JPH09511642A - フアルネシルトランスフェラーゼ阻害特性を示す新規ペプチド、およびそれを調製するために使用できるストレプトミセス属の微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ストレプトミセスCBS154.94株、その突然変異体または誘導体、ならびに該株を使用してペプチドを調製するための方法が開示されている。一般式（Ｉ）の新規ペプチド、それを含む医薬組成物、およびその癌治療における使用も開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】 フアルネシルトランスフェラーゼ阻害特性を示す新規ペプチド、および それを調製するために使用できるストレプトミセス属の微生物 本発明は微生物株およびフアルネシルトランスフェラーゼ阻害特性を示す新規 ペプチドに関する。 ras発癌遺伝子の活性化は、ヒトの癌の10−30％に関与している。対応するRas タンパク質はインビボで、細胞可溶性前駆体の状態で合成され、次にこれに生物 活性を付与し、そして哺乳類細胞を形質転換できるようにするために翻訳後に修 飾される。 この翻訳後修飾の第一の、そして必須な段階は、Rasのカルボニル末端基に位 置するシステイン残基のチオール基のフアルネシル化からなる。このシステイン 残基はプレニル化の同定配列CAAXの一部であり、ここでＣはシステインを、Ａは 脂肪族残基を、そしてＸは任意のアミノ酸を表す。 タンパク質フアルネシルトランスフェラーゼは、フアルネシル二リン酸からRa s CAAXペプチドにフアルネシル基を転移することを触媒する。このフアルネシル トランスフェラーゼタンパク質は、Ｃ-末端から４番目の残基がシステインであ るという発現条件下で、タンパク質のＣ−末端に位置するCAAX型のテトラペプチ ドを認識する。 このプレニル化の結果、Rasタンパク質は細胞を形質転換するために必要な生 物学的活性を有するようになる。したがってこのプレニル化は、Rasタンパク質 の生物学的活性を調節するために必要と思われる。 この翻訳後修飾を阻害する化合物の発見は、直ちに新たな抗−癌治療を開発す るための手段となるように思われた。 すなわち遺伝的研究では、Rasのフアルネシル化阻害は、Rasタンパク質が膜に 位置することを防ぎ、その結果、Rasタンパク質の正常細胞を癌細胞へ形質転換 する能力を遮断することが示された。 本発明の主な目的は、フアルネシルトランスフェラーゼの新規阻害剤を提案す ることである。 より詳細には、本発明はタンパク質フアルネシルトランスフェラーゼに関して 阻害特性を示すペプチドを生産するために、特に有利な特性を有するストレプト ミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物株の単離の成果である。 したがって本発明の１つの観点は、微生物ストレプトミセスCBS154.94、その １つの誘導体またはその１つの突然変異体であることを特徴とするストレプトミ セス株に関する。 本発明の意味の中で、誘導体または突然変異体とはストレプトミセスCBS154.9 4株から得られ、かつ本発明に従うペプチド、そしてより具体的にはタンパク質 フアルネシルトランスフェラーゼに関して阻害特性を示すペプチドを生産するた めに使用できる任意の株と考えられている。特に、そのような誘導体または突然 変異体は、遺伝的（ＤＮＡの変化）または生化学的修飾により得ることができる 。例えば非−特異的な手段： −物理的要因（Ｘ−線、紫外線等）、または −化学的要因（アルキル化またはビアルキル化剤、挿入剤等）、あるいは、例え ばＤＮＡ−直接型特異的突然変異挿入システム（トランスポゾン、レトロトラン スポゾン、組み込みプラスミド等）の特定の手段のような様々な突然変異誘発法 を、この目的のために使用できる。 適当な培地でのこの株の発酵、および続いて対応する発酵ブロスの抽出により 、フアルネシルトランスフェラーゼの従来の阻害剤と比べて新規な構造を有する ペプチドを単離できるが、この点に関しては予期せぬ興味深い点であった。 また本発明は、ストレプトミセスCBS154.94株、またはその１つの突然変異体 を発酵し、そして対応する発酵ブロスを抽出することにより得られるペプチドに 関する。 