JPH10127298A - アカルボース調製のためのオスモル濃度制御発酵法 - Google Patents

アカルボース調製のためのオスモル濃度制御発酵法

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JPH10127298A
JPH10127298A JP9257979A JP25797997A JPH10127298A JP H10127298 A JPH10127298 A JP H10127298A JP 9257979 A JP9257979 A JP 9257979A JP 25797997 A JP25797997 A JP 25797997A JP H10127298 A JPH10127298 A JP H10127298A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 改良されたアカルボース発酵方法の提供。 【解決手段】 発酵液中のオスモル濃度を追跡し、制御
することを特徴とするアカルボースの発酵方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】アカルボース（ａｃａｒｂｏ
ｓｅ）は、強力なα−グルコシダーゼ阻害剤であって、
真性糖尿病の治療のために経口的に投与される市販名グ
ルコベイ（ＧｌｕｃｏｂａｙR）の抗糖尿病薬として使
用されている。活性化合物は、発酵によって得られる；
生産菌は、土壌細菌アクチノプラネス種（Ａｃｔｉｎｏ
ｐｌａｎｅｓ ｓｐｅｃ．）ＳＥ５０／１１０、もしく
はそれから誘導された変異株である。
【０００２】
【従来の技術】一般に、アカルボースのような活性化合
物の発酵生産は、方法の最適化なしでは経済的でない。
したがって、原則として、達成できる時空収量に関して
発酵をかなり改良することが必要である。収量における
改良は、当業者に既知の種々の方法によって達成される
であろう。これらは、例えば、生産菌の突然変異誘発処
理および生残細胞からのより高い生産変異株の選択を含
む；これらの改良された生産菌株は、再度、この方法に
かけることができる。また、菌株改良は、しばしば、分
子生物学の技術を組み入れることによって達成できる。
さらなる重要なアプローチは、生産培地を最適化するこ
とであり、その成分および量的組成は、最高生産収量が
達成されるようでなければならない。最後に、また、発
酵操作も、酸素供給、温度、ｐＨ、せん断力等に関し
て、増殖と生産物生成にとっての最適条件に生産菌を接
触させることによって、収量の増加に寄与できる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、最後に述べ
た最適化戦略、すなわち、発酵条件の改良に関する。
【０００４】
【課題を解決するための手段】驚くべきことに、発酵液
のオスモル濃度−通常は、微生物発酵では考慮されない
パラメーター−が、アカルボース発酵の最終収量に顕著
な効果を及ぼすことが発見された。このことはすべて、
臨界オスモル濃度範囲が、全く極端な範囲にあるのでは
なくて、例えば２００ミリオスモル（ｍｏｓｍｏｌ）／
ｋｇ〜６００ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇの中庸のオスモル濃
度、すなわち、しばしば微生物培養の栄養液において達
する範囲にあるので、一層驚くべきことである。この範
囲内のオスモル濃度は、例えば、ヒトの血液が約４００
ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇの値をもつので、通常は、完全に生
理的であると言える。驚くべきことに、低い栄養液オス
モル濃度、例えば＜２００ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇばかりで
なく、より高い栄養液オスモル濃度、例えば＞６００ｍ
ｏｓｍｏｌ／ｋｇもまた、有意に、より低い生産性に導
き、そしてしばしば、そのような条件下でのアカルボー
ス培養は、全く生産物生成を示さないことさえあること
が分かった。
【０００５】アカルボース生成菌の生産性の顕著なオス
モル濃度依存に基づき、新しい制御戦略が、二次代謝産
物アカルボースの発酵について開発されたが、その制御
戦略は、比較しうる微生物発酵、特に工業分野において
は、今日まで使用されていなかった。この制御戦略の基
本は、適切な様式で実施されるべき浸透活性基質の添加
によって、オスモル濃度を所望の最適範囲内に保つこと
