JPH095329A - がん患者血液中のｎｃａ９０糖形態の特異的測定 - Google Patents
がん患者血液中のｎｃａ９０糖形態の特異的測定Info
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- JPH095329A JPH095329A JP8168721A JP16872196A JPH095329A JP H095329 A JPH095329 A JP H095329A JP 8168721 A JP8168721 A JP 8168721A JP 16872196 A JP16872196 A JP 16872196A JP H095329 A JPH095329 A JP H095329A
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- G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
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- G01N33/57585—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites involving compounds identifiable in body fluids
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 患者におけるがん、特に乳がん、結腸がんお
よび肺がんならびに白血病の進行または経過の診断およ
び監視を支援するための改良された方法を得る。 【解決手段】 患者から得られる血液試料、例えば血清
試料中のＮＣＡ９０の量を特異的に測定することによ
る。
よび肺がんならびに白血病の進行または経過の診断およ
び監視を支援するための改良された方法を得る。 【解決手段】 患者から得られる血液試料、例えば血清
試料中のＮＣＡ９０の量を特異的に測定することによ
る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、がんの診断ならび
にがん患者における病状および治療の経過の監視に関す
る。より詳細には、本発明は、血液中のがんマーカーＮ
ＣＡ５０／９０の９０kDa 糖形態の特異的測定に関す
る。
にがん患者における病状および治療の経過の監視に関す
る。より詳細には、本発明は、血液中のがんマーカーＮ
ＣＡ５０／９０の９０kDa 糖形態の特異的測定に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】非特異性交叉反応抗原（ＮＣＡ）は、が
ん胎児性抗原（ＣＥＡ）遺伝子ファミリーに属する、配
列および構造的に関連したタンパク質のグループ、すな
わち免疫グロブリン超遺伝子ファミリーのサブファミリ
ーである（文献１〜４で考察）。染色体１９の長い腕の
上でコード化されて、ＣＥＡ遺伝子ファミリーは、約２
９個の遺伝子からなり（文献２〜４）、二つの主なサブ
グループ、すなわちＣＥＡサブグループと、妊娠特異性
β糖タンパク質（ＰＳβＧ）サブグループとに分けられ
る。ＣＥＡサブグループは、１２個の遺伝子および偽遺
伝子を含み（文献４、５）、ＣＥＡ（ＣＤ６６ｅ）、胆
汁糖タンパク質（ＢＧＰ、ＣＤ６６ａ）、ＮＣＡ５０／
９０（ＣＤ６６ｃ）、ＮＣＡ９５（ＣＧＭ６、ＣＤ６６
ｂ）、ＣＧＭ１（ＣＤ６６ｄ）（文献６）およびＣＧＭ
７（文献７）を含む。現在までに、ＣＥＡ、ＢＧＰ、Ｎ
ＣＡ５０／９０およびＮＣＡ９５遺伝子のタンパク質産
物のみが同定され、生化学的に特性決定されている。Ｐ
ＳβＧサブグループは、約１１個の独特に転写された遺
伝子を含む（文献４、８、９）。最近、第三のサブグル
ープに属する６個のさらなる遺伝子のグループが記載さ
れたが、これらの遺伝子産物の発現度および組織分布は
知られていない（文献５、１０）。報告によると、ＣＥ
Ａ遺伝子ファミリーのメンバーは、顆粒球−内皮細胞の
付着、細菌ふさへの付着において機能し、タイプＩコラ
ーゲンへの結合に補助的な役割を演じるかもしれない
（文献２、４で考察）。
ん胎児性抗原（ＣＥＡ）遺伝子ファミリーに属する、配
列および構造的に関連したタンパク質のグループ、すな
わち免疫グロブリン超遺伝子ファミリーのサブファミリ
ーである（文献１〜４で考察）。染色体１９の長い腕の
上でコード化されて、ＣＥＡ遺伝子ファミリーは、約２
９個の遺伝子からなり（文献２〜４）、二つの主なサブ
グループ、すなわちＣＥＡサブグループと、妊娠特異性
β糖タンパク質（ＰＳβＧ）サブグループとに分けられ
る。ＣＥＡサブグループは、１２個の遺伝子および偽遺
伝子を含み（文献４、５）、ＣＥＡ（ＣＤ６６ｅ）、胆
汁糖タンパク質（ＢＧＰ、ＣＤ６６ａ）、ＮＣＡ５０／
９０（ＣＤ６６ｃ）、ＮＣＡ９５（ＣＧＭ６、ＣＤ６６
ｂ）、ＣＧＭ１（ＣＤ６６ｄ）（文献６）およびＣＧＭ
７（文献７）を含む。現在までに、ＣＥＡ、ＢＧＰ、Ｎ
ＣＡ５０／９０およびＮＣＡ９５遺伝子のタンパク質産
物のみが同定され、生化学的に特性決定されている。Ｐ
ＳβＧサブグループは、約１１個の独特に転写された遺
伝子を含む（文献４、８、９）。最近、第三のサブグル
ープに属する６個のさらなる遺伝子のグループが記載さ
れたが、これらの遺伝子産物の発現度および組織分布は
知られていない（文献５、１０）。報告によると、ＣＥ
Ａ遺伝子ファミリーのメンバーは、顆粒球−内皮細胞の
付着、細菌ふさへの付着において機能し、タイプＩコラ
ーゲンへの結合に補助的な役割を演じるかもしれない
（文献２、４で考察）。
【０００３】ＮＣＡ５０／９０遺伝子の産物は、グリコ
シルホスファチジルイノシトール結合を介して細胞膜に
付着した約３４kDa のポリペプチドである。ＣＥＡ遺伝
子ファミリーの他のメンバーと同様に、ＮＣＡ分子のペ
プチド骨格は、一連のジスルフィド結合した免疫グロブ
リン（Ｉｇ）様の領域からなる。ＮＣＡ５０／９０は、
そのような三つのＩｇ様領域、すなわちアミノ酸１０８
〜１１０個のＮ末端領域、アミノ酸９２〜９６個のＣ区
域様領域（Ａ領域と呼ぶ）、そしてアミノ酸８６個の第
二のＣ区域様領域（Ｂ領域と呼ぶ）を含む。３４kDa ポ
リペプチドの翻訳後グリコシル化の結果、５０kDa の見
かけ分子量を有する変性ポリペプチド（ＮＣＡ５０；５
０kDa 糖形態）および９０kDa の見かけ分子量を有する
変性ポリペプチド（（ＮＣＡ９０；９０kDa 糖形態）が
得られる（文献１〜４）。
シルホスファチジルイノシトール結合を介して細胞膜に
付着した約３４kDa のポリペプチドである。ＣＥＡ遺伝
子ファミリーの他のメンバーと同様に、ＮＣＡ分子のペ
プチド骨格は、一連のジスルフィド結合した免疫グロブ
リン（Ｉｇ）様の領域からなる。ＮＣＡ５０／９０は、
そのような三つのＩｇ様領域、すなわちアミノ酸１０８
〜１１０個のＮ末端領域、アミノ酸９２〜９６個のＣ区
域様領域（Ａ領域と呼ぶ）、そしてアミノ酸８６個の第
二のＣ区域様領域（Ｂ領域と呼ぶ）を含む。３４kDa ポ
リペプチドの翻訳後グリコシル化の結果、５０kDa の見
かけ分子量を有する変性ポリペプチド（ＮＣＡ５０；５
０kDa 糖形態）および９０kDa の見かけ分子量を有する
変性ポリペプチド（（ＮＣＡ９０；９０kDa 糖形態）が
得られる（文献１〜４）。
【０００４】歴史的に、ＮＣＡ組織発現の検査は、二つ
の並列的な検査方法、すなわち、ポリクローナルおよび
モノクローナル抗体の使用による免疫組織化学的方法
と、ＮＣＡ ｍＲＮＡ発現の検査による分子的方法に沿
って進められてきた。正常組織および悪性組織における
発現ＮＣＡ ｍＲＮＡをノーザンブロットハイブリダイ
ゼーションによって検査した研究施設もある。この技術
を用いて、ＮＣＡ ｍＲＮＡは、正常な肺組織（文献１
１、１２）、悪性の肺（文献１１）、結腸（文献１３〜
１５）、乳房（文献１５）ならびに慢性骨髄性白血病に
関連する増殖細胞（文献１５）中に証明された。あるい
はまた、免疫組織化学的分析を利用して、正常な結腸
（文献１３〜１６）、悪性の乳房（文献１７）、肺（文
献１９）、結腸（文献１６）および膵臓細胞系統（文献
１９）におけるＮＣＡの発現が実証された。
の並列的な検査方法、すなわち、ポリクローナルおよび
モノクローナル抗体の使用による免疫組織化学的方法
と、ＮＣＡ ｍＲＮＡ発現の検査による分子的方法に沿
って進められてきた。正常組織および悪性組織における
発現ＮＣＡ ｍＲＮＡをノーザンブロットハイブリダイ
ゼーションによって検査した研究施設もある。この技術
を用いて、ＮＣＡ ｍＲＮＡは、正常な肺組織（文献１
１、１２）、悪性の肺（文献１１）、結腸（文献１３〜
１５）、乳房（文献１５）ならびに慢性骨髄性白血病に
関連する増殖細胞（文献１５）中に証明された。あるい
はまた、免疫組織化学的分析を利用して、正常な結腸
（文献１３〜１６）、悪性の乳房（文献１７）、肺（文
献１９）、結腸（文献１６）および膵臓細胞系統（文献
１９）におけるＮＣＡの発現が実証された。
【０００５】ＣＥＡ遺伝子ファミリーメンバーの発現ベ
クターへの分子クローニングは、抗ＣＥＡおよび抗ＮＣ
Ａモノクローナル抗体特異性およびＮＣＡ５０／９０組
織分布の分析に使用するための貴重な手段を提供した。
Barnett らは、ＮＣＡ５０／９０およびＣＥＡ遺伝子を
コード化するｃＤＮＡをクローニングし、発現させた
（文献２０、２１）。これらの試薬を使用して、他のＣ
ＥＡ遺伝子ファミリーメンバーと交叉反応しない、ＮＣ
Ａ５０／９０の５０kDa および９０kDa の両糖形態に特
異性の抗体であるＭＡｂ２２８の特異性が特性決定され
た（文献２２）。
クターへの分子クローニングは、抗ＣＥＡおよび抗ＮＣ
Ａモノクローナル抗体特異性およびＮＣＡ５０／９０組
織分布の分析に使用するための貴重な手段を提供した。
Barnett らは、ＮＣＡ５０／９０およびＣＥＡ遺伝子を
コード化するｃＤＮＡをクローニングし、発現させた
（文献２０、２１）。これらの試薬を使用して、他のＣ
ＥＡ遺伝子ファミリーメンバーと交叉反応しない、ＮＣ
Ａ５０／９０の５０kDa および９０kDa の両糖形態に特
異性の抗体であるＭＡｂ２２８の特異性が特性決定され
た（文献２２）。
【０００６】最近の研究は、ＮＣＡ５０／９０の血清お
よび血漿測定には、慢性の骨髄性またはリンパ球性白血
病（文献２３）ならびに乳がん、結腸がんまたは肺がん
（文献２２）の患者の管理に臨床的用途がありうること
を示唆した。欧州特許公開第５４９，９７４号、第６２
１，４８０号および第６２８，８２０号を参照するこ
と。これらの研究は、ＮＣＡ５０／９０の５０kDa およ
び９０kDa の両糖形態に特異性のＭＡｂ（ＭＡｂ２２
８）を使用するＥＬＩＳＡを用いるものであった。現在
公式化されているように、このＥＬＩＳＡとは、ＮＣＡ
５０／９０の両糖形態に対するＭＡｂ２２８の特異性に
より、患者試料中のＮＣＡ５０／９０を「トータル」で
測定する。そのようなものであるため、この検定は、悪
性疾患の際にＮＣＡ５０／９０のどちらの糖形態が循環
中で優位を占めるかを判断することはできない。
よび血漿測定には、慢性の骨髄性またはリンパ球性白血
病（文献２３）ならびに乳がん、結腸がんまたは肺がん
（文献２２）の患者の管理に臨床的用途がありうること
を示唆した。欧州特許公開第５４９，９７４号、第６２
１，４８０号および第６２８，８２０号を参照するこ
と。これらの研究は、ＮＣＡ５０／９０の５０kDa およ
び９０kDa の両糖形態に特異性のＭＡｂ（ＭＡｂ２２
８）を使用するＥＬＩＳＡを用いるものであった。現在
公式化されているように、このＥＬＩＳＡとは、ＮＣＡ
５０／９０の両糖形態に対するＭＡｂ２２８の特異性に
より、患者試料中のＮＣＡ５０／９０を「トータル」で
測定する。そのようなものであるため、この検定は、悪
性疾患の際にＮＣＡ５０／９０のどちらの糖形態が循環
中で優位を占めるかを判断することはできない。
【０００７】他の研究施設が、ＮＣＡ５０／９０の正常
組織発現および悪性組織発現を研究した。Robbins ら
（文献２４）は、ヒトＣＥＡ遺伝子ファミリーメンバー
でトランスフェクトしたマウス細胞系統を使用して、モ
ノクローナル抗体のパネルの特異性を決定した。Robbin
s は、Ｂ６．２と呼ばれるＮＣＡ特異性ＭＡｂを使用し
て、試験したほぼすべての乳房および肺の腫瘍がＮＣＡ
を発現するということを免疫組織化学的に実証した。Ba
ranov ら（文献２５）は、正常な結腸粘膜および結腸腺
がんにおけるＮＣＡ５０の正確な限局化を実証した。Ba
ranov らは、間接免疫ペルオキシダーゼ電子顕微鏡技術
およびＮＣＡ５０／９０の５０kDa 糖形態に特異性のモ
ノクローナル抗体を使用して、正常なヒト結腸の先端面
および先端面に関連する微小水疱中にＮＣＡ５０の存在
