JPH0322980A - トリプトファナーゼの製造方法 - Google Patents
トリプトファナーゼの製造方法Info
- Publication number
- JPH0322980A JPH0322980A JP15589389A JP15589389A JPH0322980A JP H0322980 A JPH0322980 A JP H0322980A JP 15589389 A JP15589389 A JP 15589389A JP 15589389 A JP15589389 A JP 15589389A JP H0322980 A JPH0322980 A JP H0322980A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- tryptophanase
- escherichia coli
- promoter
- culture
- carbon source
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明はトリプトファナーゼの製造方法に関する．
トリプトファナーゼは、近年飼料添加剤として注゛目を
集めているＬ−１リブトファンの製造に好適に使用され
る有用な酵素である。
集めているＬ−１リブトファンの製造に好適に使用され
る有用な酵素である。
（従来の技術〉
従来より、エシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉ ｃ
ｈ ｉ ａ ｃ ｏ ｌ ｉ ）に属する微生物の菌
体内におけるトリプトファナーゼの産生は、グルコース
の添加により阻害されることが知られている。
ｈ ｉ ａ ｃ ｏ ｌ ｉ ）に属する微生物の菌
体内におけるトリプトファナーゼの産生は、グルコース
の添加により阻害されることが知られている。
このため、トリプトファナーゼプロモーターと該プロモ
ーターで発現されるトリプトファナーゼ構造遺伝子を保
有するエシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｂｉａ
ｃｏ！ｉ）に属する微生物を培養して菌体内にトリブ
トファナーセを産生させるに際しては、培養の主炭素源
として、安価で工業的に広く利用されているグルコース
を用いることができず、コハク酸やビルビン酸等の有Ｍ
１ｒ！Ｉｌｉ又はグリセロール等の多価アルコールを炭
素源とした培ＩＩ ［Ｄｅｍｏｓｓ，Ｒ．Ｄ．；Ｊｏｕ
ｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ
ｔ０５ ３３（１９７１）］を余儀なくされていた。し
かしながら、これらの有機酸又は多価アルコールを炭素
源として培養を行った場合、原料費が高価となり、工業
的、経済的にトリプトファナーゼを生産して利用するこ
とは困難である。また、安価な炭素源として用いられる
エタノールは、エシェリヒアに属する微生物によって殆
ど責化されず、とても該微生物の培養に用いることはで
きない．このように、通常工業的に使用される炭素源を
用いて、エシエリヒアに属する微生物を培養し、該微生
物の菌体内にトリプトファナーゼを経済的に、高収量に
産生させることはできなかった。
ーターで発現されるトリプトファナーゼ構造遺伝子を保
有するエシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｂｉａ
ｃｏ！ｉ）に属する微生物を培養して菌体内にトリブ
トファナーセを産生させるに際しては、培養の主炭素源
として、安価で工業的に広く利用されているグルコース
を用いることができず、コハク酸やビルビン酸等の有Ｍ
１ｒ！Ｉｌｉ又はグリセロール等の多価アルコールを炭
素源とした培ＩＩ ［Ｄｅｍｏｓｓ，Ｒ．Ｄ．；Ｊｏｕ
ｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ
ｔ０５ ３３（１９７１）］を余儀なくされていた。し
かしながら、これらの有機酸又は多価アルコールを炭素
源として培養を行った場合、原料費が高価となり、工業
的、経済的にトリプトファナーゼを生産して利用するこ
とは困難である。また、安価な炭素源として用いられる
エタノールは、エシェリヒアに属する微生物によって殆
ど責化されず、とても該微生物の培養に用いることはで
きない．このように、通常工業的に使用される炭素源を
用いて、エシエリヒアに属する微生物を培養し、該微生
物の菌体内にトリプトファナーゼを経済的に、高収量に
産生させることはできなかった。
リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に属する微
生物を培養して菌体内にトリプトファナーゼを産生させ
るに当り、実質的に酢酸又はその塩のみを炭素源として
培養することを特徴とするトリプトファナーゼの製造方
法を提供するものである。
生物を培養して菌体内にトリプトファナーゼを産生させ
るに当り、実質的に酢酸又はその塩のみを炭素源として
培養することを特徴とするトリプトファナーゼの製造方
法を提供するものである。
本発明によれば、経済的に、高収量でトリプトファナー
ゼを製造することができる。
ゼを製造することができる。
（発明が解決しようとする課題）
本発明者らは、トリプトファナーゼの菌体内生成に悪影
響を及ぼさない炭素源の種類について鋭意検討した結果
、実質的に酢酸又はその塩のみを炭素源として培養する
ことによりトリブトファナーを高濃度に含有する微生物
菌体が得られることを見いだし本発明を完成するに到っ
た。
響を及ぼさない炭素源の種類について鋭意検討した結果
、実質的に酢酸又はその塩のみを炭素源として培養する
ことによりトリブトファナーを高濃度に含有する微生物
菌体が得られることを見いだし本発明を完成するに到っ
た。
（発明の構成と効果〉
すなわち本発明は、トリプトファナーゼプロモーターと
該プロモーターで発現されるトリプトファナーゼ構造遺
伝子を保有するエシェリヒア・コ（発明の具体的な説明
〉 以下、本発明をさらに具体的に説明する。
該プロモーターで発現されるトリプトファナーゼ構造遺
伝子を保有するエシェリヒア・コ（発明の具体的な説明
〉 以下、本発明をさらに具体的に説明する。
本発明に使用するエシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に属する微生物としては、トリ
プトファナーゼブロモーターと該プロモーターで発現さ
れるトリプトファナーゼ構造遺伝子を保有する菌株であ
れば特に限定されるものではないが、例えば、エシエリ
ヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ａ
ＴＣＣ ２７３２５．同Ｉ ＦＯ ３３０１，同ＹＫ
３００２ ［微工研条寄第１７３３号（微工研菌寄
第８８４４号より移管）、同ＹＫ ３００３［Ｉ！ｌ
工研条寄 第１７３４号（微工研菌寄 第８８４５号よ
り移管）］、同ＹＫ ３００７ （微工研菌寄 第
１０５４３号）等が好適に用いられる． 以上に述べたエシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ）に属する微生物の培養は、実質的に
酢酸又はその塩のみを炭素源として添加し、さらに窒素
源、無機塩、成長促進物質等の栄養分を含む培地にて行
うことができる。
ｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に属する微生物としては、トリ
プトファナーゼブロモーターと該プロモーターで発現さ
れるトリプトファナーゼ構造遺伝子を保有する菌株であ
れば特に限定されるものではないが、例えば、エシエリ
ヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ａ
ＴＣＣ ２７３２５．同Ｉ ＦＯ ３３０１，同ＹＫ
３００２ ［微工研条寄第１７３３号（微工研菌寄
第８８４４号より移管）、同ＹＫ ３００３［Ｉ！ｌ
工研条寄 第１７３４号（微工研菌寄 第８８４５号よ
り移管）］、同ＹＫ ３００７ （微工研菌寄 第
１０５４３号）等が好適に用いられる． 以上に述べたエシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ）に属する微生物の培養は、実質的に
酢酸又はその塩のみを炭素源として添加し、さらに窒素
源、無機塩、成長促進物質等の栄養分を含む培地にて行
うことができる。
培地に含ませる窒素源としては、例えば、硫酸アンモニ
ウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、燐酸アン
モニウム等のアンモニウム塩；硝酸カリ、硝酸ナトリウ
ム、硝酸アンモニウム等の硝酸塩：グルタミン酸、グル
タミン、アスパラギン酸、アスパラギン等の有機窒素；
アンモニアなどを単独もしくは混合して用いることが
でき、無機塩としては、例えば、リン酸一水素カリウム
、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、
