説明されたプロト コルを参照のこと）、市販の重合体すなわち４−（α−〔２，４−ジメトキシフ ェニル〕−Fmoc−アミノメチル）フェノキシ樹脂（0.47mmolのアミノ基／ｇ）か らのFmoc基の除去によって開始された。２つの反応容器内に入った10ｇの重合体 を利用した。溶剤の体積は、各容器内に20〜25mLであった。ペプチド鎖の組立て は、作用物質としてDCC(0.84ｇ，４mmol）及びHOBt（0.55ｇ，４mmol）を用いて 樹脂（５ｇ）に対してFmoc−Asn(0.92ｇ，４mmol)をカップリングすることによ って開始させた。カップリングをくり返した。アミノ酸分析により負荷（0.39mm ol／ｇ）を決定した。重合体上の未反応残留アミノ基は、CH₂Cl₂中の無水酢酸（ 10％）及びジイソプロピルエチルアミン（５％）と反応させることによってキャ ッピングした。ペプチド鎖の組立ては、表IVで概略説明されているプロトコルに 従ってFmoc−Asn−樹脂から出発した。 樹脂１ｇあたり約５mLの量が用いられたカップリング（すなわち段階５）を除 いて、全ての洗浄及び反応のための溶剤は、樹脂１ｇにつき10mLの量で測定され た。全てのカップリングは、各カップリング段階に先立ちDCC によって調製され たFmoc−アミノ酸誘導体のHOBt活性エステルを用いて行なわれた。カップリング のためには、それぞれモル比２：１のFmocアミノ酸１−ヒドロキシベンゾトリア ゾールエステル(すなわちFmoc−AA−OBt)と成長するペプチド鎖のαアミノ基を 利用した。２分間ピリジン−水中のニンヒドリン溶液中で数mg（すなわち約３mg ）の重合体を煮沸することにより、カップリング反応を監視した。確実に完全反 応させるため２回以上、Fm oc−アミノ酸のカップリングを反復した。２回目のカップリング又、必要な場合 にはその他の付加的なカッブリングにおいて、Fmoc−AA−OBt の量の半分が用い られた。次のアミノ酸の添加を目指した続行段階は、陰性のニンヒドリン試験の 後に初めて開始された（表IV中のプロトコルの段階15を参照のこと）。概して、 各カップリング段階の完了後、残留アミノ基は、塩化メチレン中の無水酢酸（10 ％）及びジイソプロピルエチルアミン（５％）で樹脂を処理することによってキ ャッピングされた。 ペプチド鎖の組立ての完了後、普通どおり、DMF 中のピペリドンにより、Ｎ末 端Fmoc保護基を除去した。ステアリル−VIP アンタゴニストの調製のため、新た に遊離したα−アミノ基を、DCC(0.84ｇ，１mmol)とHOBt（0.54ｇ，４mmol）を 試薬として用いてステアリン酸（0.74ｇ，４mmol）に対し（各反応容器内で）さ らに結合させた。反応は 120分間続行させ２回反復させた。完全に組立てたペプ チド鎖を含む樹脂を、プロトコルに従ってCH₂Cl₂で洗浄し、次に一晩真空下でP₂ O₅上にて乾燥させた。保護基の遮断解除及び樹脂からの（末端ステアリル基を伴 う又は伴わない）ペプチドの分割を、以下の通りに達成した：１ｇの乾燥樹脂を 100cc入りフラスコ内に入れ、これに対しチオアニソール（２mL）及びエタンジ チオール（２mL）を添加した。混合物を氷浴中で４℃まで冷却し、20mLのトリフ ルオロ酢酸を添加し、５分後にトリフルオロメタンスルホン酸（２mL）も添加し た。混合物を23時間室温で穏やかに撹拌した。 次に反応混合物を４℃まで冷却し、ドライエーテル50mL中に注ぎ込んだ。４℃ で60分間撹拌した後、固体材料（樹脂及びペプチド）をscinter 漏斗上でろ過し 、ドライエーテルで洗浄し、乾燥させ、次に50％の酢酸水溶液(100mL)で抽出し た。こうして得られたペプチドを含む溶液を高真空内で濃縮させ、残基（約15ml ）をSephadex G25カラム（45×６cm）上に直接装入した。１時間あたり45mLの流量でカラムを 0.1Ｎの酢酸で溶出させた。溶出を 274nmで監視した。望まれる分画を含む水溶 液を凍結乾燥させることにより、酸分解性分析段階でスカベンジャとして添加さ れる芳香族添加物を含まないペプチドが生成された。収量は白色粉末約 400mgで あった。 材料は、徹底的な酸加水分解に続くアミノ酸分析により明らかにされるように 、所要アミノ酸含有量を示した。 