また本発明は、ストレプトミセスCBS154.94株、またはその１つ誘導体または 突然変異体を培養し、そして少なくとも１つのペプチドを回収することにより、 ペプチドを生産する方法に関する。 この株は常法により、すなわち該微生物が発育するために必要な基質を含む培 地で、適当な温度および通気条件下で発酵する。微生物の発育に最適なこれらの 条件の決定には、当業者に周知である簡単な日常的操作が必要であることは明ら かである。 単に情報として、培地はグルコース、酵母エキス、肉エキス、NaCl、CaCO₃お よび寒天から構成することができる。発酵は好ましくは周囲温度よりも高い温度 で、そしてより具体的には25℃から30℃の間の温度で行う。pHは7のオーダーで 、そして培地に通気し、そして振盪する。 発酵の終わりに、発酵ブロスを回収し、そして遠心する。上清および相当する 菌糸ペレットを次に抽出する。 これらは適当な有機溶媒を使用して抽出する。この溶媒は好ましくは酢酸エチ ルである。活性ペプチドを単離するために、各々の有機相をプールし、濃縮し、 そしてクロマトグラフィーを行う。後述する実施例１は、発酵ブロスからペプチ ドを単離するためのこの方法を詳細に記載す る。 より具体的には、本発明は一般式Ｉ： 式中： Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は互いに独立して、水素原子または直鎖もしくは 分枝のＣ₁−Ｃ₄低級アルキル基を表す、 のペプチドに関する。 より具体的には、これらのペプチドはＲ４がメチル基を表し、そしてＲ３が水 素原子を表す一般式Ｉの化合物である。 本発明において好適なペプチドとして、より具体的には以下のペプチド１、２ および３を挙げることができる： −ペプチドNo.1の場合には、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が水素原子を表し、そしてＲ ４がメチル基を表す。 −ペプチドNo.2の場合には、Ｒ２およびＲ４がメチル基を表し、そしてＲ１およ びＲ３が水素原子を表す。 −ペプチドNo.3の場合には、Ｒ１、Ｒ２およびＲ４がメチル基を表し、そしてＲ ３が水素原子を表す。 驚くべきことに、これらのペプチドはフアルネシルトランスフェラー ゼ阻害試験において、有意なイン−ビトロ活性を示す。 SPA(シンチレーション近接アッセイ:scintillation proximity assay)法の原 理をフアルネシルトランスフェラーゼの酵素活性をアッセイするために応用する 。この方法に従い、フアルネシルトランスフェラーゼ阻害活性は、(³Ｈ)-フアル ネシルピロホスフェート((³Ｈ)FPP)からビオチン化受容体基質に転移される(³Ｈ )-フアルネシルの量により測定される。 また本発明は、抗−癌治療における本発明のペプチドの使用に関する。 さらに本発明は、１つ以上の不活性な、または生理的に活性な医薬的に許容で きる補助剤と混合された、少なくとも１種の本発明のペプチドを十分量で含む医 薬組成物に関する。１．材料および方法 本発明のストレプトミセス株の試料、そして以下に示す実施例で使用した試料 を、ブタペスト条約に基づき、オランダ、バールンのセントラアルビュロー フ ォーア シュミメル カルチュレン（Centraalbureau voor schimmel culturen) (糸状菌カルチヤーのための中央局:Central bureau for mould cultures:CBS)に 寄託し、そしてCBS154.94の寄託番号で登録した。活性代謝物を検出するために使用する方法：フアルネシルトランスフェラーゼ阻 害のためのシンチレーション近接アッセイ(SPA)試験 SPA法(H.E.HartおよびE.B.Greenwald,J.Nucl.Med,20,1062-1065,1979ならびに Nelson N.，Analytical Biochemistry,165,287-293,1987)の原理を、フアルネシ ルトランスフェラーゼ(Ftase)の酵素活性をアッセイするために応用する。