CA2184756A1 - Peptides manifestant des proprietes inhibitrices de farnesyl transferase et souche du genre streptomyces les produisant - Google Patents
Peptides manifestant des proprietes inhibitrices de farnesyl transferase et souche du genre streptomyces les produisantInfo
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Abstract
La présente invention concerne une souche de Streptomyces No. CBS 154.94 et ses mutants ou dérivés et un procédé de préparation de peptides mettant en oeuvre ladite souche. Elle se rapporte également à de nouveaux peptides définis par une formule générale (I), à des compositions pharmaceutiques les contenant et à leur utilisation dans les traitements anti-cancéreux.
Description
WO95/2698l 21 84 7 5~ pcT~FRssloo37~
NOUVEAUX ~ L)ES MANIFESTANT DES PROPRIETES INHIBITRICES
DE FARNESYL TRANSFERASE ET MICROORGANISME DU GENRE
~ ~;~l~MYCES SUS~;~ll~LE D'ETRE UTILISE POUR LES PREPARER
La pré~sente ~lvclllion concernP~ une souche de microorg~nicm~s et de nouveaux pepti~lP~s m~nifPst~nt des propriétés 1nhihitricp-s de farnésyl transférase.
L'activation des onco~nP,-s ras est impliqllée. dans 10 à 3096 des cancers hnm~inc. La l,rot~le coll~Qn~l~nte Ras est srthPticée in vivo sous la forme d'un précurseur cytosolllhle puis mo~lifiée de façon post-tradllctionnPllP de m~ni~re à lui collf~er son activité biologique et lui pe~"lell.c de tr~n.cformPr les cPll~ c de mz~m~ r~lcs.
La première et ohli~toire étape de ces moAific~tiQn.~ post-trad~ ff~nnPlle-s co~e-le en une raLllésylation du groupe thiol d'un mofff ~y~ ;ne~ localisé au niveau du gro~pf~ t carbonyle termin~l de Ras, Ce mofff cystéine fait partie de la séquence d'iAPntif~ tion de la prénylation, CAAX, où C rc~rcsellte la cystéine, A un résidu ~liph~tique et X un acide aminé ql~Pl~onque.
C'e,st la protéine farnésyl transférase qui catalyse le transfert d'un gronrP-mPnt farnésyle du liphQsrh~te farnésyle au peptide CAAX Ras. Cette ~rot~ e farné,syl tr~nQ~ ~ce l~CC~ it des tétrapeptide,s de type CAAX
situé,s ~ l'~l~cll-iLé C- te~min~lp de la ~roté~e à la conflition e~rcsse que leriamp motif à partir de l'e~lcl~ilé C-tell~ lale soit une cystéine.
A l'issue de cette plcll~lation, la protéine Ras pos~s~Ae l'activité
hiologi~lue requi,se pour tr~ncform~- les CPlllllPC. La prénylation apparait donc nece~c~ire à la rég -l~tion de l'activité biolrgi-lue de la protéine Ras.
La découverte de compo.c~,.s inhibS~nt sa m~lific~tion post-tradl~HonnPllp~ est vite apparue Comme un des moyens pour la mise au point de nouveaux tr~itF...P..~.c anti~ancéreux.
AirL~si, des études E~n~tiques ont montré que l'inhihitio~ de la farnésylaHion de Ras ~mE~h:~it la loc~lic~tion de la protéine Ras au niveau membranaire et par ch~c~luent bloquait sa f~lllté à transformer le,s cP~ lp-s normales en cell~-lP-s cancéreuses.
La plcsellte invention a pour objet prinri~l de proposer de nouveaux inhihitellrs de farnésyl transférase.
EEUILLE DE REMPLACEMENT (RE~LE 26 wo 95126981 2 1 8 4 7 5 6 PCT~R95/00375 Plus prértQ~m~nt, la présente invention résulte de l'icolPmPnt d'une souche de microor~Pnicme apparentée au genre Streptomyces et po~séA~nt des propriétés particulièrement av~nt~E~ ee~s pour la production de pept1Ae.s m~nife~st~nt des propriétés inhihitrice~s a l'égard de la protéine 5 farnésyl transférase.
Un aspect de l'invention concerne donc une souche SLl~Lolllyces caractérisée en ce qu'il s'agit du microorePnieme Streptoll~y~:es CBS 154.94, d'un de ses dérivés ou de ses mllt~nte.
Au sens de la ~lte invPntion, on PntenA par dérivé ou mlltz-nt, toute souche obtenue à partir de la souche Streptollly~:es CBS 154.94 et susceptible d'être lltilieée pour la production de peptiAe~s selon l'invention et plus particulièrclllent m~ir~ t des propriétés 1nhihitricPe à l'égard de la protéine farnésyl transférase. En particulier, de tels dérivés ou mutants peuvent être obtenus par moAifir~ti~n-e e~nPtiques ( altération au niveau de 15 l'ADNl ou biorhimiques. A cet effet, différents outils de mtlt~snè~se peuvent être lltilicPs~ comme par PYPmpl~ des outils non spérifiques:
-agents physiques (rayons X, rayons ultra-violet...) ou -agents chimiques (~nte alkylants ou bialkylants, agents i~llerc~ls~nt.e...], 20 ou des outils .spérifiqlles tels que les syst~me-s d'insertions mllt~tionnPll~s dirigés sur l'ADN (trAn.erosons, rétrotr~nepo.sone, pl~-emiA~s intégrafffs, etc].