を検出した。さらには、ＮＣＡ５０は、杯細胞の内部成
分として、隣接する微小水疱どうしの空間にも検出さ
れ、成熟した柱状の上皮細胞の管腔面と関連することが
わかった。これらの研究は、正常な肺および結腸組織中
に検出可能な量のＮＣＡ５０／９０を実証したが、正常
な検体および悪性の検体におけるＮＣＡ５０／９０糖形
態の相対分布に関して成果は得られなかった。
組織発現および悪性組織発現を研究した。Robbins ら
（文献２４）は、ヒトＣＥＡ遺伝子ファミリーメンバー
でトランスフェクトしたマウス細胞系統を使用して、モ
ノクローナル抗体のパネルの特異性を決定した。Robbin
s は、Ｂ６．２と呼ばれるＮＣＡ特異性ＭＡｂを使用し
て、試験したほぼすべての乳房および肺の腫瘍がＮＣＡ
を発現するということを免疫組織化学的に実証した。Ba
ranov ら（文献２５）は、正常な結腸粘膜および結腸腺
がんにおけるＮＣＡ５０の正確な限局化を実証した。Ba
ranov らは、間接免疫ペルオキシダーゼ電子顕微鏡技術
およびＮＣＡ５０／９０の５０kDa 糖形態に特異性のモ
ノクローナル抗体を使用して、正常なヒト結腸の先端面
および先端面に関連する微小水疱中にＮＣＡ５０の存在
を検出した。さらには、ＮＣＡ５０は、杯細胞の内部成
分として、隣接する微小水疱どうしの空間にも検出さ
れ、成熟した柱状の上皮細胞の管腔面と関連することが
わかった。これらの研究は、正常な肺および結腸組織中
に検出可能な量のＮＣＡ５０／９０を実証したが、正常
な検体および悪性の検体におけるＮＣＡ５０／９０糖形
態の相対分布に関して成果は得られなかった。
【０００８】
【課題を解決するための手段】今や、予想外にも、正常
組織中に両方の糖形態が発現するが、ＮＣＡ５０／９０
の９０kDa 糖形態が優勢的に血流中に分泌されることが
見いだされた。したがって、本発明は、患者の血流中に
分泌されるＮＣＡ５０／９０遺伝子によって発現される
ヒトタンパク質を測定する方法であって、患者から得ら
れた血液試料中でＮＣＡ９０を特異的に測定することを
含む方法を提供する。さらには、ＮＣＡ９０の血中レベ
ルが正常人およびがん患者のＮＣＡ５０／９０の血中レ
ベルのいずれとも相関することがわかったため、血液中
に特異的なＮＣＡの検出は、ＮＣＡ５０／９０の測定が
臨床的価値があることが見いだされているがんの診断お
よび監視において改善された利用性を提供する。したが
って、本発明は、血液、例えば血清または血漿中で優位
を占めるＮＣＡ糖形態の特異的検出に基づき、より多大
な臨床的利用性がある第二世代診断検定の基礎を提供す
る。
組織中に両方の糖形態が発現するが、ＮＣＡ５０／９０
の９０kDa 糖形態が優勢的に血流中に分泌されることが
見いだされた。したがって、本発明は、患者の血流中に
分泌されるＮＣＡ５０／９０遺伝子によって発現される
ヒトタンパク質を測定する方法であって、患者から得ら
れた血液試料中でＮＣＡ９０を特異的に測定することを
含む方法を提供する。さらには、ＮＣＡ９０の血中レベ
ルが正常人およびがん患者のＮＣＡ５０／９０の血中レ
ベルのいずれとも相関することがわかったため、血液中
に特異的なＮＣＡの検出は、ＮＣＡ５０／９０の測定が
臨床的価値があることが見いだされているがんの診断お
よび監視において改善された利用性を提供する。したが
って、本発明は、血液、例えば血清または血漿中で優位
を占めるＮＣＡ糖形態の特異的検出に基づき、より多大
な臨床的利用性がある第二世代診断検定の基礎を提供す
る。
【０００９】より詳細には、本発明は、がんの症候を示
す患者（すなわち症候性患者）における種々のがん、例
えば乳がん、結腸がんおよび肺がんならびに白血病の診
断を支援する方法であって、患者から得られた血液試料
中でＮＣＡ９０の量を特異的に測定する段階と、そのよ
うな測定した量を、正常な個体群における血中ＮＣＡ９
０の平均量と比較する段階とを含み、有意に増大した量
のＮＣＡ９０が患者の血液中に存在することが、患者に
おけるがんの指標になるところの方法を提供する。この
方法およびがんを示唆する他の情報を用いて、医師は診
断に際して支援を受ける。
す患者（すなわち症候性患者）における種々のがん、例
えば乳がん、結腸がんおよび肺がんならびに白血病の診
断を支援する方法であって、患者から得られた血液試料
中でＮＣＡ９０の量を特異的に測定する段階と、そのよ
うな測定した量を、正常な個体群における血中ＮＣＡ９
０の平均量と比較する段階とを含み、有意に増大した量
のＮＣＡ９０が患者の血液中に存在することが、患者に
おけるがんの指標になるところの方法を提供する。この
方法およびがんを示唆する他の情報を用いて、医師は診
断に際して支援を受ける。
【００１０】本発明はまた、がんの診断を受けた患者に
おける種々のがん、例えば乳がん、結腸がんおよび肺が
んならびに白血病の経過または進行を監視する方法を提
供する。一連の特異性免疫検定を一定期間にわたって実
施して、そのような患者から得られた血液試料中でＮＣ
Ａ９０のレベルの変化を特異的に測定し、ＮＣＡ血中レ
ベルの変化を病状の変化と相関させる。より詳細には、
一般に、血中ＮＣＡ９０レベルの増大は病状の悪化を示
し、血中ＮＣＡ９０レベルの減少は病状の改善を示す。
診断を受けた患者が、がんの治療、例えば放射線治療、
化学治療、手術などを受けて、臨床的に検出可能な疾患
を除去していた場合、血中ＮＣＡ９０レベルの増大は疾
病の再発の可能性を示す。
おける種々のがん、例えば乳がん、結腸がんおよび肺が
んならびに白血病の経過または進行を監視する方法を提
供する。一連の特異性免疫検定を一定期間にわたって実
施して、そのような患者から得られた血液試料中でＮＣ
Ａ９０のレベルの変化を特異的に測定し、ＮＣＡ血中レ
ベルの変化を病状の変化と相関させる。より詳細には、
一般に、血中ＮＣＡ９０レベルの増大は病状の悪化を示
し、血中ＮＣＡ９０レベルの減少は病状の改善を示す。
診断を受けた患者が、がんの治療、例えば放射線治療、
化学治療、手術などを受けて、臨床的に検出可能な疾患
を除去していた場合、血中ＮＣＡ９０レベルの増大は疾
病の再発の可能性を示す。
【００１１】図１は、ＥＬＩＳＡおよび免疫沈降による
正常組織中のＮＣＡ５０／９０遺伝子産物の検出を示
す。ＥＬＩＳＡ検定（ＣＡ ２２８ ＥＬＩＳＡ）を使
用して全ＮＣＡ５０／９０タンパク質を測定し、免疫沈
降−ウエスタンブロット技術を使用して特異性のＮＣＡ
５０／９０糖形態を検出することにより、正常人の肺、
脾臓、肝臓、結腸、胎盤、心臓、乳房、筋肉および脳の
組織中のＮＣＡ５０／９０遺伝子産物の存在を試験し
た。これらの手法は、実施例の「材料および方法」に詳
細に説明する。これらの手法はいずれも、ＮＣＡ５０／
９０遺伝子の５０kDa および９０kDa の両糖形態に対し
て特異性であり、他のＣＥＡ遺伝子ファミリーメンバー
とは非交叉反応性であるモノクロナール抗体であるＭＡ
ｂ２２８を用いるものであった。ＥＬＩＳＡにより、種
々の組織中に検出されるＮＣＡ５０／９０タンパク質の
量を、組織タンパク質１mgあたりのＮＣＡ５０／９０の
ngとして記録する。免疫沈降およびウエスタンブロッテ
ィングによる特異性ＮＣＡ５０／９０糖形態の検出は、
以下の定性尺度を用いて表示する。「−」：ＮＣＡ糖形
態は検出されず。「＋／−」：極微量のＮＣＡ糖形態を
検出。「＋」：有意量のＮＣＡ糖形態を検出。
正常組織中のＮＣＡ５０／９０遺伝子産物の検出を示
す。ＥＬＩＳＡ検定（ＣＡ ２２８ ＥＬＩＳＡ）を使
用して全ＮＣＡ５０／９０タンパク質を測定し、免疫沈
降−ウエスタンブロット技術を使用して特異性のＮＣＡ
５０／９０糖形態を検出することにより、正常人の肺、
脾臓、肝臓、結腸、胎盤、心臓、乳房、筋肉および脳の
組織中のＮＣＡ５０／９０遺伝子産物の存在を試験し
た。これらの手法は、実施例の「材料および方法」に詳
細に説明する。これらの手法はいずれも、ＮＣＡ５０／
９０遺伝子の５０kDa および９０kDa の両糖形態に対し
て特異性であり、他のＣＥＡ遺伝子ファミリーメンバー
とは非交叉反応性であるモノクロナール抗体であるＭＡ
ｂ２２８を用いるものであった。ＥＬＩＳＡにより、種
々の組織中に検出されるＮＣＡ５０／９０タンパク質の
量を、組織タンパク質１mgあたりのＮＣＡ５０／９０の
ngとして記録する。免疫沈降およびウエスタンブロッテ
ィングによる特異性ＮＣＡ５０／９０糖形態の検出は、
以下の定性尺度を用いて表示する。「−」：ＮＣＡ糖形
態は検出されず。「＋／−」：極微量のＮＣＡ糖形態を
検出。「＋」：有意量のＮＣＡ糖形態を検出。
【００１２】図２は、ＥＬＩＳＡおよび免疫沈降による
正常人、非悪性疾病患者およびがん患者の血清中のＮＣ
Ａ５０／９０遺伝子産物の検出を示す。「材料および方
法」に記載するようにして、ＣＡ ２２８ ＥＬＩＳＡ
および免疫沈降−ウエスタンブロッティングにより、正
常人、非悪性疾病患者およびがん患者の血清中のＮＣＡ
５０／９０遺伝子産物の存在を判定した。各疾病タイプ
の患者の数を示す。疾病のタイプごとに、ＣＡ ２２８
ＥＬＩＳＡの結果を、最低の患者値から最高の患者値
までの範囲として記録する。また、免疫沈降−ウエスタ
ンブロッティングによって特異性のＮＣＡ５０／９０糖
形態について陽性であった患者血清試料の数を示す。
正常人、非悪性疾病患者およびがん患者の血清中のＮＣ
Ａ５０／９０遺伝子産物の検出を示す。「材料および方
法」に記載するようにして、ＣＡ ２２８ ＥＬＩＳＡ
および免疫沈降−ウエスタンブロッティングにより、正
常人、非悪性疾病患者およびがん患者の血清中のＮＣＡ
５０／９０遺伝子産物の存在を判定した。各疾病タイプ
の患者の数を示す。疾病のタイプごとに、ＣＡ ２２８
ＥＬＩＳＡの結果を、最低の患者値から最高の患者値
までの範囲として記録する。また、免疫沈降−ウエスタ
ンブロッティングによって特異性のＮＣＡ５０／９０糖
形態について陽性であった患者血清試料の数を示す。
【００１３】図３は、患者試料から免疫沈降させたＮＣ
Ａ９０の定量に使用する標準曲線を示す。図３は、ＮＣ
Ａ９０血清が免疫沈降する定量に使用される典型的な標
準曲線を表す。以下に記載するように、肺組織ホモジネ
ートの三つの連続希釈溶液中のＮＣＡ９０の量を電気泳
動、免疫エレクトロブロッティングおよび比重走査によ
って測定した。結果を、４回の独立した測定の平均±１
ＳＤとしてプロットする。標準曲線の範囲は０．０１７
ng〜１．４４ngである。
Ａ９０の定量に使用する標準曲線を示す。図３は、ＮＣ
Ａ９０血清が免疫沈降する定量に使用される典型的な標
準曲線を表す。以下に記載するように、肺組織ホモジネ
ートの三つの連続希釈溶液中のＮＣＡ９０の量を電気泳
動、免疫エレクトロブロッティングおよび比重走査によ
って測定した。結果を、４回の独立した測定の平均±１
ＳＤとしてプロットする。標準曲線の範囲は０．０１７
ng〜１．４４ngである。
【００１４】図４は、正常な被検者およびがん患者にお
ける血清ＣＡ２２８（全ＮＣＡ５０／９０）の値とＮＣ
Ａ９０の値との比較を示す。以下に記載するように、Ｅ
ＬＩＳＡおよび免疫エレクトロブロッティングにより、
正常な被検者１０人およびがん患者９人のパネルの血清
中のＣＡ２２８およびＮＣＡ９０のレベルを測定した。
すべてのがん患者は、担当医により、臨床的に活性の疾
病に罹患した状態にあると診断されていた。
ける血清ＣＡ２２８（全ＮＣＡ５０／９０）の値とＮＣ
Ａ９０の値との比較を示す。以下に記載するように、Ｅ
ＬＩＳＡおよび免疫エレクトロブロッティングにより、
正常な被検者１０人およびがん患者９人のパネルの血清
中のＣＡ２２８およびＮＣＡ９０のレベルを測定した。
すべてのがん患者は、担当医により、臨床的に活性の疾
病に罹患した状態にあると診断されていた。
【００１５】
【発明の実施の形態】本発明を構成するにあたり、正常
な組織、正常な血清、がん患者の血清および非悪性疾病
患者の血清中にＮＣＡ５０／９０のどちらの糖形態が存
在するかを決定するための研究を実施した。以下の実施
例にさらに詳細に報告するように、正常な組織中ではＮ
ＣＡ５０／９０の両糖形態が発現するが、循環中には９
０kDa糖形態しか検出されない。アセトン抽出した正常
なヒト組織調製物に対して実施したＣＡ ２２８ ＥＬ
ＩＳＡは、多量のＮＣＡ５０／９０（組織１mgあたり）
を肺の中で同定し、より少量のＮＣＡ５０／９０を脾
臓、肝臓、結腸、胎盤、心臓および乳房の組織中で同定
した。これらの組織調製物中の特異性ＮＣＡ５０／９０
糖形態の発現を、Affigel 10に接合した抗ＮＣＡ５０／
９０特異性ＭＡｂ（ＭＡｂ２２８）を用いる免疫沈降お
よび、エレクトロブロッティングののち、ポリクローナ
ルウサギ抗ＣＥＡ抗血清を用いる検出によって測定し
た。正常な肺、脾臓、肝臓、結腸および胎盤の抽出物
は、ＮＣＡ５０／９０の両糖形態を発現した。白血病ま
たは乳がん、肺がんもしくは結腸がんの患者４８人の血