この 酵素はヒトTHP1細胞から部分精製された（F romage N.,Guitton J.D.,Joyeux C.，Desanlis F.，Boniface O.,Soris H.M.,Bo ucher F.,Clerc F.F.,Crespo A.,Duchesne M.,Lavayre J.,Tocque B.，Van Der Pyl D.,Mayaux J.F.,Becquart J.,バイオ−クロマトグラフィーおよび分子生物 学に関する第５回欧州ＧＦＢＣ会議、1992年、5月12-14日、仏国）。ビオチン化 された受容体基質は、Ｂラミン（BLB）の末端配列の11アミノ酸に対応するペプ チドである。フアルネシルピロリン酸である供与体基質は、トリチウムで標識さ れている(³HFPP)。この酵素は³HFPPをビオチン化受容体基質に転移し、そして一 旦反応が止まると、フアルネシル化されたペプチドは、蛍光シンチラントをカプ セル化し、そしてストレプトアビジン(アマシャムキット：Amersham kit TRKQ70 10(商標))に結合したビーズに捕捉される。放射性−標識ペプチドはビーズを励 起し、これは次に固体−液体シンチレーションカウンター(Topcount(商標)、パ ッカード：Packard)で定量される発光を生じる。 このSPA反応は、40μlのFtase(2μg)を、20μlのBLB(0.1μM)、20μlの³HFPP( 0.12μM)および20μlのアッセイ緩衝液(50mM Hepes、pH7.5、5mM MgCl₂、5mM DT T、20mM KCl、0.01％ triton X100（対照）または20μlの試料（アッセイ緩衝液 で希釈：スクリーニング）を含むマクロタイタープレートに加えて開始する。プ レートを37℃で60分間インキューベーションし、そして反応はSPAビースを含む1 50μlの停止試薬を加えて停止させる。プレートを接着フィルムで密閉し、平衡 に達するように周囲温度に30分間静置し、そして次にTopcountカウンターで計数 する。結果は１分あたりの崩壊(dpm)を計数し、そして対照酵素と比較して％阻 害として表した（ブランクを引いた後）。化合物のIC₅₀値は、非−直線的回帰に より 算出される。実施例１ ストレプトミセスCBS154.94株に由来する本発明の活性代謝物の調製 250mlの培地(5g/リットルのペプトン、5g/リットルの酵母エキス、5g/リット ルの肉エキス、15g/リットルのグルコース、5g/リットルのNaCl、3g/リットルの CaCO₃、1g/リットルの寒天、pH7.0)を含む2000mlのエルレンマイヤーフラスコに 、凍結液体培養物状態のストレプトミセスCBS154.94の培養物を播種する。フラ スコを振盪機内で150rev/分で振盪し、その温度設定は28℃である。 72時間後、64％のこの培養物を2000mlの同培地を含む6000mlの丸底フラスコに 移す。脇に２つの首(１つは播種用であり、もう１つは培養器への接種用)が付い ているこの丸底フラスコを、28℃で１分あたり約1000回転の磁気撹拌機で撹拌す る。インキューベーションの72時間後、この培養物全体を滅菌状態で、60リット ルの滅菌済(120℃で20分間)培地、20g/リットルのAlburex(商標)N、15g/リット ルのグルコース、2g/リットルのCaCO₃を含む100リットルの生産発酵槽に移す。 培養物を91時間、約28℃および0.4バールの圧力に維持し、その間400rev/分で撹 拌し、そして2cm³／時間の速度で通気する。56.2kgのブロスをSharples AS16（ 商標）遠心機を使用して遠心する。この結果、水性の上清および菌糸状のペレッ トを生じる。上清を２回、１容量の酢酸エチルで抽出する。相を分離した後、有 機相を減圧下で２リットルに濃縮する。菌糸状のペレットを２時間にわたって分 解する目的で、40リットルの80:20のアセトンおよび水の混合物に溶解する。細 胞残屑を焼結ガラス漏斗を通す濾過により除去し、そしてアセトンを除去するた めに濾液を減圧下で６リット ル容量に濃縮する。６リットルの水性相(測定pHは5.8)を15リットルの酢酸エチ ルで２回抽出する。相分離の後、有機相を減圧下で２リットルに濃縮する。