La fermPnt~tion de cette souche sur un milieu de culture collvcllable et l'PYtr~cffl~n .sll~eéquente du moût de fermPnt~ti- n cG~nA~nt permet d'isoler des peptid~-s qui, quoique possPA~nt une structure oriejn~le 25 cQmr~r~ivc~llcllt aux inhihitellrs rl~QQ-qll~e de farnésyl transférase, se rcvUe.l~, de m~ni~re in~ttenAue, intér~ss~nts à ce titre.
La présente invenffon concerne é~Pl~m~ont des peptiA~s sllecepffble~s d'être obtenus par ferment~tion de la souche Streptomy~:es CBS 154.94 ou d'un de ses mllt~nte via l'extraction du moût de form~nt~tion 30 corrP-epon~l~nt Un autre objet de la présente invention concerne un procédé de production de peptiA~-s selon lequel on cultive la souche Streptomyces CBS
154.94 ou l'un de ses dérivés ou mllt~nte et l'on récupère au moins un peptide.
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) wo 95126981 PCr/FRs5/00375 218~756 La fermPnt~tion de la sot~chP est realisée de m~ni~re rl~qique à
savoir sur un milieu de culture contPn~nt les susbtrats néCpcs~ires au déveloprPmPnt dudit microor~nicmP et dans des con~litions de tPmrPratures et d'aération adéquates. Il est clair que la mise au point de 5 ces con~litions optim~lPs pour le développem~nt du microorg~niqme font appel à de simrl~q opérations de routine, f~mili~res à l'hQmmP du métier.
A titre inrlic~tif, le milieu de culture peut cG~p-e.1dre du ~ cose, un extrait de levure, un extrait de viande, du NaCl, du CaCO3 et de la gélose.
La fermPnt~tion est réalisée de pr~e1e.1ce à une t~omrérature sl1rPrie1lre à
10 la température ~mhi~nte et plus particulièr~ue.1t cc...1~.;-ce entre 25C et 30C. Le pH est de l'ordre de 7 et le m11ieu est aeré et agité.
A l'issue de la fermPnt~tlQn, on récupère et ce.1l~iluge le moût de ferm~nt~tion. On procède Pnq1~ite à l'extraction du surn~e~nt et du culot mycélien correspon-l~ntq Leur extraction est Pffectl~ée à l'aide d'un solvant organique adéquat.
Il s'agit de préference d'~cét~te d'éthyle. Les rh~qP$ organiques respectives sont ré1 1niPs, cc~ncPntrées et cllr~ to~r~rhi~-c de m~ni~re à isoler les pept1~le~s actifs. L'PYPmr1e l, presenté ci-après, rend comrte de m~ni~3re ~Pt~illée de ce processus d'iqole-nPnt des pPrti-lPC à partir du moût de 20 fermPnt~tion.
Plus particulièrement, la présente invention se rapporte à dec peptides de formule générale I
I
dans laquelle: -fEUlLLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26~
WO95/26981 21~4 756 PCT~R95/00375 Rl,R2,R3 et R4 représentent, indép~n~mm~nt l'un de l'autre, un atome d'hydrogène ou un groupement alkyle inférieur, linéaire ou ramifié, en Cl à
C4.
Plus particulièrement, il s'agit de composés de formule générale I
5 dans laquelle R4 représente un grollpPm~nt méthyle et R3 un atome d'hydrogène.
A titre de peptides préférés selon l'invention, on peut plus particulièrement mentionner les peptides l, 2 et 3 suivants:
-Dans le cas du peptide Nl, Rl, R2 et R3 représentent un atome 10 d'hydrogène et R4 un groupement méthyle.
-Dans le cas du peptide N2,R2 et R4repro.s-o.ntPnt un groupement méthyle et Rl et R3 un atome d'hydrogène.
-Dans le cas du peptide N3, Rl, R2, et R4 représentent un groupement méthyle et R3 un atome d'hydrogène.
De manière inattendue, ces peptides présentent une activité
.eignific~tive in vitro dans le test d'inhihition de la farnésyl transférase.
Le principe de la technologie SPA ( S~intill~tion Proximity Assayl est appliqué au dosage de l'activité enzymatique de la farnésyl transférase.
Selon cette méthode, l'activité inhibitrice farnésyl transférase est déterminée par la quantité de (3H) farnésyle transférée à partir du (3Hl farnésyl pyrophosphate ((3HlFPP] sur un substrat accepteur biotinylé.
La présente invention se rapporte ~g;~l~m~nt à l'lltilie~tion des peptides selon l'invention dans les tr~itPment.c ~ntic~ncéreux.
Elle concerne en outre les compositions pharmaceutiques contenant une quantité suffisante d'au moins un peptide selon l'invention en mélange avec un ou plusieurs adjuvants pharmaceutiquement acceptables, inertes ou physiologiquement actifs.
Wo 95126981 ~ ~ 8 ~ ~ 5 ~ PCT/FRg5/00375 .
Un érh~ntillon de la souche Streptomyces selon l'invention et mise en oeuvre dans l'Pxrmrle présenté ci-après, a été déposé et enregistré auprès du Centraalbureau voor Schimmrl culturen (CBS) à Baarn aux Pays-Bas dans les conditions du Traité de Budapest, sous le numéro CBS 154.94.
Méthode employée pour détecter les métabolites actifs: test d'inhibition de la farnésyl transférase par scintillation proximity assay ~SPAl.