高性能液体クロマトグラフィ（HPLC）によるさらなる精製をSephadex分画化さ れた産物について実施した。しかしながら、HPLC精製を、粗製ペプチドについて 行なうことができる。Merck RP−８カラム（７μＭ，250×25mmのカラム）上で 精製を達成した。ペプチドを水中の35％のアセトニトリル中で適用し、１分あた り10mLの流量で水中35％のアセトニトリル及び 0.1％のTFA と水中75％のアセト ニトリルの間で打ち立てられた線形勾配で溶出させた。分画を収集し、分析用HP LCによる検査の後、切断を行なった。誘導された分画をプールし凍結乾燥させた 。純粋ペプチドの収量は30〜35％であった。 ２．ペプチド合成−自動手順 ステアリル末端基を伴う又は伴わないVIP アンタゴニストの合成は、Fmoc戦略 を介した市販のプロトコルを用いてABIMEDAMS422合成装置（ABIMED(Langenfeld ，Germany)を利用して自動手順によっても達成された。保護されたアミノ酸誘導 体は全て、１つの例外すなわち、Fmoc−Arg（Pmc）(PMC＝２，２，５，７，８− ペンタメチルクロマン−６−スルフォニル)がFmoc−Arg（Mtr）に置換したとい う点を除いて、手作業手順について上で概略説明した通りであった。カップリン グ剤としてPyBOP すなわちベンゾトリアゾリル−Ｎ−オキシ−トリス（ジメチル アミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホ スフェートを用いた。ペプチド鎖を上述の通り、４−（〔２′，４′−ジメトキ シフェニル〕−Fmoc−アミノエチル）−フェノキシ樹脂（Rink Amide Resin（No va、スイス）上で組立てた。樹脂からのペプチド鎖の最終的分割ならびに側鎖保 護解除を以下の通りに達成した。 ３．AMS422で合成されたペプチドの分割 分割混合物 TFA（トリフルオロ酢酸） 90％ 水 ５％ トリエチルシラン ５％ ペプチドと共に装荷された 100ｇの樹脂を、固相合成のために使用された反応 カラムの内部で３mLの分割混合物と共に30分間インキュベートした。30分後、反 応混合物を、分割した樹脂から分離し、さらに90分間分割を続行する。氷冷エー テル（すなわち第３ブチルメチルエーテル）で分割したペプチドを沈降させ、濃 縮した(４℃，2000rpm)。溶液を傾瀉させ、ペレットを再びエーテルと混合させ 、遠心分離した。この段階をもう一度くり返した。水中にペレットを溶解させ、 凍結乾燥のために凍結させた。粗製ペプチドの精製を、以上で記述した通りに行 なった。 ４．Ｒ¹＝Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキルを有するVIP アンタゴニストの合成 VIP アンタゴニストのペプチド鎖を、上記（１）で記述した通りに、重合体支 持体すなわちｐ−メチルベンズヒドリルアミン（MBHA）樹脂上で組立てる。最後 のアミノ酸残基（すなわちヒスチジン）の取込み後、Ｎ−α−保護基(ｔ−Boc) をTFA により除去し、重合体をジイソプロピルエチルアミン（DIEA）で処理し、 洗浄し、ニンヒドリン試験に付す。次に、重合体をエチルアルコール（１ｇ／10 mL）内で懸濁させ、対応するアルデヒドＲ′−CH＝Ｏ（Ｒ′＝他の任意のアルデ ヒドの疎水性半分）を添加し（遊離Ｎ末端アミノ基１当量に対し３〜４当量のア ルデヒド）、混合物を室温で一晩穏やかに撹拌した。重合体をろ過し、エタノー ル（３×10mL）で洗浄し、エタノール及びNaBH₄内で再懸濁し（シッフ塩基Ｒ′ −CH＝Ｎ−−１当量に対して還元剤３〜４当量）、混合物を室温で２時間穏やか に撹拌する。代替的には、NaBH₃CN（シッフ塩基１当量に対して３〜４当量）を 、（0.1〜0.2mL の酢酸の存在下で）利用することができる。DMF 又はNMP とい ったようなその他の有機溶剤の中で、縮合及び還元反応を実行することもできる 。還元反応の完了後に、重合体をろ過し、洗浄し、乾燥させ、上述の通り分割混 合物で処理することができる。望ましい最終産物を提供するべく上述のものと同 様の要領で粗製産物を精製する。 