RS49677B - Regulisanje ekspresije kinolat fosforibozil transferaze - Google Patents

Regulisanje ekspresije kinolat fosforibozil transferaze

Info

Publication number
RS49677B
RS49677B YUP-648/99A YU64899A RS49677B RS 49677 B RS49677 B RS 49677B YU 64899 A YU64899 A YU 64899A RS 49677 B RS49677 B RS 49677B
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
plant cell
dna
promoter
phosphoribosyl transferase
quinolate phosphoribosyl
Prior art date
Application number
YUP-648/99A
Other languages
English (en)
Inventor
Mark A. Conkling
Nandini Mendu
Wen Song
Original Assignee
North Carolina State University,
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=21960004&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS49677(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by North Carolina State University, filed Critical North Carolina State University,
Publication of YU64899A publication Critical patent/YU64899A/sh
Publication of RS49677B publication Critical patent/RS49677B/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1077—Pentosyltransferases (2.4.2)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Manufacture Of Tobacco Products (AREA)

Abstract

Izolovani DNK molekul, naznačen time, što sadrži DNK sekvencu odabranu od grupe koja se sastoji od: (a) SEQ ID NO: 1; (b) DNK sekvenci koje kodiraju encim koji ima sekvencu amino kiseline SEQ ID NO: 2; (c) DNK sekvenci koje su sa najmanje 65% homologije sa izolovanom DNK gronjih (a) ili (b) i koje kodiraju encim kinolat fosforibozil transferaze; i (d) DNK sekvenci koje se razlikuju od DNK gornjih (a), (b) ili (c) usled izmene genetskog koda i koje kodiraju encim kinolat fosforibozil transferaze. Prijava sadrži još 11 nezavisnih i 22 zavisna patentna zahteva.

