JPH09511653A - 増幅及び連結反応の共役法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅及びオリゴヌクレオチドリガーゼ分析（ＯＬＡ）反応に基づく方法は、単一反応容器内で複合遺伝子系を分析することを提供する。本方法は、１種以上の標的ポリヌクレオチドを含む試料とＰＣＲプライマー及びＯＬＡプローブとを単一反応混合物中で同時にインキュベートすることを含む。ＯＬＡ反応産物を検出及び同定することにより、試料中の変異ポリヌクレオチド配列の存在が求められる。

Description

【発明の詳細な説明】 増幅及び連結反応の共役法 発明の背景 発明の分野 本発明は、一般的には、既知のＤＮＡ配列変異体の検出及び／又は識別する方 法に関する。更に詳細には、本発明は、単一反応容器内でＤＮＡ増幅反応及びオ リゴヌクレオチドリガーゼ分析反応を最少の後増幅試料操作により行って既知の ＤＮＡ反応変異体を検出及び／又は識別する方法に関する。関連技術の説明 核酸配列分析は、多くの研究、医療及び工業分野において重要になってきた、 例えば、Caskey，Science 236: 1223-1228(1987); Landegrenら，Science，242 ：229-237(1988); Arnheim ら，Ann．Rev．Biochem.，61: 131-156(1992)。主に 、核酸分析の強い興味は、標的核酸を増幅する数種の方法、例えば、ポリメラー ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、連結反応連鎖反応（ＬＣＲ）等の開発によって導かれた 、例えば Kessler，edit.，Nonradioactive Labeling and Detection of Biomol ecules(Springer-Verlag，ベルリン，1992); Innisら，edit.，PCR Protocols(A cademic Press,ニューヨーク，1990); Barany，PCR Methods and Applications 1: 5-16（1991）。 かかる増幅技術は、非常に感受性のある及び特定の診断分析を与える可能性が あるが、臨床又は実用環境において、特に、非常に変化しうる嚢胞性線維症遺伝 子座又は他の高度多形性遺伝子座のような複合遺伝子系の分析を含む場合に、か かる技術を用いる分析を便利にして行うことがなお求められている。かかる系に おいては、増幅産物の同定で特別な問題が生じ、その解決には典型的には多段の 後増幅操作が必要である。かかる系においてポリヌクレオチドを同定する有望な 方法は、オリゴヌクレオチド連結反応分析（ＯＬＡ）である、Whiteleyら，米国 特許第 4,883,750号。その分析法においては、標的配列の隣接領域に相補的なオ リゴヌクレオチドが調製される。オリゴヌクレオチドは、末端間にあるように標 的に対してハイブリッド形成することができ、相接する末端に又は近傍にミスマ ッチが存在しない場合に結合される。かかるミスマッチが存在するときには、連 結反応が除外される。結果として、ある遺伝子座における問題の対立遺伝子変異 体全ての完全な相補鎖である一組のオリゴヌクレオチド対が与えられる。標識方 法の賢明な使用により、同一或いは異なる遺伝子座から広範囲の対立遺伝子が単 一分析において特異的に同定される。 残念ながら、ＯＬＡを増幅した標的配列に適用すると、標的ＤＮＡのＰＣＲに よる増幅及び変異体ＤＮＡのＯＬＡによる識別を開示している Nickersonら，Pr oc．Natl．Acad．Sci．USA 87:8923-8927(1990)に例示されているように、分析 が複雑になる。標的ＤＮＡのＰＣＲ増幅が第１組の９６ウェルクラスタープレー トで行われた後、増幅した試料の分割量がＯＬＡ及び連結反応産物の生成用の第 ２組の９６ウェルプレートに移された。次に、連結反応産物を含む試料の分割量 が、第２組のプレートからＥＬＩＳＡに基づく手順による連結反応産物の検出用 第３組の９６ウェルプレートに移された。 分析を実施するために要する操作数を減じることができるならば、増幅及びＯ ＬＡ検出を用いるＤＮＡに基づく分析の適用は著しく容易になる。 発明の要約 本発明は、試料中の１種以上の標的ポリヌクレオチドを同一反応容器内でＯＬ Ａにより増幅及び検出する方法を提供するものである。本発明の重要な態様は、 ＯＬＡに用いられるオリゴヌクレオチドより高いアニーリング温度を有する標的 ポリヌクレオチド増幅用のプライマー又はオリゴヌクレオチド（連結反応に基づ く増幅の場合）を供給することである。本方法においては、標的ポリヌクレオチ ドは、ＯＬＡに用いられるオリゴヌクレオチドのアニーリング温度より高い温度 で増幅され、鎖拡張及び／又は連結反応に対して生じる妨害が増幅中に標的ポリ ヌクレオチドに対してアニールされたオリゴヌクレオチドであったことが回避さ れる。 一般的に、本発明の方法は、次の工程を含む。（ａ）各々が第１アニーリング 温度において１種以上の標的ポリヌクレオチドに対してアニールすることができ る複数の増幅プライマーを供給する工程；（ｂ）各々が第２アニーリング温度に おいて該標的ポリヌクレオチドに対してアニールすることができ、実質的にいず れも該第１アニーリング温度において該標的ポリヌクレオチドに対してアニール しない複数のオリゴヌクレオチドプローブを供給する工程；（ｃ）該第１アニー リング温度以上の温度において該複数の増幅プライマーを用いて該標的ポリヌク レオチドを増幅する工程；（ｄ）該第２アニーリング温度以下の温度において該 １種以上の標的ポリヌクレオチドに対して特異的にハイブリッド形成する該複数 のオリゴヌクレオチドプローブを結合して１種以上の連結反応産物を形成する工 程；及び（ｅ）該１種以上の連結反応産物を検出する工程。次に、該連結反応産 物の有無を、試料中の該１種以上の標的ポリヌクレオチドの有無に相関させる。 本発明は、更に、本発明の方法を実施するキットを包含する。好ましくは、か かるキットは、次の成分を含む。（ａ）各々が第１アニーリング温度において１ 種以上の標的ポリヌクレオチドに対してアニールすることができる複数の増幅プ ライマー；（ｂ）各々が第２アニーリング温度において該標的ポリヌクレオチド に対してアニールすることができ、実質的にいずれも該第１アニーリング温度に おいて該標的ポリヌクレオチドに対してアニールしない複数のオリゴヌクレオチ ドプローブ；（ｃ）該第１アニーリング温度以上の温度において該複数の増幅プ ライマーを用いて該標的ポリヌクレオチドを増幅する手段；及び（ｄ）該第２ア ニーリング温度以下の温度においてオリゴヌクレオチドプローブを結合して１種 上の連結反応産物を形成する手段。 