Le principe de la technologie SPA ~ H.E. Hart and E.B. Greenwald, J. Nucl Med, 20, 1062- 1065, 1979 et Nelson N., Analytical Biochemistry, 165, 287-293,1987.1 est appliquée au dosage de l'activité enzymatique de la farnésyl transférase (Ftase). Cette enzyme a été partiellement purifiée à partir de cellules THPl hllm~ines (Fromage N., Guitton J.D., Joyeux C., Dr.~nlic F., Boniface O., Soria H.M., Boucher F., Clerc F.F., Crespo A., Dl-rhPsne M., Lavayre J., Tocque B;, Van Der Pyl D., Mayaux J.F., Becquart J., 5th European Meetnig of GFBC on bio-chromatography and molecular biology, May 12-14, 1992, France.). Le substrat accepteur, biotinylé, est un peptide de 11 acides ~minPs correspondant à la séquence termin~le de la l~mine-B
(BLB). Le substrat donneur, le farnésyl pyrophosph~te est marqué au tritrillm (FPP 3H1. L'enzyme transfère le FPP 3H au substrat accepteur biotinylé et une fois la réaction arrêtée, le peptide farnésylé est capturé par des billes enc~p.sulant un scintillant fluorescent et couplées à la streptavidine (kit Amersham, TRKQ7010~). Le peptide radio-marqué, excite les billes qui émettent alors de la lumière que l'on quantifie dans un compteur à srintill~tion solide-liquide ~Topcount~, Packard).
30 La réaction SPA est démarrée en ajoutant 40~1 de Ftase (2}1g) dans une microplaque conten~nt 20 111 de BLB (0,1 ~Ml, 20 111 de FPP 3H (0,12 llM) et 20 ~1 de tampon d'essai 50 mM Hepes, pH 7.5, 5 mM MgC12, 5 mM DTT, 20 mM KCl, 0.01 % triton X100 ~témoin) ou 20 ~1 d'échantillon dilué dans le tampon d'essai (screening). La plaque est incubée 60 minutes à 37C et la réaction est stoppée par l'ajout de 150 ~1 de réactif d'arrêt contrn~nt les Wo 95/26981 2 1 8 4 1 5 6 pcTlFRs5loo375 billes SPA. La plaque est scellée avec un film adhésif et laissée 30 minutes à
température ~mbi~nte pour atteindre l'éqllilibre, puis comptée dans le compteur Topcount. Les résultats sont comptés en désintégration par minute, dpm, et exprimés en % d'inhibition par rapport au témoin enzyme laprès soustraction du blanc). Les CI50 des composés sont calculées par régression non linéaire.
Préparation de métabolites actifs selon l'invention à partir de la souche Streptomyces CBS 154.94.
Un erlenmeyer de 2000 ml rempli avec 250 ml de milieu (peptones 5 g/l, extrait de levure 5 g/l, extrait de viande 5 g/l, glucose 15 g/l, NaCl 5 g/l, CaC03 3 g/l, gélose 1 g/l, pH 7,0) est ~ns~ncé par une culture de Streptomyces CBS 154.94 sous forme de culture liquide congelée. Il est agité à 150 trs/min dans un agitateur thermostaté à 28C.
Après 72 heures, 64 % de cette culture sont transférés dans un ballon de 6000 ml rempli par 2000 ml du même milieu. Ce ballon, muni de 2 tubulures latérales (une pour l'ensemencement, l'autre pour l'inoculation du fermenteur) est mis en agitation à 28C sur un tambour magnétique à 1000 tours par minutes environ. Après 72 heures d'incubation, la totalité de cette culture est transférée stérilement dans un fermenteur de production de 100 litres rempli avec 60 litres de milieu pré~l~blement stérilisé (20 minutes à
120C) lAlburex~N 20 g/l, glycérol 15 g/l, CaC03 2 g/l). Pendant 91 heures la culture est m~int~nue à une température de 28C, une pression de 0,4 bar, agitée à 400 trs/min et aérée à raison de 2 m3/hr. 56,2 kg de moût sont centrifugés à l'aide d'une centrifugeuse Sharples AS16~. Un surnageant aqueux et un culot mycélien sont ainsi obtenus.
Le surnageant est extrait par 2 fois avec 1 volume d'~cét~te d'éthyle. Après décantation la phase organique est c¢ncentrée sous pression réduite à 2 litres.
NOUVEAUX ~ L)ES MANIFESTANT DES PROPRIETES INHIBITRICES
DE FARNESYL TRANSFERASE ET MICROORGANISME DU GENRE
~ ~;~l~MYCES SUS~;~ll~LE D'ETRE UTILISE POUR LES PREPARER
La pré~sente ~lvclllion concernP~ une souche de microorg~nicm~s et de nouveaux pepti~lP~s m~nifPst~nt des propriétés 1nhihitricp-s de farnésyl transférase.
L'activation des onco~nP,-s ras est impliqllée. dans 10 à 3096 des cancers hnm~inc. La l,rot~le coll~Qn~l~nte Ras est srthPticée in vivo sous la forme d'un précurseur cytosolllhle puis mo~lifiée de façon post-tradllctionnPllP de m~ni~re à lui collf~er son activité biologique et lui pe~"lell.c de tr~n.cformPr les cPll~ c de mz~m~ r~lcs.
La première et ohli~toire étape de ces moAific~tiQn.~ post-trad~ ff~nnPlle-s co~e-le en une raLllésylation du groupe thiol d'un mofff ~y~ ;ne~ localisé au niveau du gro~pf~ t carbonyle termin~l de Ras, Ce mofff cystéine fait partie de la séquence d'iAPntif~ tion de la prénylation, CAAX, où C rc~rcsellte la cystéine, A un résidu ~liph~tique et X un acide aminé ql~Pl~onque.