清のＭＡｂ２２８−Affigel 免疫沈降は、すべての試料
において９０kDa 糖形態の存在のみを検出した。さらに
は、感染性または非悪性疾病患者７人および正常な被検
者１０人の血清中で、免疫沈降によってＮＣＡ９０だけ
が検出された。免疫沈降させたすべての患者試料におい
て、免疫沈降によって同定された９０kDa 糖形態の量
が、ＥＬＩＳＡによって測定された全ＮＣＡ５０／９０
の血清レベルと正相関していた。
な組織、正常な血清、がん患者の血清および非悪性疾病
患者の血清中にＮＣＡ５０／９０のどちらの糖形態が存
在するかを決定するための研究を実施した。以下の実施
例にさらに詳細に報告するように、正常な組織中ではＮ
ＣＡ５０／９０の両糖形態が発現するが、循環中には９
０kDa糖形態しか検出されない。アセトン抽出した正常
なヒト組織調製物に対して実施したＣＡ ２２８ ＥＬ
ＩＳＡは、多量のＮＣＡ５０／９０（組織１mgあたり）
を肺の中で同定し、より少量のＮＣＡ５０／９０を脾
臓、肝臓、結腸、胎盤、心臓および乳房の組織中で同定
した。これらの組織調製物中の特異性ＮＣＡ５０／９０
糖形態の発現を、Affigel 10に接合した抗ＮＣＡ５０／
９０特異性ＭＡｂ（ＭＡｂ２２８）を用いる免疫沈降お
よび、エレクトロブロッティングののち、ポリクローナ
ルウサギ抗ＣＥＡ抗血清を用いる検出によって測定し
た。正常な肺、脾臓、肝臓、結腸および胎盤の抽出物
は、ＮＣＡ５０／９０の両糖形態を発現した。白血病ま
たは乳がん、肺がんもしくは結腸がんの患者４８人の血
清のＭＡｂ２２８−Affigel 免疫沈降は、すべての試料
において９０kDa 糖形態の存在のみを検出した。さらに
は、感染性または非悪性疾病患者７人および正常な被検
者１０人の血清中で、免疫沈降によってＮＣＡ９０だけ
が検出された。免疫沈降させたすべての患者試料におい
て、免疫沈降によって同定された９０kDa 糖形態の量
が、ＥＬＩＳＡによって測定された全ＮＣＡ５０／９０
の血清レベルと正相関していた。
【００１６】ＮＣＡ５０／９０の９０kDa 糖形態のみが
循環中に見いだされるという発見は、血液中のＮＣＡ９
０糖形態の特異的測定により、悪性度の検出および監視
により高い感度および特異性を示すＮＣＡがんマーカー
検定の基礎を提供する。
循環中に見いだされるという発見は、血液中のＮＣＡ９
０糖形態の特異的測定により、悪性度の検出および監視
により高い感度および特異性を示すＮＣＡがんマーカー
検定の基礎を提供する。
【００１７】血液（例えば血清または血漿）ＮＣＡ９０
レベルの測定には本質的にいかなる方法を用いてもよ
い。通常、このような測定は、一方がＮＣＡ５０および
ＣＥＡファミリーの他の関連メンバー（例えばＮＣＡ９
５、ＣＥＡ、ＢＧＰ、ＰＳＧおよびＮＣＡ２）の除外に
対してＮＣＡ９０を認識し、他方がＮＣＡ９０と特異的
または非特異的に結合することができる２種の抗体試薬
を用いるサンドイッチ免疫検定法によって実施される。
検定の形式および必要な抗体試薬の調製方法は、当業者
が選択することができる。適当な抗体試薬は、標識、例
えば酵素標識することもできるし、固定化、例えばマイ
クロタイタ板上に被覆したり、プラスチックまたは磁気
のビーズまたは粒子に結合することもでき、全免疫グロ
ブリン、例えばＩｇＧもしくはＩｇＭまたはフラグメン
ト、例えばＦａｂ、Ｆａｂ′およびＦ（ａｂ′）2 フラ
グメントもしくはその集合体からなることができる。
レベルの測定には本質的にいかなる方法を用いてもよ
い。通常、このような測定は、一方がＮＣＡ５０および
ＣＥＡファミリーの他の関連メンバー（例えばＮＣＡ９
５、ＣＥＡ、ＢＧＰ、ＰＳＧおよびＮＣＡ２）の除外に
対してＮＣＡ９０を認識し、他方がＮＣＡ９０と特異的
または非特異的に結合することができる２種の抗体試薬
を用いるサンドイッチ免疫検定法によって実施される。
検定の形式および必要な抗体試薬の調製方法は、当業者
が選択することができる。適当な抗体試薬は、標識、例
えば酵素標識することもできるし、固定化、例えばマイ
クロタイタ板上に被覆したり、プラスチックまたは磁気
のビーズまたは粒子に結合することもでき、全免疫グロ
ブリン、例えばＩｇＧもしくはＩｇＭまたはフラグメン
ト、例えばＦａｂ、Ｆａｂ′およびＦ（ａｂ′）2 フラ
グメントもしくはその集合体からなることができる。
【００１８】好ましくは、ＮＣＡ９０特異性抗体試薬
は、当該技術で理解されているような適当な免疫原、例
えばＮＣＡ９０含有免疫原混合物、例えば精製した脾臓
抽出物もしくは腫瘍細胞；ＮＣＡ９０発現性トランスフ
ェクタント細胞系統（欧州特許公開第３４６，７０２号
公報）；従来の免疫原性担持分子に結合した合成ペプチ
ドを含み、そのぺプチドが、ＮＣＡ９０の独特のエピト
ープを包含するアミノ酸配列を有する免疫原接合体など
を用いる宿主動物の免疫化によって調製される。モノク
ローナル抗体を含む抗体試薬が一般に好ましい。
は、当該技術で理解されているような適当な免疫原、例
えばＮＣＡ９０含有免疫原混合物、例えば精製した脾臓
抽出物もしくは腫瘍細胞；ＮＣＡ９０発現性トランスフ
ェクタント細胞系統（欧州特許公開第３４６，７０２号
公報）；従来の免疫原性担持分子に結合した合成ペプチ
ドを含み、そのぺプチドが、ＮＣＡ９０の独特のエピト
ープを包含するアミノ酸配列を有する免疫原接合体など
を用いる宿主動物の免疫化によって調製される。モノク
ローナル抗体を含む抗体試薬が一般に好ましい。
【００１９】受け入れられる疾病診断および監視方法の
他のタイプと同様に、本発明の方法は、がんの診断を受
けたすべての患者に対して有効なわけではないことが理
解されよう。むしろ、医師はＮＣＡ９０の血中値を他の
診断値および臨床的観察結果と組み合わせて利用して、
がんの発症を診断し、さらには、個々の患者ごとに治療
の経路を考案する。また、ＮＣＡ９０の血中レベルの監
視が、個々の患者ごとの治療の経路の進行を監視するた
めの手段を提供すると考えられる。
他のタイプと同様に、本発明の方法は、がんの診断を受
けたすべての患者に対して有効なわけではないことが理
解されよう。むしろ、医師はＮＣＡ９０の血中値を他の
診断値および臨床的観察結果と組み合わせて利用して、
がんの発症を診断し、さらには、個々の患者ごとに治療
の経路を考案する。また、ＮＣＡ９０の血中レベルの監
視が、個々の患者ごとの治療の経路の進行を監視するた
めの手段を提供すると考えられる。
【００２０】
【実施例】次に、以下の実施例によって本発明を説明す
るが、これによって本発明を限定することはない。
るが、これによって本発明を限定することはない。
【００２１】実施例 材料および方法 抗体および精製タンパク質 モノクローナル抗体２２８．２（ＩｇＧ1 、ｋ）（ＡＴ
ＣＣＨＢ１１２０４）はＮＣＡ５０／９０に対して特異
性である。これは、ＣＥＡ、ＢＧＰ、ＮＣＡ９５または
ＰＳβＧとは交叉反応しない。この抗体の製造、精製お
よび特異性はすでに記載されている（文献２２）。Affi
gel への接合に使用されるクロマトグラフィー精製した
マウスＩｇＧは、Zymed Laboratories社（米国カリフォ
ルニア州サンフランシスコ）から購入した（カタログ番
号０２−６５０２）。ウエスタンブロットの第一の対照
抗体として使用したウサギＩｇＧ（カタログ番号Ｉ−５
００６）、ウエスタンブロットにおける免疫複合体を検
出するのに使用した、アルカリホスファターゼに接合し
たヤギ抗ウサギＩｇＧおよび市販のウエスタンブロット
における免疫複合体を検出するのに使用したヤギ抗マウ
スＩｇＧ−アルカリホスファターゼ接合体（カタログ番
号Ａ−１４１８）は、Sigma Chemical社（米国ミズーリ
州セントルイス）から購入した。ウエスタンブロットに
第一の抗体として使用した精製ウサギ抗ヒトＣＥＡは、
Dako社（米国カリフォルニア州Carpinteria ）から購入
した（コード番号Ａ−１１５）。
ＣＣＨＢ１１２０４）はＮＣＡ５０／９０に対して特異
性である。これは、ＣＥＡ、ＢＧＰ、ＮＣＡ９５または
ＰＳβＧとは交叉反応しない。この抗体の製造、精製お
よび特異性はすでに記載されている（文献２２）。Affi
gel への接合に使用されるクロマトグラフィー精製した
マウスＩｇＧは、Zymed Laboratories社（米国カリフォ
ルニア州サンフランシスコ）から購入した（カタログ番
号０２−６５０２）。ウエスタンブロットの第一の対照
抗体として使用したウサギＩｇＧ（カタログ番号Ｉ−５
００６）、ウエスタンブロットにおける免疫複合体を検
出するのに使用した、アルカリホスファターゼに接合し
たヤギ抗ウサギＩｇＧおよび市販のウエスタンブロット
における免疫複合体を検出するのに使用したヤギ抗マウ
スＩｇＧ−アルカリホスファターゼ接合体（カタログ番
号Ａ−１４１８）は、Sigma Chemical社（米国ミズーリ
州セントルイス）から購入した。ウエスタンブロットに
第一の抗体として使用した精製ウサギ抗ヒトＣＥＡは、
Dako社（米国カリフォルニア州Carpinteria ）から購入
した（コード番号Ａ−１１５）。
【００２２】患者試料 本実験に使用した正常な血清試料は、Bayer 社（米国ニ
ューヨーク州Tarrytown ）のDiagnostics Business Gro
upの健康な試験志願者および米国ニューヨーク州Valhal
laのHudson Valley Blood Service からの提供であっ
た。米国テキサス州ヒューストンのM. D. Anderson Can
cer CenterのHerbert Fritsche博士および米国コネチカ
ット州StamfordのDianon Systems社が、乳がん、肺がん
または結腸がんの患者から血清試料の提供があった。白
血病患者からの血清は、Oncology/Hematology Consulta
nts （米国テネシー州メンフィス）から得た。
ューヨーク州Tarrytown ）のDiagnostics Business Gro
upの健康な試験志願者および米国ニューヨーク州Valhal
laのHudson Valley Blood Service からの提供であっ
た。米国テキサス州ヒューストンのM. D. Anderson Can
cer CenterのHerbert Fritsche博士および米国コネチカ
ット州StamfordのDianon Systems社が、乳がん、肺がん
または結腸がんの患者から血清試料の提供があった。白
血病患者からの血清は、Oncology/Hematology Consulta
nts （米国テネシー州メンフィス）から得た。
【００２３】この実験に使用したすべてのがん患者試料
は、担当医師が診療および医療記録に基づいて疾病が活
性であると診断した患者から得た。
は、担当医師が診療および医療記録に基づいて疾病が活
性であると診断した患者から得た。
【００２４】組織抽出物の調製 アセトン抽出した凍結乾燥ヒト組織を、Calzyme Chemic
al Co.（米国カリフォルニア州San Luis Obispo ）から
得た。ヒト心臓組織は、American Biochemicals 社（米
国カリフォルニア州サンディエゴ）から購入した。アセ
トン粉末１００mgを、５０mM ＨＥＰＥＳ（pH７．
４）、０．２％ＮＰ−４０、０．５mM pefablock （Bo
ehringer Mannheim 社、米国インディアナ州インディア
ナポリス）（カタログ番号１４２９−８６８）、１μM
ロイペプチン（Boehringer Mannheim社、カタログ番号
１０１７−１０１）、１μM ペプスタチン（Boehringer
Mannheim 社、カタログ番号６００−１６０）および１
mM ＥＤＴＡからなる低温の均質化緩衝剤５mlに溶解し
た。次いで、溶液が均質になるまで粉末を氷上でpolytr
on均質化した（約２〜４分）。さらに５分間インキュベ
ートしたのち、ホモジネートを５，０００rpm および４
℃で５分間遠心した。上澄み液を捕集し、アリコート
し、−８０℃で貯蔵した。Pierce社のＢＣＡタンパク質
検定を製造業者（Pierce社、米国イリノイ州Rockford）
の指示にしたがって使用して、組織ホモジネート中の全
タンパク質を測定した。
al Co.（米国カリフォルニア州San Luis Obispo ）から
得た。ヒト心臓組織は、American Biochemicals 社（米
国カリフォルニア州サンディエゴ）から購入した。アセ
トン粉末１００mgを、５０mM ＨＥＰＥＳ（pH７．
４）、０．２％ＮＰ−４０、０．５mM pefablock （Bo
ehringer Mannheim 社、米国インディアナ州インディア
ナポリス）（カタログ番号１４２９−８６８）、１μM
ロイペプチン（Boehringer Mannheim社、カタログ番号