である。その基質は、流加法として実施される発酵に対
して、一定時間に分割してでも、連続的にでも添加する
ことができる。しかしながらまた、驚くべきことに、完
全連続法において二次代謝産物発酵を実施することによ
って、すなわち、１種以上の基質を含有する栄養液の添
加によって、一定のオスモル濃度を保つことも可能であ
る；この型式の連続発酵においては、定常状態のオスモ
ル濃度が、培養においてつくられる。問題の浸透活性基
質は、好ましくは、培養される生産菌の増殖を促進する
物質である。これらは、特に、Ｃ源、Ｎ源および塩類を
含む。個々の基質でも、また基質の混合物でも、オスモ
ル濃度の安定化のために培養液にフィードすることがで
きる。
【０００６】それ故、本発明は、２つの本質的態様を含
む： １． 目的が、アカルボース発酵の培養液におけるオス
モル濃度に関して定められた範囲に維持することであ
る、制御戦略。
【０００７】２． 流加発酵の範疇で、基質が、一定時
間に一部分づつか連続的に添加されるか、または完全連
続発酵の範疇で、完全栄養液が添加されることを特徴と
する、所望のオスモル濃度範囲を維持する方法。
【０００８】アカルボース発酵を最適化する努力では、
種々の変った方法が、生産性に及ぼすそれらの影響に関
して試験された。栄養液組成および発酵の実施様式の両
方が、生産物収量に影響を及ぼすことが分かった。これ
らの結果は、野生型菌株でもより高い生産性の高成績変
異株の両方でも、全く同一か、または同じように観察さ
れた。
【０００９】培地については、種々の栄養液組成が、ア
カルボース発酵のために成功裏に使用することができる
（Frommer et al. ドイツ特許第26 14 393号）。一般
に、炭素源、ビタミンおよび微量元素、塩類および緩衝
物質を含有する栄養液を使用することが有利である。適
切な炭素源の１つの例は、マルトースであって、これ
は、アカルボース分子の構造的要素を形成する。経済的
な理由から、より安価な炭素源、例えばグルコース、マ
ルトースおよびより高分子のグルコースオリゴマーを含
有する澱粉加水分解物を使用することが得策である。適
切な窒素源は、個々のアミノ酸、例えばグルタミンもし
くはアスパラギン、タンパク質加水分解物もしくはタン
パク質抽出物、または大豆粉、馬鈴薯粉、グルテンもし
くは他の複合タンパク質−もしくはペプチド含有基質の
ような高タンパク質原料である。栄養液中に燐酸塩およ
び鉄塩を組み入れたり、また緩衝物質、例えば炭酸カル
シウムを用いてｐＨを調節することが得策であることも
分かった。微量元素は、複合栄養液基質および／または
水道水によって、栄養液に供給される。もし、脱塩水が
使用される場合は、微量元素濃縮液を添加することが有
利であった。
【００１０】発酵操作については、ｐＨを、生理学的範
囲内、すなわちｐＨ５〜８に保ち、そして限界を避ける
ような十分な酸素を培地に供給することが有利である。
最適な生産性は、温度範囲３０℃付近で得られる。アカ
ルボース生産菌は、繊維状細菌であるので、撹拌タンク
発酵において極端に高い撹拌速度を避け、かくしてもは
や許容されないせん断力を避けることが、さらに得策で
ある。
【００１１】発酵を最適化する過程において、驚くべき
ことに、栄養液組成によって生ずるオスモル濃度が、ア
カルボース生産性に非常に顕著な影響を及ぼすことが分
かった。この影響は、全く極端な値に限られるのではな
く、むしろ生理学的範囲内に完全に存在する。高いばか
りでなく低いオスモル濃度も、生産性におけるかなりの
低下に導くことは、さらに驚くべきことである。この関
係は、図１および２において明らかにされる。オスモル
濃度の最適値は、約４００ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇに存在す
る。値＞５００ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇまたは＜３００ｍｏ
ｓｍｏｌ／ｋｇは、生産性において明らかな低下へと導
き、値＞６００ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇまたは＜２００ｍｏ
ｓｍｏｌ／ｋｇは、生産性における非常に顕著な低下へ
と導く；若干の場合、特に該オスモル濃度範囲の限界値
または外側では、アカルボース生産は、全く認めること
ができなかった。一般に、低いオスモル濃度は、微生物
の代謝活性に悪影響を与えず、そしてかなり高いオスモ
ル濃度も、普通は許容されるので、この関係は、微生物