Description

FEDERALNO FINANSIRANO ISTRAŽIVANJE
Ovo istraživanje je učinjeno uz podršku Vlade uz odobrenje Nacionalne naučne fondacije br. MCB-9206506. Vlada ima izvesna prava na ovaj pronalazak.
OBLAST PRONALASKA
Pronalazak se odnosi na biljnu kinolat fosforibozil transferazu (QPRTazu) i na DNK koja šifrira ovaj enzim. Posebno, ovaj pronalazak se odnosi na upotrebu DNK koja šifrira kinolat fosforibozil transferazu da se proizvedu transgenske biljke koje imaju genetski izmenjene nikotinske nivoe, i na biljke tako proizvedene.
ISTORIJAT PRONALASKA
Proizvodnja duvana sa smanjenim nivoima nikotina je od interesa, uzimajući u obzir specifičnu brigu u pogledu na adiktivnu prirodu nikotina. Pored toga, biljke duvana sa izvanredno niskim nivoima proizvodnje nikotina, ili bez proizvodje nikotina, su privlačne kao primaoci za transgene koji eksprimuju komercijalno vredne proizvode kao što su farmaceutske sirovine, kozmetičke komponente, ili dodatci hrani. Bili su koncipirani različiti postupci za odstranjivanje nikotina iz duvana. Ipak, najveći deo ovih postupaka pored nikotina odstranjuje druge sastojke iz duvana delujući pri tom nepovoljno na duvan. Klasični načini gajenja useva duvana proizveli su biljke duvana sa nižim nivoima nikotina (približno 8%) od onih nadjenih u biljkama duvana divljeg tipa. Poželjne su biljke duvana i duvan koje imaju čak još dalja smanjenja u sadržaju nikotina.
Jedan pristup za smanjenje nivoa biološkog proizvoda je da se smanji količina potrebnog encima u biosintetskom putu koji vodi do tog proizvoda. Gde se odnosni encim prirodno nalazi u količini koja ograničava razmeru (u odnosu na druge encime potrebne u putu), svako smanjenje tog encimovog obilja smanjiće proizvodnju krajnjeg proizvoda. Ako količina encima nije normalno ograničavajuća razmera, njegovo prisustvo u ćeliji mora da bude smanjeno na nivoe ograničavajuće razmere da bi se smanjio prinos puta. Obratno, ako je prirodno prisutna količina encima ograničavajuća razmera, tada će svako povećanje u encimovoj aktivnosti imati za rezultat povećanje krajnjeg prinosa biosintetskog puta.
Nikotin se primamo stvara u korenju biljke duvana i potom prenosi u lišće, gde se gomila (Tso,Physiology and Biochemistry of Tobacco Plants,str.233-34, Dowden, Hutchison & Ross, Stroudsburg, Pa. (1972). Obavezan stupanj u biosintezi nikotina je stvaranje nikotinske kiseline iz kinolinske kiseline, stupanj koji se katalizuje encimom kinolin fosforibozil transferaze ("QPRTaze"). Izgleda da je QPRTaza encim ograničavajuće razmere u putu_koji daje nikotinsku kiselinu za sintezu nikotina u duvanu.Vidi na. pr.Feth i sar., "Regulation in Tobacco Callus of Enzvmes Activities of the Nicotine Pathway",Planta,168, str. 402-07 (1968): Wagner i sar., The Regulation of Enzvme Activities of the Nicotine Pathway in Tobacco",Physiol. Plant.,str. 667-72 (1986). U US Patentima 5,369,023 i 5,260,205 predložena je prema Nakatani-u i Malik-u modifikacija nikotinskih nivoa u biljkama duvana antisens regulacijom ekspresije putrescens metil transferaze (PMTaze). PCT prijava WO 94/28142 prema Wahad-u i Mallik-u opisuje DNK koja šifrira PMT i upotrebu sens i antisens PMT konstrukata.
KRATAK PREGLED PRONALASKA
Prvi vid ovog pronalaska je izolovani DNK molekul koji sadrži SEQ ID NO:l: DNK sekvence koje šifriraju encim koji ima SEQ ID NO:2 : DNK sekvence koje hibridizuju u takvu DNK i koje šifriraju encim kinolin fosforibozil transferazu: i DNK sekvence koje se razlikuju od gornje DNK usled degeneracije genetskog koda. Peptid šifriran takvom DNK je dalji vid pronalaska.
Takodje je vid ovog pronalaska DNK konstrukt koji sadrži promoter koji može da radi u biljnoj ćeliji i DNK segment koji šifrira encim kinolat fosforibozil transferazu koji je postavljen na dole od promotera i radno je povezan sa njim. DNK koja šifrira encim može da bude u antisens ili sens pravcu.
Takodje, vid ovog pronalaska je i postupak izrade transgeneske biljne ćelije koja ima smanjenu ekspresiju kinolat fosforibozil transferaze (QPRTaze), davanjem biljne ćelije poznatog tipa da eksprimuje kinolat fosforibozil transferazu: transformisanje biljne ćelije pomoću egzogenog DNK konstrukta koji sadrži promoter i DNK koja sadrži deo sekvence rnRNK koja šifrira kinolat fosforibozil transferazu.
Vid ovog pronalaska je još i transgenska biljka vrsteNicotianakoja ima smanjenu ekspresiju kinolat fosforibozil transferaze (QPRTaze) u odnosu na netransformisanu kontrolnu biljku, ćelije takvih biljaka sadrže DNK konstrukt koji obuhvata segment DNK sekvence koji reguliše mRNK kinolat fosforibozil transferazu biljke.
Takodje je vid ovog pronalaska postupak za smanjenje ekspresije gena kinolat fosforibozil transferaze u biljnoj ćeliji gajenjem transformisane biljne ćelije da sadrži egzogenu DNK, gde je transkribovana lančanica egzogene DNK komplementarna mRNK kinolat fosforibozil transferazi endogenoj prema ćeliji. Transkripcija komplementarne lančanice smanjuje ekspresiju kinolat fosforibozil endogenog gena.
Dalji vid ovog pronalaska je postupak proizvodnje biljke duvana koja ima smanjene nivoe nikotina u lišću biljke duvana gajenjem biljke duvana sa ćelijama koje sadrže egzogenu DNK sekvencu, gde je u ćelijama transkribovana lančanica egzogene sekvence DNK komplementarna sa endogenim RNK mesendjerom kinolat fosforibozil transferaze.
Dalji vid ovog pronalaska je postupak izrade transgenske biljne ćelije koja ima povišenu ekspresiju kinolat fosforibozil transferaze (QPRTaze), transformisanjem biljne ćelije koja je poznata da eksprimuje kinolat fosforibozil transferazu pomoću egzogenog DNK konstrukta koji sadrži DNK sekvencu koja šifrira kinolat fosforibozil transferazu.
Dalji vid ovog pronalaska je transgenska biljkaNicotianakoja ima povećanu ekspresiju kinolat fosforibozil transferaze (QPRTaze), gde ćelije transgenske biljke sadrže egzogenu DNK sekvencu koja šifrira kinolat fosforibozil transferazu biljke.
Dalji vid ovog pronalaska je i postupak za povećanje ekspresije gena kinolat fosforibozil transferaze u biljnoj ćeliji, gajenjem transformisane biljne ćelije da sadrži egzogenu DNK koja šifrira kinolat fosforibozil transferazu.
Dalji vid ovog pronalaska je postupak proizvodnje biljke duvana koja ima povećane nivoe nikotina u lišću, gajenjem biljke duvana koja ima ćelije koje sadrže egzogenu DNK sekvencu koja u ćelijama funkcionalno šifrira kinolat fosforibozil transferazu.
KRATAK OPIS CRTEŽA
Slika 1 pokazuje biosintetski put koji vodi do nikotina. Encimske aktivnosti poznate da se regulišu pomoćuNicliNic2su QPRtaza (kinolat fosforibozil transferaza) i PMTasa (putrescens metil transferaza).
Slika 2A daje sekvencu nukleinske kiselineNtQPTIcDNK (SEQ ID NO:l), sa kodirajućom sekvencom (SEQ ID NO:3) prikazanom velikim slovima .
Slika 2B daje izvedenu sekvencu amino kiseline (SEQ ID NO:2) QPRTaze duvana koja se šifrira pomoćuNtQPTIcDNK.
Slika 3 svrstava izvedenu NtQPTl sekvencu amino kiseline i srodne sekvence
Rhodospirillium rubrum- a, Mycobacterium lepre, Salmonella typhimurium- a,
Eschericia coli,humana, iSacharomyces cerevisiae.
Slika 4 pokazuje rezultate komplementacijeEscherichia colimutanta koji nema kinolat fosforibozil transferazu (TH265) saNtQPTlcDNK.. ćelije su bile transformisane pomoću ekspresionog vektora koji nosiNtQPTl:rast transformisanih PH265 ćelija koje eksprimujuNtQPTlna minimalnoj podlozi koja nema nikotinske kiseline je pokazao daNtQPTlšifrira QPRTazu.
Slika 5 uporedjuje nikotinske nivoe i relativno stalnog stanjeNtQTPlmRNK nivoe uNicliNic2duvanskim mutantima: divlji tip Burlev 21( Nicl/ Nicl Nic2/ Nic2) : NiclBurley 21( nicl/ nicl Nic2/ Nic2)\ Nic2Burley 21( Nicl/ Nicl Nic2/ Nic2) :iNiclNic2Burley 21( nicl/ nicl nic2/ nic2).Pune trake pokazuju mRNK nivoe transkripta: šrafirane trake pokazuju nikotinske nivoe.
Slika 6 shematizuje relativne nivoe odNtQPTlmRNK u toku vremena u biljkama duvana otsečenog vrha uporedjene sa kontrolnim biljkama kojima nije otsečen vrh.. Puna traka pokazuju mRNK nivoe transkripta: šrafirane trake pokazuju nikotinske nivoe.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
U biljkama duvana nikotin se stvara kondenzacijom nikotiske kiseline i 4-metil aminobutanala. Biosintetski put koji se svršava sa proizvodnjom nikotina prikazan jeSlici1. Dva regulatorna mesta( NicliNic2)deluju kao kodominantni regulatori proizvodnje nikotina. Encimske analize korenja samo jednog i dvostrukihNicmutanta pokazuju da su aktivnosti dva encima, kinolat fosforibozil transferaze (QPRTaze) i putrescens metil transferaze (PMTaze), direktno proporcionalni nivoima biosinteze nikotina. Poredjenje aktivnosti ecima u tkivima duvana i (koren i kalus) sa različitim sposobnostima za sintezu nikotina pokazuje da je aktivnost QPRTaze srtrogo povezana sa sadržajem nikotina (Wagner i Wagner,Planta,165:532(1985)). Saunders i Bush( Plant. Physiol 64:236 ( 1979)su pokazali da je nivo QPRTaze u korenima mutanata niskog nikotina proporcionalan nivoima nikotina u lišću.
Ovaj pronalazak obuhvata novu cDNK sekvencu (SEQ ID NO:l) koja šifrira biljnu kinolin fosforibozil transferazu (QPRTazu) od SEQ ID NO:2. Kako je aktivnost QPRTaze strogo povezana sa sadržajem nikotina, konstrukcija transgenskih biljaka duvana u kojima su nivoi QPRTaze sniženi u korenima biljke (uporedjeni prema nivoima u biljkama divljeg tipa) rezultuje biljkama koje imaju smanjene nivoe nikotina u lišću. Ovaj pronalazak daje postupke i konstrukte nukleinske kiseline za proizvodnju takvih transgenskih biljaka, kao i takve transgenske biljke. Takvi postupci obuhvataju ekspresiju antisensNtQOTlRNK, koja snižava količinu QPRtaze u korenima duvana. Nikotin je dodatno bio otkriven u neduvanskim vrstama i familijama_biljaka, iako je prisutna količina obično mnogo niža nego uN. tabacum- u.
Ovaj pronalazak takodje daje sens i antisens rekombinantne DNK molekule koji šifriraju QPRTazu ili antisens RNK molekule QPRTaze, i vektore koji sadrže ove molekule rekombinantne DNK, kao i transgenske biljne ćelije i biljke transformisane sa tim DNK molekulima i vektorima. Transgenske ćelije i biljke duvana ovog pronalaska su naznačene nižim ili višim sadržajem nikotina od netransformisanih kontrolnih ćelija i biljaka duvana..
Biljke duvana sa izvanredno niskim nivoima proizvodnje nikotina, ili bez proizvodnje nikotina, su privlačne ka primaoci za transgene koji ekprimuju komercijalno vredne proizvode takve kao žto su farmaceutske siri vine, kozmetičke komponente, ali dodaci hrani. Duvan je privlačan kao biljka primalac za transgen koji šifrira željeni proizvod, pošto duvan može lako genetski da_se kontroliše i proizvodi vrlo veliku biomasu po akru: biljke duvana sa smanjenim sredstvima posvećenim proizvodnji nikotina će sledstveno tome imati više raspoloživih sredstava za proizvodnju transgenih_proizvoda. Postupci transformisanja duvana pomoću transgena koji proizvode željene proizvode su poznati u tehnologiji: svaka podesna tehnika može da se koristi sa biljkama duvana niskog nikotina ovog pronalaska.
Biljke duvana prema ovom pronalasku sa smanjenom ekpresijom QPRTaze i smanjenim nivoima nikotina će biti poželjne u proizvodnji duvanskih proizvoda koji imaju smanjeni sadržaj nikotina. Biljke duvana prema ovom pronalasku će biti podesne za upotrebu u svakom tradicionalnom duvanskom proizvodu, uključujući ali da se ne ogarniči na duvan za lulu, cigaru i cigaretu, i duvan za žvakanje, i može da bude u svakom obliku uključujući list duvana, seckani duvan, ili rezani duvan.
Konstrukti ovog pronalaska mogu da budu takodje korisni u davanju transgenskih biljaka koje imaju povećanu ekspresiju QPRTaze i povećan sadržaj nikotina u biljci. Takvi konstrukti, postupci koji koiste ove konstrukte i biljke tako proizvedene mogu da budu poželjne u proizvodnji duvanskih proizvoda koji imaju izmenjen sadržaj nikotina, ili u proizvodnji biljaka koje imaju povećani sadržaj nikotina za insekticidna delovanja.
Ovaj pronalazak je otkrio da TobRD2 gen( vidiConkling i sar.,Plant. Phys.93, 1203 (1990)) šifriraNicotiana tabacumQPRTazu, i daje u ovoj cDNK sekverncu odNtQPTl(ranije označavanaTobRD2)i skvencu amino kiseline šifriranog encima. UporedjivanjaNtQPTlamino kiselinske sekvence sa GenBank data bazom otkrivaju oganičenu sličnost sekvence sa bakterijskim proteinima koji šifriraju kinolat fosforibozil transferazu (QPRTazu) (Slika 3).
Kinolat fosforibozil transferaza je potrebna zade novobiosintezu nikotin adenin dinukleotida (NAD) i kod prokariota i kod eukariota. U duvanu, visoki nivoi QPRTaze su otkriveni u korenima, ali ne u lišću. Da se odredi daNtQPTlšifrira QPRTazu, ovaj pronalazak koristiEschericia colibakterijski soj (IH265), mutant koji nema kinolat fosforibozil transferaza( nadC).Ovaj mutant ne može da raste na minimalnoj podlozi koja nema nikotinsku kiselinu. Ipak, ekspresija NtQPTl proteina u ovom bakterijskom soju prenosiNadC?fenotip (Slika 4), potvrdjujući daNtQPTlšifrira QPRTazu.
Ovi pronalazači su ispitivali delovanjaNicliNic2mutanata u duvanu, i delovanja otsecanja vrha duvanskih biljaka naNtQPTlnivoe mRNK postojanog stanja i nikotinske nivoe. (Odstranjivanje vršnog penjanja otsecanjem vrhova na početku cvetanja je dobro poznato da ima za posledicu povećane nivoe biosinteze i transporta nikotina u duvanu, i standardna je praksa u proizvodnji duvana). Ako jeNtQPTlzaista uključen u biosintezu nikotina, trebalo bi očekivati da bi (1)NtQPTlmRNK nivoi bili niži uNicl/ Nic2dvostrukim mutantima i (2) NtQPTl mRNk nivoi bi se povećali posle otsecanja vrhova. Nadjeno je da su NtQPTl mRNK nivoi uNicl/ Nic2dvostrukim mutantima bili približno 25% nivoa divljeg tipa (Slika 5). Dalje, unutar šest sati od otsecanja vrhova,NtQPTlmRNK nivoi u biljci duvana se povećali približno osam puta. Prema tome, otkriveno je da jeNtQPTlključni regulatorni gen u putu biosinteze nikotina.
Transgenske biljne ćelije i biljke
Regulisanje ekspresije gena u genomima biljne ćelije može da se postigne integrisanjem heterologne DNK pod transkripcionom kontrolom promotera koji je funkcionalan u domaćinu, i u kome je transkribovana lančanica heterogene DNK komplementarna lančanici DNK koja je transkribovana iz endogenog gena koji.treba da se reguliše. Uvedena DNK, koja se navodi kao antisens DNK, daje RNK sekvencu koja je komplementarna prirodno proizvedenim (endogenim) mRNKiselinama i koja sprečava ekspresiju endogene mRNK. Mehanizam takve regulacije ekspresije gena pomoću antisensa nije potpuno shvaćen. Pošto se ne želi da se drži za bilo kakvu pojedinačnu teoriju, naglašava se da jedna teorija antisens regulatora predlaže da transkripcija antisens DNK stvara RNK molekule koji se vezuju za ili sprečavaju ili koče transkripciju endogenih mRNK molekula.
U postupcima ovog pronalaska, antisens proizvod može da bude komplentaran kodirajućim ili ne kodirajućim (ili i jednim i drugim) delovima prirodno ciljne RNK koji se javljaju. Antisens konstrukcija može da se uvede u biljne ćelije na svaki podesan način, može da bude integrisana u genom biljke za inducibilnu ili konstitutivnu transkripciju antisens sekvence.VidiUS patente brojeve 5,453,566 i 5,107,065 dodeljeni Shevvmakeru i sar. (ovde uključeni referencom u njihovoj celini).
Kako se upotrebljava ovde, egzogena ili heterologna DNK (ili RNK) odnosi se na DNK (ili RNK) koja je bila uvedena u ćeliju (ili ćelijinog pretka) putem ljudskih napora. Takva heterologna DNK može da bude kopija sekvence koja je prirodno nadjena u ćeliji koja se transformisala, ili fragmenti iste.
Da se proizvede biljka duvana koja ima smanjene nivoe OJPRTaze, i na taj način niži sadržaj nikotina, od netransforrnisane kontrolne biljke duvana, ćelija duvana može da se transformiše pomoću egzogene QPRT antisens transkripcione jedinice koja sadrži parcijalnu QPRT cDNK sekvencu, pune dužine QPRT cDNK sekvencu, parcijalnu QPRT hromozomnu sekvencu, ili pune dužine QPRT hromozomnu sekvencu, u antisens orijentaciji sa svojstvenim radno povezanin regulatornim sekvencama. Svojstvene regulatorne sekvence sadrže transkripciju sekvence započinjanja ("promoter") koja može da radi u biljci koja se transformiše, i završnu sekvencu poliadenilovanja / transkripcije. Standardni načini rada, takvi kao restrikciono crtanje mape, hibridizacija Southern mrlje, i analiza nukleotidne sekvence, se tada uporebljavaju da se identifikuju kloni koji nose sekvence QPRTaze u antisens orijentaciji, radno povezane za regulatorne sekvence. Biljke duvana su potom regenerisane iz uspešno transformisanih ćelija. Najviše se pretpostavlja da antisens sekvenca koja se koristi bude komplementarna endogenoj sekvenci, medjutim, manje varijacije u egzogenim i endogenim sekvencama mogu da budu tolerisane. Pod strogim uslovima kako se opisuje niže pretpostavlja se da antisens DNK sekvenca treba da bude dovoljne sličnosti sekvenci koja je sposobna da se veže za endogenu sekvencu u ćeliji koja treba da se reguliše pod strogim uslovima kako se opisuje niže.
Antisens tehnologija je bila upotrebljavana u više laboratorija da se stvore trenagenske biljke koje su okarakterisane nižim od normalnih količina specifičnih encima. Na primer, biljke sa sniženim nivoima halkon sintaze, enzim biosintetskog puta pigmenta cveta, bile su proizvedene umetanjem u genom duvana i petunije gena antisens sintaze halkona. Ove transgenske biljke duvana i petunije proizvode cvetove sa obojenjem svetlijim od normalnog (Van der Krol i sar., "An Anti-sense Chalkone Svnthaze in Transgenic Plants Inhibits Flower Pigmentation",Nature,333, str. 866-69 (1988). Antisens RNK tehnologija je takodje uspešno bila upotrebljena da se speči proizvodnja encima poligalacturonaze u paradajzima (Smith i sar., "Antisense RNA Inhibition of Polygalacturonase Gene Expression i Transgenic Tomatoes",Nature,334, str. 724-26 (1988): Sheehy i sar., "Reduction of Polygalacturonase Activity in Tomato Fruit by Antisense RNA",Proc. NatlAcad. Sci, USA,85, str. 8805-09