本発明は、単一反応容器内でＯＬＡによる増幅及び検出を可能にすることによ り現在の方法に伴う欠点を克服し、かかる分析において要した試料及び試薬操作 の量を減じる。本発明の方法は、容易に自動化される。一般的には、本方法は、 病原体試料の混合物と関連のある配列、ゲノムＤＮＡ断片混合物中の遺伝子配列 、嚢胞性線維症遺伝子座、ｐ５３遺伝子座、ラス遺伝子座等の高度多形性又は突 然変異複合遺伝子座のような標的配列を同時に分析するために用いられる。 図面の説明 図１は、本発明の実施態様の概略図である。 図２Ａ及び２Ｂは、蛍光標識連結反応産物の電気泳動図である。定義 本発明に用いられる複数での“標的ポリヌクレオチド”なる語は、別個の多重 ポリヌクレオチド及び別個に増幅及び／又は検出される同じポリヌクレオチド鎖 上の多重領域が含まれる。標的ポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ又 はＲＮＡを含むウイルスゲノムの長さのような二本鎖又は一本鎖ポリヌクレオチ ドの単一分子又はゲノムＤＮＡ断片又は感染試料からのウイルス及び体細胞ポリ ヌクレオチド断片の混合物のようなポリヌクレオチド断片の混合物とすることが できる。典型的には、標的ポリヌクレオチドは、加熱等により変性されてプライ マー及び／又はオリゴヌクレオチドプローブとハイブリッド形成することができ る一本鎖標的分子を形成する二本鎖ＤＮＡである。 本明細書に用いられる“オリゴヌクレオチド”なる語は、ワトソン・クリック 型塩基の対合のようなモノマー対モノマー相互作用の規則的パターンによって標 的ポリヌクレオチドに特異的に結合することができかつ鋳型式反応において他の オリゴヌクレオチドに結合することができるデオキシリボヌクレオシド、リボヌ クレオシド、ポリアミド核酸等を含む天然又は修飾モノマー又は結合の線状オリ ゴマーが含まれる。通常、モノマーは、ホスホジエステル結合又はその類縁体に よって結合してサイズが数モノマー単位、例えば、３〜４モノマー単位から数百 モノマー単位までの範囲のオリゴヌクレオチドを形成する。オリゴヌクレオチド が“ATGCCTG”のような文字の順序で表されるときは、特にことわらない限り、 ヌクレオチドは左から右へ５′−＞３′の順序であり、“Ａ”はデオキシアデノ シンを示し、“Ｃ”はデオキシシチジンを示し、“Ｇ”はデオキシグアノシンを 示し、“Ｔ”はチミジンを示すことが理解される。本明細書に用いられる“ポリ ヌクレオチド”なる語は、通常、長さが数十単位から何千もの単位までのデオキ シリボヌクレオシド、リボヌクレオシド等を含むヌクレオシドの線状オリゴマー 又はその類縁体を意味する。 本明細書に用いられるオリゴヌクレオチドについての“複数”は、標的ポリヌ クレオチドの非可変領域に通常特異的な単一の“共通”オリゴヌクレオチドプロ ーブ及び配列に対立遺伝子又は突然変異の変異体を含む標的ポリヌクレオチドの 領域に通常特異的である１種以上の“野生型”及び／又は“突然変異”オリゴヌ クレオチドプローブがある２種以上のオリゴヌクレオチドプローブセットが含ま れる。 本明細書に用いられる“ヌクレオシド”は、Kornberg & Baker，DNA Replicat ion，2nd Ed.（Freeman,サンフランシスコ，1992）に記載されたような２′−デ オキシ及び２′−ヒドロキシル形を含む天然ヌクレオシドが含まれる。ヌクレオ シドについての“類縁体”は、Scheit，Nucleotide Analogs(John Wiley,ニュー ヨーク，1980)；Uhlman & Peyman，Chemical Reviews,90: 543-584(1990); 等に 記載されたような修飾塩基部分及び／又は修飾糖部分を有する合成ヌクレオシド が含まれる。かかる類縁体は、結合特性を高めるために、縮重を減じるために、 特異性を高めるためになどに設計された合成ヌクレオシドが含まれる。 本明細書に用いられる“増幅プライマー”なる語は、（ｉ）プライマー拡張産 物の合成が誘導される条件下、即ち、ヌクレオチド及びＤＮＡ依存性ＤＮＡポリ メラーゼのような重合誘導剤の存在下及び適切な温度、ｐＨ、金属濃度及び塩濃 度に置かれる場合に相補的ＤＮＡ鎖の合成を開始するように作用するか或いは（ ｉｉ）連結反応に基づく増幅計画において他の増幅プライマーに結合されるオリ ゴヌクレオチドを意味する。 発明の詳細な説明 本発明は、別々の反応混合物を供給することの必要及び／又は増幅した標的ポ リヌクレオチドにＯＬＡを適用するための容器を排除する。本方法によれば、標 的ポリヌクレオチドは、ＯＬＡのオリゴヌクレオチドプローブの存在下に最初の 温度（即ち、第１アニーリング温度）よりも高い温度で増幅される。その第１温 度以上では、反応混合物のＯＬＡ成分は増幅を妨害しない。増幅後、反応混合物 の温度は、ＯＬＡのオリゴヌクレオチドプローブの標的ポリヌクレオチドに対す る特異的アニーリングを可能にする第２温度（即ち、第２アニーリング温度）に 下げられる。次に、反応混合物は、第２温度と連結反応産物の線状増幅を可能に する高い温度との間で循環される。 好ましくは、増幅プライマーは、３０〜５０ヌクレオチドの長さであり、Ｔｍ が８０〜１２０℃である。好ましくは、かかる増幅プライマーは、第１アニーリ ング温度約７２〜約８４℃で用いられる。更に好ましくは、第１アニーリング温 度は、約７２〜約７５℃である。好ましくは、ＯＬＡに用いられるオリゴヌクレ オチドプローブは、８〜３０ヌクレオチドの長さであり、Ｔｍが４０〜７０℃で ある。かかるオリゴヌクレオチドプローブの第２アニーリング温度は、好ましく は約３０〜約５５℃、更に好ましくは約４０〜約５５℃で用いられる。好ましく は、アニーリング温度は、増幅及び検出において特異性を行わせるために選ばれ る。典型的には、アニーリング温度は、増幅プライマー又はオリゴヌクレオチド プローブの溶融温度より１〜２℃上下する温度からかかる温度より約５〜１０℃ 低い温度までの範囲で選ばれる。これらの設計の束縛を示した適切なプライマー 又はオリゴヌクレオチドを使用するための手引き及びポリヌクレオチド標的の種 類は、Rychlikら(1989)Nucl．Acids．Res．17:8453-8551; Lowe ら(1990)Nucl． Acids Res．