にとっては驚くべきことである。
【００１２】アカルボース生産性へのオスモル濃度の影
響は、もし、発酵中のオスモル濃度が、好適な範囲に維
持できるならば、発酵は、成功裏に最適化できるに違い
ないということを示唆する。一方、微生物の培養中のオ
スモル濃度の経過は、栄養液からの浸透活性基質の消費
によって、そして他方、増殖の間に栄養液中に遊離され
る浸透活性産物の生成によって決定される。アカルボー
ス・バッチ発酵の場合には、図３に示された経過を得
る；発酵の開始時のオスモル濃度は、ほぼ５００ｍｏｓ
ｍｏｌ／ｋｇ、すなわち、わずかな生産性の阻害を既に
誘導する値である。発酵の間、オスモル濃度は、最適範
囲を通り越して減少し、次いで、再び生産性の低下に導
く値に達する。
【００１３】オスモル濃度が制御された運転様式を可能
にする制御戦略を開発する試みが、ここに行われた。通
常は、微生物培養への栄養液基質の添加の目的は、基質
濃度によって生じる特定の代謝状態を生み出すことであ
る。基質制限を避けるためにも、また特定の基質制限を
生み出すためにも、この経過における試験が、しばしば
行われた。しかしながら、本試験の場合は、制御の目的
は、浸透活性栄養液成分の添加によって、一定の好適な
オスモル濃度範囲を維持することである；しかしなが
ら、同時に、無意識的に生じる過度の、または過度に不
均衡な基質濃度による不利益な効果が、基質の添加によ
って生み出されるということは、注意する必要がある。
【００１４】オスモル濃度が制御された運転方法の３つ
の型が試験された； １． 発酵の間、一定時間に少量ずつ新鮮栄養液を添加
すること；これは、段階的にオスモル濃度を捜し求めた
最適値にもたらすことができる。
【００１５】２． 流加法における発酵の間の１種以上
の基質の連続添加；この方法では、オスモル濃度は、全
発酵期間で好適な範囲に維持することができる。
【００１６】３． 新鮮栄養液の連続添加および生産物
を含有する培養ブロスの連続抜き取りによる完全連続発
酵；この場合には、オスモル濃度はまた、全発酵期間で
好適な範囲に維持できるし、そして同時に、アカルボー
スの生成に最適な定常状態が、培養中に達成できる。
【００１７】一定時間に少量の新鮮栄養液の添加は、技
術的に単純に実施される方法である。しかしながら、そ
の方法は、オスモル濃度が段階で適応させられるだけで
あるという欠点をもち、そしてある環境において、比較
的大量の新鮮な基質の添加は、生合成の調節に望ましく
ない効果をもつ。特に、後者の状態は、二次代謝に関係
する生合成経路の場合では重要である。一定時間での少
量の新鮮栄養液の添加は、振盪フラスコにおいて実験室
規模で実施された。驚くべきことに、新鮮栄養液の一部
分のバッチ法での添加によって、培養ブロスのオスモル
濃度は、最適と認識される３５０〜４５０ｍｏｓｍｏｌ
／ｋｇの範囲にうまく保たれ、かくして、生産物収量の
有意な増加が達成された。（図４：オスモル濃度の経過
および表１：最終アカルボース収量）。この場合には、
経時的に数ポイント（例えば、４８および９６時間後）
で比較的大量の栄養液を添加するか、または連続添加に
近い、比較的短い時間隔での比較的少量の栄養液を添加
することが可能である。
【００１８】発酵中の栄養液の連続添加は、パイロット
規模で実施され、試験された。その方法は、実施例２に
記述される。使用された栄養基質は、例を挙げれば、栄
養液において普通に使用される炭素源（澱粉加水分解
物）であった。他の栄養液成分（窒素源、塩類）または
多数の栄養液成分の組み合わせ物もまた、同様の方法で
使用することができた。培養ブロスのオスモル濃度は、
ほぼ３５０〜ほぼ４５０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇの好適な範
囲に維持することができた（図５）。発酵液中への連続
フィードをほぼ４０時間目に開始することによって発酵
の開始時におけるオスモル濃度の低下を防げることが、
明白になった。反対に、浸透制御下にない対照発酵方法
のオスモル濃度は、既に図３に示したように、全発酵期
間にわたって低下する。表２は、流加法における栄養液
成分の連続フィードによって達成されたオスモル濃度制
御発酵操作が、収量における有意な改良を可能にするこ
とを示している。
【００１９】
【表１】
【００２０】
【表２】
【００２１】実施例３は、オスモル濃度制御のための完
全連続発酵操作を記す。代謝における調節現象のため
に、最高の生産性は、増殖が事実上または完全に停止し