産物の純度は、分析用HPLC（Merck RP−８，125×４mmのカラム）によって確 認され、徹底的な酸加水分解(６ＮのHCl)に続くアミノ酸分析が、各成分アミノ 酸の予想値を提供した。 さまざまな合成ペプチドの分子量は、質量分析法(VG Tofspec，Laser Desorph on Mass Spectrometer，Fison Instruments，England)によって確認された。 Ｂ．細胞培養及び免疫細胞化学 以前に記述された方法により、ラットの皮質星状膠細胞を調製した（McCarthy and Partlow，Brain Res.，114：391-414（1976）；Evans，et al.，J．Neuroc hem.，43：131-138(1984)）。再度平板固定してから３〜５日後に、結合研究を 実施した。つねにイーグルMEM 中の10％のウシ胎児血清の中に、星状膠細胞培養 を維持した。これらの培養の細胞組成を、NSE 及びGFAP免疫細胞化学により決定 した(Brenneman et al.，J．Cell Biol.，104：1603-1610(19 87))。これらの分析は、培養が検出可能なNSE 陽性細胞を全く含んでおらず、95 ％以上の細胞がGFAPに対する血清で染色されたことを示していた。神経細胞機能 の検定のためには、CNS 由来の組織のいくつかの調製物を利用した。神経細胞の 生存に対するさまざまなハイブリッドアンタゴニストの効果を調査するため、以 前に記述された方法(Brenneman et al.，Dev．Brain Res.，9：13-27(1983))を 用いて、解離されたマウスの脊髄培養（12日目の胚から得られたもの）を使用し た。簡単に言うと、MEM 中の10％のウマ血清と10％のウシ胎児血清の中で細胞を 平板固定した。平板固定から１日目に、培地を、規定の培地成分(Brenneman et al.，前出(1987))で補足された５％のウマ血清に交換した。インビトロで９日経 過後に、培養を完全に培地交換し、VIP アンタゴニストで処理した。処理の持続 時間は９日目から14日目までで、その後NSE(すなわち充分明確になっている神経 細胞マーカーである神経細胞特異的エノラーゼ)についての免疫細胞化学のため に培養を固定した。合計面積60mmで 100フィールドについて、細胞計数を行なっ た。処理について知らない状態で、神経細胞を計数した。結合研究についても、 類似の細胞調製物を用いた。 Moody et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．90：4345(1993)により記述 されている通りにNSCLC 細胞を増殖させ、Wollman et al.，Brain Res.，624：3 39(1993)により記述されている通りに神経芽細胞腫細胞を増殖させた。 Ｃ．放射リガンド結合研究 0.1％のウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝溶液を用いて、４℃で無傷細胞 についてVIP 結合研究を行なった。以前の研究は、VIP に対する短時間の露呈が 、分単位の半減期で、透明なエンドソーム小胞内へのペプチドレセプタ複合体の 内在化を結果としてもたら すことを示していた(Boissard et al.，Cancer Res.，46：4406−4413(1986))。 VIP はリソソーム内で分解されるか又は細胞内エフェクタとして役立ち得る。大 部分のVIP レセプタは、細胞表面まで再循環させられる(Luis et al.，Biochimi e，70：1311-1322(1988))。内在化は、組織特異的であり（Artaunis et al.，Am ．J．Physiol.，256：G689-G697(1989)）、４℃で遮断される（Svobada et al. ，Eur．J．Biochem.，176：707-713(1988)）。従って、全ての結合研究は、上述 のさまざまなCNS 調製物からの無傷の細胞について４℃で行なわれた。星状膠細 胞培養内にて行なわれた経時的実験は、細胞培養内での50pMの¹²⁵Ｉ−標識づけ されたVIP(35mmの組織培養皿１枚につき 0.3〜0.5mg のタンパク質)との一時間 のインキュベーションの間に平衡結合が達成されることを示した。