18:1757-1761; Hiller ら(1991)PCR Methods and Applications 1:1 24-128; Wetmur，Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology， 26:227-259(1991); Breslauerら，Proc．Natl．Acad．Sci.83:3746-3750(1986); Innis ら，edit.，PCR Protocols（Academic Press，ニューヨーク，1990）等 を含む多くの文献に見られる。 ＯＬＡ反応用増幅プライマー及びオリゴヌクレオチドプローブは、Caruthers らの米国特許第 4,458,066号及び同第 4,415,732号; Beaucageら(1992)Tetrahed ron 48:2223-2311; 及びApplied Biosystems User Bulletin No.13（1Apr.1987 ）に開示された標準方法、例えば、ホスホルアミダイト化学による固相合成によ って容易に合成される。同様に、プライマー及びオリゴヌクレオチドプローブは 、Eckstein，edit.,Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach（ IRL Press,オックスフォード，1991）に開示されたような通例の化学を用いて、 例えば、標識を結合するために反応性基で誘導される。 本方法で生成した連結反応産物は、種々の手段で検出される。例えば、検出は 、検出可能標識をオリゴヌクレオチドプローブの１種の末端に結合することによ り達成される。また、オリゴヌクレオチドの非結合末端は、分光法、光化学、生 化学、免疫化学又は放射化学手段で検出可能な異なる標識で標識される。検出は 、また、Urdeaらの米国特許第 5,124,246号に記載されたような核酸ハイブリッ ド 形成分析；又は類似の手法を用いて達成される。 好ましくは、連結反応産物は、沈降、排除クロマトグラフィー、ろ過、高性能 液体クロマトグラフィー、電気泳動、アフィニティーコレクション等のサイズ依 存性分離を与える方法によって識別されるように各連結反応産物の移動度を特定 させる移動修飾因子、即ち、拡張因子を有する。最も好ましくは、かかる移動修 飾因子は、別個に検出可能にする連結反応産物の電気泳動移動度を変化させる。 好ましくは、野生型対立遺伝子ＯＬＡ産物は、電気泳動又はキャピラリー電気泳 動、特に、ゲルを含まないキャピラリー電気泳動によって突然変異対立遺伝子Ｏ ＬＡ産物から分離される。更に好ましくは、移動修飾因子を含む増幅したＯＬＡ 産物は、検出可能に標識され、次の文献：Mayrandら(1990)Clin．Chem．36:2063 -2071;及び Mayrandら(1992)Appl．Theoret．Electrophoresis 3:1-11に記載さ れた 373型ＤＮＡシークエンサー(Applied Biosystems,カリフォルニア州フォス ターシティー)のような機器によるゲル電気泳動で分離される。移動修飾因子の オリゴヌクレオチドへの合成及び結合及びＯＬＡにおけるその使用は、国際出願 第PCT/US93/20236号及び同第PCT/US93/20239号に記載されており、これらを参考 として引用する。 これらの出願に教示されたように、種々の移動修飾因子は、荷電又は非荷電結 合基によって結合された多サブユニットの単位から構成されるポリマーを含むポ リエチレンオキシド、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリペプチド、オリゴサッ カリド、ポリウレタン、ポリアミド、ポリスルホンアミド、ポリスルホキシド及 びそのブロックコポリマーで形成されたポリマー鎖を含むオリゴヌクレオチドプ ローブに結合される。 本発明のその実施態様の重要な特徴は、異なる連結反応産物に対する電荷／翻 訳摩擦抵抗の異なる比率を与える異なる移動修飾ポリマー鎖の使用である。即ち 、あるｐＨにおいて非ふるい分け液体媒質による電気泳動ポリマー移動について 測定したオリゴヌクレオチド、結合ポリマー鎖及び標識の合計電荷／合計翻訳摩 擦抵抗は、各々異なる配列の連結反応産物に対して異なっている。好ましくは、 電荷／翻訳摩擦抵抗の特有の比率は、典型的には、ポリマー鎖の長さ（サブユニ ットの数）の差で達成される。しかしながら、ポリマー鎖電荷の差もオリゴヌク レ オチドの長さの差であるように予想される。 一般的には、ポリマー鎖を形成するポリマーは、ホモポリマー、ランダムコポ リマー又はブロックコポリマーとすることができ、ポリマーは、線状、櫛状、枝 分れ又は樹枝状構造とすることができる。更に、本発明は、単一点で会合した結 合ポリマーに結合した単一ポリマー鎖について記載されているが、ポリマー鎖を 集合的に形成する１を超えるポリマー鎖要素によって誘導化される結合ポリマー も企図する。 好ましいポリマー鎖は、プローブが水性媒質中で容易に可溶性であることを行 わせるためにオリゴヌクレオチド結合ポリマーに結合した場合に親水性であるか 又は少なくとも十分に親水性であるものである。ポリマー鎖は、また、ハイブリ ッド形成反応を行ってはならない。結合ポリマーがオリゴヌクレオチドの場合の ように高度に荷電されている場合には、結合ポリマーは、非荷電であるか又は結 合ポリマーより実質的に小さい電荷／サブユニット密度を有することが好ましい 。 選定された長さのポリマー鎖を別個に或いは単一プローブ固相合成法の一部と して合成する方法は、ポリマー鎖の好ましい特性と共に以下に記載される。 下記の好適実施態様においては、ポリマー鎖は、ヘキサエチレンオキシド（Ｈ ＥＯ）ユニットで形成され、ＨＥＯユニットは、エチレンオキシドサブユニット のこわれていない鎖を形成するために端と端をつないで結合されるか又は下記の ように荷電又は非荷電結合により結合される。 プローブ中でポリマー鎖を調製する方法は、一般的には、既知のポリマーサブ ユニット合成法を行う。特定したサイズの多サブユニットポリマー単位を直接に 或いは荷電又は非荷電結合基を介して相互にカップリングすることを含むこれら の方法は、一般的には、ポリエチレンオキシド、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、 ポリウレタンポリマー及びオリゴサッカリドのような種々のポリマーに適用でき る。 ポリマー単位のカップリング方法は、選定した長さのコポリマー、例えば、ポ リプロピレン単位と交互のポリエチレンオキシド単位のコポリマーに適切である 。選定した長さとアミノ酸組成のポリペプチド、ホモポリマー或いは混合ポリマ ーは、標準固相法により合成される。好ましくは、選定した数のＨＥＯ単位を有 す るＰＥＯ鎖は、Levensonら，米国特許第 4,914,210号に開示されたＤＭＴ保護ホ スホルアミダイトモノマーから調製される。 ポリマー鎖のオリゴヌクレオチドへのカップリングは、慣用のホスホルアミダ イトオリゴヌクレオチド合成法の拡張又は他の標準カップリング法により行われ る。また、ポリマー鎖は、標準固相合成法を用いてポリマー鎖単位をオリゴヌク レオチドに段階的に加えることによりオリゴヌクレオチド（又は他の配列特異的 結合ポリマー）上に蓄積される。 上述したように、ポリマー鎖は、そのプローブに各々異なる配列プローブ及び ／又は連結反応産物に特有の電荷／翻訳摩擦抵抗の比率を与える。ポリマー鎖が 誘導化結合ポリマー鎖に与える貢献は、通常、ポリマー鎖のサブユニットの長さ に左右される。しかしながら、ＰＥＯ鎖中の荷電結合基又はポリペプチド鎖中の 荷電アミノ酸のような電荷基のポリマー鎖への付加も、プローブにおける選定電 荷／摩擦抵抗特性を達成するために用いられる。 本発明のその実施態様の重要な特徴は、わずかに異なるサイズ及び／又は電荷 差のあるポリマー鎖による誘導化により非ふるい分け媒質中電気泳動で細かく分 割することができる異なる長さ及び／又は異なる配列オリゴヌクレオチドの連結 反応産物を与えることである。キャピラリー電気泳動（ＣＥ）のような電気泳動 は、標準法で慣用のＣＥ機器を用いて行われる。 ふるい分けマトリックスの不在下での電気泳動によりオリゴヌクレオチドのよ うな荷電結合ポリマーを分別する能力は、多くの利点を与える。これらのうちの １つは、全てがほぼ同じサイズである荷電ポリマーを分別する能力である。その 特徴は、プローブのオリゴヌクレオチド部分が標的ポリヌクレオチドとサイズが 同じであることを可能にし、もって、ハイブリッド形成速度論及び熱力学が同じ であることを可能にする。他の利点は、電気泳動、特にＣＥに非常に便利であり 、ふるい分けポリマー、特に毛細管内で架橋ゲルを形成及び除去するという問題 が回避される。 上記ＯＬＡにおいて、連結反応産物の濃度は、必要があれば、反復プローブハ イブリッド形成及び連結反応工程により高められる。簡便な線状増幅は、鋳型と して標的ポリヌクレオチドを用いて変性、アニーリング及びプローブ連結反応工 程を所望濃度の誘導化プローブが達成されるまで反復して達成される。 本発明を行うためには、１種以上の標的ヌクレオチド配列を有するＤＮＡを含 む試料が供給される。試験されるか又は選別される個体の染色体ＤＮＡは、その 個体からの細胞試料から得られる。細胞試料は、個体の年齢及び症状によって種 々の組織から得られる。好ましくは、細胞試料は、周知の技術を用いて末梢血か ら得られる。胎児試験においては、試料は、羊水穿刺又は絨毛膜採取により得る ことが好ましい。他のＤＮＡ源は、精液、口腔細胞等が含まれる。好ましくは、 ＤＮＡは、標準方法、例えば、上記Maniatisら及びHiguchi(May 1989)PCR Appli cations，Issue 2(Perkin Elmer-Cetus Users Bulletin)に記載されたフェノー ル：クロロホルム抽出を用いて試料から抽出される。胎児試験用細胞試料は、例 えば Iversonら,(1981)Prenatal Diagnosis 9:31-48に記載されたように蛍光活 性化細胞選別を用いて母性末梢血からも得られる。 本発明の方法は、ＰＣＲによる標的ポリヌクレオチドの特定の増幅又は引き続 いてのＯＬＡ用鋳型を与えるための連結反応に基づく増幅を含む。リガーゼ鎖反 応のような連結反応に基づくポリヌクレオチド増幅は、次の文献に開示されてい る：Barany，PCR Methods and Applications 1: 5-16(1991); Landegrenら，米 国特許第 4,988,617号; Landegren ら，Science 241: 1077-1080(1988); Backma n ら，欧州特許出願第 0439182A2号公報; Yu & Wallace，Genomics 4: 560-569( 1989)等。 試料中の標的ポリヌクレオチドを増幅するＰＣＲ法は、当該技術において周知 であり、Saikiら(1986)Nature 324:163 及びMullisの米国特許第 4,683,195号， Mullisらの同第 4,683,202号，Gelfand らの同第 4,889,818号，Innis ら(eds.) PCR Protocols(Academic Press，NY 1990)及びTaylor(1991)Polymerase chain r eaction: basic principles and automation，in PCR: A Practical Approach,M cPherson ら(eds.)IRL Press，オックスフォードに記載されている。 概要としては、ＰＣＲ技術は、増幅されるべき標的ヌクレオチド配列に隣接し かつ３′端が相互に面するように向けられ、各プライマーが他方に向かって伸び ているオリゴヌクレオチドプライマーの調製を含む。ポリヌクレオチド試料は、 好ましくは熱により抽出及び変性され、モル過剰に存在するプライマーとハイブ リッド形成される。重合は、上記のようにデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ ｄＮＴＰ）の存在下に触媒される。これにより、もとの鎖の新たに合成された相 補鎖に共有結合された５′端に別個のプライマーを含む２本の“長い産物”が得 られる。次に、反応混合物が、例えば、温度を下げるか、変性剤不活性化するか 又はポリメラーゼを更に添加することにより重合条件に戻され、第２サイクルが 開始される。第２サイクルは、２本のもとの鎖、第１サイクルからの２本の長い 産物、もとの鎖から複製された新しい２本の長い鎖及び長い産物から複製された ２本の“短い産物”を与える。短い産物の配列は、各端にプライマーを有する標 的配列である。各追加のサイクルにより、２本の長い産物が更に作製され、長短 産物の数に等しい多くの短い産物が前のサイクルの終わりに残っている。従って 、標的配列を含む短い産物の数は、各サイクルにより指数関数的に増える。好ま しくは、ＰＣＲは、市販のサーマルサイクラー、例えば、パーキンエルマー9600 型サーマルサイクラーで行われる。 ＰＣＲ増幅は、試料と第１及び第２プライマー、所望の程度の配列増幅を行う のに十分な量の４種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ 、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ）及びプライマー拡張産物を作製することができる酵素 、例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラ グメント、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、種々の供給源（例えば、Perkin Elmer）か ら市販されているサーマス・アクアチカス(Thermus aquaticus)(Ｔａｑ)、サー マス・サーモフィルス(Thermus thermophilus)(米国 Biochemicals)、バシラス ・ステレオサーモフィルス(Bacillus stereothermophilus)(Bio-Rad)又はサーモ コッカス・リトラリス(Thermococcus litoralis)(“ベント”ポリメラーゼ，New England Biolabs)から単離した熱安定ＤＮＡポリメラーゼ等のプライマー及び 鋳型依存性ポリヌクレオチド重合剤と接触させることにより行われる。 本発明の重要な実施態様は、電気泳動ゲルにより十分に分割されたバンドで測 定されるように、十分に分割された増幅産物を生じる増幅相におけるパラメター を選定することである。連結反応相において作製された連結反応産物の特性は、 増幅産物の特性に直接依存する。この点で、ＰＣＲ増幅において重要なパラメー ターは、使用されるアニーリング温度である。好ましくは、高度に特異的な増幅 が達成られかつ偽標的の増幅が最少であるように最も実用的なアニーリングが用 いられる。 増幅後、反応混合物の温度は、ＯＬＡを実施するために下げられる。温度が下 げられる量は、個々の実施態様に依存することは当然のことである。典型的には 、温度は、２０〜５０℃からオリゴヌクレオチドプローブの標的ポリヌクレオチ ドに特異的なアニーリングを容易にする第２アニーリング温度まで下げられる。 即ち、第２アニーリング温度は、オリゴヌクレオチドプローブと標的ポリヌクレ オチド間のミスマッチを有するデュプレックスの形成を除外するのに十分高くな ければならない。突然変異を検出するためのＯＬＡ反応は、ＤＮＡの２本の一本 鎖の端がそれらを結合するＤＮＡリガーゼに対して正確に配列されなければなら ない事実を利用する。両端の末端ヌクレオチドが相補鎖に塩基対合されない場合 には、リガーゼはそれらを結合できない。従って、使用した標的オリゴヌクレオ チド配列に対して、第１及び第２オリゴヌクレオチドプローブが調製され、その 末端ヌクレオチドは正常配列及び突然変異配列に各々相補的である。 ＰＣＲ増幅が用いられる場合の本発明の重要な特徴は、ＤＮＡポリメラーゼに よって拡張されることができない３′末端を有するオリゴヌクレオチドプローブ を供給することである。これは、種々の慣用の方法で達成される。結合されない ３′末端を有するプローブについては、切断は、切断基、例えば、蛍光色素、３ ′リン酸、３′アミノ等を結合するか又は３′末端にジデオキシヌクレオチドを 有するプローブを与えることにより便利に行われる。結合される３′ヒドロキシ ルを有するプローブについては、結合されるプローブは、反応混合物中でポリメ ラーゼを効果的に置換する濃度で供給され、拡張が除外される。 好適実施態様においては、第１又は第２オリゴヌクレオチドブローブの１つは 、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）、６−カルボキシフルオレセイ ン（６−ＦＡＭ）、2′,7′−ジメトキシ−4′,5′−ジクロロ−６−カルボキシ フルオレセイン（ＪＯＥ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチル−６−カルボキ シローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、4, 7,2′,4′,5′,7′−ヘキサクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＨＥＸ− １）、4,7,2′,4′,5′,7′−ヘキサクロロ−５−カルボキシフルオレセイン （ＨＥＸ−２）、2′,4′,5′,7′−テトラクロロ−５−カルボキシフルオレセ イン（ＺＯＥ）、4,7,2′,7′−テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン （ＴＥＴ−１）、1′,2′,7′,8′−ジベンゾ-4,7−ジクロロ−５−カルボキシ フルオレセイン（ＮＡＮ−２）及び1′,2′,7′,8′−ジベンゾ-4,7−ジクロロ −６−カルボキシフルオレセインのような蛍光標識を有する。更に、連結反応産 物は、ＥＬＩＳＡ、Urdeaの米国特許第 4,868,105号に記載されたサンドイッチ 型ヌクレオチドハイブリッド形成分析又は当業者に容易に明らかになる他の方法 によって検出される。第１及び第２オリゴヌクレオチドプローブは、標的ポリヌ クレオチドにおいて隣接の核酸配列に対してハイブリッド形成するように構築さ れる。従って、第２オリゴヌクレオチドプローブに相対する第１オリゴヌクレオ チドプローブの向きは、図１に示される５′→３′か又は３′→５′とすること ができる。 好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブは、蛍光分子をプローブの非結合末 端に結合することにより蛍光標識される。マルチプレックス分析における検出を 容易にするために、異なるＯＬＡリポータープローブのコピーが異なる蛍光標識 で標識される。適切な蛍光標識を選定する手引きは、Smithら(1987)Meth．Enzym ol．155:260-301，Kargerら(1991)Nucl．Acids Res．19:4955-4962，Haugland（ 1989）Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular P robes，Inc.,オレゴン州ユージーン)に見られる。好ましい蛍光標識としては、K hannaらの米国特許第 4,318,846号及び Leeら（1989）Cytometry 10:151-164に 開示されたようなフルオレセイン及びその誘導体及び上記の６−ＦＡＭ、ＪＯＥ 、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、ＨＥＸ−１、ＨＥＸ−２、ＺＯＥ、ＴＥＴ−１又はＮＡ Ｎ−２等が含まれる。最も好ましくは、複数の蛍光色素が用いられる場合には、 上記Fungに教示されたように分光学的に分割可能である。本明細書に用いられる “分光学的に分割可能”な蛍光色素は、電気泳動で分離した標識ポリヌクレオチ ドを分離したポリヌクレオチドの濃度バンドの実質的な重なりにもかかわらず容 易に検出されることを可能にする量子収量、発光バンド幅及び発光最大を有する ものである。 好適実施態様においては、第１オリゴヌクレオチドプローブは、５′→第２オ リゴヌクレオチドプローブが相補的である配列である変異ヌクレオチド配列に相 補的である。連結反応は、起こるとすれば第１オリゴヌクレオチドプローブの３ ′末端と第２オリゴヌクレオチドプローブの５′末端との間で起こる。従って、 その実施態様においては、第１オリゴヌクレオチドプローブは、５′末端上に移 動修飾因子又は検出可能な標識を有する。５′移動修飾因子、例えば、非相補ヌ クレオチド又は非ヌクレオチド拡張鎖は、拡張鎖が増幅中にアニールされないよ うな条件であることからＴａｑポリメラーゼの５′→３′エキソヌクレアーゼ活 性によって影響されない。また、アニーリングが生じるかなりのエキソヌクレア ーゼ活性を妨げるのに十分低い濃度で存在させる。その好適実施態様においては 、検出は、検出可能な標識を第２オリゴヌクレオチドプローブの３′末端にカッ プリングすることにより達成される。これにより、連結反応産物の検出が可能で あり、Ｔａｑポリメラーゼで３′拡張鎖を切断するようにも作用する。第１オリ ゴヌクレオチドプローブの３′端からの拡張鎖は生じるが連結反応を妨げること から検出されない。 本発明の方法に用いられる反応バッファーは、使用増幅計画及びＯＬＡ双方の 要求を支持しなければならない。ＴａｑＤＮＡリガーゼには、活性のために補因 子としてＮＡＤ＋、２価のカチオンＭｇ2+が必要であり、その活性は、低濃度の １価のカチオンＮａ＋でなくてＫ＋で刺激される(Takahashiら(1984)J．Biol．C hem．259:10041-10047)。ＯＬＡ反応に対する最適分析条件には、１０〜５０単 位の熱安定リガーゼの存在下に５〜１０mMのマグネシウムイオンが必要である。 従って、クレイムした増幅連結反応の共役法で用いられる反応バッファーは、特 に、１〜２００mM、好ましくは２５〜５０mMＫ＋、0.5〜２０mM、好ましくは１ 〜５mMＭｇ2+及び0.5〜２０mM、好ましくは１〜５mMＮＡＤ＋から調製される。 好ましくは、本発明の方法は、熱安定酵素を用いる自動化工程として行われる 。その工程においては、反応混合物は、ＰＣＲサイクル、例えば、変性領域、プ ライマーアニーリング領域及び反応領域、次に、１以上のＯＬＡサイクルによっ て循環される。熱安定酵素と使用するのに特に適応されるマシンが用いられ、酵 素をサイクル毎に添加する必要がないので、液体処理装置を含まない温度サイク ルを用いる。 上述したように、本発明は、本方法を実施するためのキットを包含する。かか るキットは、（ａ）各々が第１アニーリング温度において１種以上の標的ポリヌ クレオチドに対してアニールすることができる複数の増幅プライマー；（ｂ）各 々が第２アニーリング温度において該標的ポリヌクレオチドに対してアニールす ることができ、実質的にいずれも該第１アニーリング温度において該標的ポリヌ クレオチドに対してアニールしない複数のオリゴヌクレオチドプローブ；（ｃ） 該第１アニーリング温度以上の温度において該複数の増幅プライマーを用いて該 標的ポリヌクレオチドを増幅する手段；及び（ｄ）該第２アニーリング温度以下 の温度においてオリゴヌクレオチドプローブを結合して１種以上の連結反応産物 を形成する手段が含まれる。好ましくは、本発明のキットは、更に、含まれるオ リゴヌクレオチドプローブ及び増幅プライマー及び本方法の操作に適切な第１及 び第２アニーリング温度を記載している、キットの具体的な実施態様に適切な説 明書が含まれる。ＰＣＲ増幅の場合には、キットは、更に、ＤＮＡポリメラーゼ 、ヌクレオシド三リン酸、ＤＮＡリガーゼ及び連結反応及び増幅の共役用反応バ ッファーが含まれる。最も好ましくは、キットのオリゴヌクレオチドプローブ及 び増幅プライマーは、ＣＦＴＲ遺伝子座を分析するために表１及び表２の配列よ り選ばれる。実験 下記の実施例は、どのように本発明の方法を行うかの完全な開示と説明を当業 者に提供するものであり、本発明者らが本発明としてみなす範囲を限定するもの ではない。特にことわらない限り、部は重量部であり、温度は℃であり、圧力は 大気圧又はほぼ大気圧である。 本発明の方法による嚢胞性線維症貫膜電気伝導度調節（ＣＦＴＲ）遺伝子の対 立遺伝子変異体の検出及び識別が例示される。本方法は、小さな欠失及び挿入の ほかに全ての種類の単一塩基置換変異を検出することができる。手法は、ＣＦＴ Ｒ遺伝子の小さなセグメント（個々のエキソン又はイントロンフラグメント）の 最初のＰＣＲ増幅に続いてオリゴヌクレオチド連結反応を含み、各増幅領域内の 多数の突然変異を同時に選別することができる。ＯＬＡ手順においては、標的Ｄ ＮＡ鎖に対してハイブリッド形成する２種の並列した合成オリゴヌクレオチドプ ローブが、２種のハイブリッド形成プローブの結合領域に正しい塩基の対合があ る場合にのみ熱安定ＤＮＡリガーゼにより酵素結合される。別の２種のＤＮＡ配 列間で識別するために、図１に示されるように３種のオリゴヌクレオチドプロー ブを用いた。正常及び変異診断ＯＬＡプローブを、３′末端塩基が実験下に正常 或いは個々の突然変異の改変塩基に相同であるように設計した。対立遺伝子特異 的オリゴヌクレオチドを、ポリアクリルアミドゲルにおいてサイズが異なる対立 遺伝子産物の同定を可能にするように異なるサイズの非相補尾部を付加すること により５′末端で修飾した。２種の対立遺伝子又は識別プローブのすぐ下流でハ イブリッド形成するように設計されたリポーターオリゴヌクレオチドプローブを 、５′リン酸化し、その３′端に蛍光色素５−ＦＡＭを付加することにより修飾 した。オリゴヌクレオチドプローブのアニーリング温度、即ち、その実施態様に おける第２アニーリング温度とプローブの変性温度間の反復サーモサイクリング により連結反応産物の線状増幅が得られた。次に、その連結反応産物をアプライ ドバイオシステム373A型ＤＮＡシークエンサーの８％変性ポリアクリルアミドゲ ルによる電気泳動で分析した。 ヒトゲノムＤＮＡを、末梢血核形成細胞及び口腔細胞から調製した。ＤＮＡを 抽出するためのグアニジン法を用いて、ＤＮＡを全血から単離した（Chirgwinら (1979)Biochemistry 18:5294-5296; 上記Chehabら(1992)）。概要としては、３ 〜５mlの安定化全血（エチレンジアミン四酢酸塩（ＥＤＴＡ）又はクエン酸塩） を４５mlの溶解液(０.３２M スクロース、１０mMトリスＨＣｌ、ｐＨ8.0、５mM ＭｇＣｌ₂、１％トリトンX-100)と混合し、１５００ rpmで２０分間遠心するこ とにより核を沈降させた。核を、２mlのグアニジニウムチオシアネート（５M グ アニジンチオシアネート、５０mlトリスＨＣｌ、ｐＨ8.0、１０mMＥＤＴＡ）に 再懸濁し、１５分間回転させることにより抽出し、同量のイソプロピルアルコー ルを加えることにより沈殿させた。精製ＤＮＡを少量のＴＥバッファー（１０mM トリスＨＣｌ、ｐＨ8.0、１mMＥＤＴＡ）又は滅菌水に溶解した。 口腔の粘膜表面からの細胞を、刷毛又は爪楊枝で穏やかに削ることにより得た 。採取後、からみついた口腔細胞をミクロ遠心管の５００μlのＰＢＳに穏やか に攪拌して離し、１２００ｇで５分間遠心することにより沈降させた。ＤＮＡを 、 上記の口腔細胞から或いは細胞を５０〜２００μl 量の滅菌水に再懸濁し２０分 間煮沸することにより抽出した。細胞片を簡単な遠心で除去し、５μl のＤＮＡ 上清液をＤＮＡ増幅反応に用いた。ある場合には、煮沸前に試料をプロテイナー ゼＫ（１００μg/ml）で５０℃において数時間消化した。 使用した全オリゴヌクレオチドを、標準シアノエチルホスホルアミダイト化学 (Giusti ら(1993)PCR Methods Applic．2:223-227)を用いてアプライドバイオシ ステムス３９４型ＤＮＡシンセサイザー（カリフォルニア州フォスターシティ） で合成した。リポーターオリゴヌクレオチドプローブは、３′アミン−ＯＮ Ｃ ＰＧカラム(5220-1，Clontech Laboratories，Inc.，カリフォルニア州パロアル ト）で合成して５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、2′,7′−ジメトキ シ−4′,5′−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′ −テトラメチル−６−カルボキシローダミン、６−カルボキシローダミンＸ等の 蛍光色素で引き続いて標識するために３′端を誘導化した。各リポーターオリゴ ヌクレオチドプローブの５′端を、５′末端を化学的にリン酸化する５′リン酸 −ＯＮ(5210-1，Clontech Laboratories，Inc.，カリフォルニア州パロアルト) を用いてリン酸化した。色素標識リン酸化オリゴヌクレオチドを、逆相ＨＰＬＣ （上記Giustiら）により非複合オリゴヌクレオチドから精製した。オリゴヌクレ オチド精製カートリッジ(Applied Biosystems)を用いて、正常及び変異対立遺伝 子オリゴヌクレオチドプローブを精製した。精製オリゴヌクレオチドプローブを 凍結乾燥し、滅菌蒸留水に再懸濁し、分光光度法で定量した。下記に示される実 施例に用いられるプライマー及びプローブの配列を表１及び２に示す。プライマ ー及びプローブ配列は、Zielenskiら，Genomics，10:214-228（1991）から用い たものもある。 実施例１１５種のほとんど共通の嚢胞性線維症突然変異の増幅及び連結反応の共役による 分析 マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びリガーゼ増幅反応（Ｏ ＬＡ）を行う方法は、高Ｔｍ（７６〜１１６℃）を有するＰＣＲプライマー、Ｔ ｍ５２〜６８℃を有するＯＬＡオリゴヌクレオチド、９４℃で行われた変性工 程及び７２℃で行われたアニーリング延長工程を用いる２工程ＰＣＲサイクル及 び９４℃で行われた変性工程及び約５２〜５６℃で行われたハイブリッド形成工 程を有する２工程ＯＬＡの１〜３サイクルを用いる。増幅−連結反応の共役反応 は、パーキン−エルマー9600ＤＮＡサーモサイクラーの0.2mlの薄壁管内で全量 ５０μl で行った。各反応は、末梢血から抽出した２μl のＤＮＡ（１００〜２ ００ng）又は煮沸粘膜細胞溶解物からの２μl のＤＮＡ、ＣＦＴＲエキソン１０ 、１１、２０、２１及びイントロン１９又はＣＦＴＲエキソン４、１１、１４ｂ 及び１９のマルチプレックスＰＣＲ（２００〜８００nM）用プライマー及びＣＦ ＴＲ突然変異Ｇ５４２Ｘ、Ｇ５５１Ｄ、△Ｆ５０８、Ｗ１２８２Ｘ、Ｎ１３０３ 、３９０５ｉｎｓＴ及び３８４９＋１０ｋｂＣＴ又は３８４９＋４ＡＧ、３６５ ９ｄｅ１Ｃ、Ｒ１１７Ｈ、Ｒ１１６２Ｘ、１１７−１ＧＴ、６２１＋１ＧＴＲ５ ５３Ｘ及び２７８９＋５ＧＡのオリゴヌクレオチドプローブ(2.5〜12.5 nM)各々 を１０mMのトリスＨＣｌ、ｐＨ8.3、５０mMのＫＣｌ、4.5mMのＭｇＣｌ₂、１mM のＮＡＤ＋、２００〜６００μM の各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴ Ｐ、５単位のクローン化ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ及び２０単位のサーマス・ア クアチクスＤＮＡリガーゼ（上記Baranyら(1991)）を含有するバッファー中に含 有した。 ９４℃で５分変性した後、試料を各々９４℃で３０秒間及び７２℃で1.5分間 からなるＰＣＲ増幅２５サイクルに供した。第２変性を９８℃で３分間、次に９ ４℃で３０秒間及び５５℃で３分間のオリゴヌクレオチド連結反応１〜１０サイ クルを続けた。本方法後、分析前に試料を少しでも−２０℃に貯蔵した。 各反応混合液の0.5〜2.0μl 分割量を用いて増幅−連結反応産物を分析し、１ ０フェムトモルのレーン内部標準は色素ＲＯＸ（６−カルボキシローダミンＸ） (Applied Biosystems)で標識したサイズが３０〜７０塩基のオリゴマー及び４μ l のホルムアミドローディングバッファー(脱イオンホルムアミド：５０mMＥＤ ＴＡ、５：１(v/v))からなるものとした。試料を、１０0℃で５分間熱変性し、 急速に氷で冷却し、８％ポリアクリルアミド変性配列決定ゲルに充填した。ゲル を、アプライドバイオシステムモデル373A型蛍光ＤＮＡシークエンサーで１５０ ０V において３時間電気泳動した。連結反応産物の位置及び相対量をジー ンスキャン 672ソフトウェア(Applied Biosystem)で自動的に記録した。