濾液 および菌糸を処理して得た酢酸エチル抽出物をプールし、そして蒸発させ、57g の油状抽出物を得る。この抽出物を150mlのブタノールに溶解し、そして次に135 0mlのn-ヘプタンを激しく撹拌しながら加えて沈殿させる。相分離の後、上清を 除去し、そして生成した沈殿を焼結ガラス漏斗を通す濾過により分離する。真空 乾燥器内で一晩乾燥させた後、3μg/ml未満のIC₅₀を有する21.7gの抽出物を得る 。実施例２ 活性代謝物の単離および特性決定 前述の実施例に従い得た抽出物を、150mlの95:5のCH₂Cl₂およびMeOHの混合物 に溶解し、そしてシリカゲル（フリットを備え、そして650gの減圧充填したAmic on(商標)40-60μmシリカゲルを含む180×200mmカラム）でクロマトグラフ処理を 行う。溶出は、以下の比率および量のCH₂Cl₂/MeOHを使用して段階的に行う： 画分４および５を減圧下で蒸発させた後、約１μg/mlのIC₅₀を有する4.82gの活 性抽出物を得る。 次の精製工程は、C₁₈-グラフトシリカゲルのカラムの液体クロマトグ ラフィーから成る：前の活性抽出物(10:90のMeOHおよびH₂Oの混合物にすでに溶 解した)を、10ml/minの速度で、160mlの40-63μm Econosil prep C₁₈ HL Alltec h(商標)支持体を含む300mlのAnalytichem International ベッセルに流す。溶出 は10−100％のメタノール水溶液を使用して行う。この勾配は各段階が10の因子 で増加する500mlの段階を使用して作成する。この段階で、得られる10画分をメ ルク（Merck）60F 254(商標)シリカゲルプレートで薄層クロマトグラフィーで分 析し、AcOEt/EtOH/H₂O 50:15:10（容量／容量／容量）を溶離液として使用する 。この系で、必要な代謝物は0.6と0.7の間のフロントからの比（frontal ration :Rf）で移動し、254nmのUV下で見ることができ、そして硫酸バニリンを散布した 時、藤色になる。 70:30および80:20(容量／容量)のMeoH/H₂O混合物で溶離した後に得た画分は、 主に活性代謝物を含む；1948mgの第一画分および704mgの第二画分は、約0.7μg/ mlのIC₅₀を有する。 精製は高圧液体クロマトグラフィーで続ける：２つの前の画分を減圧下で濃縮 し、そして残渣を最少量のメタノールに溶解して、約50mg/mlの最終濃度とする 。各クロマトグラフィーには、2mlのこの溶液をHPLC装置に以下の仕様で注入す る： カラム：250×25mm、5μm Nucleosil SFCC C₁₈(商標) 流速：10ml／分 Ａ／Ｂ、50:50、容量：容量、単一溶出 Ａ：0.05％ ＴＦＡを含むH₂O Ｂ：CH₃CN/H₂O、95:5(容量:容量)、0.05％のTFAを含む 230nmでのＵＶ検出。 環状ペプチド１、２および３を溶出し、そしてそれぞれ保持時間24分、30分そ して45分で別々に集める。 多回のHPLC注入および上記条件での分離の結果、それぞれ本発明の代謝物１、 ２および３を含む３つの活性画分を単離する。減圧下でアセトニトリルを蒸発さ せた後、３つの画分を別個にMega Bond Elut C₁₈ Varian(商標)カラムに通し、 次にこれを蒸留水で流出液のｐＨが中性になるまですすぐ：次に溶出は約10mlの メタノールを使用して行う。 メタノール性溶出液を減圧下で蒸発した後、以下のものをそれぞれ得る： 各ペプチドの構造はマススペクトロメトリー、赤外線分光測定法および核磁気 共鳴(¹Hおよび¹³C)で決定した。実施例３ フアルネシルトランスフェラーゼタンパク質に対する阻害活性の測定 各々の代謝物について、その活性は前述の材料および方法と表題された章に記 載した方法を使用してアッセイする。結果は以下の表IIに与える。 活性代謝物の同定

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９６年２月２９日 【補正内容】 請求の範囲 １．ストレプトミセスCBS154.94株およびその突然変異体または誘導体。 ２．一般式Ｉ 式中： Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は互いに独立して、水素原子または直鎖もしくは 分枝のＣ₁−Ｃ₄低級アルキル基を表す、 に従うことを特徴とするペプチド。 ３．Ｒ４がメチル基を表し、そしてＲ３が水素原子を表す一般式Ｉのペプチドで あることを特徴とする、請求の範囲第２項に記載のペプチド。 ４．Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が水素原子を表し、そしてＲ４がメチル基を表す一般 式Ｉのペプチドであることを特徴とする、請求の範囲第２または３項に記載のペ プチド。 ５．Ｒ２およびＲ４がメチル基を表し、そしてＲ１およびＲ３が水素原子を表す 一般式Ｉのペプチドであることを特徴とする、請求の範囲第２または３項に記載 のペプチド。 ６．Ｒ１、Ｒ２およびＲ４がメチル基を表し、そしてＲ３が水素原子を 表す一般式Ｉのペプチドであることを特徴とする、請求の範囲第２または３項に 記載のペプチド。 ７．フアルネシルトランスフェラーゼ阻害活性を示すことを特徴とする、請求の 範囲第２ないし第６項のいずれか１項に記載のペプチド。 ８．請求の範囲第１項に記載のストレプトミセスCBS154.94株またはその突然変 異体の１つを発酵し、そして対応する発酵ブロスを抽出することにより得られる ペプチド。 ９．請求の範囲第１項に記載のストレプトミセスCBS154.94株を培養し、そして フアルネシルトランスフェラーゼ阻害活性を有する少なくとも１つのペプチドを 、対応する発酵ブロスを抽出して回収することを特徴とするペプチドの生産法。 １０．１つ以上の不活性な、または生理的に活性な医薬的に許容できる補助剤と 混合した、請求の範囲第２ないし第８項のいずれか１項に記載の少なくとも1つ のペプチドを十分量で含んで成る、医薬組成物。 １１．請求の範囲第２ないし第８項のいずれか１項に記載のペプチドの抗−癌治 療での使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:465）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ストレプトミセスCBS154.94株およびその突然変異体または誘導体。 ２．一般式Ｉ 式中： Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は互いに独立して、水素原子または直鎖もしくは 分枝のＣ₁−Ｃ₄低級アルキル基を表す、 に従うことを特徴とするペプチド。 ３．Ｒ４がメチル基を表し、そしてＲ３が水素原子を表す一般式Ｉのペプチドで あることを特徴とする、請求の範囲第２項に記載のペプチド。 ４．Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が水素原子を表し、そしてＲ４がメチル基を表す一般 式Ｉのペプチドであることを特徴とする、請求の範囲第２または３項に記載のペ プチド。 ５．Ｒ２およびＲ４がメチル基を表し、そしてＲ１およびＲ３が水素原子を表す 一般式Ｉのペプチドであることを特徴とする、請求の範囲第２または３項に記載 のペプチド。 ６．Ｒ１、Ｒ２およびＲ４がメチル基を表し、そしてＲ３が水素原子を 表す一般式Ｉのペプチドであることを特徴とする、請求の範囲第２または３項に 記載のペプチド。 ７．フアルネシルトランスフェラーゼ阻害活性を示すことを特徴とする、請求の 範囲第２ないし第６項のいずれか１項に記載のペプチド。 ８．請求の範囲第１項に記載のストレプトミセスCBS154.94株またはその突然変 異体の１つを発酵し、そして対応する発酵ブロスを抽出することにより得られる ペプチド。 ９．請求の範囲第１項に記載のストレプトミセスCBS154.94株を培養し、そして 少なくとも１つのペプチドを対応する発酵ブロスから回収することを特徴とする ペプチドの生産法。 １０．１つ以上の不活性な、または生理的に活性な医薬的に許容できる補助剤と 混合した、請求の範囲第２ないし第８項のいずれか１項に記載の少なくとも１つ のペプチドを十分量で含んで成る、医薬組成物。 １１．請求の範囲第２ないし第８項のいずれか１項に記載のペプチドの抗−癌治 療での使用。