C'e,st la protéine farnésyl transférase qui catalyse le transfert d'un gronrP-mPnt farnésyle du liphQsrh~te farnésyle au peptide CAAX Ras. Cette ~rot~ e farné,syl tr~nQ~ ~ce l~CC~ it des tétrapeptide,s de type CAAX
situé,s ~ l'~l~cll-iLé C- te~min~lp de la ~roté~e à la conflition e~rcsse que leriamp motif à partir de l'e~lcl~ilé C-tell~ lale soit une cystéine.
A l'issue de cette plcll~lation, la protéine Ras pos~s~Ae l'activité
hiologi~lue requi,se pour tr~ncform~- les CPlllllPC. La prénylation apparait donc nece~c~ire à la rég -l~tion de l'activité biolrgi-lue de la protéine Ras.
La découverte de compo.c~,.s inhibS~nt sa m~lific~tion post-tradl~HonnPllp~ est vite apparue Comme un des moyens pour la mise au point de nouveaux tr~itF...P..~.c anti~ancéreux.
AirL~si, des études E~n~tiques ont montré que l'inhihitio~ de la farnésylaHion de Ras ~mE~h:~it la loc~lic~tion de la protéine Ras au niveau membranaire et par ch~c~luent bloquait sa f~lllté à transformer le,s cP~ lp-s normales en cell~-lP-s cancéreuses.
La plcsellte invention a pour objet prinri~l de proposer de nouveaux inhihitellrs de farnésyl transférase.
EEUILLE DE REMPLACEMENT (RE~LE 26 wo 95126981 2 1 8 4 7 5 6 PCT~R95/00375 Plus prértQ~m~nt, la présente invention résulte de l'icolPmPnt d'une souche de microor~Pnicme apparentée au genre Streptomyces et po~séA~nt des propriétés particulièrement av~nt~E~ ee~s pour la production de pept1Ae.s m~nife~st~nt des propriétés inhihitrice~s a l'égard de la protéine 5 farnésyl transférase.
Un aspect de l'invention concerne donc une souche SLl~Lolllyces caractérisée en ce qu'il s'agit du microorePnieme Streptoll~y~:es CBS 154.94, d'un de ses dérivés ou de ses mllt~nte.
Au sens de la ~lte invPntion, on PntenA par dérivé ou mlltz-nt, toute souche obtenue à partir de la souche Streptollly~:es CBS 154.94 et susceptible d'être lltilieée pour la production de peptiAe~s selon l'invention et plus particulièrclllent m~ir~ t des propriétés 1nhihitricPe à l'égard de la protéine farnésyl transférase. En particulier, de tels dérivés ou mutants peuvent être obtenus par moAifir~ti~n-e e~nPtiques ( altération au niveau de 15 l'ADNl ou biorhimiques. A cet effet, différents outils de mtlt~snè~se peuvent être lltilicPs~ comme par PYPmpl~ des outils non spérifiques:
-agents physiques (rayons X, rayons ultra-violet...) ou -agents chimiques (~nte alkylants ou bialkylants, agents i~llerc~ls~nt.e...], 20 ou des outils .spérifiqlles tels que les syst~me-s d'insertions mllt~tionnPll~s dirigés sur l'ADN (trAn.erosons, rétrotr~nepo.sone, pl~-emiA~s intégrafffs, etc].
La fermPnt~tion de cette souche sur un milieu de culture collvcllable et l'PYtr~cffl~n .sll~eéquente du moût de fermPnt~ti- n cG~nA~nt permet d'isoler des peptid~-s qui, quoique possPA~nt une structure oriejn~le 25 cQmr~r~ivc~llcllt aux inhihitellrs rl~QQ-qll~e de farnésyl transférase, se rcvUe.l~, de m~ni~re in~ttenAue, intér~ss~nts à ce titre.
La présente invenffon concerne é~Pl~m~ont des peptiA~s sllecepffble~s d'être obtenus par ferment~tion de la souche Streptomy~:es CBS 154.94 ou d'un de ses mllt~nte via l'extraction du moût de form~nt~tion 30 corrP-epon~l~nt Un autre objet de la présente invention concerne un procédé de production de peptiA~-s selon lequel on cultive la souche Streptomyces CBS
154.94 ou l'un de ses dérivés ou mllt~nte et l'on récupère au moins un peptide.
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) wo 95126981 PCr/FRs5/00375 218~756 La fermPnt~tion de la sot~chP est realisée de m~ni~re rl~qique à
savoir sur un milieu de culture contPn~nt les susbtrats néCpcs~ires au déveloprPmPnt dudit microor~nicmP et dans des con~litions de tPmrPratures et d'aération adéquates. Il est clair que la mise au point de 5 ces con~litions optim~lPs pour le développem~nt du microorg~niqme font appel à de simrl~q opérations de routine, f~mili~res à l'hQmmP du métier.
A titre inrlic~tif, le milieu de culture peut cG~p-e.1dre du ~ cose, un extrait de levure, un extrait de viande, du NaCl, du CaCO3 et de la gélose.
La fermPnt~tion est réalisée de pr~e1e.1ce à une t~omrérature sl1rPrie1lre à
10 la température ~mhi~nte et plus particulièr~ue.1t cc...1~.;-ce entre 25C et 30C. Le pH est de l'ordre de 7 et le m11ieu est aeré et agité.
A l'issue de la fermPnt~tlQn, on récupère et ce.1l~iluge le moût de ferm~nt~tion. On procède Pnq1~ite à l'extraction du surn~e~nt et du culot mycélien correspon-l~ntq Leur extraction est Pffectl~ée à l'aide d'un solvant organique adéquat.