硫酸マンガンなどを単独もしくは混合して用いることが
できる．該微生物の成長促進物質としては、サイアミン
、ビオチン等のビタミン類； メチオニン、システイン
等のアミノ酸；あるいはこれら全部若しくは部分的に含
有する酵母エキス、ポリペプトン、肉エキス、コーンス
テイーブリカー カザミノ酸等が用いられる．また、培
地にＬ一又はＤＬ−トリブトフ７ンを添加することはト
リプトファナーゼの製造には好ましい。
ウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、燐酸アン
モニウム等のアンモニウム塩；硝酸カリ、硝酸ナトリウ
ム、硝酸アンモニウム等の硝酸塩：グルタミン酸、グル
タミン、アスパラギン酸、アスパラギン等の有機窒素；
アンモニアなどを単独もしくは混合して用いることが
でき、無機塩としては、例えば、リン酸一水素カリウム
、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、
硫酸マンガンなどを単独もしくは混合して用いることが
できる．該微生物の成長促進物質としては、サイアミン
、ビオチン等のビタミン類； メチオニン、システイン
等のアミノ酸；あるいはこれら全部若しくは部分的に含
有する酵母エキス、ポリペプトン、肉エキス、コーンス
テイーブリカー カザミノ酸等が用いられる．また、培
地にＬ一又はＤＬ−トリブトフ７ンを添加することはト
リプトファナーゼの製造には好ましい。
培地中に添加するＬ一又はＤＬ−｝リプトファン量は、
特に制限されるものではないが、好ましくはｏ．ｏｉ〜
２重量％、さらに好ましくは０．０５〜０．５重量％で
ある。
特に制限されるものではないが、好ましくはｏ．ｏｉ〜
２重量％、さらに好ましくは０．０５〜０．５重量％で
ある。
培地温度は１０〜４５℃、好ましくは２５〜４０℃の範
囲であり、培地のｐＨは３〜１ ０， 好ましくは５
〜９の範囲である．培養中のｐＨに変化がある場合には
アンモニア、苛性ソーダ、苛性加里などで上記の範囲内
で、一定に保持することが望ましい．培養時間は、通常
５〜４８時間行われる． さらに培養は好気的条件下で行い、培養中の溶存酸素が
律速因子とならないように、通気攪拌をすることが望ま
しい。
囲であり、培地のｐＨは３〜１ ０， 好ましくは５
〜９の範囲である．培養中のｐＨに変化がある場合には
アンモニア、苛性ソーダ、苛性加里などで上記の範囲内
で、一定に保持することが望ましい．培養時間は、通常
５〜４８時間行われる． さらに培養は好気的条件下で行い、培養中の溶存酸素が
律速因子とならないように、通気攪拌をすることが望ま
しい。
培養液中への酢酸又はその塩の添加量は特に制限されろ
ものではないが、通常０．０５〜２０重量％、好ましく
は０．１〜５重量％である。なお、酢酸の塩としては酢
酸ナトリウム、酢酸カリウム、ｒｌＦｍアンモニウム等
が好適に用いられる。 以下、実施例を挙げてざらに
洋纏に本発明を説明する。
ものではないが、通常０．０５〜２０重量％、好ましく
は０．１〜５重量％である。なお、酢酸の塩としては酢
酸ナトリウム、酢酸カリウム、ｒｌＦｍアンモニウム等
が好適に用いられる。 以下、実施例を挙げてざらに
洋纏に本発明を説明する。
以下の実施例において、トリプトファナーゼ活性の測定
は、次の方法で実施した。
は、次の方法で実施した。
培養ｔＮ ２ ０ ｍ ’ｌから遠心分１ｉ（４０００
ＲＰＭ，１５分間，４℃）した菌体を１００ミリｍｏＱ
リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）２０ｍ２に！ｌ！！濁後再
び遠心分ＡＩ（４０００ＲＰＭ，１５分間，４℃）して
菌体を集める。該集菌体を上記緩衝液２ ｔｎ ｊｌに
懸濁後、超音波破砕処理（ブランソン製ソニファイヤー
２００）を行い、該処理物を遠心分ｉｌｌ （１ ２０
００ＲＰＭ，４０分間，４℃）した上清液を供試酵素液
とした。
ＲＰＭ，１５分間，４℃）した菌体を１００ミリｍｏＱ
リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）２０ｍ２に！ｌ！！濁後再
び遠心分ＡＩ（４０００ＲＰＭ，１５分間，４℃）して
菌体を集める。該集菌体を上記緩衝液２ ｔｎ ｊｌに
懸濁後、超音波破砕処理（ブランソン製ソニファイヤー
２００）を行い、該処理物を遠心分ｉｌｌ （１ ２０
００ＲＰＭ，４０分間，４℃）した上清液を供試酵素液
とした。
反応は、上記酵素液を１００ミリｍｏｓ！リン酸緩衝液
（ｐＨ ８． ０）にて適当量希釈後、該希釈｝１