(1988)), i male podjedinice encima ribuloze bisfosfat karboksilaze u duvanu (Rodermel i sar., "Nuclear-Organelle Interactions: Nuclear Antisense Gene Inhibits Ribulo se Bisfosfate Carboxylase Enzyme Levels in Trabsformed Tobacco Plants",Cell,55, str..673-81 (1988)). Alternativno, transgenske biljke okarakterisane većim od normalnih količina datog encima mogu da se stvore transformisanjem biljaka pomoću gena za taj encim u sens (t.j .normalnoj) orijentaciji. Nivoi nikotina u transgenskim biljkama duvana ovog pronalaska mogu da se otkriju pomoću standarnih ispitivanja nikotina. Transformisane biljke u kojima je nivo QPRTaze smanjen uporedjen sa netransformisanim kontrolnim biljkama će_prema tome imati smanjeni nivo nikotina uporedjen sa kontrolnom: trasformisane biljke u kojima je nivo QPRTaze povećan uporedjen sa netransformisanim kontrolnim biljkama će prema tome imati povišeni nivo nikotina uporedjen sa kontrolnom.
Heterologna sekvenca koja se koristi u antisens postupcima ovog pronalaska može da se odabere tako kao da proizvodi RNK proizvod komplementaran celoj sekvenci mRNK QPRTaze, ili delu iste. Sekvenca može da bude komplentarna svakoj susednoj sekvenci prirodnog mesengera RNK, to jest, može da bude komplementarna endogenoj mRNK sekvenci blizu 5' -završetka ili mestu koje pokriva , niže od mesta koje pokriva, izmedju mesta koje pokriva i kodona započinjanja i može da pokrije sav ili samo deo područja koje ne kodira, može da premosti nekodirajuće i kodirajuće područje, komplementarno prema 3'-završetku kodirajućeg područja, ili komplemtarno prema 3'-neprevedom području rnNRK-e. Podesne antisens sekvence mogu da budu od bar oko 13 do oko 15 nukleotida, bar oko 16 do oko 21 nukleotida, bar oko 20 nukleotida, bar oko 30 nukleotida, bar oko 50 nukleotida, bar oko 75 nukleotida, bar oko 100 nukleotida, bar oko 125 nukleotida, bar oko 150 nukleotida, bar oko 200 nukleotida, ili više. Uz to, sekvence mogu da se produže ili skrate na 3' ili 5'krajevima istih.
Posebna antisens sekvenca i dužina antisens sekvence će varirati u zavisnosti željenog stepena kočenja, stabilnosti antisens sekvence, i slično. Neko ko poznaje tehnologiju, biće rukovodjen u izboru pogodnih antisens skvenci QPRTaze koristeći načine rada koji su dostupni u tehnologiji i informaciju koja je tu data. Sa pozivanjem na Sliku 2A i SEQ ID NO:l u njoj, oligonukleotid pronalaska može da bude kontinuirani fragmet sekvence cDNK QPRTaze u antisens orijentaciji, svake dužine koja je dovoljna da postigne željena delovanja kada se transformiše u primaoca biljne ćelije.
Ovaj pronalazak može takodje da se primeni u postupcima sens kosupresione proizvodnje nikotina. Sens DNKiseline koje su upotrebljene u izvodjenu ovog pronalaska su dovoljne dužine da, kada se eksprimuju u ćeliji biljke, suprimiraju nativnu ekspresiju proteina biljne QPRTaze u toj biljnoj ćeliji kako se ovde opisuje. Takve sens DNKiseline mogu da budu u suštini cela genomska ili komplementarna DNK koja šifruje encim QPRTaze, ili fragment iste, sa takvim fragmentima koji su tipično bar 15 nukleotida u dužini. Postupci potvrdjivanja dužine sens DNK koja rezultuje u supresiji ekspresije nativnog gena u ćeliji dostupni su onima koji poznaju tehnologiju.
U drugačijem ostvarenju ovog pronalaska,Nicotianabiljne ćelije se transformišu pomoću DNK konstrukta koji sadrži DNK segment koji šifruje encimske RNK molekule( t. j."ribozim"), čiji je encimatski molekul RNK usmeren protiv( t. j.čepa) transkript mRNK DNKiseline šifrujući biljnu QPRTazu kako se ovde opisuje. Ribozomi sadrže supstrate koji vezuju područja koja su vezana za dostupna područja ciljne mRNK, i područja koja katalizuju cepanje RNK, sprečavajući prenošenje i proizvodnju proteina. Vezujući domeni mogu da sadrže antisens sekvence komplementarne ciljnoj mRNK sekvenci, katalitički motiv mogu da budu motiv glave čekića ili drugi motivi, takvi kao što je motiv čiode. Mesta cepanja ribozoma unutar ciljne RNK mogu u početku da budu identifikovana podrobnim ispitivanjem ciljnog molekula za mesta cepanja ribozoma (na pr. GUA, GUU ili GUC sekvence). Pošto su jednom identifikovane, kratke RNK sekvence od 15, 20, 30 ili više ribonukleotida koje odgovaraju predelu ciljnog gena koji sadrži mesto cepanja mogu da se procene za predvidjene strukturalne karakteristike. Podesnost kandidatskih ciljeva može takodje da se proceni testiranjem njihove dostupnosti hibridizaciji pomoću komplementarnih oligonukleotida, koristeći ispitivanja zaštite ribonukleaze kako su poznata u tehnologiji. DNK koja šifrira encimske molekule RNK može da se proizvedu prema poznatim načinima rada.Vidi, na pr.,T. Cech i sar., U.S.Patent br. 4,987,071: Keene i sat, US Patent br. 5,559,021: Donson i sar., US Patent br. 5,589,367: Torrence i sar., US Patent br. 5,583,032: Joyce, US
Patent br. 5,580,967: Gold i sar., US Patent br. 5,595,877: Wagner i sar. US
Patent br. 5,591,601: i US Patent br, 5,622,854 ( čija otkrića u njihovoj celini treba ovde da budu inkorporisana referencom). Prizvodnja takvog enzimskog RNK molekula u biljnoj ćeliji i prekidanje proizvodnje proteina QPRTaze smanjuje aktivnost QPRTaze u biljnim ćelijama u suštini na isti način kao proizvodnju antisens RNK molekula: to jest, kidanjem translacije mRNKiseline u ćeliji koja proizvodi enzim. Izraz "ribizom" je ovde upotrebljen da opiše RNK koja sadrži nukleinsku kiselinu koja funkcioniše kao enzim (takav kao endoribonukleaza), i može da se koristi izmenjujući se sa "enzimatskim RNK molekulom". Ovaj pronalazak dalje obuhvata DNK koja šifrira ribozome, DNK koja šifrira ribozome koja je bila umetnuta u ekspresioni vektor, ćelije domaćina koje sadrže takve vektore, i postupke smanjenja proizvodnje QPRTaze u biljkama koristeći ribozome.
Sekvence nukleinske kiseline upotrebljene u izvodjenju ovog pronalaska obuhvataju one sekvence sa sličnošću prema SEQ ID NO:l, i koja šifrira protein koji ima aktivnost kinolat fosforibozil transferaze. Ova definicija je namenjena da obuhvati prirodne alelne varijacije u proteinima QPRTaze. Prema tome, DNK sekvence koje hibridizuju u DNK od SEQ DD NO:l i kodiraju za ekspresiju QPRTaze, naročito biljne encime QPRTaze, mogu takodje da se upotrebe u izvodjenju ovog pronalaska.
Mogu da postoje različiti oblici duvanskog enzima QPRT. Različiti oblici encima mogu da budu usled post-translacione modifikacije jedinog genskog proizvoda, ili različitih oblikaNtQPTlgena.
Uslovi koji dopuštaju druge DNK sekvence koje kodiraju za ekspresijujproteina koji ima aktivnost QPRTaze da hibridizuje u DNK od SEOJD NO:2 ili u druge DNK sekvence koje šifriraju protein dat kao SEQ ID NO:2 mogu da se odrede na rutinski način. Na primer, hibridizacija takvih sekvenci može da se izvede pod uslovima smanjene rigoroznosti ili čak rigoroznim uslovima (na pr., uslovi pretstavljeni rigoroznošću ispiranja od 0,3 M NaCl, 0.03 M natrijum citrata, 0.1% SDS na 60°C ili čak 70°C ) u DNK koja šifrira protein dat kao SEQ ID NO:2 ovde u standardnomin situispitivanju_bibridizacije.VidiJ. Sambrock i sar., Miolecular cloning, A Laboratorv Manual (2-go izdanje 1989.)
(Cold Spring Harbor Laboratirv)). Opšte uzev, takve sekvence će biti bar 65% slične, 75% slične, 85% slične. 96% slične, ili čak 95% slične, ili više, sa sekvencama datim ovde kao SEQ DD NO:l ili DNK sekvencama koje kodiraju proiteine od SEQ DD NO:2 . (Odredjivanja sličnosti sekvenci su vršena sa dve
sekvence koje su poravnate za maksimalnu sličnost: pri čemu su praznine u obe od dveju sekvenci koje su odgovarale jedna drugoj smatrane maksimalnom sličnošću Dužine praznina od 10 ili manje se pretpostavljaju, dužine praznina od 5 ili manje se više pretpostavljaju i dužine praznina od 2 ili manje se još više pretpostavljaju).
Dostupni su postupci diferencijalne hibridizacije koji dopuštaju izolovanje cDNK klona čiji su mRNK nivoi niži od oko 0.05% poli(A<*>)RNK.Vidi M.Conkling isar., Plant Physiol.93,1203-1211 (1990). Ukratko, cDNK biblioteke se ispituju upotrebljavajući jednolančane cDNK uzorke reversno transkribovane mRNK iz biljnog tkiva (na pr., korena i/ili lišća). Za diferencijalno ispitivanje, nitrocelulozna ili najlonska membrana se potopi u 5xSSC, stavi u 96 usisnih mnogostrukih udubljenja, 150X stacionarne kulture u toku noći se prebaci iz osnovne ploče u svako udubljenje, i postavi vakuum dok sva tečnost nije prošla kroz filter. 150'L rastvora za denaturaciju (0,5M NaOH, 1,5 M NaCl) se stavi u svako udubljenje upotrebljavajući višestruko sredstvo za pipetiranje i ostavi da stoji oko 3 minuta. Nanese vakuum kao gore i odstrani filter i neutrališe u 0,3 M Tris-HCl (pH 8,0), 1,5 M NaCl. Zatim seu vakuumusuši 2 sata i inkubira sa relevatnim uzorcima. Upotrebom najlonskih filter membrana i držanjem osnovnih ploča skladištenih na -70°C u 7% DMSO, filteri mogu da se ispituju mnogo puta sa mnogo uzoraka i odgovarajući kloni ponovo dobiju posle više godina skladištenja. ;Kako se upotrebljava ovde, izraz "gen" se odnosi na DNK sekvencu koja sadrži (1 ) na gore (5') regulatorne signale uključujući promoter, (2) kodirajuće područje koje specificira proizvod, protein ili RNK gena, (3) nadole (3') područja koja obuhvataju transkripciono završavanje i poliadenilacione signale i (4) pridružene sekvence potrebne za efikasnu i specifičnu ekspresiju. ;DNK sekvenca ovog pronalaska može da se sastoji u suštini od sekvence date ovde (SEQ ID NO:l), ili ekvivalentnih nukleotidnih sekvenci koje pretstavljaju alele ili polimorfne varijante ovih gena, ili kodirajuće predele istih. ;Upotreba fraze "substancijalna sličnost sekvence" u ovom opisu i u zahtevima znači da se DNK, RNK ili sekvence aminokiselina koje imaju slabe ili nekonsekventne varijacije sekvence iz aktuelnih sekvenci otkrivenih i zaštićenih ovde smatraju da su ekvivalentne sekvencama ovog pronalaska. U tom pogledu, "slabe i nekonsekventne varijacije sekvence" znači da će "slične" sekvence (t.j. sekvence koje imaju suštinsku sličnost sekvence sa DNK, RNK, ili proteinima otkrivenim i zaštićenim ovde) biti funkcionalno ekvivalentne sekvencama otkrivenim i zaštićenim u ovom pronalasku. Funkcionalno ekvivalentne sekvence će funkcionisati na isti način da proizvedu suštinski iste sastave kao sastave nukleinske kiseline i amino kiseline otkrivene i zaštićene ovde. ;DNK sekvence koje se ovde daju mogu da budu transformisane u različit oblik ćelija domaćina. Različit oblik podesnih ćelija domaćina, koje imaju željena svojstva rasta i manipulisanja, lako se dobijaju u tehnologiji. ;Upotreba fraze "izolovan" ili "u suštini čist" u ovom opisu i zahtevima kao modifikator DNK, RNK, polipeptida ili proteina znači da su DNK, RNK, polipeptidi ili proteini tako označeni bili odvojeni iz njihovihin vivoćelijskih okruženja naporima ljudskih bića. ;Kako se upotrebljava ovde, "nativna DNK sekvenca" ili "prirodna DNK sekvenca" znači DNK sekvencu koja može da se izoluje iz netransgenskih ćelija ili tkiva. Nativne sekvence DNK su one koje nisu bile veštački izmenjene, kao mutagenezom koja je regulisana mestom. Pošto se jednom identifikuju nativne sekvnece DNK, DNK molekuli koji imaju nativne DNK sekvence mogu hemijski da se sintetizuju ili proizvedu koristeći postupke rekombinantne DNK kako su poznate u tehnologiji. Kako se upotrebljava ovde, nativna biljna sekvenca DNK je ona koja može da se izoluje iz netransgenskih biljnih ćelija ili tkiva. Kako se upotrebljava ovde, nativna duvanska sekvenca DNK je ona koja može da se izoluje iz netransgenskih ćelija duvana ili tkiva. ;DNK konstrukti, ili "transkripcione kasete", ovog pronalaska obuhvataju, 5' do 3' u pravcu transkripcije, promoter kako se razmatra ovde, sekvencu DNK kako se razmatra ovde operativno povezanu sa promoterom, i po želji, terminacionu sekvencu koja obuhvata zaustavni signal za RNA polimerazu i poliadenilacioni signal za poliadenilazu. Svi ovi regulatorni regioni treba da budu sposobni da rade u ćelijama tkiva koje treba da se trabnsformiše. Svaki podesan signal terminacije može da se upotrtebi u izvodjenju ovog pronalaska, pri čemu primere istih obuhvataju, ali nisu na to ograničeni, terminator nopalin sintaze( nos),terminator oktapin sintaze( ocs).CaMV terminator, ili nativne signale termiacije koji potiču iz istog gena kao kao transkripcioni inicijativni_region ili potiče iz razlličitog gena.Vidi, na pr.Rezian i sar. (1988) gore, i Rodermel i sar., (1988) gore. ;Izraz "operativno povezan" kako se upotrebljava ovde, odnosi se na sekvence DNK na jednom molekulu DNK koje su povezane tako da je funkcija jedne izmenjena drugom. Prema tome, promoter je operativno povezan sa DNK kada je sposoban da deluje na transkripciju te DNK (t.j. DNK je pod transkripcionom kontrolom promotera). Kaže se promotor je "na više" od DNK, za koju se opet kaže daje naniže od promotera. ;Transkripciona kaseta može da bude data u DNK konstruktu koji takodje ima bar jedan replikacioni sistem. Pogodnosti radi, uobičajeno je da se ima replikacioni sistem funkcionalan uEscherichia coli,takav kao ColEl, pSCIOl, pACYC184, ili slično. Na ovaj način, u svakom stupnju posle svake manipulacije, nastali konstrukt može da se klonira, sekvencuje, i odredi ispravnost manipulacije. Osim toga, ili umestoE. colireplikacionog sistema, može da se upotrebi širok opseg replikacionog sistema domaćina, takav kao replikacioni sistem P-l inkopatibilnosti plazmida, na pr. pRK290. Pored replikacionog sistema, često će se nalaziti prisutan bar jedan marker, koji može da bude koristan u jednom ili više domaćina, ili različiti markeri za individualne domaćine. To jest, jedan marker može da se upotrebi za izbor prokariotskog domaćina, dok drugi marker može da se upotrebi za izbor eukaruiotaskog domaćina, naročito u biljnom domaćinu. Markeri mogu da budu zaštita protiv biocida, takvih kao što su antibiotici, toksini, teški metali, ili slično, mogu da daju komplementaciju, pružajući prototrofiju auksotrofhom domaćinu: ili mogu da daju vidljivi fenotip kroz proizvodnju novog jedinjenja u biljci. ;Različiti fragmenti koji sadrže različite konstrukte, transkripcione kasete, markere i slično mogu da se uvedu postupno restrikcionim cepanjem encima podesnog replikacionog sistema, i umetanjem posebnog konstrukta ili fragmenta u pristupačno mesto. Posle ligacije i kloniranja DNK konstrukt može da se izoluje za dalju manipulaciju. Svi ovi načini rada su široko dati pomoću primera u literaturi kako je primerom pokazali Sarnbrook i sar. Molecular Cloning, A Laboratorv Manual (2go izd. 1989 (Cold Spring Harbor Laboratorv). ;Vektori koji mogu da se upotrebe da se transformiše biljno tkivo pomoću konstrukata nukleiske kiseline ovog pronalaska obuhvataju iAgrobacteriumvektore i balističke vektore kao i vektore podesne za transformaciju koju posreduje DNK. ;Izraz"promoter" se odnosi na region sekvence DNK koji u sebi sadrži potrebne signale za efikasnu ekspresiju kodirajuće sekvence.Ovaj može da obuhvati sekvence za koju se vezuje RNK polimeraza ali nije ograničen na takve sekvernce i može da obuhvati region za koji se vezuju drugi regulatorni proteini zajedno sa regionima uključenim u kontrolu proteinske transformacije i mogu da obuhvate kodirajuće sekvence. ;Promoteri upotrebljeni u izvodjenju ovog pronalaska mogu da budu konstitutivno aktivni promoteri. Dostupni su brojni konstitutivno aktivni promoteri koji mogu da rade u biljkama. Primer koji se pretpostavlja je Cauliflower Mosaic Virus (CaMV) (Mozaički virus karfiola) 35S promoter koji se eksprimuje konstitutivno u većini biljnih tkiva. U alternativi, promoter može da bude promoter specifičan za koren ili specifični promoter korteksa korena, kako se objašnjava detaljnije niže. ;Antisens sekvence su bile eksprimovane u transgenskim duvanskim biljkama koje koriste Cauliflower Mosaic Virus (CaMV) 35S promoter.Vidi, na pr.,Cornelissen i sar., "Both RNA Level and Translation Efficiencv are Reduced by Anti-Sense RNA in Transgenic Tobacco",Nucleic Acids Res.17, str. 833-43 ;(1989): Rezian i sar., "Anti-sense RNAs of Cucumber Mosaic Virus in Transgenic Plants Assessed for Control of the Virus",Olant Molecular Biology11, str. 463-71 (1988): Rodermel i sar., "Nuclear-Organelle Interactions: Nuclear Antisense Gene Inhibits Ribulose Bisphosphate Carboxylase Enzyme Levels in Transformed Tobacco Plants",Cell 55,str. 673-81 (1988) Smith i sar.,"Antisense RNA Inhibition of Polvgalacturonase Gene Expression in Transgenic Tomatoes",Nature 334, str. 724- 26 ( 1988) :Van der Krol i sar., "An Anti-sense Chalcone Svnthase Gene in Transgenic Plants Inhibits Flower Pigmentation",Nature333, str.866-69 (1988). Pretpostavlja se upotreba CaMV 35S promotera za ekspresiju QPRTaze u transformisanim ćelijama i biljkama duvana ovog pronalaska. Upotreba CaMV promotera za ekspresiju drugih rekombinantnih gena u duvanskim korenima je bila dobro opisana (Lam i sar.,"Site-Specific Mutations Alter In Vitro Factor Binding and Change Promoter Expression Pattern in Transgenic Plants",Proc. Nat. Acad. Sci. USA86, str.7890-94 (1989): Poulsen i sar.,"Dissection of 5' Upstream Sequences for Selective Expression of the Nicotiana plumbaginifoliarbcS-8BGene",Mb/. Gen. Genet.214, str. 16-23 (1988)). ;Ostali promoteri koji su aktivni samo u tkivima korena (specifični promoteri korena) su takodje posebno podesni za postupke ovog pronalaska.Vidi, na pr.,US Patent br.5,459,252 Conkling-u i sar.:Yamamoto i sar.,The Plant Cell,3:371 (1991). TobRD2 specifični promoter korteksa korena može takodje da se koristi.Vidi na pr.,US Patentna Prijava SN 08/508,786, sada odobrena, Conkling-u sar: PCT WO 9705261. Svi ovde navedeni patenti su nameneni da budu ovde uneti referencom u njihovoj celini. ;QPRTaza rekombinatnih DNK molekula i vektori upotrebljeni da proizvedu transformisane ćelije i biljke duvana ovog pronalaska mogu dalje da sadrže dominatan marker gen koji može da se bira. Podesni dominantni markeri koji mogu da se biraju obuhvataju, inter alia, gene otporne na antibiotik koji šifriraju neomicin fosfotransferazu (NPTII), higromicin fosfotransferazu (HTP) i hloramfenikol acetiltransferazu (CAT). Drugi dobro poznat dominatni marker koji može da se bira podesan za upotrebu u duvanu je mutant gena dihidrofolat reduktaze koji šifrira na metoktreksat otpornu dihidrofolat reduktazu.. DNK vektori koji sadrže podesne gene otporne na antibiotike i odgovarajući antibiotici, komercijalno su dostupni. ;Transformisane ćelije duvana se odabiraju iz okolne populacije netransformisanih ćelija stavljanjem mešane populacije ćelija u podlogu kulture koja sadrži odgovarajuću koncentraciju antibiotika (ili drugog jedinjenja koje je normalno toksično za ćelije duvana) protiv koga proizvod gena odabranog dominantnog markera koji može da se bira pruža otpor. Na taj način, samo će one ćelije duvana koje su bile transformisane