Il s'agit de préference d'~cét~te d'éthyle. Les rh~qP$ organiques respectives sont ré1 1niPs, cc~ncPntrées et cllr~ to~r~rhi~-c de m~ni~re à isoler les pept1~le~s actifs. L'PYPmr1e l, presenté ci-après, rend comrte de m~ni~3re ~Pt~illée de ce processus d'iqole-nPnt des pPrti-lPC à partir du moût de 20 fermPnt~tion.
Plus particulièrement, la présente invention se rapporte à dec peptides de formule générale I
I
dans laquelle: -fEUlLLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26~
WO95/26981 21~4 756 PCT~R95/00375 Rl,R2,R3 et R4 représentent, indép~n~mm~nt l'un de l'autre, un atome d'hydrogène ou un groupement alkyle inférieur, linéaire ou ramifié, en Cl à
C4.
Plus particulièrement, il s'agit de composés de formule générale I
5 dans laquelle R4 représente un grollpPm~nt méthyle et R3 un atome d'hydrogène.
A titre de peptides préférés selon l'invention, on peut plus particulièrement mentionner les peptides l, 2 et 3 suivants:
-Dans le cas du peptide Nl, Rl, R2 et R3 représentent un atome 10 d'hydrogène et R4 un groupement méthyle.
-Dans le cas du peptide N2,R2 et R4repro.s-o.ntPnt un groupement méthyle et Rl et R3 un atome d'hydrogène.
-Dans le cas du peptide N3, Rl, R2, et R4 représentent un groupement méthyle et R3 un atome d'hydrogène.
De manière inattendue, ces peptides présentent une activité
.eignific~tive in vitro dans le test d'inhihition de la farnésyl transférase.
Le principe de la technologie SPA ( S~intill~tion Proximity Assayl est appliqué au dosage de l'activité enzymatique de la farnésyl transférase.
Selon cette méthode, l'activité inhibitrice farnésyl transférase est déterminée par la quantité de (3H) farnésyle transférée à partir du (3Hl farnésyl pyrophosphate ((3HlFPP] sur un substrat accepteur biotinylé.
La présente invention se rapporte ~g;~l~m~nt à l'lltilie~tion des peptides selon l'invention dans les tr~itPment.c ~ntic~ncéreux.
Elle concerne en outre les compositions pharmaceutiques contenant une quantité suffisante d'au moins un peptide selon l'invention en mélange avec un ou plusieurs adjuvants pharmaceutiquement acceptables, inertes ou physiologiquement actifs.
Wo 95126981 ~ ~ 8 ~ ~ 5 ~ PCT/FRg5/00375 .
Un érh~ntillon de la souche Streptomyces selon l'invention et mise en oeuvre dans l'Pxrmrle présenté ci-après, a été déposé et enregistré auprès du Centraalbureau voor Schimmrl culturen (CBS) à Baarn aux Pays-Bas dans les conditions du Traité de Budapest, sous le numéro CBS 154.94.
Méthode employée pour détecter les métabolites actifs: test d'inhibition de la farnésyl transférase par scintillation proximity assay ~SPAl.
Le principe de la technologie SPA ~ H.E. Hart and E.B. Greenwald, J. Nucl Med, 20, 1062- 1065, 1979 et Nelson N., Analytical Biochemistry, 165, 287-293,1987.1 est appliquée au dosage de l'activité enzymatique de la farnésyl transférase (Ftase). Cette enzyme a été partiellement purifiée à partir de cellules THPl hllm~ines (Fromage N., Guitton J.D., Joyeux C., Dr.~nlic F., Boniface O., Soria H.M., Boucher F., Clerc F.F., Crespo A., Dl-rhPsne M., Lavayre J., Tocque B;, Van Der Pyl D., Mayaux J.F., Becquart J., 5th European Meetnig of GFBC on bio-chromatography and molecular biology, May 12-14, 1992, France.). Le substrat accepteur, biotinylé, est un peptide de 11 acides ~minPs correspondant à la séquence termin~le de la l~mine-B
(BLB). Le substrat donneur, le farnésyl pyrophosph~te est marqué au tritrillm (FPP 3H1. L'enzyme transfère le FPP 3H au substrat accepteur biotinylé et une fois la réaction arrêtée, le peptide farnésylé est capturé par des billes enc~p.sulant un scintillant fluorescent et couplées à la streptavidine (kit Amersham, TRKQ7010~). Le peptide radio-marqué, excite les billes qui émettent alors de la lumière que l'on quantifie dans un compteur à srintill~tion solide-liquide ~Topcount~, Packard).
30 La réaction SPA est démarrée en ajoutant 40~1 de Ftase (2}1g) dans une microplaque conten~nt 20 111 de BLB (0,1 ~Ml, 20 111 de FPP 3H (0,12 llM) et 20 ~1 de tampon d'essai 50 mM Hepes, pH 7.5, 5 mM MgC12, 5 mM DTT, 20 mM KCl, 0.01 % triton X100 ~témoin) ou 20 ~1 d'échantillon dilué dans le tampon d'essai (screening). La plaque est incubée 60 minutes à 37C et la réaction est stoppée par l'ajout de 150 ~1 de réactif d'arrêt contrn~nt les Wo 95/26981 2 1 8 4 1 5 6 pcTlFRs5loo375 billes SPA. La plaque est scellée avec un film adhésif et laissée 30 minutes à
température ~mbi~nte pour atteindre l'éqllilibre, puis comptée dans le compteur Topcount. Les résultats sont comptés en désintégration par minute, dpm, et exprimés en % d'inhibition par rapport au témoin enzyme laprès soustraction du blanc). Les CI50 des composés sont calculées par régression non linéaire.
Préparation de métabolites actifs selon l'invention à partir de la souche Streptomyces CBS 154.94.
Un erlenmeyer de 2000 ml rempli avec 250 ml de milieu (peptones 5 g/l, extrait de levure 5 g/l, extrait de viande 5 g/l, glucose 15 g/l, NaCl 5 g/l, CaC03 3 g/l, gélose 1 g/l, pH 7,0) est ~ns~ncé par une culture de Streptomyces CBS 154.94 sous forme de culture liquide congelée. Il est agité à 150 trs/min dans un agitateur thermostaté à 28C.
Après 72 heures, 64 % de cette culture sont transférés dans un ballon de 6000 ml rempli par 2000 ml du même milieu. Ce ballon, muni de 2 tubulures latérales (une pour l'ensemencement, l'autre pour l'inoculation du fermenteur) est mis en agitation à 28C sur un tambour magnétique à 1000 tours par minutes environ. Après 72 heures d'incubation, la totalité de cette culture est transférée stérilement dans un fermenteur de production de 100 litres rempli avec 60 litres de milieu pré~l~blement stérilisé (20 minutes à
120C) lAlburex~N 20 g/l, glycérol 15 g/l, CaC03 2 g/l). Pendant 91 heures la culture est m~int~nue à une température de 28C, une pression de 0,4 bar, agitée à 400 trs/min et aérée à raison de 2 m3/hr. 56,2 kg de moût sont centrifugés à l'aide d'une centrifugeuse Sharples AS16~. Un surnageant aqueux et un culot mycélien sont ainsi obtenus.
Le surnageant est extrait par 2 fois avec 1 volume d'~cét~te d'éthyle. Après décantation la phase organique est c¢ncentrée sous pression réduite à 2 litres.
2 1 84756 Wo 9~/26981 PCT/FR95/00375 Le culot mycélien est repris par 40 litres d'un mélange acétone/eau 80:20 pour ~1élit~ge pendant 2 heures. Les débris cellulaires sont écartés par filtration sur verre fritté et le filtrat est concentré sous vide pour éliminer l'acétone jusqu'à un volume de 6 litres. Les 6 litres de phase aqueuse ~le pH
mesuré est de 5,81 sont extraits par 2 fois 15 litres d'acétate d'éthyle. Après ~lerAnt~tion, la phase organique est concentrée sous pression réduite à 2 litres.
Les extraits acétate d'éthyle, issus du tr~itPm~nt du filtrat et du mycélium, sont réunis et évaporés pour conduire à un extrait huileux de 57 g. Cet extrait est repris par 150 ml de butanol puis précipité par addition de 1350 ml de n-heptane sous forte agitation. Après décantation, le surnageant est écarté et le précipité formé est séparé par filtration sur verre fritté. Un extrait de 21,7 g pré.s-ont~nt une Clso inférieure à 3 llg/ml est obtenu après .séch~ge une nuit à l'étuve sous vide.
Isolement et caractérisation des métabolites actifs L'extrait, obtenu selon l'exemple précédent, est mis en solution dans 150 ml d'un mélange CH2C12/MeOH 95:5 et chromatographié sur silice (colonne de 180 x 200 mm muni d'un fritté et cont-on~nt 650 g de silice Amicon~ 40-60 llm tassés sous vide).
L'élution s'effectue par paliers sl-cc~s.qif.s de CH2C12/MeOH:
90/05v/v 1000 ml pour la fraction 1 90/10v/v 1000 ml pour la fraction 2 80/20v/v 1000 ml pour la fraction 3 70/30v/v 1000 ml pour la fraction 4 60/40v/v 1000 ml pour la fraction 5 50/50v/v 1000 ml pour la fraction 6 Après évaporation sous pression réduite des fractions 4 et 5 on obtient 4,82 g d'extrait actif présentant une CIso voisine de 1 ~g/ml.
L'étape suivante de pllrific~tion consiste en une chromatographie liquide sur colonne de silice greffée Clg: l'extrait actif précédent, remis en solution dans un mélange MeOH/H2O 10:90, est percolé à un débit de 10 ml/min WO 95/26981 2 1 ~ 4 7 5 6 PCT~S/00375 dans un réservoir Analytichem International de 300 rnl contenant 160 ml de support Econosil prep Clg HL Alltech~ 40-63 ~m. L'élution s'effectue à
l'aide d'un m~ nge de rnéth~nol dans l'eau de 10 à 100 %. Le gradient est réalisé par paliers incr~mentéfi d'un facteur 10, tous les 500 ml. A ce stade les 10 fractions obtenues peuvent être analysées par chromatographie sur couche mince sur plaque de silice Merck 60 F 254(~ avec l'éluant AcOEt/EtOH/H20 50: 15: 10, V:v:v. Dans ce système les métabolites recherchés migrent à un rapport frontal lRf~ compris entre 0,6 et 0,70 sont visibles sous UV à 254nm, et se révèlent de couleur mauve après pulvérisation de vanilline sulfurique.
Les fractions obtenues après élution par les mélanges MeOH/H20 70:30 et 80:20 lv:v) contiennent majoritairement les métabolites actifs; la première fraction de 1948 mg et la seconde fraction de 704 mg présentent une CIso voisine de 0,7 llg/ml .