更０．１ｍ２と反応液［Ｌ一トリブトファンｌＯミリｍ
ｏ２， ビリドキサールリンＭＯ．０４ミリｍｏ２を
含有する１００ミリｍ ｏ ２リン酸緩衝液（ｐＨ８．
０）１ ０．９ｍ２を含む試験管に添加して３７℃にて
恒温水槽中で２０分間振盪反応を行う。反応はｌＯ這重
％トリクロル酢＃１ｍ２を添加して停止後、遠心分ｉｔ
（４０００ＲＰＭ，１５分間，４℃）にて得た上清液中
の生成インドール量をガスクロマトグラフィー（島津製
，ＧＣ−３８Ｆ）により定量した． また供試酵素液中のタンパク質量の測定は、Ｌｏ ｗ
ｒ ｙ等の方法（ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏ
ｇｉｃａｌ Ｃｈｅ＋ｓｉｓｔｒｙ， ｖｏｌ １９３
， １１． ２６５， １９５ｔ年）に従い求めた．ト
リプトファナーゼの活性は、単位タンパク質量当り１時
問に生成するインドール徽をもって表示した． 実施ｒ１４１ 第１表に示した培地１ ０ ０ ｍ Ｓ！を５ ０ ０
ｍ ２容三角フラスコに分注し、１２０℃で１５分間
滅菌処理したものにトリプトファナーゼ生産菌であるエ
シエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃ ｏ ｌ
ｉ ） ＡＴＣＣ ２７３２５を植菌し、 ３７
℃で１日間振盪培養後、該ｉｓ ｉ物の２ ０ ｍ ｌ
を同様（こして調製した培地１ ０ ０ ０ ｍ ２に
接種し、通気攪拌培養槽を用い、３７℃にて回転数６
０ Ｏ ＲＰＭ、通気量１ｖ■、ｐＨ７．２（２８％ア
ンモニア水で調整）にて８時間培養した。
（ｐＨ ８． ０）にて適当量希釈後、該希釈｝１
更０．１ｍ２と反応液［Ｌ一トリブトファンｌＯミリｍ
ｏ２， ビリドキサールリンＭＯ．０４ミリｍｏ２を
含有する１００ミリｍ ｏ ２リン酸緩衝液（ｐＨ８．
０）１ ０．９ｍ２を含む試験管に添加して３７℃にて
恒温水槽中で２０分間振盪反応を行う。反応はｌＯ這重
％トリクロル酢＃１ｍ２を添加して停止後、遠心分ｉｔ
（４０００ＲＰＭ，１５分間，４℃）にて得た上清液中
の生成インドール量をガスクロマトグラフィー（島津製
，ＧＣ−３８Ｆ）により定量した． また供試酵素液中のタンパク質量の測定は、Ｌｏ ｗ
ｒ ｙ等の方法（ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏ
ｇｉｃａｌ Ｃｈｅ＋ｓｉｓｔｒｙ， ｖｏｌ １９３
， １１． ２６５， １９５ｔ年）に従い求めた．ト
リプトファナーゼの活性は、単位タンパク質量当り１時
問に生成するインドール徽をもって表示した． 実施ｒ１４１ 第１表に示した培地１ ０ ０ ｍ Ｓ！を５ ０ ０
ｍ ２容三角フラスコに分注し、１２０℃で１５分間
滅菌処理したものにトリプトファナーゼ生産菌であるエ
シエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃ ｏ ｌ
ｉ ） ＡＴＣＣ ２７３２５を植菌し、 ３７
℃で１日間振盪培養後、該ｉｓ ｉ物の２ ０ ｍ ｌ
を同様（こして調製した培地１ ０ ０ ０ ｍ ２に
接種し、通気攪拌培養槽を用い、３７℃にて回転数６
０ Ｏ ＲＰＭ、通気量１ｖ■、ｐＨ７．２（２８％ア
ンモニア水で調整）にて８時間培養した。
第１表
酢酸ナトリウム １０ｇＬ，
− トリブトファン ０．５ｇＫＨ２Ｐ
Ｏ４ １．６ｇ１’＜２８
ＰＯ４ ５．５ｇ（Ｎ ｝
ｈ） ２ Ｓ ０４
３． Ｏ ｇＭ ｇ Ｓ Ｏ ４
・７Ｈ２０ ０．１ｇＦ ｅ Ｓ Ｏ
ａ ・７ Ｈ２０ ８ ０ｍ ｇ力ザ
Ｓ）ｒｌｌ （Ｄ ＩＦＣＯ） ５．
０ｇ蒸留水を加えて １ ０ ０ ０
ｍ Ｓｔ（ｐＨ． ７． ２） 培養終了後、ｔ１！養液２０ｍ２から遠心分離を行い、
前記した方法にてトリプトファナーゼ活性を測定した。
− トリブトファン ０．５ｇＫＨ２Ｐ
Ｏ４ １．６ｇ１’＜２８
ＰＯ４ ５．５ｇ（Ｎ ｝
ｈ） ２ Ｓ ０４
３． Ｏ ｇＭ ｇ Ｓ Ｏ ４
・７Ｈ２０ ０．１ｇＦ ｅ Ｓ Ｏ
ａ ・７ Ｈ２０ ８ ０ｍ ｇ力ザ
Ｓ）ｒｌｌ （Ｄ ＩＦＣＯ） ５．
０ｇ蒸留水を加えて １ ０ ０ ０
ｍ Ｓｔ（ｐＨ． ７． ２） 培養終了後、ｔ１！養液２０ｍ２から遠心分離を行い、
前記した方法にてトリプトファナーゼ活性を測定した。
なお、比較例として、第１表の培地乞こ於で酢酸ナトリ
ウムをグルコース１０ｇに換えた培地を用いて培養を行
った。
ウムをグルコース１０ｇに換えた培地を用いて培養を行
った。
結果を第２表に示した．
第２表
実施例２
菌株としてエシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｂｉ
ａ ｃｏｌｉ）ＹＫ ３００７ （＊工研菌寄第
１ ０５４３号） を用いた以外は実施例１と同 様の操作を行った． 結果を第３表に示した。
ａ ｃｏｌｉ）ＹＫ ３００７ （＊工研菌寄第
１ ０５４３号） を用いた以外は実施例１と同 様の操作を行った． 結果を第３表に示した。
第３表
Claims (1)
- （１）トリプトファナーゼプロモーターと該プロモータ
ーで発現されるトリプトファナーゼ構造遺伝子を保有す
るエシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉ）に属する微生物を培養して、その菌体内にトリプ
トファナーゼを産生せしめるに当り、実質的に酢酸又は
その塩のみを炭素源として培養することを特徴とするト
リプトファナーゼの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15589389A JPH0322980A (ja) | 1989-06-20 | 1989-06-20 | トリプトファナーゼの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15589389A JPH0322980A (ja) | 1989-06-20 | 1989-06-20 | トリプトファナーゼの製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0322980A true JPH0322980A (ja) | 1991-01-31 |
Family
ID=15615806
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15589389A Pending JPH0322980A (ja) | 1989-06-20 | 1989-06-20 | トリプトファナーゼの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0322980A (ja) |
-
1989
- 1989-06-20 JP JP15589389A patent/JPH0322980A/ja active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH10127298A (ja) | アカルボース調製のためのオスモル濃度制御発酵法 | |
| JPH0322980A (ja) | トリプトファナーゼの製造方法 | |
| CN116042753B (zh) | 一种玉米浆菌体蛋白复合水解液的制备方法及l-异亮氨酸的制备方法 | |
| JPH0346115B2 (ja) | ||
| US3196084A (en) | Process for preparing cephalosporin c | |
| JPH0591895A (ja) | Ｄ−セリンの製造法 | |
| JPH0468906B2 (ja) | ||
| JPS6117475B2 (ja) | ||
| JPS63267285A (ja) | Ｌ−バリンの製造法 | |
| JPH04349879A (ja) | ブレビバクテリウム属微生物の培養法 | |
| JP2899071B2 (ja) | Ｌ―α―アラニンの製造法 | |
| JPH01101891A (ja) | Ｌ−スレオニンの製造法 | |
| JPS604720B2 (ja) | 醗酵方法 | |
| JPS63254990A (ja) | 発酵法によるｌ−スレオニンの製造法 | |
| JPS62289194A (ja) | フエニルアラニン又はその誘導体の製造法 | |
| JPH0424992B2 (ja) | ||
| JPH01120296A (ja) | Ｌ−イソロイシンの製造法 | |
| JPS61268175A (ja) | トリプトフアン・シンセタ−ゼ生産菌培養法 | |
| JPS61260891A (ja) | 発酵法によるｌ−スレオニンの製造方法 | |
| JPH03266977A (ja) | β‐チロシナーゼ含有菌の培養方法 | |
| JPS59120094A (ja) | 発酵法によるｌ−プロリンの製法 | |
| JPH0365193A (ja) | Ｌ―プロリンの製造方法 | |
| JPH0427396A (ja) | Ｌ―アスパラギン酸の製造法 | |
| JPS635080B2 (ja) | ||
| JPS6142555B2 (ja) |