preživeti i množiti se. ;Postupci izrade rekombinantnih biljaka ovog pronalaska, opšte uzev,_obuhvataju prvo dobijanje biljne ćelije koja je sposobna da se regeneriše (biljna ćelija se tipično nalazi u tkivu koje je sposobno da se regeneriše). Biljna ćelija se potom transformiše pomoću DNK konstrukta koji sadrži transkripcionu kasetu ovog pronalaska (kako se opisuje ovde) i rekombinantna biljka se regeneriše iz transformisane biljne ćelije. Kako se objašnjava niže, stupanj transformisanja se izvodi načinima rada kako su poznati u tehnologiji, pri čemu obuhvataju ali se ne ograničavaju na bombardovanje biljne ćelije pomoću mikročestica koje nose transkripcionu kasetu, pri čemu se inficira ćelija saAgrobacterium tumefaciens- omkoja sadrži Ti plazmid koji nosi transkripcionu kasetu, ili bilo koji drugi način rada podesan za proizvodnju transgenske biljke. ;Poznati su brojniAgrobacteriumvektorski sistemi korisni u izvodjenju ovog pronalaska. Na primer, U.S.Patent br. 4,459,353 otkriva postupak za transformisanje prijemljivih biljka, uključujući dikotiledone, pomoću sojaAgrobacterium- akoji sadrži Ti plazmid. Transformacija drvenastih biljaka pomoću vektoraAgrobacterium- aje otkrivena u U.S.Patentu br. 4,795,855. Dalje, U.S.Patent br. 4,940,838 dodeljen Schilperort-u i sar., otkriva binarni vektorAgrobacterium- a(tj.jedan u komeAgrobacteriumsadrži jedan plazmid koji ima vir region Ti plazmida ali nema T region, i drugi plazmid koji ima T region ali nema vir region) koristan u izvodjenju ovog pronalaska. ;Mikročestice koje nose konstrukt DNK ovog pronalaska, mikročestica koja je podesna za balističku transformaciju biljne ćelije, su takodje korisne za izradu transformisanih biljaka ovog pronalaska. Mikročestica se utera u biljnu ćeliju da proizvede transformisanu biljnu ćeliju, i biljka se regeneriše iz transformisane biljne ćelije. Svaka podesna balistička metodologija transformacije ćelije i uredjaj mogu da se koriste u izvodjenju ovog pronalaska. Kao primer uredjaj i postupci su otkriveni u Sanford i Wolf, U.S.Patentu br. 4,945,050, i kod Christou i sar., U.S.Patent br. 5,013,580. Kada se koriste balistički postupci transformacije, transkripciona kaseta može da se umetne u plazmid koji je sposoban da se replicira u ili integriše u ćeliju koja treba da se transformiše. Primere mikročestica podesnih za upotrebu u takvim sistemima obuhvataju 1 do 5' m zlatne lopte. Konstrukt DNK može da se stavi na mikročesticu svakim podesnim načinom rada, kao npr. taloženjem. ;Biljne vrste mogu da se tansformišu pomoću konstrukta DNK ovog pronalaska pomoću transformacije protoplasta biljne ćelije koju posreduje DNK i potonjom regeneracijom biljke iz transformisanih protoplasta prema dobro poznatim postupcima u tehnologiji. Fuzija duvanskih protoplasta sa lipozomima koji sadrže DNK ili preko elektroporacije je poznata u tehnologiji. (Shillito i sar.,"Direct Gene Transfer to Protoplasts of Dicotvledonous and Monocotvledonous Plants by a Number of Methods, Including Electroporation",Methods in Ezymology153, str, 313-36 (1987)). ;Kako se upotrebljava ovde, transformacija se odnosi na uvodjenje egzogene DNK u ćelije, tako da se pomoću egzogene DNK proizvedu stabilno transformisane transgenske ćelije. ;Transformisane ćelije se podstaknu da regenerišu intaktne duvanske biljke preko nanošenja duvanske ćelije i tehnika gajenja tkiva koje su dobro poznate u tehnologiji. Postupak regeneracije biljke se bira tako da bude kompatibilan sa postupkom transformacije. Pouzdano prisustvo i orijentacija sekvence QPRTaze u transgenskim biljkama duvana može da se proveri pomoću Mendel-ovog nasledja sekvence QPRTaze, kako je otkriveno pomoću standardnih postupaka analize DNK primenjenih na potomstvo koje proizlazi iz konrtrolisanih ukrštanja. Posle regeneracije transgenskih duvanskih biljaka iz transformisanih ćelija, uvedena DNK sekvenca se lako prenosi na druge duvanske varijetete preko konvencionalnih izvodjenja gajenja biljke i bez nezgodnog eksperimentisanja. ;Na primer, da se analizira odvajanje transgena, regenerisane transformisane biljke (RJ mogu da rastu do zrelosti, ispitaju za nivoe nikotina, i odvoje da se proizvedu Rjbiljke. Procenat Rjbiljaka koje nose transgen su homozigotne za transgen. Da se identifikuju homozigotne R, biljke, transgenske R, biljke rastu do zrelosti i odvoje. Homozigotne Rjbiljke će proizvesti R2potomstvo gde svaka biljka potomstva nosi transgen, potomstvo heterozigotnih R, biljaka će odvojiti 3:1. ;Nikotin služi i kao prirodni pesticid koji pomaže da se duvanske biljke zaštite od oštećenja štetočinama. Prema tome može da bude poželjno da se dodatno transformišu biljke sa niskim nikotinom ili bez nikotina koje se proizvode ovim postupcima pomoću transgena (takvim kaoBacillus thuringiensis)koje će pružiti dodatnu zaštitu od insekata. ;Biljka koja se pretpostavlja za upotrebu u ovim postupcima su vrsteNicotiana^ili duvan, uključujućiN. tabacum, N. ništica i N. gluitinosa.Svaki soj ili varijetet duvana može da se upotrebi. Pretpostavljaju se sojevi koji su već niskog sadržaja nikotina, takvi kaoNicl/ Nic2dvostruki mutanti. ;Svako biljno tkivo koje je sposobno da se naknadno klonalno razmnožava, bilo organogenezom ili embriogenezom, može da se transformiše sa vektorom ovog pronalaska. Izraz "organogeneza" kako se koristi ovde, znači proces pomoću koga se izdanci i koreni razvijaju sekvencijalno iz centara tkiva koja su sposobna da se razmnožavaju: izraz "embriogeneza", kako se koristi ovde, znači proces kojim se izdanci i koreni razvijaju zajedno na skladan način (ne sekvencijelno), bilo iz somatskih ćelija ili gameta. Posebno odabrano tkivo će varirati u zavisnosti od sistema klonalnog razmnožavanja koji je za to dostupan, i najbolje za to podesan, budući da se transformišu posebne vrste. Ciljna tkiva kao prirner obuhvataju lisne kolutove, polen, embrione, kotiledone, hipokotiledone, kalusno tkivo, postojeće tkivo koje je sposobvno za razmnošavanje (na pr. vršna peteljka, pomoćni pupoljci, i korenske peteljke), i pobudjeno tkivo peteljke (na pr.kotiledonska peteljka i hipokotiledona peteljka). ;Biljke ovog pronalaska mogu da poprime različite oblike. Biljke mogu da budu himere transformisanih ćelija i netransformisanih ćelija: biljke mogu da budu klonalni transformanti (na pr. da sve transformisane ćelije sadrže transkripcionu kasetu): biljke mogu da sadrže kaleme transformisanih i netransformisanih tkiva (na pr., transformisano koreno stablo kalemljeno na netransformisani scion u citrus vrstama). Transformisane biljke mogu da se razmnožavaju različitim sredstvima,takvim kao klonalnim razmnožavanjem ili načinima rada klasičnog gajenja. Na primer, prva generacija (ili TI) transformisanih biljaka može posebno da se gaji da da homozigotnu drugu generaciju (ili T2) transformisanih biljaka, a T2 biljke dalje razmnožavaju putem klasičnih načina gajenja. Dominantan marker koji može da se izdvoji (takav kaonptll)može da se udruži sa transkripvionom kasetom da učestvuje u razmnožavanju. ;S obzirom na prethodno, biće očevidno da biljke koje mogu da se upotrebe u izvodjenju ovog pronalaska obuhvataju one rodaNicotiana.;Onima kojima su bliske metode rekombinantne DNK koje su gore opisane shvatiće da može da se upotrebi cela dužina QPRTaze cDNK molekula ili puna dužina QPRTaze hromozomnog gena, spojenih u sens orijentaciji, sa podesno radno vezanim regulatornim sekvencama, da konstruišu transgenske duvanske ćelije i biljke. (Oni koji poznaju struku shvatiće takodje da pogodne regulatorne sekvence za ekspresiju gena u sens orijentaciji obuhvataju svaku sekvencu poznatih eukariotskih translacionih početnih sekvenci, pored promotera i poliadenilacionih/transkripcionih završnih sekvenci opisanih gore). Takve transformisane biljke duvana su okarakteriasane povećanim nivoima QPRTaze, i stoga višim sadržajem nikotina od netransformisanih kontrolnih biljaka duvana. ;Treba shvatiti, prema tome, da upotreba DNK sekvenci QPRTaze da se smanje ili povećaju nivoi encima QPRTaze, i pri tom da se smanji ili poveća sadržaj nikotina u biljkama duvana, spada u opseg ovog pronalaska. ;Kako se upotrebljava ovde, usev se sastoji od mnogo biljaka ovog pronalaska, i od istog roda, zajedno posejan na agrikulturnom polju. Pod "agrikultumim poljem" se misli običan komad zemljišta ili staklenik. Prema tome, ovaj pronalazak daje postupak za proizvodnju usevnih biljaka koje imaju izmnenjenu aktivnost QPRTaze i na taj način povišene ili snižene sadržaje nikotina kada se uporede sa sličnim usevima netransformisanih biljaka iste vrste i varijeteta. ;Primeri koji slede su izloženi da ilustruju ovaj pronalazak, i ne treba ih shvatiti kao ograničavanje istog. ;PRIMER 1. ;Izolovanje i sekvenciranje ;TobRD2cDNK (Conkling i sar.,Plant Phys.93, 1203 (1990)) je sekvencirana i ovde je data kao SEQ ID NO:l, a izvedena amino kiselinska sekvenca kao SEQ ID NO:2. Predvidelo se da je izvedena amino kiselinska sekvenca citosolni protein. Iako geni biljne QPRTaze nisu bile objavljeni, uporedjenjaNtPTlamino kiselinske sekvence sa GenBank data bazom ((Slika 3) otkrila su ograničenu sličnost sekvence prema izvesnim bakterijskim i drugim_proteinima: aktivnost kinolat fosforibozil transferaze (QPRTaze) bila je pokazana zaS. typhimurium, E. coliiN. tabacumgene.NtQPTlkoji šifrira QPTazu ima sličnosti sa izvedenim peptidnim fragmentom koji šifriraArabidopsisEST (ekspresioni sekvnencni dodatak) sekvencom (GenBank Accession number (F20096), koji može da pretstavlja deo genaArabidopsisQPRTaze. ;PRIMER 2 ;Hibridizacije in- situ ;Da se odredi prostorna raspodela TobRD2 mRNK transkripata u različitim tkivima korena, izvedene su hibrizacijein- situnetranformisanih biljaka. Hibridizacije in-situ antisens lančanice TobRD2 za TobRD2 mRNK u tkivu korena izvedena je uporebom načina rada kako je opisano kod Meyerowitz-a,Plant Mol. Biol. Rep.5,242 (1987) i Smith-a i sar.,Plant mol. Biol. Rep. 5, 237 ( 1987).Sedam dana stari duvanski( Nicotania tabacum)koreni zasejavanja bili su fiksirani u fosfatno puferovanom glutaraldehidu, koji je stavljen u sloj Paraplast Plus (Monoject Inc., St. Louis, MO) i sečen na 8 mm debljine da se dobiju poprečni kao i uzdužni preseci. Antisens TobRD2 transkripti, sintetizovani in vitro u prisustvu 35S-ATP, bili su uzeti kao uzorci. Obeležena RNK je hidrolizovana alkalnim tretiranjem da se dobije 100 do 200 bazne mase prosečne dužine pre upotrebe. ;Hibidizacije su bile radjene u 50% formamidu u toku 16 sat na 42°C, sa približno 5 x IO<6>broja po minutu (cpm) markirane RNK po mililitru hibridizacionog rastvora. Posle ekspozicije, slajdovi su bili razvijeni i vizualizovani pod svetlim i tamnim mikroskopskim poljem. ;Signal hibridizacije je bio lokalizovan za kortikalni sloj ćelija u korenima (rezultati nisu pokazani). Poredjenje slika i svetlog i tamnog polja istih preseka lokalizovali su TobRD2 transkripte za parenhimske ćelije korteksa korena Nije bio vidljiv signal u epidermu ili centralnom vaskularnom delu ose vaskularnih biljaka. ;PRIMER 3 ;TobRD2mRNK nivoi uNic 1 i Nic2mutantima duvana i korelacija prema ;nivoima nikotina ;TobRD2postojanog stanja nivoi mRNK su bili ispitivani uNicliNic2mutantnim biljkama duvana.NicliNic2su poznati da regulišu aktivnost kinolat fosforibozil transferaze i aktivnost purtrescens metil-transferaze, i kodominantni su regulatori proizvodnje nikotina. Ovi rezultati su prikazani na Slikama 5A i 5B i pokazuju daseTobRD2ekspresija reguliše pomoćuNicliNic2,RNK je bila izolovana iz korenova divljeg tipa duvanskih biljaka Burlev 21( Nicl/ Nicl Nic2/ Nic2) :korenova Mc/-Burlev 21( niclnicl Nic2/ Nic2) :korenovaNic2-Burlev 21( Nicl/ Nicl nic2/ nic2) :i korenovaNicl- Nic2- Bur\ ey21( nicl/ nicl;nic2/ nic2).;Četiri Burlev 21 duvanskih sojeva( nic)je raslo iz zasejavanja u zemljištu u toku 4 meseca i prebačeno hidroponske komore (gajenje biljaka u hemijskom rastvoru bez zemlje) u aerisanom hranljivom rastvoru u stakleniku u toku jednog meseca. Ovi sojevi su bili izogeni, izuzev za dva nisko nikotinska mesta i imali su genotipoveNicl/ Nicl Nic2/ Nic2, Nicl/ Nicl nic2/ nic2, nicl/ nicl Nic2/ Nic2, nicl/ nicl nic2nic2.Korenovi su bili požnjeveni iz oko 20 biljaka za svaki genotip i sakupljeni za izolovanje RNK. Ukupna RNK (1 'g) iz svakog genotipa podvrgnut je elektroforezi kroz 1% gel agarozu koja sadrži 1.1 M formaldehida i prebačeno je na najlonsku membranu prema Sambrook-u i sar. ;(1989). Membrane su bile hibridizovane sa<32>P-markiranim TobRD2 cDNK fragmentima. Relativni intenzitet TobRD2 transkripta je bio meren denzitometrijom. Slika 5 (pune trake) prikazuje relativne transkripcione nivoe (uporedjene premaNicl/ Nicl Nic2/ Nic2)za svaki od četiri genotipa. Relativan sadržaj nikotina (uporedjen premaNicl/ Nicl Nic2/ Nic2)od četiri genotipova je prikazan pomoću šrafiranih traka. ;Slika 5 grafički uporedjuje relativna stalna stanjaTobRD2 mRNKnivoa, upotrebljavajući nivo koji je nadjen u Burlev 21 divljeg tipa( Nicl/ Nicl Nic2/ Nic2)kao referentnu količinu.TobRD2mRNK nivoi uNicl/ Nic2dvostrukim mutantima su bili približno 25% nivoa duvana divljeg tipa. Slika 5B dalje uporedjuje relativne nivoe nikotina u srodnim izogenim sojevima duvana koji je proučavan u ovom primeru. (pune trake pokazuju nivo transkriptaTobRD2tšrafirane trake ukazuju nivo nikotina). Postojala je uska korelacija izmedju nikotinskih nivoa i nivoaTobRD2transkripta. ;PRIMER 4;Delovanie otsecanja vrhova naTobRD2 mRNK nivoe;Dobro je poznato u tehnologiji da odstranjivanje cveta sa vrha biljke duvana (otsecanje vrhova) povećava rast korena i povećava sadržaj nikotina lišća te biljke. Otsecanje vrhova biljke je standardna praksa u komercijalnom gajenju duvana, i optimalno vreme za otsecanje vrhova date biljke duvana pod poznatim nizom uslova gajenja može lako da odredi ko je obično vešt u tehnologiji. ;Biljke duvana( N. tabacumSR1) rasle iz zasejavanja u zamljištu u toku meseca i prebačene su u saksije koje sadrže pesak. Biljke su gajene u stakleniku za drugih dva meseca dok nisu počele da puštaju cvetove. Glave cvetova i dva kolena su potom odstranjeni sa četiri biljke (otsecanje vrhova). Deo korenova je potom požnjeven iz svake biljke posle pokazanog vremena i sakupljen za RNK ekstrakciju. Kontrolnim biljkama nisu bili otsecani vrhovi. Ukupna RNK (l'g) iz svake vremenske tačke je bila podvrgnuta elektroforezi preko 1% gel agaroze koji je sadržavao 1,1 M formaldehid i prebačena na najlonsku membranu prema Sambrook-u i sar. , (1989). Membrane su hibridizovane sa<32>P-markiranim TobRD2 cDNK fragmentima. Relativan intenzitet TobRD2 transkripata je bio meren pomoću densitometrije.Slika6 prikazuje relativne tanskriptne nivoe (uporedjene sa nultim vremenom) za svaku vremensku tačku sa otsecanjem vrhova (puna traka) ili bez otsecanja vrhova (šrafirane trake). ;RelativniTobRDŽnivoi su bili odredjeni u tkivu korena u toku 24 sata: rezultati su prikazani naSlici 6(pune trake pokazujuTobRD2transkriptne nivoe u biljkama otsečenih vrhova: šrafirane trake pokazujuTobRD2transkriptne nivoe u kontrolim biljkama neotsečenih vrhova). Unutar šest sati otsecanja vrhova biljaka duvana, mRNK nivoiTobRD2su se povećali približno osam puta u biljkama otsećenih vrhova: nije zapaženo povećanje u kontrolnim biljkama u toku istog vremenskog perioda. ;PRIMER 5 ;Dopunjavanje bakterijskog mutanta koji nema OPRTazu ;sa DNK od SEOD3NO:l ;Escherichia colisoj TH265 je mutant koji nema kinolat fosforibozil transferaza( nadC-), i stoga ne može da rasti na podlozi koje nemaju nikotinske kiseline. ;TH265 ćelije su bile transformisane pomoću ekspresionog vektora (pWS161) koji sadrži DNK od SEQ ID NO:l, ili transformisane samo pomoću ekspresionog vektora (pKK233). Rast transformisanih bakterija je bio uporedjen sa rastom TH265 (pKK233) transformanata, i sa rastom netransformisanog TH265 Hfl<iC-mutanta. Rast je bio uporedejen na ME minimalnoj podlozi (koja nema nikotinsku kiselinu) i na ME minimalnoj podlozi sa dodatom nikotinskom kiselinom. ;E. colisoj sa mutacijom QPRTaze( nadC),TH265, dobijen je ljubaznošću Dr.K.T.Hughesa-a (Hughes i sar.,J. Bact.175:479 (1993). ćelije su održavane na LB podlozi i sposobne ćelije pripravljene kako je opisano kod Sambrook-a i sar. (1989) . Ekspresioni plazmid je bio konstruisan u pKK2233 (Brosius, 19<*>4) pomoću TobRD2 cDNK koja je klonirana pod kontrolom Tac promotera. Nastali plazmid, pWS161, je bio transformisan u TH265 ćelije. Transformisane ćelije su bile potom zasejne na minimalnoj podlozi (Vogel i Bonner, 1956) agarnih ploča sa ili bez nikotinske kiseline (0,0002%) kao dodatkom. Same TH265 ćelije i TH265 transformisane pomoću pKK2233 su bile stavljene na sličnim pločama za upotrebu kao kontrole.
Rezultati su pokazani na Slici 4. Samo TH265 transformisan sa DNK od SEQ ID NO:l je rastao u podlozi koja nema nikotinsku kiselinu. Ovi rezultati pokazuju da ekspresija DNK iz SEQ TD NO:l u TH265 bakterijskim ćelijama prenosiNadC+fenotip na ove ćelije, potvrdjujući da ova sekvenca šifrira QPRTazu. TobRD2 nomenklatura je na taj način bila promenjena uNtQPTL
Primer 6
Transformacija biljaka duvana
DNK od SEQ ID NO:l , u antisens orijentaciji, se operativno vezuje za biljni promoter (CaMV 35S ili TobRD2 specifični promoter korteksa korena) da se proizvedu dve razližite DNK kasete: CaMV35S promoter/antisens SEQ ID NO:l i TobRD2 promoter/antisens SEQ ID NO:l.
Soj duvana divljeg tipa i soj duvana niskog nikotina su odabrani za transformaciju, na pr. divljeg tipa duvan Burlev 21( Nicl+/ Nic2-)i homozigotninicl-/ nic2-Burlev 21. Vekili broj ćelija biljke duvana iz svakog soja je transformisan upotrebljavajući svaku od DNK kaseta. Transformacija je izvodjena upotrebljavajućiAgrobacteriumvektor , na pr.Agrobacterium-binarni vektor koji nosi Ti-granične sekvence intpllgen (koji prenosi otpor prema kanamicinu i pod kontrolomnospromotera( nptll)).
Transformisane ćelije su odabrane i regenerisane u transgenske biljke duvana (RJ. Rg su rasle do zrelosti i ispitivane za nivoe nikotina: niz transformisanih duvanskih biljaka ispoljavao je znatno niže nivoe nikotina kada se uporede sa netransformisanim kontrolnim biljkama.
R,, su tada odvojene i izdvajanje transgena je analizirano uR{potomstvu. R[potomstvo je raslo do zrelosti i izdvojeno: odvajanje transgenog medju R2potomstvom ukazuje koje suRybiljke homozigotne za transgen.