ＰＣＲ 産物を、１×トリス−ホウ酸塩ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）バッファー(0.09M トリス− ホウ酸塩、0.002M ＥＤＴＡ、ｐＨ8.0)中３％メタフォアアガロース(FMC BioPro ducts,メイン州ロックランド)で１００V で５〜６時間電気泳動することにより 分析し、0.5μg/ml臭化エチジウムで染色することにより可視化した。 図２は、これらの分析の結果を示す図である。図２Ａ及び図２Ｂは、１５種の ほとんど共通の嚢胞性線維症突然変異のうちの各々７種と８種を正確に判別する 分析能力を示している。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．試料中の１種以上のポリヌクレオチドを検出する方法であって、下記の工程 を含む方法。 （ａ）各々が第１アニーリング温度において１種以上の標的ポリヌクレオチ ドに対してアニールすることができる複数の増幅プライマーを供給する工程； （ｂ）各々が第２アニーリング温度において該標的ポリヌクレオチドに対し てアニールすることができ、実質的にいずれも該第１アニーリング温度において 該標的ポリヌクレオチドに対してアニールしない複数のオリゴヌクレオチドプロ ーブを供給する工程； （ｃ）該第１アニーリング温度以上の温度において該複数の増幅プライマー を用いて該標的ポリヌクレオチドを増幅する工程； （ｄ）該第２アニーリング温度以下の温度において該１種以上の標的ポリヌ クレオチドに対して特異的にハイブリッド形成する該複数のオリゴヌクレオチド プローブを結合して１種以上の連結反応産物を形成する工程；及び （ｅ）該１種以上の連結反応産物を検出する工程。 ２．前記増幅工程が、ポリメラーゼ連鎖反応又はリガーゼ連鎖反応により増幅す る段階を含む請求項１記載の方法。 ３．前記第１アニーリング温度が約７２〜約８４℃であり、前記第２アニーリン グ温度が約３０〜約５５℃である請求項２記載の方法。 ４．前記第１アニーリング温度が約７２〜約７５℃であり、前記第２アニーリン グ温度が約４０〜約５５℃である請求項３記載の方法。 ５．前記連結反応産物が異なる電気泳動移動度を有し、前記検出工程が前記連結 反応産物を電気泳動で分離する段階を含む請求項１記載の方法。 ６．前記連結反応産物が異なる蛍光標識を有し、前記検出工程が該異なる蛍光標 識で生じた蛍光シグナルを測定する段階を含む請求項１記載の方法。 ７．前記連結反応産物が異なる電気泳動移動度を有し、前記検出工程が前記連結 反応産物を電気泳動で分離する段階を含む請求項６記載の方法。 ８．前記蛍光標識が、５−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシフルオレ セイン、２′,７′−ジメトキシ−４′,５′−ジクロロ−６−カルボキシフルオ レセイン、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチル−６−カルボキシローダミン、６ −カルボキシローダミンＸ、4,7,2′,4′,5′,7′−ヘキサクロロ−６−カルボ キシフルオレセイン、4,7,2′,4′,5′,7′−ヘキサクロロ−５−カルボキシフ ルオレセイン、2′,4′,5′,7′−テトラクロロ−５−カルボキシフルオレセイ ン、4,7,2′,7′−テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、1′,2′,7′ ,8′−ジベンゾ-4,7−ジクロロ−５−カルボキシフルオレセイン及び1′,2′,7 ′,8′−ジベンゾ-4,7−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセインからなる群よ り選ばれる請求項７記載の方法。 ９．前記１種以上の標的ポリヌクレオチドが嚢胞性線維症貫膜電気伝導度調節因 子（ＣＦＴＲ）をコードする遺伝子の対立遺伝子又は突然変異である請求項８記 載の方法。 10．前記１種以上の標的ポリヌクレオチドが、△Ｆ５０８、Ｇ５４２Ｘ、Ｇ５５ １Ｄ、Ｗ１２８２Ｘ、Ｎ１３０３Ｋ、３９０５ｉｎｓＴ、３８４９＋１０ｋｂＣ Ｔ、３８４９＋４ＡＧ、３６５９ｄｅ１Ｃ、Ｒ１１７Ｈ、Ｒ１１６２Ｘ、１７１ ７−１ＧＴ、６２１＋１ＧＴ、Ｒ５５３Ｘ、２７８９＋５ＧＡ、Ｒ３４７Ｐ、２ １８４ｄｅ１Ａ、１０７８ｄｅ１Ｔ、Ｒ３３４Ｗ、７１１＋１ＧＴ、Ｇ８５Ｅ、 １８９８＋１ＧＡ、Ａ４５５Ｅ、Ｓ５４９Ｒ、Ｓ５４９Ｎ、Ｒ５６０Ｔ、△１５ ０７、Ｑ４９３Ｘ、Ｖ５２０Ｆ及びＹ１２２Ｘからなる群より選ばれた嚢胞性線 維症貫膜電気伝導度調節因子（ＣＦＴＲ）をコードする遺伝子の対立遺伝子又は 突然変異である請求項９記載の方法。 11．試料中の１種以上のポリヌクレオチドを検出するためのキットであって、下 記の成分を含むキット。 （ａ）各々が第１アニーリング温度において１種以上の標的ポリヌクレオチ ドに対してアニールすることができる複数の増幅プライマー； （ｂ）各々が第２アニーリング温度において該標的ポリヌクレオチドに対し てアニールすることができ、実質的にいずれも該第１アニーリング温度において 該標的ポリヌクレオチドに対してアニールしない複数のオリゴヌクレオチドプロ ーブ； （ｃ）該第１アニーリング温度以上の温度において該複数の増幅プライマー を用いて該標的ポリヌクレオチドを増幅する手段；及び （ｄ）該第２アニーリング温度以下の温度においてオリゴヌクレオチドプロ ーブを結合して１種以上の連結反応産物を形成する手段。 12．下記の成分を更に含む請求項11記載のキット。 （ａ）請求項１記載の方法を実施するための説明書； （ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ； （ｃ）ヌクレオシド三リン酸； （ｄ）ＤＮＡリガーゼ：及び （ｅ）増幅及び連結反応の共役用反応バッファー。 13． 前記オリゴヌクレオチドプローブ及び前記増幅プライマーが、△Ｆ５０８ 、Ｇ５４２Ｘ、Ｇ５５１Ｄ、Ｗ１２８２Ｘ、Ｎ１３０３Ｋ、３９０５ｉｎｓＴ、 ３８４９＋１０ｋｂＣＴ、３８４９＋４ＡＧ、３６５９ｄｅ１Ｃ、Ｒ１１７Ｈ、 Ｒ１１６２Ｘ、１７１７−１ＧＴ、６２１＋１ＧＴ、Ｒ５５３Ｘ、２７８９＋５ ＧＡ、Ｒ３４７Ｐ、２１８４ｄｅ１Ａ、１０７８ｄｅ１Ｔ、Ｒ３３４Ｗ、７１１ ＋１ＧＴ、Ｇ８５Ｅ、１８９８＋１ＧＡ、Ａ４５５Ｅ、Ｓ５４９Ｒ、Ｓ５４９Ｎ 、Ｒ５６０Ｔ、△１５０７、Ｑ４９３Ｘ、Ｖ５２０Ｆ及びＹ１２２Ｘからなる群 より選ばれた嚢胞性線維症貫膜電気伝導度調節因子（ＣＦＴＲ）をコードする遺 伝子の対立遺伝子又は突然変異を検出することができる請求項12記載のキット。