特異的VIP 結 合は、１時間と３時間のインキュベーションの間では増大しなかった。しかしな がら、３時間のインキュベーション全体を通して、非特異的結合が増大した。標 識付けされたリガンドは、New England Nuclear(Boston，MA)から購入した、類 似の特異的活性を備えた、tyr²²での〔¹²⁵Ｉ〕−VIP(2000Ci／mmol，Amersham C orp.，Arlington Heights，IL)又はtyr¹⁰ならびにtyr²²で標識づけされたヨウ素 化VIP であり、両方について同じ結果が得られた。さらに、我々はVIP をクロラ ミンＴ方法を用いて標識づけした。簡単に言うと、クロラミンＴ（15μｇ，Sigm a chemical Corp.）の存在下で 100μｇのペプチドを〔¹²⁵Ｉ〕−Na（１mCi，Am ersham，Inc）と共にインキュベートさせた。３分後に、異性重亜硫酸ナトリウ ム（35μｇ）を添加することにより反応をクエンチングされた。さらに３分後、 １％のKI 10 μＬを添加し、Sephadex Ｇ−25ゲルろ過により放射性ペプチドか ら遊離標識付きヨウ素を分離した。１％のウシ血清アルブミンの存在下でリン酸 緩衝溶液(PBS)中で溶出を 行なった。シリカＣ−８カラム（RP−８，７μｍ，250×10mm）を用いた逆相HPL Cにより、純度及び分子同一性についてヨウ素化ペプチドを分析した。 50μＭの〔¹²⁵Ｉ〕−VIP を添加する前に30分間アンタゴニスト（１pM-10μＭ ）上でいずれかのVIP と共に培養を予備インキュベートした。競合する標識付け 無しのペプチドとの0.5時間の予備インキュベーションを行なって、放射性ペプ チドの非特異的結合を最小限におさえた。次に、放射性ペプチドの培養と共に、 標識づけされたリガンドをインキュベートした。次に、１時間、培養と共に、標 識づけされたリガンドをインキュベートし、その後培地を除去し、１mLのリン酸 緩衝溶液（４℃）の添加及び迅速な除去によって細胞を３回洗浄した。その後、 標識づけした細胞を 0.2ＮのNaOH内で溶解させ、放射能の計数のため移送した。 変位曲線の結合パラメータは、ACCUFIT プログラム（London Software，Chagrin Falls，OH）によって決定された。このプログラムは、以前に記述された非線形 最小二乗回帰分析法を実行する（Feldman，Anal．Biochem.，48：317-338（1972 ）；Linden，J．Cyclic Nucleotide Res.，8：163-172(1982)：及びUnnerstall ，「神経伝達物質レセプタ分析の諸方法」（Yamamura，Enna and Kuher（編）、 Raven Press，New York(1990)中の「結合データのコンピュータ関連分析」）。 Ｋ_dv，Ｋ_i及びＫ_Bの値は、平衡条件を仮定して計算した。 Ｄ．ｃ−fos mRNA検定 ｃ−fos 実験のためには、SCLC細胞を、0.5％のウシ胎児血清を含むSTT 培地 を用いて培養した。４時間後、細胞を60分間、10nMのBNといったような刺激で処 理した。イソチオシアン酸グアニジウム(GIT)方法を用いて分離した。前述の通 りに、0.66Ｍのホルムアルデヒド１％アガロースゲル内で変性RNA を10μｇ分離 させた。RNA の無欠性を評定するため、臭化エチジウムでゲルを処理した。RNAを一晩ニトロ セルロース膜上にブロットし、Bethes da Research Laboratorisのランダムプラ イミングキットを用いて³²Ｐ−dCTPで標識づけされたｃ−fos プローブを用いて 膜をハイブリッド形成させた。１日80℃で Kodax XAR−２フィルムに膜を露呈し た。Molecular Dynamics濃度計を用いてオートラジオグラムを分析した。 Ｅ．cAMP検定 上述の通り細胞培養の中にラット星状膠細胞を維持した。低温トリクロロ酢酸 抽出物（Evans et al.，前出、1984年）から放射性免疫検定法(NENキット、New England Nuclear)により、cAMPの蓄積を測定した。さらに10分間の１μＭのVIP とのインキュベーションに先立ち５分間、さまざまVIP アンタゴニストを星状膠 細胞培養と予備インキュベートした。VIP 用量応答曲線の平行右方シフトをひき 起こすVIP アンタゴニストの能力を測定することにより、アデニル酸シクラーゼ でカップリングされたVIP レセプタ及び神経細胞の生存に結びつけられたVIP レ セプタ（上記参照）に対するVIP アンタゴニストの親和力を評定した（Mayer，J ．Pharmacol．Exp．Ther.，161：116-125（(1972)）。アゴニストの一定の与え られた濃度の存在及び不在下でのVIP の等活性濃度の比率をCRとしてＫ_a＝〔ア ンタゴニスト〕／（CR−１）という等式から、VIP アンタゴニストに関する解離 定数を計算した。刺激曲線の中央点でVIP の等活性濃度（EC）を設定した。 Ｆ．チミジンの取込み チミジン取込みのためには、24時間のインキュベーション期間中細胞を³Ｈ− チミジン（４μCi／皿）に露呈した。次に培地を除去し、35mmの組織培養皿(0.5 mL／皿)に0.2ＮのNaOHを付加し、約20分間インキュベートした。0.3％のポリエ チレンイミンで予め浸漬 したGF／Ｃろ紙を通して細胞懸濁液をろ過した。フィルターを25mLのH₂O 及び５ mLのエタノールで洗浄し、乾燥し、放射能について計数した。 Ｇ．概日運動活動リズム 動物を各々別々のカゴの中に入れ、赤外線検出器の備わった動物監視システム を用いて６〜９日間連続して運動活動を記録した。運動活動リズムの分光分析を 、活動データに対し異なる正弦曲線を適合することによって決定した（Matter e t al.，Chronoliology Int'1，8：460(1991)を参照のこと）。 以上で言及した刊行物は全てその全体が参考として本書に内含されている。 上述の発明は、明確さ及び理解を期して幾分か詳細に述べられてきたが、この 開示を読めば当業者なら、形及び詳細のさまざまな変更を本発明の精神及び範囲 から逸脱することなく加えることができる、ということが理解できるだろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (71)出願人 エダ リサーチ アンド ディベロップメ ント カンパニー リミティド イスラエル国，76100 レホボット，ピー. オー．ボックス 95，ウェイツマン イン スティテュート オブ サイエンス（番地 なし) (71)出願人 ムーディー，テリー ダブリュ. アメリカ合衆国，メリーランド 20876, ジャーマンタウン，マイルストーン マナ ー コート 11 (72)発明者 ムーディー，テリー ダブリュ. アメリカ合衆国，メリーランド 20876, ジャーマンタウン，マイルストーン マナ ー コート 11 (72)発明者 ゴゼス，イラーナ イスラエル国，ラマート ハシャロン，ハ ーマル ストリート 14 (72)発明者 ブレネーマン，ダグラス イー. イスラエル国，エムディー 20872，ダマ カス，サンタ アニタ 10601 (72)発明者 フリドキン，マティティアフー イスラエル国，76284 レホボット，ミラ ー ストリート 23

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． R¹-Lys-Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-G ln-X¹-Ala-X²-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-AsnNH-R²。というアミノ酸配 列を含む血管作用性腸管ポリペプチド(VIP)アンタゴニストにおいて、この式中 Ｒ¹及びＲ²は、そのうちの少なくとも１つが水素であることを条件として、水 素、Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキル及びＣ₁〜Ｃ₂₀アシルから成るグループの中から独立して 選択された一員であり、 Ｘ¹及びＸ²は、天然に発生するアミノ酸及びアミノ酸擬似体から成るグループ の中から独立して選ばれた一員であり、しかもLys-Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-Thr-As p-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Il e-Leu-Asn。という組成物ではない、VIP アンタゴニスト。 ２．Ｘ¹及びＸ²が、疎水性をもつ天然に発生するアミノ酸及びアミノ酸擬似体 から成るグループから独立して選択された一員である、請求の範囲第１項に記載 の血管作用性腸管ポリペプチド(VIP)アンタゴニスト。 ３．Ｒ¹がＨであり、 Ｒ²がＨであり、 Ｘ¹がノルロイシン残基であり、 Ｘ²がバリン残基である、 請求の範囲第１項に記載の血管作用性腸管ポリペプチド(VIP)アンタゴニスト。 ４．Ｒ¹がCH₃(CH₂)₁₆CO−であり； Ｒ²がＨであり、 Ｘ¹がノルロイシン残基であり、 Ｘ²がバリン残基である、 請求の範囲第１項に記載の血管作用性腸管ポリペプチド(VIP)アンタゴニスト。 ５．Ｒ¹がCH₃(CH₂)₁₆CO−であり Ｒ²がＨであり、 Ｘ¹がメチオニン残基であり、 Ｘ²がバリン残基である、 請求の範囲第１項に記載の血管作用性腸管ポリペプチド(VIP)アンタゴニスト。 ６．拮抗作用をもたらすのに充分な量で血管作用性腸管ポリペプチド(VIP)ア ンタゴニストを哺乳動物に投与することを含んで成る哺乳動物内のVIP 関連活性 を拮抗する方法において、前記アンタゴニストがR¹-Lys-Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-T hr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-X¹-Ala-X²-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser -Ile-Leu-AsnNH-R²。というアミノ酸配列を含み、この式中 Ｒ¹及びＲ²は、そのうちの少なくとも１つが水素であることを条件として、水 素、Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキル及びＣ₁〜Ｃ₂₀アシルから成るグループの中から独立して 選択された一員であり、 Ｘ¹及びＸ²は、天然に発生するアミノ酸及びアミノ酸擬似体から成るグループ の中から独立して選ばれた一員であり、しかも前記アンタゴニストがLys-Pro-Ar g-Arg-Pro-Tyr-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Ly s-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn。という組成物ではない、拮抗方法。 ７．前記アンタゴニストのＲ¹がＨであり、 前記アンタゴニストのＲ²がＨであり、 前記アンタゴニストのＸ¹がノルロイシン残基であり、 前記アンタゴニストのＸ²がバリン残基である、請求の範囲第６ 項に記載の方法。 ８．前記アンタゴニストのＲ¹がCH₃(CH₂)₁₆CO−であり、 前記アンタゴニストのＲ²がＨであり、 前記アンタゴニストのＸ¹がノルロイシン残基であり； 前記アンタゴニストのＸ²がバリン残基である、 請求の範囲第６項に記載の方法。 ９．前記アンタゴニストのＲ¹がCH₃(CH₂)₁₆CO−であり、 前記アンタゴニストのＲ²がＨであり、 前記アンタゴニストのＸ¹がメチオニン残基であり、 前記アンタゴニストのＸ²がバリン残基である、 請求の範囲第６項に記載の方法。 10．腫瘍細胞を含むVIP レセプタの成長を阻害する方法において、この阻害を もたらすのに充分な量で血管作用性腸管ポリペプチド(VIP)アンタゴニストと前 記腫瘍細胞を接触させる段階を含んで成る方法であって、前記アンタゴニストが R¹-Lys-Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-X¹-Al a-X²-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-AsnNH-R²。というアミノ酸配列を含み 、この式中 Ｒ¹及びＲ²は、そのうちの少なくとも１つが水素であることを条件として、水 素、Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキル及びＣ₁〜Ｃ₂₀アシルから成るグループの中から独立して 選択された一員であり、 Ｘ¹及びＸ²は、天然に発生するアミノ酸及びアミノ酸擬似体から成るグループ の中から独立して選ばれた一員であり、しかも前記アンタゴニストがLys-Pro-Ar g-Arg-Pro-Tyr-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr−Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-L ys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn。という組成物ではない、成長阻害方法。 11．前記アンタゴニストのＲ¹がＨであり、 前記アンタゴニストのＲ²がＨであり、 前記アンタゴニストのＸ¹がノルロイシン残基であり、 前記アンタゴニストのＸ²がバリン残基である、請求の範囲第10項に記載の方 法。 12．前記アンタゴニストのＲ¹がCH₃(CH₂)₁₆CO−であり、 前記アンタゴニストのＲ²がＨであり、 前記アンタゴニストのＸ¹がノルロイシン残基であり； 前記アンタゴニストのＸ²がバリン残基である、 請求の範囲第10項に記載の方法。 13．前記アンタゴニストのＲ¹がCH₃(CH₂)₁₆CO−であり、 前記アンタゴニストのＲ²がＨであり、 前記アンタゴニストのＸ¹がメチオニン残基であり、 前記アンタゴニストのＸ²がバリン残基である、 請求の範囲第10項に記載の方法。 14．前記細胞が非小細胞肺ガン細胞である、請求の範囲第10項に記載の方法。 15．神経細胞の死滅を誘発する方法において、この神経細胞の死滅をもたらす のに充分な量の血管作用性腸管ポリペプチド(VIP)とこの神経細胞を接触させる 段階を含んで成る方法であって、前記アンタゴニストが R¹-Lys-Pro-Arg-Arg-Pr o-Tyr-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-X¹-Ala-X²-Lys-Lys-Tyr-Leu- Asn-Ser-Ile-Leu-AsnNH-R²。というアミノ酸配列を含み、この式中 Ｒ¹及びＲ²は、そのうちの少なくとも１つが水素であることを条件として、水 素、Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキル及びＣ₁〜Ｃ₂₀アシルから成るグループの中から独立して 選択された一員であり、 Ｘ¹及びＸ²は、天然に発生するアミノ酸及びアミノ酸擬似体から成るグループ の中から独立して選ばれた一員であり、しかも前記 アンタゴニストがLys-Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg- Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn。という組成物で はない、誘発方法。 16．前記アンタゴニストのＲ¹がＨであり、 前記アンタゴニストのＲ²がＨであり、 前記アンタゴニストのＸ¹がノルロイシン残基であり、 前記アンタゴニストのＸ²がバリン残基である、請求の範囲第15項に記載の方 法。 17．前記アンタゴニストのＲ¹がCH₃(CH₂)₁₆CO−であり、 前記アンタゴニストのＲ²がＨであり、 前記アンタゴニストのＸ¹がノルロイシン残基であり； 前記アンタゴニストのＸ²がバリン残基である、 請求の範囲第15項に記載の方法。 18．前記アンタゴニストのＲ¹がCH₃(CH₂)₁₆CO−であり、 前記アンタゴニストのＲ²がＨであり、 前記アンタゴニストのＸ¹がメチオニン残基であり、 前記アンタゴニストのＸ²がバリン残基である、 請求の範囲第15項に記載の方法。 19．哺乳動物における概日リズムを阻害する方法において、この阻害をもたら すのに充分な量の血管作用性腸管ポリペプチド(VIP)アンタゴニストを前記哺乳 動物に投与する段階を含んで成る方法であって、前記アンタゴニストが R¹-Lys- Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-X¹-Ala-X²-Ly s-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-AsnNH-R²。というアミノ酸配列を含み、この式 中 Ｒ¹及びＲ²は、そのうちの少なくとも１つが水素であることを条件として、水 素、Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキル及びＣ₁〜Ｃ₂₀アシルから 成るグループの中から独立して選択された一員であり、 Ｘ¹及びＸ²は、天然に発生するアミノ酸及びアミノ酸擬似体から成るグループ の中から独立して選ばれた一員である、概日リズムの阻害方法。 20．前記アンタゴニストのＲ¹がＨであり、 前記アンタゴニストのＲ²がＨであり、 前記アンタゴニストのＸ¹がメチオニン残基であり、 前記アンタゴニストのＸ²がバリン残基である、 請求の範囲第19項に記載の方法。 21．前記アンタゴニストのＲ¹がＨであり、 前記アンタゴニストのＲ²がＨであり、 前記アンタゴニストのＸ¹がノルロイシン残基であり； 前記アンタゴニストのＸ²がバリン残基である、 請求の範囲第19項に記載の方法。 22．神経芽細胞腫の細胞分裂を阻害する方法において、この阻害をもたらすの に充分な量の血管作用性腸管ポリペプチド(VIP)アンタゴニストと前記神経芽細 胞腫細胞を接触させる段階を含んで成る方法であって、前記アンタゴニストが R¹ -Lys-Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-X¹-Ala -X²-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-AsnNH-R²。というアミノ酸配列を含み、 この式中 Ｒ¹及びＲ²は、そのうちの少なくとも１つが水素であることを条件として、水 素、Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキル及びＣ₁〜Ｃ₂₀アシルから成るグループの中から独立して 選択された一員であり、 Ｘ¹及びＸ²は、天然に発生するアミノ酸及びアミノ酸擬似体から成るグループ の中から独立して選ばれた一員である、神経芽細胞腫細胞分裂阻害方法。 23．前記アンタゴニストのＲ¹がＨであり、 前記アンタゴニストのＲ²がＨであり、 前記アンタゴニストのＸ¹がメチオニン残基であり、 前記アンタゴニストのＸ²がバリン残基である、 請求の範囲第22項に記載の方法。 24．前記アンタゴニストのＲ¹がＨであり； 前記アンタゴニストのＲ²がＨであり、 前記アンタゴニストのＸ¹がノルロイシン残基であり； 前記アンタゴニストのＸ²がバリン残基である、 請求の範囲第22項に記載の方法。 25．薬学的に受容可能な賦形剤と血管作用性腸管ポリペプチド(VIP)アンタゴ ニストを含んで成る薬学組成物において、このアンタゴニストが R¹-Lys-Pro-Ar g-Arg-Pro-Tyr-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-X¹-Ala-X²-Lys-Lys- Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-AsnNH-R²。というアミノ酸配列を含み、この式中 Ｒ¹及びＲ²は、そのうちの少なくとも１つが水素であることを条件として、水 素、Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキル及びＣ₁〜Ｃ₂₀アシルから成るグループの中から独立して 選択された一員であり、 Ｘ¹及びＸ²は、天然に発生するアミノ酸及びアミノ酸擬似体から成るグループ の中から独立して選ばれた一員であり、しかも前記アンタゴニストがLys-Pro-Ar g-Arg-Pro-Tyr-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Ly s-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn。という組成物ではない、薬学組成物。