Claims (33)

1. Izolovani DNK molekul, naznačen time, što sadrži DNK sekvencu odabranu od grupe koja se sastoji od: (a) SEQIDNO:l; (b) DNK sekvenci koje kodiraju encim koji ima sekvencu amino kiseline SEQ ID NO: 2; (c) DNK sekvenci koje su sa najmanje 65% homologije sa izolovanom DNK gornjih (a) ili (b) i koje kodiraju encim kinolat fosforibozil transferaze; i (d) DNK sekvenci koje se razlikuju od DNK gornjih (a), (b) ili (c) usled izmene genetskog koda i koje kodiraju encim kinolat fosforibozil transferaze.
2. DNK konstrukt, naznačen time, što ekspresiona kaseta u 5' do 3' pravcu, sadrži promoter koji radi u biljnoj ćeliji i DNK sekvencu prema zahtevu 1 koji je postavjen nadole od promotera i operativno je povezan sa njime.
3. DNK konstrukt, naznačen time, što ekspresiona kaseta u 5' do 3' pravcu, sadrži biljni promoter i DNK sekvencu prema zahtevu 1 koji je postavljen nadole od promotera i operativno je povezan sa njime, pri čemu je DNK sekvenca u antisens orijentaciji.
4. DNK konstrukt, naznačen time, što ekspresiona kaseta u 5' do 3' pravcu, sadrži promoter koji radi u biljnoj ćeliji i DNK koja kodira biljnu kinolat fosforibozil transferazu, koja ima nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 1 prema zahtevu 1, pri čemu je DNK radno povezana sa promoterom.
5. DNK konstrukt, naznačen time, što sadrži, u 5' do 3' pravcu, promoter koji radi u biljnoj ćeliji i DNK koja kodira biljnu kinolat fosforibozil transferazu, koja ima nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 1 prema zahtevu 1, pri čemu je DNK u antisens orijentaciji i radno je povezana sa promoterom.
6. DNK konstrukt prema zahtevu 2,3,4 ili 5, naznačen time, što mu je promoter konstitutivno aktivan u biljnim ćelijama.
7. DNK konstrukt prema zahtevu 2, 3, 4 ili 5, naznačen time, što je promoter selektivno aktivan u ćelijama tkiva korena biljke ili u ćelijama tkiva korteksa korena biljke.
8. DNK konstrukt prema bilo kom od zahteva 2 do 7, naznačen time, što konstrukt dalje sadrži plazmid.
9. DNK konstrukt prema bilo kom od zahteva 2 do 8, naznačen time, što nosi biljni transformacioni vektor.
10. DNK konstrukt prema zahtevu 9, naznačen time, što je biljni transformacioni vektorAgrobacterium tumefaciensvektor.
11. Biljna ćelija, naznačena time, što sadrži DNK konstrukt prema bilo kom od zahteva 2 do 10.
12. Peptid, naznačen time, što ima sekvencu amino kiseline SEQ ID NO: 2.
13. Peptid, naznačen time, što se kodira DNK sekvencom koja je odabrana od grupe koja se sastoji od: (a) SEQIDNO:l; (b) DNK sekvenci koje su sa najmanje 65% homologije sa izolovanom DNK sekvencom (a) i kodiraju encim kinolat fosforibozil transferaze; i (c) DNK sekvenci koje se razlikuju od DNK gornjih (a) ili (b) usled izmene genetskog koda i kodiraju encim kinolat fosforibozil transferaze.
14. Postupak dobijanja transgenske biljne ćelije koja ima smanjenu ekspresiju kinolat fosforibozil transferaze (OJPRTaze), naznačen time, što s^ postupak sastoji od: transformisanja biljne ćelije tipa koji ekspresuje kinolat fosforibozil transferazu, sa egzogenim DNK konstruktom, pri čemu konstrukt sadrži, u 5' do 3' pravcu, promoter koji radi u biljnoj ćeliji i heterolognu DNK koja kodira mRNK kinolat fosforibozil transferaze i odabrana je od DNK sekvenci prema zahtevu 1, gde je heterologna DNK radno povezana sa promoterom, da proizvede transformisanu biljnu ćeliju, pri čemu transformisana biljna ćelija ima smanjenu ekspresiju QPRTaze upoređeno sa netransformisanom biljnom ćelijom.
15. Postupak prema zahtevu 14, naznačen time, što je heterologna DNK sekvenca prema zahtevu 1 u sens ili antisens orijentaciji.
16. Postupak prema zahtevu 14 ili 15, naznačen time, što je biljna ćelijaNicotiana tabacum.
17. Postupak prema bilo kom od zahteva 14 do 16, naznačen time, sto je promoter konstitutivno aktivan.
18. Postupak prema bilo kom od zahteva 14 do 17, naznačen time, što je promoter selektivno aktivan u ćelijama tkiva korena biljke ili u ćelijama tkiva korteksa korena biljke.
19. Postupak prema bilo kom od zahteva 14 do 18, naznačen time, što se korak transformisanja izvodi bombardovanjem biljne ćelije mikročesticama koje nosi DNK konstrukt.
20. Postupak prema bilo kom od zahteva 14 do 18, naznačen time, što se korak transformisanja izvodi inficiranjem biljne ćelije saAgrobacterium tumefacienskoja sadrži Ti plazmid koji nosi DNK konstrukt.
21. Postupak prema bilo kom od zahteva 14 do 20, naznačen time, što je heterologna DNK sekvenca prema zahtevu 1 komplementarna sa mesenger RNK kinolat fosforibozil transferazom (QPRT mRNK) ekspresovanom u biljnoj ćeliji u regionu odabranom od: (a) 5'-neprevedene sekvence QPRT mRNK; (b) 3'-neprevedene sekvence QPRT mRNK; i (c) prevedenog regiona QPRT mRNK.
22. Postupak prema bilo kom od zahteva 14 do 20, naznačen time, što je heterologna DNK sekvenca prema zahtevu 1 komplementarna najmanje sa 15 nukleotida mesenger RNK kinolat fosforibozil transferaze koja se ekspresuje u biljnoj ćeliji.
23. Postupak prema bilo kom od zahteva 14 do 20, naznačen time, što je heterologna DNK sekvenca prema zahtevu 1 komplementarna najmanje sa 200 nukleotida mesenger RNK kinolat fosforibozil transferaze koja se ekspresuje u biljnoj ćeliji.
24. Postupak prema bilo kom od zahteva 14 do 23, naznačen time, što heterologna DNK sekvenca sadrži kinolat fosforibozil transferazu koja kodira sekvencu koja ima nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 1 prema zahtevu 1.
25. Ćelija transgenske biljke vrsteNicotianakoja ima smanjenu ekspresiju kinolat fosforibozil transferaze (QPRTaze) u odnosu na netransformisanu kontrolnu biljnu ćeliju, naznačena time, što ćelija transgenske biljke sadrži: egzogeni DNK konstrukt koji sadrži, u 5' do 3' pravcu, promoter koji radi u biljnoj ćeliji i heterolognu DNK odabranu od DNK sekvenci prema zahtevu 1 i radno povezanu sa promoterom; pri čemu biljna ćelija pokazuje smanjenu ekspresiju QPRTaze upoređeno sa netransformisanom kontrolnom biljnom ćelijom.
26. Transgenska biljna ćelija prema zahtevu 25, naznačena time, što je heterologna DNK u sens ili antisens orijentaciji.
27. Transgenska biljna ćelija vrsteNicotianakoja ima smanjenu ekspresiju kinolat fosforibozil transferaze (QPRTaze) u odnosu na netransformisanu kontrolnu biljnu ćeliju, naznačena time, Stoje transgenska biljna ćelija potomak biljne ćelije prema zahtevu 25 i sadrži DNK sekvencu prema zahtevu 1.
28. Postupak za smanjenje ekspresije gena kinolat fosforibozil transferaze u biljnoj ćeliji, naznačen time, što je odgajena biljna ćelija transformisana da sadrži heterolognu DNK sekvencu prema zahtevu 1, pri čemu je transkribovana sekvenca heterologne DNK sekvence komplementarna sa mesenger RNK kinolat fosforibozil transferaze endogene prema ćeliji, pri čemu transkripcija komplementarne sekvence smanjuje ekspresiju konolat fosforibozil gena.
29. Postupak dobijanja transformisane biljne ćelije koja ima povećanu ekspresiju kinolat fosforibozil transferaze (QPRTaze), naznačen time, što se sastoji od transformisanja biljne ćelije sa egzogenim DNK konstruktom, koji sadrži, u 5' do 3' pravcu, promoter koji radi u biljnoj ćeliji i heterolognu DNK sekvencu prema zahtevu 1, pri čemu je heterologna DNK sekvenca radno povezana sa promoterom, da se proizvede transformisana biljna ćelija koja ima povećanu ekspresiju QPRTaze upoređeno sa netransformisanom biljnom ćelijom.
30. Transgenska biljna ćelija vrsteNicotianakoja ima povećanu ekspresiju kinolat fosforibozil transferaze (QPRTaze) u odnosu na netransformisanu kontrolnu biljnu ćeliju, naznačena time, što transgenska biljna ćelija sadrži: egzogeni DNK konstrukt koji sadrži, u 5' do 3' pravcu, promoter koji radi u biljnoj ćeliji i DNK sekvencu prema zahtevu 1, radno povezanu sa promoterom; pri čemu biljna ćelija ispoljava povišenu ekspresiju QPRTaze upoređeno sa netransformisanom kontrolnom biljnom ćelijom.
31. Transgenska biljna ćelija vrste Nicotiana koja ima povećanu ekspresiju kinolat fosforibozil transferaze (QPRTaze) u odnosu na netransformisanu kontrolnu biljnu ćeliju, naznačena time, što je transgenska biljna ćelija potomak biljne ćelije prema zahtevu 30 i sadrži transgen prema zahtevu 1.
32. Postupak za povećanje ekspresije gena kinolat fosforibozil tranferaze u biljnoj ćeliji, naznačen time, što se sastoji od: gajenja biljne ćelije transformisane da sadrži egzogenu DNK, odabrane od DNK sekvenci prema zahtevu 1, pri čemu egzogena DNK kodira kinolat fosforibozil transferazu.
33. Postupak prema zahtevu 32, naznačen time, što se tranformisana biljna ćelija dobija postupkom koji se sastoji od. integrisanja u genom biljne ćelije domaćina DNK konstrukta koji sadrži, u pravcu transkripcije, promoter funkcionalan u biljnoj ćeliji, DNK sekvencu prema zahtevu 1 koja kodira kinolat fosforibozil transferazu funkcionalnu u ćeliji, pri čemu je DNK sekvenca radno povezana sa promoterom, i transkripcioni završni region funkcionalan u ćeliji, pri čemu se dobija transformisana biljna ćelija.
YUP-648/99A 1997-06-12 1998-06-10 Regulisanje ekspresije kinolat fosforibozil transferaze RS49677B (sr)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US4947197P 1997-06-12 1997-06-12