La purification se poursuit par chromatographie liquide haute pression: les 2 fractions précédentes sont concentrées sous pression réduite et repAses par le minimum de méthanol pour obtenir une concentration finale voisine de 50 mg/ml. Cette solution est injectée à raison de 2 ml pour chaque chromatographie dans un appareil HPLC équipé comme suit:
colonne Nucleosil SFCC Clg~ 511m, 250x25 mm débit de 10 ml/mn élution isocratique A/B, 50:50, v:v A: H20 avec 0,05 % TFA
B: CH3 CN/H 2. 95: 5 (v:v~, avec 0,05 % TFA
25 détection UV à 230 nm.
Les peptides cycliques 1, 2 et 3 sont élués et collectés séparément aux temps de rétention respectifs de 24 min, 30 min, et 45 min.
A l'issue de multiples injections et séparations par HPLC dans les 30 conditions citées ci-dessus, nous isolons 3 fractions actives conten~nt respectivement les métabolites 1,2 et 3 selon l'invention. Après évaporation de l'acétonitrile sous pression réduite, les 3 fractions sont percolées séparément sur une colonne Mega Bond Elut Clg Varian~ qui est ensuite rincée par de l'eau distillée jusqu'à pH neutre de l'effluent; l'élution 35 s'effectue ensuite par environ 10 ml de méthanol.
WO 9S/26981 2 1 8 4 7 5 6 PCT/FRg5/00375 -Après évaporation sous pression réduite des éluats méthanoliques, nous obtenons respectivement:
Rl H H CH3 QUANTITE Smg 214mg 243mg TABLEAU I
Les structures de ~h~cun des peptides ont été déterrninéP.s par Spectrométrie de Masse, Infra-rouge et Résonnance ~l~gnétirlue Nucléaire 10 (IH et 13C) .
Détermination de l'activité inhibitrice de la protéine farnésyl-transférase.
Cette activité est appréciée pour chaque métabolite selon la méthode décrite dans le ch~pitre précédent intitlllé. materiels et méthodes. Les résultats sont présentés dans le tableau II ci-après.
IDENTIFICATION DES ~qETABOLITES ACTIFS
CVFM~ 1 2 3 CI ~,n 0,052,uM 626nM 538nM 1,3~1M
TABLEAU II
~ Peptide ( Cystéine-valine-phény~ nine-Méthionine) utilisé à titre de témoin dans les mesures d'activité farnésyl transférase.
mesuré est de 5,81 sont extraits par 2 fois 15 litres d'acétate d'éthyle. Après ~lerAnt~tion, la phase organique est concentrée sous pression réduite à 2 litres.
Les extraits acétate d'éthyle, issus du tr~itPm~nt du filtrat et du mycélium, sont réunis et évaporés pour conduire à un extrait huileux de 57 g. Cet extrait est repris par 150 ml de butanol puis précipité par addition de 1350 ml de n-heptane sous forte agitation. Après décantation, le surnageant est écarté et le précipité formé est séparé par filtration sur verre fritté. Un extrait de 21,7 g pré.s-ont~nt une Clso inférieure à 3 llg/ml est obtenu après .séch~ge une nuit à l'étuve sous vide.
Isolement et caractérisation des métabolites actifs L'extrait, obtenu selon l'exemple précédent, est mis en solution dans 150 ml d'un mélange CH2C12/MeOH 95:5 et chromatographié sur silice (colonne de 180 x 200 mm muni d'un fritté et cont-on~nt 650 g de silice Amicon~ 40-60 llm tassés sous vide).
L'élution s'effectue par paliers sl-cc~s.qif.s de CH2C12/MeOH:
90/05v/v 1000 ml pour la fraction 1 90/10v/v 1000 ml pour la fraction 2 80/20v/v 1000 ml pour la fraction 3 70/30v/v 1000 ml pour la fraction 4 60/40v/v 1000 ml pour la fraction 5 50/50v/v 1000 ml pour la fraction 6 Après évaporation sous pression réduite des fractions 4 et 5 on obtient 4,82 g d'extrait actif présentant une CIso voisine de 1 ~g/ml.
L'étape suivante de pllrific~tion consiste en une chromatographie liquide sur colonne de silice greffée Clg: l'extrait actif précédent, remis en solution dans un mélange MeOH/H2O 10:90, est percolé à un débit de 10 ml/min WO 95/26981 2 1 ~ 4 7 5 6 PCT~S/00375 dans un réservoir Analytichem International de 300 rnl contenant 160 ml de support Econosil prep Clg HL Alltech~ 40-63 ~m. L'élution s'effectue à
l'aide d'un m~ nge de rnéth~nol dans l'eau de 10 à 100 %. Le gradient est réalisé par paliers incr~mentéfi d'un facteur 10, tous les 500 ml. A ce stade les 10 fractions obtenues peuvent être analysées par chromatographie sur couche mince sur plaque de silice Merck 60 F 254(~ avec l'éluant AcOEt/EtOH/H20 50: 15: 10, V:v:v. Dans ce système les métabolites recherchés migrent à un rapport frontal lRf~ compris entre 0,6 et 0,70 sont visibles sous UV à 254nm, et se révèlent de couleur mauve après pulvérisation de vanilline sulfurique.
Les fractions obtenues après élution par les mélanges MeOH/H20 70:30 et 80:20 lv:v) contiennent majoritairement les métabolites actifs; la première fraction de 1948 mg et la seconde fraction de 704 mg présentent une CIso voisine de 0,7 llg/ml .
La purification se poursuit par chromatographie liquide haute pression: les 2 fractions précédentes sont concentrées sous pression réduite et repAses par le minimum de méthanol pour obtenir une concentration finale voisine de 50 mg/ml. Cette solution est injectée à raison de 2 ml pour chaque chromatographie dans un appareil HPLC équipé comme suit:
colonne Nucleosil SFCC Clg~ 511m, 250x25 mm débit de 10 ml/mn élution isocratique A/B, 50:50, v:v A: H20 avec 0,05 % TFA
B: CH3 CN/H 2. 95: 5 (v:v~, avec 0,05 % TFA
25 détection UV à 230 nm.
Les peptides cycliques 1, 2 et 3 sont élués et collectés séparément aux temps de rétention respectifs de 24 min, 30 min, et 45 min.
A l'issue de multiples injections et séparations par HPLC dans les 30 conditions citées ci-dessus, nous isolons 3 fractions actives conten~nt respectivement les métabolites 1,2 et 3 selon l'invention. Après évaporation de l'acétonitrile sous pression réduite, les 3 fractions sont percolées séparément sur une colonne Mega Bond Elut Clg Varian~ qui est ensuite rincée par de l'eau distillée jusqu'à pH neutre de l'effluent; l'élution 35 s'effectue ensuite par environ 10 ml de méthanol.
WO 9S/26981 2 1 8 4 7 5 6 PCT/FRg5/00375 -Après évaporation sous pression réduite des éluats méthanoliques, nous obtenons respectivement:
Rl H H CH3 QUANTITE Smg 214mg 243mg TABLEAU I
Les structures de ~h~cun des peptides ont été déterrninéP.s par Spectrométrie de Masse, Infra-rouge et Résonnance ~l~gnétirlue Nucléaire 10 (IH et 13C) .
Détermination de l'activité inhibitrice de la protéine farnésyl-transférase.
Cette activité est appréciée pour chaque métabolite selon la méthode décrite dans le ch~pitre précédent intitlllé. materiels et méthodes. Les résultats sont présentés dans le tableau II ci-après.
IDENTIFICATION DES ~qETABOLITES ACTIFS
CVFM~ 1 2 3 CI ~,n 0,052,uM 626nM 538nM 1,3~1M
TABLEAU II
~ Peptide ( Cystéine-valine-phény~ nine-Méthionine) utilisé à titre de témoin dans les mesures d'activité farnésyl transférase.
Claims (11)
1. Souche Streptomyces N° CBS 154.94 et ses mutants ou dérivés.
2. Peptide caractérisé en ce qu'il répond à la formule générale I
dans laquelle:
R1, R2, R3 et R4 représentent, indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène ou un groupement alkyle inférieur, linéaire ou ramifié. en C1 à
C4.
dans laquelle:
R1, R2, R3 et R4 représentent, indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène ou un groupement alkyle inférieur, linéaire ou ramifié. en C1 à
C4.
3. Peptide selon la revendication 2 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un peptide de formule générale I dans laquelle R4 représente un groupement méthyle et R3 représente un atome d'hydrogène.
4. Peptide selon la revendication 2 ou 3 caractérisé en ce qu'il s'agit du peptide de formule générale I dans laquelle R1, R2 et R3 représentent un atome d'hydrogène et R4 un groupement méthyle,
5. Peptide selon la revendication 2 ou 3 caractérisé en ce qu'il s'agit du peptide de formule générale I dans laquelle R2 et R4 représentent un groupement méthyle et R1 et R3 un atome d'hydrogène.
6. Peptide selon la revendication 2 ou 3 caractérisé en ce qu'il s'agit du peptide de formule générale ? dans laquelle R1, R2, et R4 représentent un groupement méthyle et R3 un atome d'hydrogène.
7. Peptide selon l'une des revendications de 2 à 6 caractérisé en ce qu'il présente une activté inhibitrice de farnésyl transférase.
8. Peptide obtenu par fermentation de la souche Streptomyces CBS 154.94 ou d'un de ses mutants selon la revendication 1 via l'extraction du moût de fermentation correspondant.
9. Procédé de production de peptide caractérisé en ce que l'on cultive la souche Streptomyces CBS 154.94 selon la revendication 1 et l'on récupère au moins un peptide possédant une acitvité inhibitrice de farnésyl transférase, par extraction du moût de fermentation correspondant.
10. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient une quantité suffisante d'au moins un peptide selon l'une quelconque des revendications de 2 à 8 en mélange avec un ou plusieurs adjuvants pharmaceutiquement acceptables, inertes ou physiologiquement actifs.
11. Utilisation d'un peptide selon l'une des revendications de 2 à 8 dans les traitements anti-cancéreux.
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| FR9403744A FR2718149B1 (fr) | 1994-03-30 | 1994-03-30 | Nouveaux peptides manifestant des propriétés inhibitrices de farnesyl transférase et microorganisme du genre streptomyces susceptible d'être utilisé pour les préparer. |
| FR94/03744 | 1994-03-30 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CA2184756A1 true CA2184756A1 (fr) | 1995-10-12 |
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| CA002184756A Abandoned CA2184756A1 (fr) | 1994-03-30 | 1995-03-24 | Peptides manifestant des proprietes inhibitrices de farnesyl transferase et souche du genre streptomyces les produisant |
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| US5661161A (en) * | 1994-09-29 | 1997-08-26 | Merck & Co., Inc. | Inhibitors of farnesyl-protein transferase |
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| JPH09511642A (ja) | 1997-11-25 |
| WO1995026981A2 (fr) | 1995-10-12 |
| EP0753007A1 (fr) | 1997-01-15 |
| WO1995026981A3 (fr) | 1995-11-23 |
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| FR2718149B1 (fr) | 1996-04-26 |
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| FZDE | Dead |