１０１７−１０１）、１μM ペプスタチン（Boehringer
Mannheim 社、カタログ番号６００−１６０）および１
mM ＥＤＴＡからなる低温の均質化緩衝剤５mlに溶解し
た。次いで、溶液が均質になるまで粉末を氷上でpolytr
on均質化した（約２〜４分）。さらに５分間インキュベ
ートしたのち、ホモジネートを５，０００rpm および４
℃で５分間遠心した。上澄み液を捕集し、アリコート
し、−８０℃で貯蔵した。Pierce社のＢＣＡタンパク質
検定を製造業者（Pierce社、米国イリノイ州Rockford）
の指示にしたがって使用して、組織ホモジネート中の全
タンパク質を測定した。
【００２５】ＮＣＡ５０／９０ＥＬＩＳＡ ＮＣＡ５０／９０ＥＬＩＳＡ（ＣＡ ２２８と呼ぶ）を
前記（２３）のように実施した。簡潔に述べると、９６
ウェルのImmulon プレート（Dynatech社、米国バージニ
ア州Chantilly ）４枚に、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3 中５
μg/mlのＭＡｂ２２８．２（pH９．０）をウェルあたり
５０μl 塗布し、４℃で一夜インキュベートした。次
に、２５mM トリス（pH７．５）、１５０mM ＮａＣ
ｌ、０．０５％ Tween-20、０．１％ ＮａＮ3 （ＴＢ
ＳＴ）および５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、画分
Ｖ、Sigma 社、カタログ番号Ａ−７０３０）を含有する
緩衝剤をウェルあたり２００μl 添加することにより、
ウェル中の未反応のサイトをブロックした。プレートを
３７℃で１時間ブロックした。プレートをＴＢＳＴで６
回洗浄し、２５mM ＨＥＰＥＳ（pH７．０）、２５０mM
ＮａＣｌ、１００μg/mlマウスＩｇＧ、２．５％ＢＳ
Ａ、５０μg/mlゲンタマイシンおよび０．１％ＮａＮ3
（試料希釈剤）中で１：５１に希釈したＮＣＡ５０／９
０検定溶液の患者試料５０μl を各ウェルに加えた。次
に、プレートを３７℃で２時間インキュベートした。洗
浄したのち、５０mM ＨＥＰＥＳ（pH７．０）、１５０
mM ＮａＣｌ、１mM ＭｇＣｌ6 ・Ｈ2 Ｏ、０．１mM
ＺｎＣｌ2 、１％ＢＳＡ、５０μg/ml ゲンタマイシン
および０．１％ＮａＮ3 （接合体希釈剤）中で２．５μ
g/mlに希釈したヤギ抗ＣＥＡ−アルカリホスファターゼ
接合体の溶液５０μl を各ウェルに加えた。３７℃で１
時間インキュベートし、ＴＢＳＴ中で洗浄したのち、１
Ｘジエタノールアミン基質緩衝剤中リン酸ｐ−ニトロフ
ェニル（Pierce社、カタログ番号３４０７４）１mg/ml
の溶液５０μl を各ウェルに加え、３７℃で３０分間イ
ンキュベートした。１Ｎ ＮａＯＨ１００μl を各ウェ
ルに加えることによって反応を終了させた。Thermomax
マイクロプレートリーダ（Molecular Devices 社、米国
カリフォルニア州Sunnyvale ）を用いて、４０５nmでの
吸光度マイナス４９０nmでの吸光度を測定した。非線形
スプライン曲線あてはめプログラムを使用する、検定標
準曲線との比較により、各試料中のＮＣＡ５０／９０の
量を測定した。
前記（２３）のように実施した。簡潔に述べると、９６
ウェルのImmulon プレート（Dynatech社、米国バージニ
ア州Chantilly ）４枚に、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3 中５
μg/mlのＭＡｂ２２８．２（pH９．０）をウェルあたり
５０μl 塗布し、４℃で一夜インキュベートした。次
に、２５mM トリス（pH７．５）、１５０mM ＮａＣ
ｌ、０．０５％ Tween-20、０．１％ ＮａＮ3 （ＴＢ
ＳＴ）および５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、画分
Ｖ、Sigma 社、カタログ番号Ａ−７０３０）を含有する
緩衝剤をウェルあたり２００μl 添加することにより、
ウェル中の未反応のサイトをブロックした。プレートを
３７℃で１時間ブロックした。プレートをＴＢＳＴで６
回洗浄し、２５mM ＨＥＰＥＳ（pH７．０）、２５０mM
ＮａＣｌ、１００μg/mlマウスＩｇＧ、２．５％ＢＳ
Ａ、５０μg/mlゲンタマイシンおよび０．１％ＮａＮ3
（試料希釈剤）中で１：５１に希釈したＮＣＡ５０／９
０検定溶液の患者試料５０μl を各ウェルに加えた。次
に、プレートを３７℃で２時間インキュベートした。洗
浄したのち、５０mM ＨＥＰＥＳ（pH７．０）、１５０
mM ＮａＣｌ、１mM ＭｇＣｌ6 ・Ｈ2 Ｏ、０．１mM
ＺｎＣｌ2 、１％ＢＳＡ、５０μg/ml ゲンタマイシン
および０．１％ＮａＮ3 （接合体希釈剤）中で２．５μ
g/mlに希釈したヤギ抗ＣＥＡ−アルカリホスファターゼ
接合体の溶液５０μl を各ウェルに加えた。３７℃で１
時間インキュベートし、ＴＢＳＴ中で洗浄したのち、１
Ｘジエタノールアミン基質緩衝剤中リン酸ｐ−ニトロフ
ェニル（Pierce社、カタログ番号３４０７４）１mg/ml
の溶液５０μl を各ウェルに加え、３７℃で３０分間イ
ンキュベートした。１Ｎ ＮａＯＨ１００μl を各ウェ
ルに加えることによって反応を終了させた。Thermomax
マイクロプレートリーダ（Molecular Devices 社、米国
カリフォルニア州Sunnyvale ）を用いて、４０５nmでの
吸光度マイナス４９０nmでの吸光度を測定した。非線形
スプライン曲線あてはめプログラムを使用する、検定標
準曲線との比較により、各試料中のＮＣＡ５０／９０の
量を測定した。
【００２６】マウスＩｇＧおよびＭＡｂ２２８のAffige
l 10への接合 精製したマウスＩｇＧ（Zymed Laboratories社、カタロ
グ番号０２−６５０２）およびＭＡｂ２２８を０．１Ｍ
ＨＥＰＥＳ（pH８．０）中で１．５mg/ml の濃度に希
釈した。タンパク質測定のために各溶液から少量のアリ
コートを採取した。Affigel 10（BioRad Laboratories
社、米国カリフォルニア州Richmond、カタログ番号１５
３−６０４６）約２mlを２本のポリプロピレン１２×７
５キャップ付き培養管のぞれぞれに入れ、低温の脱イオ
ン水中、５０００rpm および４℃で３分間遠心すること
により、３回洗浄した。最初の遠心ののち、Affigel 溶
液を加えるか、管から取り出すかして、各管に充満した
ゲル約１．０mlを得た。最後の洗浄ののち、Affigel ペ
レットから上澄み液を取り出した。１．５mg／ml抗体溶
液２ml（３．０mg）を充満したAffigel １．０mlに加え
ることにより、接合を実施した。穏やかに撹拌すること
によってAffigel を抗体溶液に再懸濁させ、４℃で４時
間揺動した。接合インキューベートののち、各管を２５
００rpm および４℃で５分間遠心して、ＩｇＧ−Affige
l 接合体をペレット化した。タンパク質測定のために上
澄み液の少量のアリコートを採取した。ＩｇＧ−Affige
l 接合体を再懸濁させ、４℃で貯蔵した。接合前アリコ
ート中のタンパク質の量マイナス接合後抗体溶液中のタ
ンパク質の量をＢＣＡタンパク質検定（Pierce社）で定
量することにより、Affigel に接合した抗体の量を測定
した。通常、この接合プロトコルの結果、ゲル１mlあた
り１．２５〜１．５mgのＡｂが得られた。
l 10への接合 精製したマウスＩｇＧ（Zymed Laboratories社、カタロ
グ番号０２−６５０２）およびＭＡｂ２２８を０．１Ｍ
ＨＥＰＥＳ（pH８．０）中で１．５mg/ml の濃度に希
釈した。タンパク質測定のために各溶液から少量のアリ
コートを採取した。Affigel 10（BioRad Laboratories
社、米国カリフォルニア州Richmond、カタログ番号１５
３−６０４６）約２mlを２本のポリプロピレン１２×７
５キャップ付き培養管のぞれぞれに入れ、低温の脱イオ
ン水中、５０００rpm および４℃で３分間遠心すること
により、３回洗浄した。最初の遠心ののち、Affigel 溶
液を加えるか、管から取り出すかして、各管に充満した
ゲル約１．０mlを得た。最後の洗浄ののち、Affigel ペ
レットから上澄み液を取り出した。１．５mg／ml抗体溶
液２ml（３．０mg）を充満したAffigel １．０mlに加え
ることにより、接合を実施した。穏やかに撹拌すること
によってAffigel を抗体溶液に再懸濁させ、４℃で４時
間揺動した。接合インキューベートののち、各管を２５
００rpm および４℃で５分間遠心して、ＩｇＧ−Affige
l 接合体をペレット化した。タンパク質測定のために上
澄み液の少量のアリコートを採取した。ＩｇＧ−Affige
l 接合体を再懸濁させ、４℃で貯蔵した。接合前アリコ
ート中のタンパク質の量マイナス接合後抗体溶液中のタ
ンパク質の量をＢＣＡタンパク質検定（Pierce社）で定
量することにより、Affigel に接合した抗体の量を測定
した。通常、この接合プロトコルの結果、ゲル１mlあた
り１．２５〜１．５mgのＡｂが得られた。
【００２７】免疫沈降法 免疫沈降の前に、組織モホジネートを、１００mM Ｎａ
Ｈ2 ＰＯ4 （pH７．４）、５００mM ＮａＣｌおよび２
％Chaps 洗浄剤（Sigma Chemical社）を含有する試料希
釈溶液中で１．７mg／mlに希釈した。筋肉（１．２mg／
ml）および脳（０．８mg／ml）の組織調製物は、希釈せ
ずに使用した。ＩｇＧ−Affigel ビーズを、ＰＢＳ中、
２５００rpm で３〜５分間遠心することにより、３回洗
浄した。ペレット化したゲルを等量のＰＢＳに再懸濁さ
せて５０％の最終濃度にした。ＭＡｂ２２８−Affigel
接合体および対照マウスＩｇＧ−Affigel 接合体の両方
を用いて各試料および組織ホモジネートを免疫沈降させ
た。未希釈の患者血清または希釈した組織ホモジネート
５０μl 、試料希釈剤５０μl および５０％ＩｇＧ−Af
figel スラリー３０μl を１．５mlのEppendorf 遠心管
に加えることによって免疫沈降を実施した。穏やかに揺
動しながら４℃で４時間インキュベートしたのち、沈殿
物を、１００mM ＮａＨ2 ＰＯ4 （pH７．４）、０．１
％ＳＤＳ、３００mM ＮａＣｌおよび２％Chaps を含有
する洗浄緩衝剤０．５ml中で３回洗浄した。最後の洗浄
ののち、免疫沈殿物を、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）
を含有しない２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝剤（以下を
参照）２５μl 中に再懸濁させた。試料を−２０℃で貯
蔵した。
Ｈ2 ＰＯ4 （pH７．４）、５００mM ＮａＣｌおよび２
％Chaps 洗浄剤（Sigma Chemical社）を含有する試料希
釈溶液中で１．７mg／mlに希釈した。筋肉（１．２mg／
ml）および脳（０．８mg／ml）の組織調製物は、希釈せ
ずに使用した。ＩｇＧ−Affigel ビーズを、ＰＢＳ中、
２５００rpm で３〜５分間遠心することにより、３回洗
浄した。ペレット化したゲルを等量のＰＢＳに再懸濁さ
せて５０％の最終濃度にした。ＭＡｂ２２８−Affigel
接合体および対照マウスＩｇＧ−Affigel 接合体の両方
を用いて各試料および組織ホモジネートを免疫沈降させ
た。未希釈の患者血清または希釈した組織ホモジネート
５０μl 、試料希釈剤５０μl および５０％ＩｇＧ−Af
figel スラリー３０μl を１．５mlのEppendorf 遠心管
に加えることによって免疫沈降を実施した。穏やかに揺
動しながら４℃で４時間インキュベートしたのち、沈殿
物を、１００mM ＮａＨ2 ＰＯ4 （pH７．４）、０．１
％ＳＤＳ、３００mM ＮａＣｌおよび２％Chaps を含有
する洗浄緩衝剤０．５ml中で３回洗浄した。最後の洗浄
ののち、免疫沈殿物を、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）
を含有しない２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝剤（以下を
参照）２５μl 中に再懸濁させた。試料を−２０℃で貯
蔵した。
【００２８】電気泳動およびエレクトロブロッティング 本質的にすでに記載された（文献２６，２７）ようにし
て電気泳動およびウエスタンブロッティングを実施し
た。精製したタンパク質または免疫沈降物を、１９０mM
トリス（pH６．８）、４％ＳＤＳ、２mM ＥＤＴＡ、２
０％グリセロールおよび０．００４％ブロモフェノール
ブルーを含有する等量の２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝
剤に溶解し、水浴中で５分間煮沸した。４〜２０％の勾
配のゲル（Daiichi-Enprotech 、米国マサチューセッツ
州Natick）上、ゲルあたり２５〜４０mAで３〜４時間電
気泳動を実施した。半乾燥エレクトロブロッティング装
置（Integrated Separations Systems-Enprotech、米国
マサチューセッツ州Natick）およびＩＳＳタンパク質エ
レクトロブロッティング緩衝剤（Integrated Separatio
ns Systems-Enprotech、カタログ番号ＳＳ１１０２０
４）を使用して、０．２ミクロンＰＶＤＦ膜（BioRad）
上にタンパク質をエレクトロブロットした。膜１cm2 あ
たり１mAの定電圧で４５分間エレクトロブロッティング
を実施した。次に、ブロットした膜を、３％ＢＳＡを含
有するＰＢＳ、１μg/mlのウサギＩｇＧもしくはウサギ
抗ヒトＣＥＡ（第一の抗体）および１：５０００に希釈
したヤギ抗ウサギＩｇＧ−アルカリホスファターゼで順
次に処理した。５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイ
ルホスフェートおよびニトロブルーテトラゾリウム（Ｂ
ＣＩＰ−ＮＢＴ、Sigma 社、カタログ番号Ｂ−５６５
５）を製造業者の指示どおりに添加することにより、結
合した免疫複合体を視覚化した。
て電気泳動およびウエスタンブロッティングを実施し
た。精製したタンパク質または免疫沈降物を、１９０mM
トリス（pH６．８）、４％ＳＤＳ、２mM ＥＤＴＡ、２
０％グリセロールおよび０．００４％ブロモフェノール
ブルーを含有する等量の２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝
剤に溶解し、水浴中で５分間煮沸した。４〜２０％の勾
配のゲル（Daiichi-Enprotech 、米国マサチューセッツ
州Natick）上、ゲルあたり２５〜４０mAで３〜４時間電
気泳動を実施した。半乾燥エレクトロブロッティング装
置（Integrated Separations Systems-Enprotech、米国
マサチューセッツ州Natick）およびＩＳＳタンパク質エ
レクトロブロッティング緩衝剤（Integrated Separatio
ns Systems-Enprotech、カタログ番号ＳＳ１１０２０
４）を使用して、０．２ミクロンＰＶＤＦ膜（BioRad）
上にタンパク質をエレクトロブロットした。膜１cm2 あ
たり１mAの定電圧で４５分間エレクトロブロッティング
を実施した。次に、ブロットした膜を、３％ＢＳＡを含
有するＰＢＳ、１μg/mlのウサギＩｇＧもしくはウサギ
抗ヒトＣＥＡ（第一の抗体）および１：５０００に希釈
したヤギ抗ウサギＩｇＧ−アルカリホスファターゼで順
次に処理した。５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイ
ルホスフェートおよびニトロブルーテトラゾリウム（Ｂ
ＣＩＰ−ＮＢＴ、Sigma 社、カタログ番号Ｂ−５６５
５）を製造業者の指示どおりに添加することにより、結
合した免疫複合体を視覚化した。
【００２９】Pharmacia LKB UltroScan XL走査比重計を
用いて膜のバンド染色強度（ピーク面積）を測定した。
用いて膜のバンド染色強度（ピーク面積）を測定した。
【００３０】ＮＣＡ９０の定量 試料のＮＣＡ９０ピーク区域を、既知のＮＣＡ９０濃度
の肺組織ホモジネートの連続希釈溶液の場合の標準曲線
と比較することにより、患者血清５０μl 中に存在する
ＮＣＡ９０の量を測定した。簡潔に述べると、免疫沈降
させていない肺組織ホモジネート（ＣＡ ２２８ ＥＬ
ＩＳＡによる測定でＮＣＡ５０／９０濃度が既知のも
の）の連続希釈溶液を電気泳動に付し、前記のようにＰ
ＶＤＦ膜の上に免疫ブロットした。組織希釈溶液の全Ｎ
ＣＡ５０／９０濃度に、ＮＣＡ９０である全ＮＣＡ５０
／９０の％値（ブロットの比重測定走査から得た）を乗
じることにより、各肺組織希釈溶液中のＮＣＡ９０濃度
を測定した。そして、ＮＣＡ９０ピーク面積に対してプ
ロットしたＮＣＡ９０濃度のログを使用して標準曲線を
構成した（代表的な標準曲線を図３に示す）。次に、Ｎ
ＣＡ９０ピーク面積を標準曲線と比較することにより、
患者血清試料５０μl 中のＮＣＡ９０の量を定量化し
た。結果に２０を乗じて、血清１mlあたりのＮＣＡ９０
の濃度を測定し、その結果を１mlあたりのＮＣＡ９０の
ngとして記録した。
の肺組織ホモジネートの連続希釈溶液の場合の標準曲線
と比較することにより、患者血清５０μl 中に存在する
ＮＣＡ９０の量を測定した。簡潔に述べると、免疫沈降
させていない肺組織ホモジネート（ＣＡ ２２８ ＥＬ
ＩＳＡによる測定でＮＣＡ５０／９０濃度が既知のも
の）の連続希釈溶液を電気泳動に付し、前記のようにＰ
ＶＤＦ膜の上に免疫ブロットした。組織希釈溶液の全Ｎ
ＣＡ５０／９０濃度に、ＮＣＡ９０である全ＮＣＡ５０
／９０の％値（ブロットの比重測定走査から得た）を乗
じることにより、各肺組織希釈溶液中のＮＣＡ９０濃度
を測定した。そして、ＮＣＡ９０ピーク面積に対してプ
ロットしたＮＣＡ９０濃度のログを使用して標準曲線を
構成した（代表的な標準曲線を図３に示す）。次に、Ｎ
ＣＡ９０ピーク面積を標準曲線と比較することにより、
患者血清試料５０μl 中のＮＣＡ９０の量を定量化し
た。結果に２０を乗じて、血清１mlあたりのＮＣＡ９０
の濃度を測定し、その結果を１mlあたりのＮＣＡ９０の
ngとして記録した。
【００３１】結果 正常な組織におけるＮＣＡ５０／９０の発現 広範囲な生化学的特性決定にもかかわらず、主としてＮ
ＣＡ５０／９０特異性試薬の欠如により、ＮＣＡ５０／
９０正常な組織発現についてはほとんど知られていな
い。正常組織におけるＮＣＡ５０／９０の発現を検査す
るため、ＥＬＩＳＡ検定（ＣＡ ２２８ ＥＬＩＳＡ）
および免疫沈降プロトコルの両方を用いた。両方法と
も、グリコシル化ＮＣＡ５０およびＮＣＡ９０遺伝子産
物のいずれに対して特異的であり、他のＣＥＡ遺伝子フ
ァミリーメンバーと交叉反応しないモノクロナール抗体
ＭＡｂ２２８（文献２２）を使用する。ＣＡ ２２８
ＥＬＩＳＡを使用して、肺、脾臓、肝臓、結腸、胎盤、
心臓のアセトン粉末抽出物および乳房組織のホモジネー
ト中にＮＣＡ５０／９０を検出した。筋肉および脳組織
抽出物中にはＮＣＡ５０／９０は検出されなかった（図
１）。興味深いことに、ＮＣＡ５０／９０は筋肉組織中
には見いだされず、心臓組織抽出物中に検出された。さ
らには、脾臓は、他の器官の大部分よりも多量のＮＣＡ
５０／９０をタンパク質１mgあたり含有することがわか
った。これらの発見の両方に可能な説明は、心臓および
脾臓の組織中に検出されるＮＣＡ５０／９０が、ＮＣＡ
５０／９０を発現することが知られる、組織の処理の際
にそれらの器官中に存在していた血液中の顆粒球（文献
２３、２８〜３０）から誘導されるということである。
図１の表に示すＥＬＩＳＡの結果は、肺、脾臓および肝
臓の組織が最も多量の全ＮＣＡ５０／９０を組織タンパ
ク質１mgあたり含有するということを実証する。
ＣＡ５０／９０特異性試薬の欠如により、ＮＣＡ５０／
９０正常な組織発現についてはほとんど知られていな
い。正常組織におけるＮＣＡ５０／９０の発現を検査す
るため、ＥＬＩＳＡ検定（ＣＡ ２２８ ＥＬＩＳＡ）
および免疫沈降プロトコルの両方を用いた。両方法と
も、グリコシル化ＮＣＡ５０およびＮＣＡ９０遺伝子産
物のいずれに対して特異的であり、他のＣＥＡ遺伝子フ
ァミリーメンバーと交叉反応しないモノクロナール抗体
ＭＡｂ２２８（文献２２）を使用する。ＣＡ ２２８
ＥＬＩＳＡを使用して、肺、脾臓、肝臓、結腸、胎盤、
心臓のアセトン粉末抽出物および乳房組織のホモジネー
ト中にＮＣＡ５０／９０を検出した。筋肉および脳組織
抽出物中にはＮＣＡ５０／９０は検出されなかった（図
１）。興味深いことに、ＮＣＡ５０／９０は筋肉組織中
には見いだされず、心臓組織抽出物中に検出された。さ
らには、脾臓は、他の器官の大部分よりも多量のＮＣＡ
５０／９０をタンパク質１mgあたり含有することがわか
った。これらの発見の両方に可能な説明は、心臓および
脾臓の組織中に検出されるＮＣＡ５０／９０が、ＮＣＡ
５０／９０を発現することが知られる、組織の処理の際
にそれらの器官中に存在していた血液中の顆粒球（文献
２３、２８〜３０）から誘導されるということである。
図１の表に示すＥＬＩＳＡの結果は、肺、脾臓および肝
臓の組織が最も多量の全ＮＣＡ５０／９０を組織タンパ
ク質１mgあたり含有するということを実証する。
【００３２】正常な組織中に発現するＮＣＡ５０／９０
の特定の糖形態を検出するため、ＭＡｂ２２８−Affige
l またはマウスＩｇＧ−Affigel （対照）を用いてアセ
トン粉末抽出物および乳房組織ホモジネートの調製物を
免疫沈降させたたのち、電気泳動を実施し、ウサギ抗Ｃ
ＥＡまたはウサギＩｇＧ抗体調製物（対照）のいずれか
を用いて免疫ブロットした。
の特定の糖形態を検出するため、ＭＡｂ２２８−Affige
l またはマウスＩｇＧ−Affigel （対照）を用いてアセ
トン粉末抽出物および乳房組織ホモジネートの調製物を
免疫沈降させたたのち、電気泳動を実施し、ウサギ抗Ｃ
ＥＡまたはウサギＩｇＧ抗体調製物（対照）のいずれか
を用いて免疫ブロットした。
【００３３】組織抽出物またはホモジネートからのＮＣ
Ａ５０／９０免疫沈降の結果を図１の表にまとめる。
肺、脾臓、肝臓、結腸および胎盤は、ＮＣＡ５０／９０
の両方の糖形態を発現した。心臓および乳房の組織はＮ
ＣＡ９０のみを発現したが、筋肉および脳は、かろうじ
て検出可能な量のＮＣＡ９０しか有していなかった。心
臓、乳房、筋肉および脳の組織中にＮＣＡ５０を検出で
きないことは、これらの組織中のこの糖形態の欠如を意
味するか、そうでなければ、免疫沈降によるＮＣＡ５０
検出の感度限界が組織タンパク質１mgあたり全ＮＣＡ５
０／９０約１０ngであることを示唆している。
Ａ５０／９０免疫沈降の結果を図１の表にまとめる。
肺、脾臓、肝臓、結腸および胎盤は、ＮＣＡ５０／９０
の両方の糖形態を発現した。心臓および乳房の組織はＮ
ＣＡ９０のみを発現したが、筋肉および脳は、かろうじ
て検出可能な量のＮＣＡ９０しか有していなかった。心
臓、乳房、筋肉および脳の組織中にＮＣＡ５０を検出で
きないことは、これらの組織中のこの糖形態の欠如を意
味するか、そうでなければ、免疫沈降によるＮＣＡ５０
検出の感度限界が組織タンパク質１mgあたり全ＮＣＡ５
０／９０約１０ngであることを示唆している。
【００３４】がん患者血清中のＮＣＡ５０／９０の発現 ＭＡｂ２２８免疫沈降実験は、正常な肺、脾臓、肝臓、
結腸および胎盤の組織抽出物中でのＮＣＡ５０および９
０の両糖形態の発現を実証したが、心臓、乳房、筋肉お
よび脳の組織中にはＮＣＡ９０だけが見いだされた。が
ん患者の血清中に見いだされるＮＣＡ５０／９０の糖形
態を決定するため、肺がん患者１２人、結腸がん患者１
３人、乳がん患者１２人および白血病患者１１人からの
血清を、マウスＩｇＧ−Affigel （対照として）または
ＭＡｂ２２８−Affigel によって免疫沈降させたのち、
ウサギＩｇＧ（対照）またはウサギ抗ＣＥＡ抗体のいず
れかで免疫検出した。図２の表に示すように、試験した
がん患者試料の１００％（４８／４８）が彼らの血清中
で９０kDa 糖形態のみを発現した。免疫ブロット染色の
強さによって決まる患者血清からのＮＣＡ９０の半定量
的免疫沈降は、ＥＬＩＳＡによって測定された血清中の
全ＮＣＡ５０／９０のレベル（データは提示せず）と正
相関していた。血清中のＮＣＡ９０発現の排他性は、全
ＮＣＡ５０／９０の血清濃度にかかわらず確認された。
臨床的に高い濃度（＞３５ng/ml ）または低い濃度（＜
３５ng/ml ）のＮＣＡ５０／９０を含む試料は、９０kD
a の糖形態のみを発現した。
結腸および胎盤の組織抽出物中でのＮＣＡ５０および９
０の両糖形態の発現を実証したが、心臓、乳房、筋肉お
よび脳の組織中にはＮＣＡ９０だけが見いだされた。が
ん患者の血清中に見いだされるＮＣＡ５０／９０の糖形
態を決定するため、肺がん患者１２人、結腸がん患者１
３人、乳がん患者１２人および白血病患者１１人からの
血清を、マウスＩｇＧ−Affigel （対照として）または
ＭＡｂ２２８−Affigel によって免疫沈降させたのち、
ウサギＩｇＧ（対照）またはウサギ抗ＣＥＡ抗体のいず
れかで免疫検出した。図２の表に示すように、試験した
がん患者試料の１００％（４８／４８）が彼らの血清中
で９０kDa 糖形態のみを発現した。免疫ブロット染色の
強さによって決まる患者血清からのＮＣＡ９０の半定量
的免疫沈降は、ＥＬＩＳＡによって測定された血清中の
全ＮＣＡ５０／９０のレベル（データは提示せず）と正
相関していた。血清中のＮＣＡ９０発現の排他性は、全
ＮＣＡ５０／９０の血清濃度にかかわらず確認された。
臨床的に高い濃度（＞３５ng/ml ）または低い濃度（＜
３５ng/ml ）のＮＣＡ５０／９０を含む試料は、９０kD
a の糖形態のみを発現した。
【００３５】非悪性疾病の患者の血清におけるＮＣＡ５
０／９０の発現 がん患者血清からのＮＣＡ５０／９０糖形態の免疫沈降
は、患者の血清中の９０kDa 糖形態のみの存在を明らか
にした。感染性かつ非悪性の疾病の患者の血清中に存在
するＮＣＡ５０／９０種を検査するため、Ａ型肝炎ウイ
ルス感染、Ｂ型肝炎ウイルス感染、肝硬変、大腸炎およ
び肺の疾患をもつ患者からの血清を、マウスＩｇＧ−Af
figel およびＭＡｂ２２８−Affigel で免疫沈降させ
た。図２にまとめる結果は、これらの感染性かつ非悪性
の疾病の患者の血清中にＮＣＡ９０糖形態のみが検出さ
れることを明らかに実証する。この患者集団のＣＡ ２
２８ＥＬＩＳＡ値は、２７．６〜４９．３ng/ml の範囲
であった。二つの患者試料（いずれも肝炎患者）が、３
５ng/ml である正常値の上限を超える血清ＮＣＡ５０／
９０濃度を有していた。これらの試料の両方で、９０kD
a 糖形態のみが検出された。
０／９０の発現 がん患者血清からのＮＣＡ５０／９０糖形態の免疫沈降
は、患者の血清中の９０kDa 糖形態のみの存在を明らか
にした。感染性かつ非悪性の疾病の患者の血清中に存在
するＮＣＡ５０／９０種を検査するため、Ａ型肝炎ウイ
ルス感染、Ｂ型肝炎ウイルス感染、肝硬変、大腸炎およ
び肺の疾患をもつ患者からの血清を、マウスＩｇＧ−Af
figel およびＭＡｂ２２８−Affigel で免疫沈降させ
た。図２にまとめる結果は、これらの感染性かつ非悪性
の疾病の患者の血清中にＮＣＡ９０糖形態のみが検出さ
れることを明らかに実証する。この患者集団のＣＡ ２
２８ＥＬＩＳＡ値は、２７．６〜４９．３ng/ml の範囲
であった。二つの患者試料（いずれも肝炎患者）が、３
５ng/ml である正常値の上限を超える血清ＮＣＡ５０／
９０濃度を有していた。これらの試料の両方で、９０kD
a 糖形態のみが検出された。
【００３６】正常な被検者の血清におけるＮＣＡ５０／
９０糖形態の発現 同様に、正常な被検者からの血清試料１０個をＭＡｂ２
２８媒介免疫沈降および免疫ブロッティングに付した。
試験したすべての正常な血清試料中にＮＣＡ９０糖形態
だけが検出された（図２）。これらの試料のＣＡ ２２
８ ＥＬＩＳＡ値は１３．４〜４９．４ng/ml の範囲で
あった。患者３人は、３５ng/ml を超える濃度の血清Ｎ
ＣＡ５０／９０を有していた。３人とも、９０kDa 糖形
態のみを血清中に有していた。これらの結果は、正常な
被検者が、悪性疾病患者および非悪性疾病患者と同様
に、正常な肺、結腸および肝臓の組織中に５０kDa およ
び９０kDa の両糖形態を有するにもかかわらず、循環中
にＮＣＡ５０／９０の９０kDa 糖形態のみを有すること
を明らかに実証した。
９０糖形態の発現 同様に、正常な被検者からの血清試料１０個をＭＡｂ２
２８媒介免疫沈降および免疫ブロッティングに付した。
試験したすべての正常な血清試料中にＮＣＡ９０糖形態
だけが検出された（図２）。これらの試料のＣＡ ２２
８ ＥＬＩＳＡ値は１３．４〜４９．４ng/ml の範囲で
あった。患者３人は、３５ng/ml を超える濃度の血清Ｎ
ＣＡ５０／９０を有していた。３人とも、９０kDa 糖形
態のみを血清中に有していた。これらの結果は、正常な
被検者が、悪性疾病患者および非悪性疾病患者と同様
に、正常な肺、結腸および肝臓の組織中に５０kDa およ
び９０kDa の両糖形態を有するにもかかわらず、循環中
にＮＣＡ５０／９０の９０kDa 糖形態のみを有すること
を明らかに実証した。
【００３７】正常な個人ならびに結腸がん、肺がんおよ
び乳がんの患者の血清中のＮＣＡ９０の定量 正常な血清およびがん患者の血清中のＮＣＡ９０の定量
方法を開発した。この方法は、ＭＡｂ２２８−Affigel
接合体を用いる免疫沈降によって血清からＮＣＡ９０を
単離し、沈降物をＰＶＤＦ膜上にエレクトロブロット
し、ポリクロナールウサギ抗ＣＥＡ抗体調製物を用いて
移行した沈降物を検出し、確認されたＮＣＡ９０バンド
を比重測定走査することを含む。免疫沈降させたＮＣＡ
９０の定量は、免疫沈降させた試料のＮＣＡ９０ピーク
面積（膜の走査によって得た）を、既知のＮＣＡ９０濃
度の肺組織ホモジネートの連続希釈溶液から導き出した
標準曲線と比較することによって実施した。ＮＣＡ９０
ピーク面積に対してＮＣＡ９０濃度を表す代表的な標準
曲線を図３に示す。
び乳がんの患者の血清中のＮＣＡ９０の定量 正常な血清およびがん患者の血清中のＮＣＡ９０の定量
方法を開発した。この方法は、ＭＡｂ２２８−Affigel
接合体を用いる免疫沈降によって血清からＮＣＡ９０を
単離し、沈降物をＰＶＤＦ膜上にエレクトロブロット
し、ポリクロナールウサギ抗ＣＥＡ抗体調製物を用いて
移行した沈降物を検出し、確認されたＮＣＡ９０バンド
を比重測定走査することを含む。免疫沈降させたＮＣＡ
９０の定量は、免疫沈降させた試料のＮＣＡ９０ピーク
面積（膜の走査によって得た）を、既知のＮＣＡ９０濃
度の肺組織ホモジネートの連続希釈溶液から導き出した
標準曲線と比較することによって実施した。ＮＣＡ９０
ピーク面積に対してＮＣＡ９０濃度を表す代表的な標準
曲線を図３に示す。
【００３８】ＮＣＡ９０免疫沈降−ウエスタンブロッテ
ィング技術を使用して、正常人１０名およびがん患者９
名（結腸がん４名、肺がん２名、乳がん３名）の血清中
のＮＣＡ９０濃度を測定し、これらの試料について測定
したＣＡ ２２８ ＥＬＩＳＡ値と比較した。免疫沈降
−ウエスタンブロッティングによる血清ＮＣＡ９０の定
量は、正常人およびがん患者の集団それぞれの場合で
０．７±０．４ng/ml （±１ＳＤ）および３．５±２．
４ng/ml の平均値を出した。これらの二つの患者集団に
ついてのＣＡ ２２８ ＥＬＩＳＡの結果は、２９．３
±１２．３ng/mlおよび３２９．４±２６４．９ng/ml
のＮＣＡ５０／９０の平均レベルを出した。この結果を
図４に示す。免疫沈降および免疫エレクトロブロッティ
ングは、患者血清中に存在する全ＮＣＡ９０の一部しか
検出しないが、図４に示す結果は、血清ＮＣＡ９０の特
異的定量が、全血清ＮＣＡ５０／９０を測定する場合よ
りも、正常な集団と悪性疾病の集団とを正しく区別する
ということを実証する。
ィング技術を使用して、正常人１０名およびがん患者９
名（結腸がん４名、肺がん２名、乳がん３名）の血清中
のＮＣＡ９０濃度を測定し、これらの試料について測定
したＣＡ ２２８ ＥＬＩＳＡ値と比較した。免疫沈降
−ウエスタンブロッティングによる血清ＮＣＡ９０の定
量は、正常人およびがん患者の集団それぞれの場合で
０．７±０．４ng/ml （±１ＳＤ）および３．５±２．
４ng/ml の平均値を出した。これらの二つの患者集団に
ついてのＣＡ ２２８ ＥＬＩＳＡの結果は、２９．３
±１２．３ng/mlおよび３２９．４±２６４．９ng/ml
のＮＣＡ５０／９０の平均レベルを出した。この結果を
図４に示す。免疫沈降および免疫エレクトロブロッティ
ングは、患者血清中に存在する全ＮＣＡ９０の一部しか
検出しないが、図４に示す結果は、血清ＮＣＡ９０の特
異的定量が、全血清ＮＣＡ５０／９０を測定する場合よ
りも、正常な集団と悪性疾病の集団とを正しく区別する
ということを実証する。
【００３９】本発明者の研究の重要な発見は、循環中の
ＮＣＡ５０／９０の９０kDa 糖形態のみの検出である。
悪性疾病患者、非悪性疾病患者、感染性疾病患者および
正常人の血清のＭＡｂ２２８−Affigel 免疫沈降の結
果、試験した各試料中でＮＣＡ９０が排他的に検出され
た。ＮＣＡ５０／９０の高い全血清レベルをもつ肺が
ん、肝臓がんおよび結腸がんの患者は、血清中にＮＣＡ
９０のみを有していた。組織の多大な損傷を伴う肝炎お
よび肝硬変の患者もまた、循環中にＮＣＡ９０のみを有
していた。正常な血清中の低い量のＮＣＡ９０およびが
ん患者の血清中の高い量のＮＣＡ９０の排他的検出を説
明づけるかもしれない興味深い生物学的仮説がいくつか
存在する。ＮＣＡ５０／９０産生細胞は、宿主（顆粒球
および／または正常組織）であろうと腫瘍細胞であろう
と、ＮＣＡ５０／９０の両方の糖形態を合成し、水疱の
表面に発現させ、分泌するが、循環中では、穏やかにグ
リコシル化されたＮＣＡ９０形態がタンパク分解的に開
裂するため、高度にグリコシル化されたＮＣＡ５０形態
だけが検出される。我々の研究室からの予備的な証拠
は、これが当てはまらないことを示唆する。市販の精製
された胎盤ＮＣＡ５０／９０を正常なヒト血清中に加え
たのち、ＭＡｂ−Affigel 免疫沈降を実施すると、ＮＣ
Ａ５０／９０の両方の糖形態が回収された（データは提
示せず）。あるいはまた、細胞は両方の糖形態を合成す
ることはできるが、９０kDa 形態だけが血漿膜の表面に
発現される。この仮説は、ＮＣＡ５０／９０遺伝子産物
のグリコシル化が、おそらくは、細胞もしくは膜水疱の
脂質二重層における糖タンパク質の正しい配向を保証す
ることにより、ポリペプチドの細胞限局化を指示するの
かもしれないことを意味する。第三の仮説として、ＮＣ
Ａ５０／９０の両糖形態が合成され、発現することがで
きるが、９０kDa 形態だけが細胞外に分泌（または放
出）される。この仮説は、グリコシル化が、おそらくは
細胞外グリコシルホスファチジルリパーゼの作用の促進
を介して、分泌／放出に対する重要な補助として機能す
ることを意味する。
ＮＣＡ５０／９０の９０kDa 糖形態のみの検出である。
悪性疾病患者、非悪性疾病患者、感染性疾病患者および
正常人の血清のＭＡｂ２２８−Affigel 免疫沈降の結
果、試験した各試料中でＮＣＡ９０が排他的に検出され
た。ＮＣＡ５０／９０の高い全血清レベルをもつ肺が
ん、肝臓がんおよび結腸がんの患者は、血清中にＮＣＡ
９０のみを有していた。組織の多大な損傷を伴う肝炎お
よび肝硬変の患者もまた、循環中にＮＣＡ９０のみを有
していた。正常な血清中の低い量のＮＣＡ９０およびが
ん患者の血清中の高い量のＮＣＡ９０の排他的検出を説
明づけるかもしれない興味深い生物学的仮説がいくつか
存在する。ＮＣＡ５０／９０産生細胞は、宿主（顆粒球
および／または正常組織）であろうと腫瘍細胞であろう
と、ＮＣＡ５０／９０の両方の糖形態を合成し、水疱の
表面に発現させ、分泌するが、循環中では、穏やかにグ
リコシル化されたＮＣＡ９０形態がタンパク分解的に開
裂するため、高度にグリコシル化されたＮＣＡ５０形態
だけが検出される。我々の研究室からの予備的な証拠
は、これが当てはまらないことを示唆する。市販の精製
された胎盤ＮＣＡ５０／９０を正常なヒト血清中に加え
たのち、ＭＡｂ−Affigel 免疫沈降を実施すると、ＮＣ
Ａ５０／９０の両方の糖形態が回収された（データは提
示せず）。あるいはまた、細胞は両方の糖形態を合成す
ることはできるが、９０kDa 形態だけが血漿膜の表面に
発現される。この仮説は、ＮＣＡ５０／９０遺伝子産物
のグリコシル化が、おそらくは、細胞もしくは膜水疱の
脂質二重層における糖タンパク質の正しい配向を保証す
ることにより、ポリペプチドの細胞限局化を指示するの
かもしれないことを意味する。第三の仮説として、ＮＣ
Ａ５０／９０の両糖形態が合成され、発現することがで
きるが、９０kDa 形態だけが細胞外に分泌（または放
出）される。この仮説は、グリコシル化が、おそらくは
細胞外グリコシルホスファチジルリパーゼの作用の促進
を介して、分泌／放出に対する重要な補助として機能す
ることを意味する。
【００４０】上記のように、本発明を詳細に説明し、例
示した。明らかに、本発明の真髄および範囲を逸するこ
となく、本発明に対して他にも多様な変形を加えること
ができる。
示した。明らかに、本発明の真髄および範囲を逸するこ
となく、本発明に対して他にも多様な変形を加えること
ができる。
【００４１】参照文献目録 １．Thomas, P., Toth, C. A., Saini, K. S., Jessup,
J. M.およびSteele,J.共著「がん胎児性抗原遺伝子フ
ァミリーの構造、代謝および機能」Biochim. et Biophy
s. Acta, 1032: 177, 1990 ２．Thompson, J. A., Grunert, F.およびZimmerman,
W. 共著「がん胎児性抗原遺伝子ファミリー：分子生物
学および臨床的展望」J. Clin. Lab. Anal., 5:344, 19
91 ３．Stanners, C. P., Rojas, M., Zhou, H., Fuks, A.
およびBeauchemin, N.共著「ＣＥＡファミリー：進化過
渡期における系か？」Int. J. Biological Markers, 7:
137, 1992 ４．Nagel, G. およびGrunert, F. 共著「遺伝子からタ
ンパク質へ：非特異性交叉反応抗原」Tumor Biol., 16:
17, 1995 ５．Khan, W., Frangsmyr, L., Teglund, S., Isrealss
on, A., Bremer, K.およびHammarstrom, S. 共著「三つ
の新遺伝子の同定およびがん胎児性遺伝子ファミリーの
サイズの推定」Genomics, 14: 384, 1992 ６．Nagel, G., Grunert, F., Kuijpers, T., Watt, S.
M., Thompson, J. およびZimmerman, W. 共著「ゲノム
編成、スプライス変異体およびＣＧＭ１の発現、がん胎
児性抗原遺伝子ファミリーのＣＤ６６関連メンバー」Eu
r. J. Biochem., 214: 27, 1993 ７．Kuroki, M., Arakawa, F., Matsuo, Y., Oikawa,
S., Misumi, Y., Nakazato, H. およびMatsuoka, Y.共
著「ヒト顆粒球における非特異性交叉反応抗原の分子ク
ローニング」J.Biol. Chem., 266: 11810, 1991 ８．Khan, W., Teglund, S., Bremer, K. およびHammar
strom, S. 共著「免疫グロブリンスーパファミリーの妊
娠特異性糖タンパク質ファミリー：新メンバーの同定お
よびファミリーサイズの推定」Genomics, 12: 780, 199
2 ９．Barnett, T. R., Pickle, W.およびElting, J. J.
共著「骨髄細胞系統ＫＧ−１からの妊娠特異性β１糖タ
ンパク質ファミリーの二つの新メンバーの特性決定およ
び転写ユニットの別個の２分類の示唆」Biochemistry,
29: 10213, 1990 １０．Olsen, A., Teglund, S., Nelson, D., Gordon,
L., Copeland, A., Georgescu, A., Carrano, A.および
Hammarstrom, S. 共著「ヒト染色体１９における妊娠特
異性糖タンパク質領域の遺伝子編成：領域に及ぶ７００
kbコスミド整列群のアセンブリおよび分析」Genomics,
23: 269, 1994
J. M.およびSteele,J.共著「がん胎児性抗原遺伝子フ
ァミリーの構造、代謝および機能」Biochim. et Biophy
s. Acta, 1032: 177, 1990 ２．Thompson, J. A., Grunert, F.およびZimmerman,
W. 共著「がん胎児性抗原遺伝子ファミリー：分子生物
学および臨床的展望」J. Clin. Lab. Anal., 5:344, 19
91 ３．Stanners, C. P., Rojas, M., Zhou, H., Fuks, A.
およびBeauchemin, N.共著「ＣＥＡファミリー：進化過
渡期における系か？」Int. J. Biological Markers, 7:
137, 1992 ４．Nagel, G. およびGrunert, F. 共著「遺伝子からタ
ンパク質へ：非特異性交叉反応抗原」Tumor Biol., 16:
17, 1995 ５．Khan, W., Frangsmyr, L., Teglund, S., Isrealss
on, A., Bremer, K.およびHammarstrom, S. 共著「三つ
の新遺伝子の同定およびがん胎児性遺伝子ファミリーの
サイズの推定」Genomics, 14: 384, 1992 ６．Nagel, G., Grunert, F., Kuijpers, T., Watt, S.
M., Thompson, J. およびZimmerman, W. 共著「ゲノム
編成、スプライス変異体およびＣＧＭ１の発現、がん胎
児性抗原遺伝子ファミリーのＣＤ６６関連メンバー」Eu
r. J. Biochem., 214: 27, 1993 ７．Kuroki, M., Arakawa, F., Matsuo, Y., Oikawa,
S., Misumi, Y., Nakazato, H. およびMatsuoka, Y.共
著「ヒト顆粒球における非特異性交叉反応抗原の分子ク
ローニング」J.Biol. Chem., 266: 11810, 1991 ８．Khan, W., Teglund, S., Bremer, K. およびHammar
strom, S. 共著「免疫グロブリンスーパファミリーの妊
娠特異性糖タンパク質ファミリー：新メンバーの同定お
よびファミリーサイズの推定」Genomics, 12: 780, 199
2 ９．Barnett, T. R., Pickle, W.およびElting, J. J.
共著「骨髄細胞系統ＫＧ−１からの妊娠特異性β１糖タ
ンパク質ファミリーの二つの新メンバーの特性決定およ
び転写ユニットの別個の２分類の示唆」Biochemistry,
29: 10213, 1990 １０．Olsen, A., Teglund, S., Nelson, D., Gordon,
L., Copeland, A., Georgescu, A., Carrano, A.および
Hammarstrom, S. 共著「ヒト染色体１９における妊娠特
異性糖タンパク質領域の遺伝子編成：領域に及ぶ７００
kbコスミド整列群のアセンブリおよび分析」Genomics,
23: 269, 1994
【００４２】１１．Hasegawa, T., Isobe, K., Tsuchiy
a, Y., Oikawa, S., Nakazato, H.,Nakashima, I.およ
びShimokata, K. 共著「非特異性交叉反応抗原（ＮＣ
Ａ）が肺がんで発現するがん胎児性抗原（ＣＥＡ）関連
遺伝子ファミリーの主要メンバーである」Br. J.Cance
r, 67: 58, 1993 １２．Kim, J., Kaye, F. J., Henslee, J. G., Shivel
y, J. E., Park, J-G., Lai, S-L., Linnoila, R. I.,
Mulshine, J. L. およびGadzar, A. F. 共著「肺におけ
るがん胎児性抗原の発現と胃腸のがん」Int. J. Cance
r, 52: 718, 1992 １３．Chi, K., Jessup. J. M.およびFrazier, M. L.共
著「結腸直腸がんにおける非特異性交叉反応抗原のｍＲ
ＮＡコーディングの優勢的発現」Tumor Biol.,12: 298,
1991 １４．Sato, C., Miyaki, M., Oikawa, S., Nakazato,
H.およびKosaki, G.共著「ヒト結腸腺がんおよび正常な
結腸粘膜におけるがん胎児性抗原および非特異性交叉反
応抗原遺伝子の発現の相違」Jpn. J. Cancer Res., 79:
433, 1988 １５．Cournoyer, D., Beauchemin, N., Boucher, D.,
Benchimol, S., Fuks,A.およびStanners, C. P. 共著
「悪性および非悪性ヒト組織におけるがん胎児性抗原フ
ァミリーの遺伝子の転写」Cancer Res., 48: 3153, 198
8 １６．Keep, J. C., Benson, A. B., Sullivan, M. D.,
Carney, W. P., Rosen, S. T.およびRadosevich, J.
A. 共著「モノクロナール抗体４７Ｄ１０および抗がん
胎児性抗原を用いる結腸直腸がんの免疫表現型分析」Tu
mor Biol., 10: 153, 1989 １７．Nap, M., Keuning, H., Burtin, P., Costerhui
s, J. W. およびFleuren, G. 共著「良性および悪性の
乳房腫瘍におけるＣＥＡおよびＮＣＡ」AmericanJ. of
Clin. Pathol., 82: 536, 1984 １８．Radosevich, J. A., Robinson, P. G., Carney,
W. P., Warren, W., Rosen, S. T. およびGould, V. E.
共著「非特異性交叉反応抗原と反応するモノクロナール
抗体（４７Ｄ１０）を用いる肺および胸膜の新生物の免
疫組織化学的分析」Tumor Biol., 10: 281, 1989 １９．Kuroki, M., Ichiki, S., Kuroki, M.およびMats
uoka, Y.共著「ヒト膵臓腫瘍からの連続的な細胞系統に
よるがん胎児性抗原と非特異性交叉反応抗原の共産生」
J. Natl, Cancer Inst., 69: 401, 1982 ２０．Barnett, T., Goebel, S., Nothdurft, M. A. お
よびElting, J.共著「がん胎児性抗原ファミリー：ＮＣ
ＡおよびＣＥＡのｃＤＮＡコーディングの特性決定なら
びにその保存されたループ領域における作為的配列変異
の示唆」Genomics, 3: 59, 1988
a, Y., Oikawa, S., Nakazato, H.,Nakashima, I.およ
びShimokata, K. 共著「非特異性交叉反応抗原（ＮＣ
Ａ）が肺がんで発現するがん胎児性抗原（ＣＥＡ）関連
遺伝子ファミリーの主要メンバーである」Br. J.Cance
r, 67: 58, 1993 １２．Kim, J., Kaye, F. J., Henslee, J. G., Shivel
y, J. E., Park, J-G., Lai, S-L., Linnoila, R. I.,
Mulshine, J. L. およびGadzar, A. F. 共著「肺におけ
るがん胎児性抗原の発現と胃腸のがん」Int. J. Cance
r, 52: 718, 1992 １３．Chi, K., Jessup. J. M.およびFrazier, M. L.共
著「結腸直腸がんにおける非特異性交叉反応抗原のｍＲ
ＮＡコーディングの優勢的発現」Tumor Biol.,12: 298,
1991 １４．Sato, C., Miyaki, M., Oikawa, S., Nakazato,
H.およびKosaki, G.共著「ヒト結腸腺がんおよび正常な
結腸粘膜におけるがん胎児性抗原および非特異性交叉反
応抗原遺伝子の発現の相違」Jpn. J. Cancer Res., 79:
433, 1988 １５．Cournoyer, D., Beauchemin, N., Boucher, D.,
Benchimol, S., Fuks,A.およびStanners, C. P. 共著
「悪性および非悪性ヒト組織におけるがん胎児性抗原フ
ァミリーの遺伝子の転写」Cancer Res., 48: 3153, 198
8 １６．Keep, J. C., Benson, A. B., Sullivan, M. D.,
Carney, W. P., Rosen, S. T.およびRadosevich, J.
A. 共著「モノクロナール抗体４７Ｄ１０および抗がん
胎児性抗原を用いる結腸直腸がんの免疫表現型分析」Tu
mor Biol., 10: 153, 1989 １７．Nap, M., Keuning, H., Burtin, P., Costerhui
s, J. W. およびFleuren, G. 共著「良性および悪性の
乳房腫瘍におけるＣＥＡおよびＮＣＡ」AmericanJ. of
Clin. Pathol., 82: 536, 1984 １８．Radosevich, J. A., Robinson, P. G., Carney,
W. P., Warren, W., Rosen, S. T. およびGould, V. E.
共著「非特異性交叉反応抗原と反応するモノクロナール
抗体（４７Ｄ１０）を用いる肺および胸膜の新生物の免
疫組織化学的分析」Tumor Biol., 10: 281, 1989 １９．Kuroki, M., Ichiki, S., Kuroki, M.およびMats
uoka, Y.共著「ヒト膵臓腫瘍からの連続的な細胞系統に
よるがん胎児性抗原と非特異性交叉反応抗原の共産生」
J. Natl, Cancer Inst., 69: 401, 1982 ２０．Barnett, T., Goebel, S., Nothdurft, M. A. お
よびElting, J.共著「がん胎児性抗原ファミリー：ＮＣ
ＡおよびＣＥＡのｃＤＮＡコーディングの特性決定なら
びにその保存されたループ領域における作為的配列変異
の示唆」Genomics, 3: 59, 1988
【００４３】２１．Barnett, T. R., Kretschmer, A.,
Austen, D. A., Goebel, S. J., Hart, J. T., Elting,
J. J.およびKamarck, M. E.共著「がん胎児性抗原：代
替スプライシングが、がん胎児性抗原ファミリーの新メ
ンバーをコーディングする多数のｍＲＮＡを説明づけ
る」J. Cell Biol., 108: 267, 1989 ２２．Allard, W. J., Neaman, I. E., Elting, J. J,
Barnett, T. R., Yosimura, H., Fritsche, H. A. およ
びYeung, K. K.共著「乳がん、肺がんおよび結腸がんの
患者において非特異性交叉反応抗原５０／９０が高揚す
る」Cancer Res., 54: 1227, 1994 ２３．Allard, W. J., Neaman, I. E., Very, D. L., J
r., Murray, B. L. およびYeung, K. K.共著「顆粒球お
よびリンパ球におけるＣＥＡファミリーメンバーの発現
ならびに慢性骨髄性白血病および慢性リンパ球性白血病
における血清バイオマーカーとしての使用」原稿作成
中、１９９５ ２４．Robbins, P. F., Eggensperger, D., Qi, C-F.お
よびSchlom, J.共著「ヒト乳がんおよび肺がんにおける
ヒトがん胎児性抗原および非特異性交叉反応抗原の発現
の定義」Int. J. Cancer, 53: 892, 1993 ２５．Baranov, V., Yeung, M. M. およびHammerstrom,
B. 共著「正常なヒト結腸粘膜およびがん性ヒト結腸粘
膜におけるがん胎児性抗原および非特異性交叉反応性５
０kDa 抗原の発現：モノクロナール抗体との比較による
超微細構造研究」Cancer Res., 54: 3305, 1994 ２６．Allard, W. J., Vicario, P. P., Saperstein,
R., Slater, E. E.およびStrout, H. V. 共著「ストレ
プトゾトシン誘発糖尿病においてラット肝臓阻害性グア
ニンヌクレオチド結合タンパク質の機能は変化するが、
その発現は変化しない」Endocrinology, 129: 169, 199
1 ２７．Allard, W. J. およびLienhard, G. E. 共著「ヒ
ト赤血球からのグルコーストランスポーターに対するモ
ノクロナール抗体。Ｍr ＝５５，０００タンパク質とし
てのトランスポーターの同定」J. Biol. Chem., 260: 8
668, 1985 ２８．Kuroki, M., Matsuo, Y., Kinugara, T.およびMa
tsuoka, Y.共著「細胞活性化の際のヒト好中球による、
ＣＥＡ遺伝子ファミリーのメンバーである非特異性交叉
反応抗原（ＮＣＡ）の増大した発現および放出」J. Leu
k. Biol., 52:551, 1992 ２９．Mayne, K. M., Pulford, K., Jones, M., Mickle
m, K., Nagel, G., Van der Schoot, C. E. およびMaso
n, D. Y.共著「抗体Ｂｙ１１４は、ＣＤ６６抗原の９０
kDのＰＩ結合成分に対して選択的である：発作性夜間血
色素尿症の研究のための新試薬」Brit. J. Haematol.,
83: 30, 1993 ３０．Ducher, T. P. およびSkubitz, K. M.共著「ヒト
好中球におけるＣＤ６６、ＣＤ６７およびＮＣＡの非細
胞限局化」J. Leuk. Biol., 52: 11, 1992
Austen, D. A., Goebel, S. J., Hart, J. T., Elting,
J. J.およびKamarck, M. E.共著「がん胎児性抗原：代
替スプライシングが、がん胎児性抗原ファミリーの新メ
ンバーをコーディングする多数のｍＲＮＡを説明づけ
る」J. Cell Biol., 108: 267, 1989 ２２．Allard, W. J., Neaman, I. E., Elting, J. J,
Barnett, T. R., Yosimura, H., Fritsche, H. A. およ
びYeung, K. K.共著「乳がん、肺がんおよび結腸がんの
患者において非特異性交叉反応抗原５０／９０が高揚す
る」Cancer Res., 54: 1227, 1994 ２３．Allard, W. J., Neaman, I. E., Very, D. L., J
r., Murray, B. L. およびYeung, K. K.共著「顆粒球お
よびリンパ球におけるＣＥＡファミリーメンバーの発現
ならびに慢性骨髄性白血病および慢性リンパ球性白血病
における血清バイオマーカーとしての使用」原稿作成
中、１９９５ ２４．Robbins, P. F., Eggensperger, D., Qi, C-F.お
よびSchlom, J.共著「ヒト乳がんおよび肺がんにおける
ヒトがん胎児性抗原および非特異性交叉反応抗原の発現
の定義」Int. J. Cancer, 53: 892, 1993 ２５．Baranov, V., Yeung, M. M. およびHammerstrom,
B. 共著「正常なヒト結腸粘膜およびがん性ヒト結腸粘
膜におけるがん胎児性抗原および非特異性交叉反応性５
０kDa 抗原の発現：モノクロナール抗体との比較による
超微細構造研究」Cancer Res., 54: 3305, 1994 ２６．Allard, W. J., Vicario, P. P., Saperstein,
R., Slater, E. E.およびStrout, H. V. 共著「ストレ
プトゾトシン誘発糖尿病においてラット肝臓阻害性グア
ニンヌクレオチド結合タンパク質の機能は変化するが、
その発現は変化しない」Endocrinology, 129: 169, 199
1 ２７．Allard, W. J. およびLienhard, G. E. 共著「ヒ
ト赤血球からのグルコーストランスポーターに対するモ
ノクロナール抗体。Ｍr ＝５５，０００タンパク質とし
てのトランスポーターの同定」J. Biol. Chem., 260: 8
668, 1985 ２８．Kuroki, M., Matsuo, Y., Kinugara, T.およびMa
tsuoka, Y.共著「細胞活性化の際のヒト好中球による、
ＣＥＡ遺伝子ファミリーのメンバーである非特異性交叉
反応抗原（ＮＣＡ）の増大した発現および放出」J. Leu
k. Biol., 52:551, 1992 ２９．Mayne, K. M., Pulford, K., Jones, M., Mickle
m, K., Nagel, G., Van der Schoot, C. E. およびMaso
n, D. Y.共著「抗体Ｂｙ１１４は、ＣＤ６６抗原の９０
kDのＰＩ結合成分に対して選択的である：発作性夜間血
色素尿症の研究のための新試薬」Brit. J. Haematol.,
83: 30, 1993 ３０．Ducher, T. P. およびSkubitz, K. M.共著「ヒト
好中球におけるＣＤ６６、ＣＤ６７およびＮＣＡの非細
胞限局化」J. Leuk. Biol., 52: 11, 1992
【図面の簡単な説明】
【図１】ＥＬＩＳＡおよび免疫沈降による正常な組織中
のＮＣＡ５０／９０遺伝子産物の検出を示す表である。
のＮＣＡ５０／９０遺伝子産物の検出を示す表である。
【図２】ＥＬＩＳＡおよび免疫沈降による正常人、非悪
性疾病患者およびがん患者の血清中のＮＣＡ５０／９０
遺伝子産物の検出を示す表である。
性疾病患者およびがん患者の血清中のＮＣＡ５０／９０
遺伝子産物の検出を示す表である。
【図３】患者試料から免疫沈降させたＮＣＡ９０の定量
に使用する標準曲線を示すグラフである。
に使用する標準曲線を示すグラフである。
【図４】正常な被検者およびがん患者における血清ＣＡ
２２８（全ＮＣＡ５０／９０）の値とＮＣＡ９０の値と
を比較するグラフである。
２２８（全ＮＣＡ５０／９０）の値とＮＣＡ９０の値と
を比較するグラフである。
フロントページの続き (72)発明者 ウイリアム、ジェフリ、アラド アメリカ合衆国ニューヨーク州12570、ポ ウクァグ、ストウ・ドライヴ 93番
Claims (36)
- 【請求項１】 患者の血流中に分泌されるＮＣＡ５０／
９０遺伝子によって発現されるヒトタンパク質を測定す
る方法であって、患者から得られる血液試料中のＮＣＡ
９０を測定することを特徴とする方法。 - 【請求項２】 抗体試薬の少なくとも１種がＮＣＡ９０
に対して特異性であり、ＮＣＡ５０、ＣＥＡ、ＮＣＡ９
５またはＢＧＰに対して実質的な反応性をもたないサン
ドイッチ免疫検定を実施することによって患者の血液試
料中のＮＣＡ９０の量を測定する請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 該ＮＣＡ９０特異性抗体試薬がモノクロ
ーナル抗体試薬である請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 該血液試料が血清または血漿試料である
請求項１記載の方法。 - 【請求項５】 症候性患者におけるがんの診断を支援す
るための、 該患者から得られる血液試料中のＮＣＡ５０／９０の量
を測定する段階と、 該測定したＮＣＡ５０／９０の量を、正常な個体群にお
けるＮＣＡ５０／９０の平均血中レベルと比較する段階
とを含み、有意に増大したレベルのＮＣＡ５０／９０が
患者の血液中に存在することが、患者におけるがんの指
標になる方法において、 患者の血液試料中でＮＣＡ９０を特異的に測定すること
を特徴とする方法。 - 【請求項６】 がんが乳がんである請求項５記載の方
法。 - 【請求項７】 がんが結腸がんである請求項５記載の方
法。 - 【請求項８】 がんが肺がんである請求項５記載の方
法。 - 【請求項９】 がんが白血病である請求項５記載の方
法。 - 【請求項１０】 抗体試薬の少なくとも１種がＮＣＡ９
０に対して特異性であり、ＮＣＡ５０、ＣＥＡ、ＮＣＡ
９５またはＢＧＰに対して実質的な反応性をもたないサ
ンドイッチ免疫検定を実施することによって患者の血液
試料中のＮＣＡ９０の量を測定する請求項５記載の方
法。 - 【請求項１１】 該ＮＣＡ９０特異性抗体試薬がモノク
ローナル抗体試薬である請求項１０記載の方法。 - 【請求項１２】 該血液試料が血清または血漿試料であ
る請求項５記載の方法。 - 【請求項１３】 がんの診断を受けた患者の疾病の経過
を監視するための、 一連の特異性免疫検定を経時的に実施して、該患者から
得られる血液試料中のＮＣＡ５０／９０のレベルの変化
を測定することを含み、ＮＣＡ５０／９０の血中レベル
の変化が疾病状態の変化に相関する方法において、 患者の血液試料中でＮＣＡ９０を特異的に測定すること
を特徴とする方法。 - 【請求項１４】 がんが乳がんである請求項１３記載の
方法。 - 【請求項１５】 がんが結腸がんである請求項１３記載
の方法。 - 【請求項１６】 がんが肺がんである請求項１３記載の
方法。 - 【請求項１７】 がんが白血病である請求項１３記載の
方法。 - 【請求項１８】 抗体試薬の少なくとも１種がＮＣＡ９
０に対して特異性であり、ＮＣＡ５０、ＣＥＡ、ＮＣＡ
９５またはＢＧＰに対して実質的な反応性をもたないサ
ンドイッチ免疫検定を実施することによって患者の血液
試料中のＮＣＡ９０の量を測定する請求項１３記載の方
法。 - 【請求項１９】 該ＮＣＡ９０特異性抗体試薬がモノク
ローナル抗体試薬である請求項１８記載の方法。 - 【請求項２０】 該血液試料が血清または血漿試料であ
る請求項１３記載の方法。 - 【請求項２１】 がんの診断を受けた患者の疾病の経過
を監視するための、一連の特異性免疫検定を経時的に実
施して、該患者から得られる血液試料中のＮＣＡ５０／
９０のレベルの変化を測定することを含み、血中ＮＣＡ
５０／９０レベルの増大が病状悪化を表し、血中ＮＣＡ
５０／９０レベルの減少が病状改善を表す方法におい
て、 患者の血液試料中でＮＣＡ９０を特異的に測定すること
を特徴とする方法。 - 【請求項２２】 がんが乳がんである請求項２１記載の
方法。 - 【請求項２３】 がんが結腸がんである請求項２１記載
の方法。 - 【請求項２４】 がんが肺がんである請求項２１記載の
方法。 - 【請求項２５】 がんが白血病である請求項２１記載の
方法。 - 【請求項２６】 抗体試薬の少なくとも１種がＮＣＡ９
０に対して特異性であり、ＮＣＡ５０、ＣＥＡ、ＮＣＡ
９５またはＢＧＰに対して実質的な反応性をもたないサ
ンドイッチ免疫検定を実施することによって患者の血液
試料中のＮＣＡ９０の量を測定する請求項２１記載の方
法。 - 【請求項２７】 該ＮＣＡ９０特異性抗体試薬がモノク
ローナル抗体試薬である請求項２６記載の方法。 - 【請求項２８】 該血液試料が血清または血漿試料であ
る請求項２１記載の方法。 - 【請求項２９】 がんの治療を受けた患者における疾病
の経過を監視するための、 一連の特異性免疫検定を経時的に実施して、該患者から
得られる血液試料中のＮＣＡ５０／９０のレベルの変化
を測定することを含み、血中ＮＣＡ５０／９０レベルの
増大が疾病の再発を表す方法において、 患者の血液試料中でＮＣＡ９０を特異的に測定すること
を特徴とする方法。 - 【請求項３０】 がんが乳がんである請求項２９記載の
方法。 - 【請求項３１】 がんが結腸がんである請求項２９記載
の方法。 - 【請求項３２】 がんが肺がんである請求項２９記載の
方法。 - 【請求項３３】 がんが白血病である請求項２９記載の
方法。 - 【請求項３４】 抗体試薬の少なくとも１種がＮＣＡ９
０に対して特異性であり、ＮＣＡ５０、ＣＥＡ、ＮＣＡ
９５またはＢＧＰに対して実質的な反応性をもたないサ
ンドイッチ免疫検定を実施することによって患者の血液
試料中のＮＣＡ９０の量を測定する請求項２９記載の方
法。 - 【請求項３５】 該ＮＣＡ９０特異性抗体試薬がモノク
ローナル抗体試薬である請求項３４記載の方法。 - 【請求項３６】 該血液試料が血清または血漿試料であ
る請求項２９記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US48918895A | 1995-06-09 | 1995-06-09 | |
| US08/489188 | 1995-06-09 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH095329A true JPH095329A (ja) | 1997-01-10 |
Family
ID=23942764
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8168721A Pending JPH095329A (ja) | 1995-06-09 | 1996-06-10 | がん患者血液中のｎｃａ９０糖形態の特異的測定 |
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| EP (1) | EP0747705A1 (ja) |
| JP (1) | JPH095329A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4896883B2 (ja) * | 2004-10-14 | 2012-03-14 | ユニヴェルシテ ドーベルニュ クレルモン １ | クローン病の診断法及び治療法 |
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| US7033774B2 (en) * | 1997-04-21 | 2006-04-25 | Glycozyme, Inc. | Determination of recombinant glycosylated proteins and peptides in biological fluids |
| CA2289118A1 (en) * | 1997-05-06 | 1998-11-12 | Zymogenetics, Inc. | Novel tumor antigens |
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| WO2005111627A2 (en) | 2004-04-15 | 2005-11-24 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods and products related to the improved analysis of carbohydrates |
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| CA2118760C (en) * | 1993-04-21 | 2004-06-22 | William Jeffrey Allard | Diagnosis and monitoring of colon cancer patients by measurement of nca 50/90 in blood |
-
1996
- 1996-05-28 EP EP96108409A patent/EP0747705A1/en not_active Withdrawn
- 1996-06-10 JP JP8168721A patent/JPH095329A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4896883B2 (ja) * | 2004-10-14 | 2012-03-14 | ユニヴェルシテ ドーベルニュ クレルモン １ | クローン病の診断法及び治療法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0747705A1 (en) | 1996-12-11 |
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