Publications (2)

Publication Number Publication Date
YU64899A YU64899A (sh) 2004-12-31
RS49677B true RS49677B (sr) 2007-11-15

Family

ID=21960004

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
YUP-648/99A RS49677B (sr) 1997-06-12 1998-06-10 Regulisanje ekspresije kinolat fosforibozil transferaze

Country Status (37)

Country Link
US (9) US6586661B1 (sr)
EP (3) EP1457563B1 (sr)
JP (4) JP4095678B2 (sr)
KR (1) KR100365969B1 (sr)
CN (2) CN100482799C (sr)
AP (1) AP1169A (sr)
AT (1) ATE262039T1 (sr)
AU (1) AU748514B2 (sr)
BG (1) BG64319B1 (sr)
BR (1) BRPI9810870B1 (sr)
CA (2) CA2484366A1 (sr)
CU (1) CU23174A3 (sr)
CZ (1) CZ297379B6 (sr)
DE (2) DE69822463T2 (sr)
DK (1) DK0991766T3 (sr)
EA (2) EA009898B1 (sr)
EE (1) EE04595B1 (sr)
ES (1) ES2154624T3 (sr)
GE (1) GEP20032871B (sr)
GR (1) GR20010300003T1 (sr)
HU (1) HU225888B1 (sr)
ID (1) ID29311A (sr)
IL (3) IL132184A0 (sr)
LT (1) LT4706B (sr)
LV (1) LV12507B (sr)
NO (1) NO324872B1 (sr)
NZ (1) NZ500963A (sr)
OA (1) OA11219A (sr)
PL (1) PL201266B1 (sr)
PT (1) PT991766E (sr)
RO (1) RO121968B1 (sr)
RS (1) RS49677B (sr)
SI (1) SI20215B (sr)
SK (1) SK161899A3 (sr)
TR (1) TR199902728T2 (sr)
UA (1) UA72187C2 (sr)
WO (1) WO1998056923A1 (sr)

Families Citing this family (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7885697B2 (en) 2004-07-13 2011-02-08 Dexcom, Inc. Transcutaneous analyte sensor
US6586661B1 (en) * 1997-06-12 2003-07-01 North Carolina State University Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression by transformation with a tobacco quinolate phosphoribosyl transferase nucleic acid
US20100251425A9 (en) * 1998-05-15 2010-09-30 University Of Central Florida Expression of human interferon in transgenic chloroplasts
DE19926216A1 (de) * 1999-06-09 2001-02-22 Metallgesellschaft Ag Verfahren zur Herstellung von Bariumsulfat, Bariumsulfat und Verwendung des Bariumsulfats
AU2001286843A1 (en) * 2000-08-30 2002-03-13 North Carolina State University Transgenic plants containing molecular decoys that alter protein content therein
DE60128149D1 (en) * 2000-11-07 2007-06-06 Univ North Carolina State Putrescin-n-methyltransferasepromotor
JP2004520818A (ja) 2000-11-10 2004-07-15 ベクター、タバコ、リミテッド タバコの煙から発癌性物質を除去する方法および製品
DE10055870A1 (de) 2000-11-10 2002-05-29 Degussa Neue für das nadC-Gen kodierende Nukleotidsequenzen
WO2002098208A2 (en) * 2001-06-06 2002-12-12 22Nd Century Limited, Llc Tobacco biomass utilization
WO2005103296A2 (en) * 2004-03-30 2005-11-03 Vector Tobacco, Ltd. Global gene expression analysis of human bronchial epithelial cells exposed to cigarette smoke, smoke condensates, or components thereof
US20060157072A1 (en) * 2001-06-08 2006-07-20 Anthony Albino Method of reducing the harmful effects of orally or transdermally delivered nicotine
CN1638655A (zh) * 2001-06-08 2005-07-13 韦克多烟草有限公司 修饰烟草中烟碱和亚硝胺的水平
US6730832B1 (en) 2001-09-10 2004-05-04 Luis Mayan Dominguez High threonine producing lines of Nicotiana tobacum and methods for producing
EP1441603A2 (en) * 2001-11-09 2004-08-04 Vector Tobacco Inc. Method and composition for mentholation of charcoal filtered cigarettes
JP2005512555A (ja) * 2001-12-19 2005-05-12 ベクター・タバコ・インコーポレーテッド シガレットのメントール化する方法及び組成物
JP2005512554A (ja) * 2001-12-19 2005-05-12 ベクター・タバコ・インコーポレーテッド タバコ製品に清涼効果を付与する方法および組成物
EP1499188A4 (en) * 2002-04-09 2007-11-14 Vector Tobacco Ltd TOBACCO WITH LESS NICOTINE AND NITROSAMINES
EP1675454A4 (en) * 2003-08-19 2007-03-21 22Nd Century Ltd Llc TOBACCO PRODUCTS WITH REDUCED EXPOSURE
US7920906B2 (en) 2005-03-10 2011-04-05 Dexcom, Inc. System and methods for processing analyte sensor data for sensor calibration
WO2005041151A2 (en) * 2003-10-02 2005-05-06 Vector Tobacco Ltd. Tobacco product labeling system
US9247900B2 (en) 2004-07-13 2016-02-02 Dexcom, Inc. Analyte sensor
US7538071B2 (en) 2003-11-21 2009-05-26 Carl Berger Methods of reducing the nicotine content of tobacco plants and tobacco plants obtained thereby
US8792955B2 (en) 2004-05-03 2014-07-29 Dexcom, Inc. Transcutaneous analyte sensor
AU2012203977B2 (en) * 2005-02-28 2015-01-29 22Nd Century Limited, Llc Reducing levels of nicotinic alkaloids in plants
CA2992898A1 (en) * 2005-02-28 2006-10-19 22Nd Century Limited, Llc Reducing levels of nicotinic alkaloids in plants
WO2006124448A2 (en) 2005-05-11 2006-11-23 Vector Tobacco Inc. Reduced risk tobacco products and methods of making same
FR2889003A1 (fr) * 2005-07-22 2007-01-26 St Microelectronics Sa Adaptation automatique d'une source video a un recepteur
WO2008020333A2 (en) 2006-06-19 2008-02-21 National Research Council Of Canada Nucleic acid encoding n-methylputrescine oxidase and uses thereof
PL2061889T3 (pl) 2006-09-13 2014-11-28 22Nd Century Ltd Llc Zwiększanie poziomów alkaloidów nikotynowych
US9551003B2 (en) * 2006-09-13 2017-01-24 22Nd Century Limited, Llc Increasing levels of nicotinic alkaloids in plants
US9102948B2 (en) 2006-11-17 2015-08-11 22Nd Century Limited, Llc Regulating alkaloids
US9106606B1 (en) 2007-02-05 2015-08-11 F5 Networks, Inc. Method, intermediate device and computer program code for maintaining persistency
CA3008999C (en) 2007-05-25 2022-10-04 22Nd Century Limited, Llc Nucleic acid sequences encoding transcription factors regulating alkaloid biosynthesis and their use in modifying plant metabolism
US20100206317A1 (en) * 2007-09-28 2010-08-19 Vector Tobacco, Inc. Reduced risk tobacco products and use thereof
WO2009074325A1 (en) 2007-12-13 2009-06-18 Philip Morris Products S.A. Transgenic plants modified for reduced cadmium transport, derivative products, and related methods
WO2011062298A1 (ja) 2009-11-19 2011-05-26 国立大学法人岡山大学 遺伝子発現を上昇させるシステム及び該システムを保持したベクター
EP2509656B1 (en) 2009-12-11 2015-03-25 Terumo BCT, Inc. System for blood separation with shielded extraction port and optical control
WO2011102394A1 (ja) 2010-02-17 2011-08-25 日本たばこ産業株式会社 植物内容成分の調節因子、およびその利用
US9862923B2 (en) 2010-03-26 2018-01-09 Philip Morris Usa Inc. Cultured tobacco cells as a matrix for consumable products
EP2565265A1 (en) 2011-09-02 2013-03-06 Philip Morris Products S.A. Isopropylmalate synthase from Nicotiana tabacum and methods and uses thereof
US8716571B2 (en) 2011-09-21 2014-05-06 Reynolds Technologies, Inc. Tobacco having reduced amounts of amino acids and methods for producing such lines
US9137958B2 (en) 2012-02-08 2015-09-22 Reynolds Technologies, Inc. Tobacco having altered amounts of environmental contaminants
CA2894955C (en) * 2012-12-21 2023-10-31 Philip Morris Products S.A. Tobacco specific nitrosamine reduction in plants
CN103173488B (zh) * 2013-03-14 2014-09-03 浙江省农业科学院 新的融合标签进行水稻转基因快速筛选的方法
US10375910B2 (en) 2013-03-15 2019-08-13 Altria Client Services Llc Development of tobacco varieties with no or significantly reduced anatabine content
US20180291388A1 (en) * 2015-05-05 2018-10-11 North Carolina State University Methods and compositions for reducing the tobacco specific nitrosamine nnk in tobacco
EP4218404A3 (en) 2015-06-26 2023-09-06 Altria Client Services LLC Compositions and methods for producing tobacco plants and products having altered alkaloid levels
EP3480314A1 (en) 2017-11-03 2019-05-08 Philip Morris Products S.A. Regulation of alkaloid content
US20200035118A1 (en) 2018-07-27 2020-01-30 Joseph Pandolfino Methods and products to facilitate smokers switching to a tobacco heating product or e-cigarettes
US10897925B2 (en) 2018-07-27 2021-01-26 Joseph Pandolfino Articles and formulations for smoking products and vaporizers
WO2021072288A1 (en) * 2019-10-10 2021-04-15 Altria Client Services Llc Compositions and methods based on qpt engineering for producing tobacco plants and products having altered alkaloid levels
CN113528537A (zh) * 2021-08-11 2021-10-22 云南省烟草农业科学研究院 一种降低烟叶烟碱含量的NtQPT2基因突变体及其应用
CN116983432A (zh) * 2023-07-07 2023-11-03 深圳先进技术研究院 用于治疗类风湿性关节炎的药物