た後でなければ達成されないので、二次代謝産物の完全
連続発酵は、多くの場合には原則として不可能である。
しかしながら、増殖と生産物生成の間の平行は、可能で
あるべき連続培養には絶対的な前提条件である。したが
って、アカルボース発酵の場合に、完全連続様式の運転
が成功裏に実施できたことは、全く驚くべきことである
と考えざるを得ない。図６は、培養ブロスにおけるオス
モル濃度が、連続法の操作によって好適な範囲に保つこ
とができたことを示している。その結果、図７に示すよ
うに、生産性は、数回の容量変化を通じてバッチ発酵で
の最高値において成功裏に維持された。
【００２２】本発明では、オスモル濃度最適値が、菌株
に特異的なパラメーターであることを指摘することは重
要である。菌株改良技術によって作製された種々の高生
産菌株は、それらのオスモル濃度最適値において異なる
かもしれない。変化したオスモル濃度最適値をもつ高生
産変異株を作製することは、まさに菌株改良のねらいで
あろう。それ故、本発明の明細書に述べられたオスモル
濃度値は、例示であり、そして使用された生産菌株に適
合する。オスモル濃度最適値は、各々新しく作製された
高生産変異株に対して新たに決定されるべきであり、そ
してオスモル濃度制御発酵は、記述された様式で最適オ
スモル濃度を維持するよう試験するために実施されねば
ならない。
【００２３】
【実施例】
（実施例１）アカルボース発酵への一度に少量の新鮮栄養液添加によ
るオスモル濃度制御 アカルボース生産菌株を、次の栄養液９０ｍｌを入れた
１ ｌ容振盪フラスコ中で培養した：澱粉加水分解物１
００ｇ／ｌ、酵母エキス７ｇ／ｌ、カゼイン加水分解物
３ｇ／ｌ、ＣａＣＯ3３ｇ／ｌ、Ｋ2ＨＰＯ4３ｇ／ｌ、
水道水、ｐＨ６．９。栄養液を、オートクレーブで１２
１℃、１０分間殺菌し、次いで、種母培養を接種し、回
転数２５０ｒｐｍの振盪機で３０℃において培養した。
先に特定した組成の１．５倍濃度栄養液を、４８、７２
時間、または４８、９６時間後に、各時間２０ｍｌ添加
した。フィード液は、１２１℃で１０分間、オートクレ
ーブで殺菌された。オスモル濃度は、日に一度、氷点降
下を測定することによって決定した；アカルボース含量
は、日に一度、ＨＰＬＣによって測定した。
【００２４】（実施例２）アカルボース発酵への栄養液基質の連続添加によるオス
モル濃度制御 アカルボース生産菌株を、次の栄養液１６００ｌを入れ
た３０００ｌ発酵槽中で培養した：澱粉加水分解物１０
０ｇ／ｌ、酵母エキス７ｇ／ｌ、カゼイン加水分解物３
ｇ／ｌ、ＣａＣＯ3３ｇ／ｌ、Ｋ2ＨＰＯ4３ｇ／ｌ、水
道水、ｐＨ６．９。栄養液を、連続工程で殺菌（１５０
℃、５２秒）し、前殺菌した発酵槽中に満たし、３００
ｌ発酵槽で作製された種母培養を接種し、そして次の条
件下で発酵させた：温度：３１℃、上部内圧：１．０〜
１．８ｂａｒ、撹拌数：１５０〜２２０ｒｐｍ、通気
量：５００〜１０００ｌ／ｍｉｎ。４８時間から、澱粉
加水分解物溶液を約３．２ ｌ／ｈｒのフィード速度で
連続的にフィードした；その溶液は水道水中澱粉加水分
解物１６３ｋｇを含有し（最終容量：２３３ ｌ）、そ
して１２１〜１２５℃で２０分間殺菌された。オスモル
濃度は、日に一度、氷点降下を測定することによって決
定した。アカルボースはＨＰＬＣによって測定した。
【００２５】（実施例３）連続アカルボース発酵によるオスモル濃度制御 アカルボース生産菌株を、次の栄養液１６００ｌを入れ
た３０００ｌ発酵槽中で培養した：澱粉加水分解物１０
０ｇ／ｌ、Ｌ−アスパラギン・２Ｈ2Ｏ ２０ｇ／ｌ、
Ｋ2ＨＰＯ4３ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２ｇ／ｌ、
ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ １ｇ／ｌ、Ｍｇ3（ＰＯ4）2・８
Ｈ2Ｏ ２ｇ／ｌ、ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ０．１ｇ／ｌ、
ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ０．１ｇ／ｌ、ＺｎＣｌ2０．１
ｇ／ｌ、水道水、ｐＨ６．８。栄養液を、連続工程で殺
菌（１５０℃、５２秒）し、前殺菌した発酵槽中に満た
し、３００ｌ発酵槽で作製された種母培養を接種し、そ
して次の条件下で発酵させた：温度：３１℃、上部内
圧：１．０〜１．８ｂａｒ、撹拌数：１５０〜２２０ｒ
ｐｍ、通気量：５００〜１０００ｌ／ｍｉｎ。４８時間
から、澱粉加水分解物溶液を約３．２ ｌ／ｈｒのフィ
ード速度で連続的にフィードした；その溶液は水道水中
澱粉加水分解物１６３ｋｇを含有し（最終容量：２３３
ｌ）、そして１２１〜１２５℃で２０分間殺菌され
た。９６時間後、培養ブロスの１部分２００ ｌを進行
中の発酵から抜き取り、そして前殺菌した３００ｌ発酵
槽中に無菌条件下で移送した。次いで、新鮮栄養液を、
流速１日当たり０．３３発酵槽容量で、この培養に連続
的にフィードした；生成物含有の培養ブロスを、同じ速
度で発酵槽から連続的に抜き取った。オスモル濃度およ
びアカルボースは、実施例２のように測定した。
【００２６】本発明の特徴および態様は以下のとおりで
ある。
【００２７】１． オスモル濃度が、範囲２００〜６０
０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇに設定され、そして維持されるこ
とを特徴とする、アカルボース調製のための発酵方法。
【００２８】２． オスモル濃度が、範囲３００〜５０
０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇに設定され、そして維持されるこ
とを特徴とする、前記１項記載の方法。
【００２９】３． １種以上の栄養液成分が、発酵過程
においてアカルボースを生成する培養物に存在するか、
または添加されることを特徴とする、アカルボース調製
のための発酵方法。
【００３０】４． １種以上の栄養液成分の添加が、培
養物中のオスモル濃度が範囲２００〜６００ｍｏｓｍｏ
ｌ／ｋｇ内に維持されるように実施されることを特徴と
する、前記３項記載の方法。
【００３１】５． １種以上の栄養液成分の添加が、培
養物中のオスモル濃度が範囲３００〜５００ｍｏｓｍｏ
ｌ／ｋｇ内に維持されるように実施されることを特徴と
する、前記３項記載の方法。
【００３２】６． 栄養液成分または成分群が、一定時
間に、分割された部分として培養物に存在するか、また
は添加されることを特徴とする、前記３〜５項記載の方
法。
【００３３】７． 栄養液成分または成分群が、連続的
に培養物に存在するか、または添加されることを特徴と
する、前記３〜５項記載の方法。
【００３４】８． 栄養液成分または成分群が、連続的
に培養物に存在するか、または添加され、そして生産物
を含有する培養ブロスが、培養物から連続的に抜き取ら
れることを特徴とする、前記３〜５項記載の方法。
【００３５】９． 生産物を含有する培養液が、培養物
から一定時間に少量抜き取られ、そして交替に、新鮮栄
養液が、一定時間に少量培養物に添加されることを特徴
とする、アカルボース調製のための発酵方法。
【００３６】１０．発酵が、流加法で実施され、そして
フィード基質溶液が、一定時間に分割してか、または連
続的に添加されることを特徴とする、アカルボース調製
のための発酵方法。
【００３７】１１．発酵が連続法として実施されること
を特徴とする、アカルボース調製のための発酵方法。
【図面の簡単な説明】
【図１】アカルボース発酵におけるアカルボースの生産
性に及ぼすオスモル濃度の影響を表すグラフである。
【図２】アカルボース発酵における培地成分のオスモル
濃度がアカルボースの生産性に及ぼす影響を表すグラフ
である。
【図３】パイロット規模のアカルボースのバッチ発酵に
おける経時的なオスモル濃度の変化を表すグラフであ
る。
【図４】新鮮栄養液を間欠的添加して、培養ブロスのオ
スモル濃度を一定に保持した事例を表すグラフである。
【図５】パイロット規模でのアカルボースバッチ発酵に
おけるオスモル濃度の制御例を表すグラフである。
【図６】連続アカルボース発酵におけるオスモル濃度の
制御例を表すグラフである。
【図７】パイロット規模でのアカルボース連続発酵にお
ける経時的なアカルボース生産性の変動を表すグラフで
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:045） (72)発明者 ウルリヒ・シユタイナー アメリカ合衆国カリフオルニア州94598ウ オルナツトクリーク・メドウビユーレイン 3110

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 オスモル濃度が、範囲２００〜６００ミ
    リオスモル／ｋｇに設定され、そして維持されることを
    特徴とする、アカルボース調製のための発酵方法。
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