Family Cites Families (216)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US254285A (en) * 1882-02-28 David w
US299541A (en) * 1884-06-03 heae-n
US38123A (en) * 1863-04-07 Improvement in harvesters
US819751A (en) * 1905-01-04 1906-05-08 Giuseppe Gianoli Process of charging silk.
US2479526A (en) * 1940-12-11 1949-08-16 Wurton Machine Company Apparatus for curing green tobacco
US2728803A (en) * 1951-12-28 1955-12-27 Standard Oil Co Separation of ethylbenzene from other c8 aromatic hydrocarbons by extraction with hf-bf3
US2728603A (en) 1954-12-13 1955-12-27 James H Stagg Lawn and garden sprinkler
DE1917552U (de) 1964-01-31 1965-06-10 Fritz Tautenhahn Flaechig-ornamentales gitterwerk.
US3693631A (en) 1971-04-28 1972-09-26 Reynolds Leasing Corp Tobacco expansion process
US3840025A (en) * 1972-08-14 1974-10-08 Industrial Nucleonics Corp Tobacco moisture control system and method
US3905123A (en) * 1973-10-15 1975-09-16 Industrial Nucleonics Corp Method and apparatus for controlling a tobacco dryer
US4319587A (en) * 1975-06-09 1982-03-16 Irving S. Moser Smoking article
DE2531285C2 (de) * 1975-07-12 1982-10-28 Deutsche Benkert Gmbh & Co Kg, 4690 Herne Filterzigarette
US4192323A (en) * 1977-09-21 1980-03-11 Gas-Fired Products, Inc. Apparatus and method for automatically controlling curing conditions in a tobacco curing barn
US4557280A (en) 1978-06-15 1985-12-10 Brown & Williamson Tobacco Corporation Process for reduction of nitrate and nicotine content of tobacco by microbial treatment
US4243056A (en) * 1979-01-12 1981-01-06 Philip Morris Incorporated Method for uniform incorporation of additives into tobacco
FR2478958A1 (fr) * 1980-04-01 1981-10-02 Decoufle Dispositif d'alimentation en encre des appareils d'imprimerie pour machines a confectionner les cigarettes
US4499911A (en) * 1980-12-09 1985-02-19 Johnson William H Energy efficient curing and drying system
GB2092149B (en) * 1981-02-03 1985-01-03 Searle & Co Imidazoline hydrazone and hydrazine derivatives production thereof and use in medicine
US4459355A (en) * 1982-07-12 1984-07-10 International Paper Company Method for transforming plant cells
US4762785A (en) 1982-08-12 1988-08-09 Calgene, Inc. Novel method and compositions for introducting alien DNA in vivo
NL8203963A (nl) * 1982-10-14 1984-05-01 Naarden International Nv Werkwijze voor het aromatiseren van droog plantaardig materiaal.
EP0320500B1 (en) 1983-01-13 2004-11-17 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Non-oncogenic ti plasmid vector system and recombinant DNA molecules for the introduction of expressible genes into plant cell genomes
US6051757A (en) 1983-01-14 2000-04-18 Washington University Regeneration of plants containing genetically engineered T-DNA
JPS60500438A (ja) 1983-01-17 1985-04-04 モンサント　カンパニ− 植物細胞を形質転換するためのプラスミド
US5034322A (en) 1983-01-17 1991-07-23 Monsanto Company Chimeric genes suitable for expression in plant cells
SU1582990A3 (ru) 1983-01-17 1990-07-30 Монсанто Компани (Фирма) Способ получени трасформированных клеток двудольных растений
US6174724B1 (en) 1983-01-17 2001-01-16 Monsanto Company Chimeric genes suitable for expression in plant cells
EP0131623B2 (en) 1983-01-17 1999-07-28 Monsanto Company Chimeric genes suitable for expression in plant cells
US5352605A (en) 1983-01-17 1994-10-04 Monsanto Company Chimeric genes for transforming plant cells using viral promoters
NL8300699A (nl) 1983-02-24 1984-09-17 Univ Leiden Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; werkwijze voor het produceren van agrobacterium tumefaciens bacterien; stabiele cointegraat plasmiden; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten.
NL8300698A (nl) 1983-02-24 1984-09-17 Univ Leiden Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; agrobacterium tumefaciens bacterien en werkwijze voor het produceren daarvan; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten.
US4751348A (en) 1983-07-16 1988-06-14 Cold Spring Harbor Laboratory Nicotiana plants with both altered polyamine levels and flower structures and method for obtaining these plants
US4766855A (en) * 1983-07-20 1988-08-30 Cummins Engine Co., Inc. Plasma jet ignition apparatus
US5208149A (en) 1983-10-20 1993-05-04 The Research Foundation Of State University Of New York Nucleic acid constructs containing stable stem and loop structures
DE3486053T3 (de) 1983-10-20 2004-01-08 The Research Foundation Of State University Of New York Regulierung von Gen-Expression durch Translationshemmung unter Verwendung von m-RNS hinderndem Komplementär-RNS.
US5190931A (en) 1983-10-20 1993-03-02 The Research Foundation Of State University Of New York Regulation of gene expression by employing translational inhibition of MRNA utilizing interfering complementary MRNA
US5272065A (en) 1983-10-20 1993-12-21 Research Foundation Of State University Of New York Regulation of gene expression by employing translational inhibition of MRNA utilizing interfering complementary MRNA
US4885248A (en) 1984-02-15 1989-12-05 Lubrizol Genetics, Inc. Transfer vector
US4771002A (en) 1984-02-24 1988-09-13 Lubrizol Genetics, Inc. Transcription in plants and bacteria
NL8401780A (nl) 1984-06-04 1986-01-02 Rijksuniversiteit Leiden En Pr Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van planten.
US5149645A (en) 1984-06-04 1992-09-22 Rijksuniversiteit Leiden Process for introducing foreign DNA into the genome of plants
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US5036006A (en) 1984-11-13 1991-07-30 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US5100792A (en) 1984-11-13 1992-03-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues
DE3587548T2 (de) 1984-12-28 1993-12-23 Bayer Ag Rekombinante DNA, die in pflanzliche Zellen eingebracht werden kann.
US6281410B1 (en) 1986-07-31 2001-08-28 Calgene Llc Methods and compositions for regulated transcription and expression of heterologous genes
US4943674A (en) 1987-05-26 1990-07-24 Calgene, Inc. Fruit specific transcriptional factors
US5753475A (en) 1985-01-17 1998-05-19 Calgene, Inc. Methods and compositions for regulated transcription and expression of heterologous genes
US6617496B1 (en) 1985-10-16 2003-09-09 Monsanto Company Effecting virus resistance in plants through the use of negative strand RNAs
NL8502948A (nl) 1985-10-29 1987-05-18 Rijksuniversiteit Leiden En Pr Werkwijze voor het inbouwen van "vreemd dna" in het genoom van dicotyle planten.
US4795855A (en) * 1985-11-14 1989-01-03 Joanne Fillatti Transformation and foreign gene expression with woody species
GB8529851D0 (en) 1985-12-04 1986-01-15 Rothmans Of Pall Mall Linear layered cigarette
US5107065A (en) 1986-03-28 1992-04-21 Calgene, Inc. Anti-sense regulation of gene expression in plant cells
US5453566A (en) 1986-03-28 1995-09-26 Calgene, Inc. Antisense regulation of gene expression in plant/cells
IL81737A (en) 1986-03-28 1992-11-15 Calgene Inc Regulation of gene expression in plant cells
US4699158A (en) * 1986-04-17 1987-10-13 Philip Morris Incorporated Adjustable filter cigarette with tactile indicator
US4700725A (en) * 1986-04-17 1987-10-20 Philip Morris Incorporated Adjustable filter cigarette
ATE39600T1 (de) * 1986-04-23 1989-01-15 Reynolds Tobacco Gmbh Verfahren zur behandlung von tabak und aehnlichen organischen materialien.
US4766911A (en) * 1986-06-23 1988-08-30 R. J. Reynolds Tobacco Company Method for tracing smoking articles
US4962028A (en) 1986-07-09 1990-10-09 Dna Plant Technology Corporation Plant promotors
US5229292A (en) 1986-07-28 1993-07-20 Stine Seed Farm, Inc. Biological control of insects using pseudomonas strains transformed with bacillus thuringiensis insect toxingene
EP0265556A1 (en) 1986-10-31 1988-05-04 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Stable binary agrobacterium vectors and their use
US5268463A (en) * 1986-11-11 1993-12-07 Jefferson Richard A Plant promoter α-glucuronidase gene construct
US5015580A (en) * 1987-07-29 1991-05-14 Agracetus Particle-mediated transformation of soybean plants and lines
US4966916A (en) * 1987-02-12 1990-10-30 Abood Leo G Agonists and antagonists to nicotine as smoking deterrents
US4835162A (en) * 1987-02-12 1989-05-30 Abood Leo G Agonists and antagonists to nicotine as smoking deterents
US5356799A (en) 1988-02-03 1994-10-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Antisense gene systems of pollination control for hybrid seed production
US5922602A (en) 1988-02-26 1999-07-13 Biosource Technologies, Inc. Cytoplasmic inhibition of gene expression
US5179022A (en) 1988-02-29 1993-01-12 E. I. Du Pont De Nemours & Co. Biolistic apparatus for delivering substances into cells and tissues in a non-lethal manner
US4954442A (en) 1988-08-31 1990-09-04 Purdue Research Foundation Opine enhancement of vir gene induction
US5023179A (en) * 1988-11-14 1991-06-11 Eric Lam Promoter enhancer element for gene expression in plant roots
GB8827592D0 (en) 1988-11-25 1988-12-29 Taniguchi T Improvements in & relating to regulation of expression
US4990607A (en) * 1989-03-14 1991-02-05 The Rockefeller University Alteration of gene expression in plants
US5223419A (en) * 1989-03-14 1993-06-29 The Rockefeller University Alteration of gene expression in plants
US5231020A (en) 1989-03-30 1993-07-27 Dna Plant Technology Corporation Genetic engineering of novel plant phenotypes
US5034323A (en) 1989-03-30 1991-07-23 Dna Plant Technology Corporation Genetic engineering of novel plant phenotypes
GB8916213D0 (en) 1989-07-14 1989-08-31 Ici Plc Dna constructs,cells and plants derived therefrom
US6203976B1 (en) 1989-07-18 2001-03-20 Osi Pharmaceuticals, Inc. Methods of preparing compositions comprising chemicals capable of transcriptional modulation
US5580722A (en) 1989-07-18 1996-12-03 Oncogene Science, Inc. Methods of determining chemicals that modulate transcriptionally expression of genes associated with cardiovascular disease
US5776502A (en) 1989-07-18 1998-07-07 Oncogene Science, Inc. Methods of transcriptionally modulating gene expression
US5665543A (en) 1989-07-18 1997-09-09 Oncogene Science, Inc. Method of discovering chemicals capable of functioning as gene expression modulators
ATE238431T1 (de) 1989-07-18 2003-05-15 Osi Pharm Inc Methode der veränderung der expression von genen bei der transkription und zum nachweis von chemischen substanzen, die wie modulatoren der genexpression wirken
US5501967A (en) 1989-07-26 1996-03-26 Mogen International, N.V./Rijksuniversiteit Te Leiden Process for the site-directed integration of DNA into the genome of plants
NL8901931A (nl) 1989-07-26 1991-02-18 Mogen International N V En Rij Werkwijze voor het plaatsgericht introduceren van vreemd dna in het genoom van planten.
US5097025A (en) 1989-08-01 1992-03-17 The Rockefeller University Plant promoters
US5062434A (en) 1989-09-22 1991-11-05 Brown & Williamson Tobacco Corporation Cigarette paper
GB8923716D0 (en) 1989-10-20 1989-12-06 Ici Plc Dna,constructs,cells and plants derived therefrom
US5177308A (en) 1989-11-29 1993-01-05 Agracetus Insecticidal toxins in plants
EP0434616B1 (de) 1989-12-19 1995-11-15 Ciba-Geigy Ag Verfahren und Vorrichtung zur genetischen Transformation von Zellen
JPH0673478B2 (ja) * 1990-01-11 1994-09-21 旭化成工業株式会社 Ｌ―カルニチンの高感度測定法および測定用組成物
WO1991011535A1 (en) 1990-01-30 1991-08-08 Childrens Hospital Of Los Angeles Inhibition of transcription by double-stranded oligonucleotides
CA2036935A1 (en) 1990-02-26 1991-08-27 Paul Christou Plant transformation process with early identification of germ line transformation events
GB9005945D0 (en) 1990-03-16 1990-05-09 Cambridge Advanced Tech Plant promoter
WO1991014790A1 (en) 1990-03-27 1991-10-03 New England Medical Center Hospitals, Inc. Inhibitors of transcription activation activity of papillomaviruses
US5109876A (en) * 1990-04-19 1992-05-05 R. J. Reynolds Tobacco Company Cigarette paper and cigarette incorporating same
US5204253A (en) 1990-05-29 1993-04-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method and apparatus for introducing biological substances into living cells
US5260205A (en) 1990-11-14 1993-11-09 Philip Morris Incorporated Method of purifying putrescine N-methyltransferase from tobacco plant extract with a polyamine
US5668295A (en) 1990-11-14 1997-09-16 Philip Morris Incorporated Protein involved in nicotine synthesis, DNA encoding, and use of sense and antisense DNAs corresponding thereto to affect nicotine content in transgenic tobacco cells and plants
US5932782A (en) 1990-11-14 1999-08-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant transformation method using agrobacterium species adhered to microprojectiles
US5035252A (en) 1990-12-14 1991-07-30 Mondre Steven J Nicotine-containing dental floss
US5459252A (en) 1991-01-31 1995-10-17 North Carolina State University Root specific gene promoter
JPH04265569A (ja) * 1991-02-19 1992-09-21 Canon Inc 音声信号記録装置及び再生装置
CA2108144A1 (en) 1991-03-06 1992-09-07 Jack A. Roth Methods and compositions for the selective inhibition of gene expression
JPH06509704A (ja) 1991-04-18 1994-11-02 ザ　ソールク　インスチチュート　フォア　バイオロジカル　スタディズ 特定ｄｎａ配列に選択的に結合する蛋白質に対する偽構築体として有用なオリゴデオキシヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド
FR2675803B1 (fr) 1991-04-25 1996-09-06 Genset Sa Oligonucleotides fermes, antisens et sens et leurs applications.
GB9109063D0 (en) 1991-04-26 1991-06-12 Ici Plc Modification of lignin synthesis in plants
WO1993000546A1 (en) 1991-06-20 1993-01-07 Reinforced Plastics/Composites Pty Ltd A connecting system
ATE165397T1 (de) 1991-06-27 1998-05-15 Genelabs Tech Inc Screeningtest für den nachweis von dna-bindenden molekülen
GB9304200D0 (en) 1993-03-02 1993-04-21 Sandoz Ltd Improvements in or relating to organic compounds
DK152291D0 (da) 1991-08-28 1991-08-28 Danisco Fremgangsmaade og kemiske forbindelser
US5994629A (en) 1991-08-28 1999-11-30 Novartis Ag Positive selection
WO1993005646A1 (en) * 1991-09-13 1993-04-01 Technology Management Services, S.A. Reduction of nicotine levels in tobacco
WO1993014768A1 (en) 1992-01-27 1993-08-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and compositions for neutralizing intracellular nucleic acid-binding protein biological activity in a cell, including methods and compositions useful to regulate gene function
EP0628082B1 (en) 1992-02-26 2001-05-16 Zeneca Mogen B.V. Agrobacterium strains capable of site-specific recombination
US5780051A (en) * 1992-04-02 1998-07-14 Dynagen, Inc. Methods and articles of manufacture for nicotine cessation and monitoring nicotine use
EP0633940B1 (en) * 1992-04-02 2002-12-04 SemBioSys Genetics Inc. Oil-body protein cis-elements as regulatory signals
US5626152A (en) * 1992-08-26 1997-05-06 Molins Plc Cigarette making machine
US5469871A (en) * 1992-09-17 1995-11-28 R. J. Reynolds Tobacco Company Cigarette and method of making same
RU2130632C1 (ru) * 1992-11-27 1999-05-20 Фоксел Способ и устройство для изготовления голограмм
WO1994012015A1 (en) 1992-11-30 1994-06-09 Chua Nam Hai Expression motifs that confer tissue- and developmental-specific expression in plants
IL108367A0 (en) 1993-01-27 1994-04-12 Hektoen Inst For Medical Resea Antisense polynzcleotide inhibition of human growth factor-sensitive cancer cells
AU684785B2 (en) 1993-05-13 1998-01-08 Plant Genetic Systems N.V. Marker gene
KR960702865A (ko) * 1993-06-01 1996-05-23 에이. 스테판 로버츠 퓨트레신 n-메틸트랜스퍼라제와, 이를 코딩하는 재조합 dna 분자 및 알칼로이드 함량이 감소된 유전자 변이된 담배 식물(putrescine n-methyltransfera-se, recombinant dna molecules encoding putrescine n-methyltranferase, and transgenic tobacco plants with decreased alkaloid content)
US5540242A (en) * 1993-07-07 1996-07-30 Brown & Williamson Tobacco Corporation Cigarette paper having reduced sidestream properties
US5377697A (en) * 1993-08-27 1995-01-03 Hoechst Celanese Corporation Cigarette filter test apparatus and associated method for measuring filter hot collapse and tobacco consumption
US5810020A (en) * 1993-09-07 1998-09-22 Osmotek, Inc. Process for removing nitrogen-containing anions and tobacco-specific nitrosamines from tobacco products
EP1340505A3 (en) 1993-10-29 2004-07-14 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Therapeutic use of cis-element decoys in vivo
US6399376B1 (en) 1993-11-05 2002-06-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of vascular cell adhesive molecule expression through oligonucleotide interactions
US5731179A (en) 1993-12-08 1998-03-24 Japan Tobacco Inc. Method for introducing two T-DNAS into plants and vectors therefor
US5394894A (en) * 1994-02-22 1995-03-07 Zade; Ismail Y. Method and apparatus for elimination of smoking
ES2081257B1 (es) 1994-05-12 1996-07-16 Sagrera Jorge Martinez Instalacion y procedimiento para el curado de tabaco.
US5858774A (en) 1994-05-12 1999-01-12 The Research Foundation Of State University Of New York Antisense DNA constructs for expression of hybrid MRNAs driven by inducible, tissue-specific promoters
US5750870A (en) 1994-06-17 1998-05-12 Agritope, Inc. Plant genetic transformation methods and transgenic plants
JP3235934B2 (ja) 1994-08-04 2001-12-04 三菱レイヨン株式会社 ロドコッカス属細菌由来カナマイシン耐性遺伝子
IT1275697B1 (it) * 1994-12-20 1997-10-17 Olmo Giancarlo Dell Metodo per stampare direttamente su carta microincisioni di ologrammi,chinogrammi,reticoli di diffrazione o microincisioni
US5733744A (en) 1995-01-13 1998-03-31 Cornell Research Foundation, Inc. Binary BAC vector
EP0817856A1 (en) 1995-03-22 1998-01-14 Novo Nordisk A/S Introduction of dna into bacillus strains by conjugation
BR9607771A (pt) 1995-03-30 1998-07-07 Takara Shuzo Co Promotor de planta e processo para expressão de gene usando o dito promotor
DE69636997T2 (de) 1995-05-12 2007-07-12 Anges MG Inc., Ibaraki HEILUNG UND VORBEUGUNG VON DURCH NF-kappaB VERURSACHTEN ERKRANKUNGEN
US5837876A (en) 1995-07-28 1998-11-17 North Carolina State University Root cortex specific gene promoter
GB9517263D0 (en) 1995-08-23 1995-10-25 Cancer Res Campaign Tech Expression systems
ES2262158T3 (es) 1995-09-25 2006-11-16 Syngenta Participations Ag Integracion mejorada de adn exogeno suministrado a celulas vegetales.
US6051409A (en) 1995-09-25 2000-04-18 Novartis Finance Corporation Method for achieving integration of exogenous DNA delivered by non-biological means to plant cells
US6198827B1 (en) * 1995-12-26 2001-03-06 Rocktron Corporation 5-2-5 Matrix system
US5693512A (en) 1996-03-01 1997-12-02 The Ohio State Research Foundation Method for transforming plant tissue by sonication
CA2251738A1 (en) 1996-04-16 1997-10-23 Immusol Incorporated Targeted viral vectors
US5851804A (en) 1996-05-06 1998-12-22 Apollon, Inc. Chimeric kanamycin resistance gene
US5713376A (en) 1996-05-13 1998-02-03 Berger; Carl Non-addictive tobacco products
CA2255822A1 (en) 1996-05-20 1997-11-27 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secre Tary, Department Of Health And Human Services Oligonucleotides which specifically bind retroviral nucleocapsid proteins
US6022863A (en) 1996-05-21 2000-02-08 Yale University Regulation of gene expression
US5834236A (en) 1996-06-27 1998-11-10 The Salk Institute For Biological Studies AATT repeat transcription enhancer element
US5803081A (en) * 1996-06-28 1998-09-08 Regent Court Technologies Tobacco and related products
USRE38123E1 (en) * 1996-06-28 2003-05-27 Regent Court Technologies, Llc. Tobacco products having reduced nitrosamine content
US6135121A (en) 1996-06-28 2000-10-24 Regent Court Technologies Tobacco products having reduced nitrosamine content
US5845647A (en) 1996-06-28 1998-12-08 Regent Court Technologies Tobacco and related products
US6037525A (en) 1996-08-01 2000-03-14 North Carolina State University Method for reducing expression variability of transgenes in plant cells
US5830318A (en) 1996-10-25 1998-11-03 Schweitzer-Mauduit International, Inc. High opacity tipping paper
US5929306A (en) 1996-11-15 1999-07-27 University Of Kentucky Research Foundation KYRT1, a disarmed version of a highly tumorigenic Agrobacterium tumefaciens strain identified as Chry5
US6202649B1 (en) * 1996-12-02 2001-03-20 Regent Court Technologies Method of treating tobacco to reduce nitrosamine content, and products produced thereby
US6096947A (en) 1997-01-14 2000-08-01 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for improving transformation efficiency
WO1998032843A2 (en) 1997-01-28 1998-07-30 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Compositions and method for modulation of alkaloid biosynthesis and flower formation in plants
US6166032A (en) 1997-02-07 2000-12-26 Synapse Pharmaceuticals International, Inc. Method for controlling tobacco use and alleviating withdrawal symptoms due to cessation of tobacco use
ES1036967Y (es) * 1997-04-15 1998-05-01 Techpack Espana S L Cazoleta perfeccionada para estuche de lapiz de labios.
US6163521A (en) * 1997-04-16 2000-12-19 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. Disk having read-only and read-write areas
US6020989A (en) * 1997-05-14 2000-02-01 Affinity Co., Ltd. Laminated bodies and windows using them
US6586661B1 (en) 1997-06-12 2003-07-01 North Carolina State University Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression by transformation with a tobacco quinolate phosphoribosyl transferase nucleic acid
UY25037A1 (es) 1997-06-13 1998-12-11 Shell Int Research Un proceso para producir material vegetal modificado geneticamente que comprende una o mas secuencias de adn de interes establemente incorporadas
US6020969A (en) * 1997-07-11 2000-02-01 Philip Morris Incorporated Cigarette making machine including band inspection
US6391547B1 (en) 1997-09-09 2002-05-21 Center For The Application Of Molecular Biology To International Agriculture Microbial β-glucuronidase genes, gene products and uses thereof
US6641996B1 (en) 1997-09-09 2003-11-04 Cambia Microbial β-glucuronidase genes, gene products and uses thereof
WO1999010512A1 (en) 1997-08-25 1999-03-04 Nunhems Zaden B.V. Improved agrobacterium-mediated transformation of plants
WO1999014348A1 (en) 1997-09-12 1999-03-25 Performance Plants, Inc. In planta transformation of plants
CA2248622A1 (en) 1997-09-23 1999-03-23 Joe Celeste Biolistic apparatus for delivering substances into cells and tissues
AU750808B2 (en) * 1997-10-03 2002-07-25 Cary Medical Corporation Compositon for the treatment of nicotine addiction containing a nicotine receptor antagonist and an anti-depressant or anti-anxiety drug
US6077992A (en) 1997-10-24 2000-06-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Binary viral expression system in plants
PT1034262E (pt) 1997-11-18 2005-10-31 Pioneer Hi Bred Int Composicoes e metodos para a modificacao genetica de plantas
US6060310A (en) 1997-11-24 2000-05-09 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Transcription factor decoy and tumor growth inhibitor
US6153811A (en) 1997-12-22 2000-11-28 Dekalb Genetics Corporation Method for reduction of transgene copy number
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
US6265538B1 (en) * 1998-02-27 2001-07-24 The Regents Of The University Of California Inhibitor of the inflammatory response induced by the TNFA and IL-1
KR20010042069A (ko) 1998-03-20 2001-05-25 베니텍 오스트레일리아 리미티드 유전자 발현 조절방법
JP3444191B2 (ja) 1998-03-31 2003-09-08 日本製紙株式会社 フェニルプロパノイド生合成経路を制御する転写因子
US6136799A (en) 1998-04-08 2000-10-24 Abbott Laboratories Cosolvent formulations
EP2267138B1 (en) 1998-04-08 2016-06-08 Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization Methods and means for obtaining modified phenotypes
US5938017A (en) * 1998-05-04 1999-08-17 Wik; Dennis O. Article for assisting persons to quit smoking and method for same
AR020078A1 (es) 1998-05-26 2002-04-10 Syngenta Participations Ag Metodo para alterar la expresion de un gen objetivo en una celula de planta
US6350479B1 (en) * 1998-06-05 2002-02-26 Regent Court Technologies Treating depression with alcohol extracts of tobacco
US6271031B1 (en) 1998-08-12 2001-08-07 E.I. Du Pont De Nemours And Company Quinolinate metabolism enzymes
CA2341324A1 (en) 1998-08-31 2000-03-09 Monsanto Company Transgene assay using stable agrobacterium rhizogenes transformation
DE69929073T2 (de) * 1998-10-01 2006-08-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Verfahren und Zusammensetzungen für die Transformation von Pflanzen
DE19847767A1 (de) * 1998-10-16 2000-04-20 Decoufle Sarl Anordnung zum Zuführen von fließfähiger Druckfarbe zu einem Druckwerk für einen Zigarettenpapierstreifen
DE19852757A1 (de) 1998-11-16 2000-05-18 Eth Zuerich Zuerich Promotoren zur Genexpression in Wurzeln von Pflanzen
CN1219885C (zh) 1998-12-22 2005-09-21 加拿大国家研究委员会 转基因植物及其生产方法
EP1141356A2 (en) 1998-12-23 2001-10-10 The Samuel Roberts Noble Foundation, Inc. Plant transformation process
CZ301610B6 (cs) 1999-04-19 2010-04-28 Biogemma S.A.S. Zpusob transformace rostlin
AU4991500A (en) 1999-05-06 2000-11-21 Michael Timko Regulation of gene expression in tobacco for manipulation of plant growth and secondary metabolism
US6603061B1 (en) 1999-07-29 2003-08-05 Monsanto Company Agrobacterium-mediated plant transformation method
US6314964B1 (en) * 1999-09-15 2001-11-13 Schweitzer-Mauduit International, Inc. Cigarette paper containing carbon fibers for improved ash characteristics
US6809232B1 (en) 1999-11-29 2004-10-26 Midwest Oilseeds, Inc. Methods and compositions for the introduction of molecules into cells
JP4080746B2 (ja) 1999-12-16 2008-04-23 クロップデザイン・エヌ・ヴェー 最適化されたｔ−ｄｎａ転移およびそのためのベクター
US20050229272A1 (en) 1999-12-30 2005-10-13 Monica Driscoll Compositions and methods for gene silencing
WO2001051630A1 (en) 2000-01-07 2001-07-19 Baylor University Antisense compositions and methods
EP1272630A2 (en) 2000-03-16 2003-01-08 Genetica, Inc. Methods and compositions for rna interference
AU2001253255A1 (en) 2000-04-07 2001-10-23 Large Scale Biology Corporation Compositions and methods for inhibiting gene expression
WO2002000926A2 (en) 2000-06-30 2002-01-03 Epigenomics Ag Diagnosis of diseases associated with signal transduction
AU2001286843A1 (en) 2000-08-30 2002-03-13 North Carolina State University Transgenic plants containing molecular decoys that alter protein content therein
DE60128149D1 (en) 2000-11-07 2007-06-06 Univ North Carolina State Putrescin-n-methyltransferasepromotor
WO2002098208A2 (en) 2001-06-06 2002-12-12 22Nd Century Limited, Llc Tobacco biomass utilization
US20060157072A1 (en) * 2001-06-08 2006-07-20 Anthony Albino Method of reducing the harmful effects of orally or transdermally delivered nicotine
CN1638655A (zh) 2001-06-08 2005-07-13 韦克多烟草有限公司 修饰烟草中烟碱和亚硝胺的水平
US6557560B2 (en) * 2001-06-18 2003-05-06 Ctc Canada Inc. Cigarette making machine
EP1675454A4 (en) 2003-08-19 2007-03-21 22Nd Century Ltd Llc TOBACCO PRODUCTS WITH REDUCED EXPOSURE
CA2992898A1 (en) 2005-02-28 2006-10-19 22Nd Century Limited, Llc Reducing levels of nicotinic alkaloids in plants
WO2008020333A2 (en) 2006-06-19 2008-02-21 National Research Council Of Canada Nucleic acid encoding n-methylputrescine oxidase and uses thereof
ATE519853T1 (de) 2006-10-13 2011-08-15 Univ North Carolina State Änderung des alkaloid-gehalts von tabak mittels modifizierung spezifischer p450-cytochromgene

Also Published As

Publication number Publication date
EP0991766A1 (en) 2000-04-12
SI20215B (sl) 2007-04-30
EA200400186A1 (ru) 2004-08-26
LT99142A (en) 2000-06-26
US7408098B2 (en) 2008-08-05
US20060191036A1 (en) 2006-08-24
US7425670B2 (en) 2008-09-16
EP0991766B1 (en) 2004-03-17
HK1027379A1 (en) 2001-01-12
JP4095678B2 (ja) 2008-06-04
DE991766T1 (de) 2002-04-04
ES2154624T1 (es) 2001-04-16
LT4706B (lt) 2000-09-25
CU23174A3 (es) 2006-09-22
US20060191035A1 (en) 2006-08-24
NO996169L (no) 1999-12-13
AU748514B2 (en) 2002-06-06
ATE262039T1 (de) 2004-04-15
US6586661B1 (en) 2003-07-01
CN100482799C (zh) 2009-04-29
JP2009112316A (ja) 2009-05-28
UA72187C2 (uk) 2005-02-15
AU7829198A (en) 1998-12-30
DE69822463D1 (de) 2004-04-22
EP1457563B1 (en) 2012-08-08
CN1304576C (zh) 2007-03-14
BG64319B1 (bg) 2004-09-30
DK0991766T3 (da) 2004-07-12
IL132184A (en) 2010-11-30
YU64899A (sh) 2004-12-31
EA004652B1 (ru) 2004-06-24
US7795509B2 (en) 2010-09-14
GR20010300003T1 (en) 2001-06-29
CA2287776C (en) 2012-04-03
US7645925B2 (en) 2010-01-12
US7304220B2 (en) 2007-12-04
PL337442A1 (en) 2000-08-14
BRPI9810870B1 (pt) 2021-06-01
EE9900575A (et) 2000-08-15
LV12507A (en) 2000-06-20
EA200000007A1 (ru) 2000-06-26
EP1457563A1 (en) 2004-09-15
IL132184A0 (en) 2001-03-19
NZ500963A (en) 2001-09-28
EP1457562B1 (en) 2012-08-08
OA11219A (en) 2003-07-17
KR20010013663A (ko) 2001-02-26
NO996169D0 (no) 1999-12-13
HU225888B1 (en) 2007-11-28
TR199902728T2 (xx) 2000-09-21
KR100365969B1 (ko) 2002-12-26
CA2484366A1 (en) 1998-12-17
DE69822463T2 (de) 2005-01-20
SI20215A (sl) 2000-10-31
HK1065066A1 (en) 2005-02-08
US20070011774A1 (en) 2007-01-11
LV12507B (en) 2000-11-20
HUP0003767A2 (hu) 2001-02-28
ES2154624T3 (es) 2004-11-01
GEP20032871B (en) 2003-01-27
EE04595B1 (et) 2006-02-15
AP9901680A0 (en) 1999-12-31
BR9810870A (pt) 2000-11-14
NO324872B1 (no) 2007-12-17
BG103886A (en) 2000-07-31
US6423520B1 (en) 2002-07-23
US20020108151A1 (en) 2002-08-08
EP1457562A1 (en) 2004-09-15
HUP0003767A3 (en) 2002-10-28
JP4288206B2 (ja) 2009-07-01
CZ367799A3 (cs) 2000-04-12
CN1257542A (zh) 2000-06-21
JP2001522250A (ja) 2001-11-13
JP4459271B2 (ja) 2010-04-28
IL192232A0 (en) 2008-12-29
EA009898B1 (ru) 2008-04-28
PL201266B1 (pl) 2009-03-31
CA2287776A1 (en) 1998-12-17
SK161899A3 (en) 2000-06-12
HK1069411A1 (en) 2005-05-20
AP1169A (en) 2003-06-30
RO121968B1 (ro) 2008-09-30
WO1998056923A1 (en) 1998-12-17
US20060200872A1 (en) 2006-09-07
CN1618972A (zh) 2005-05-25
CZ297379B6 (cs) 2006-11-15
PT991766E (pt) 2004-08-31
JP2004290201A (ja) 2004-10-21
US20030140366A1 (en) 2003-07-24
US7605308B2 (en) 2009-10-20
US20040168211A1 (en) 2004-08-26
JP2008131950A (ja) 2008-06-12
ID29311A (id) 2001-08-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7795509B2 (en) Tobacco products with reduced nicotine
AU2004203879B2 (en) Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression
AU2002300895B2 (en) Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression
HK1065066B (en) Increase of quinolate phosphoribosyl transferase expression in plants
HK1069411B (en) Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression in tobacco plants
HK1027379B (en) Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression
MXPA99011625A (en) Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression