JPH10179149A - 低温保存細胞の解凍方法 - Google Patents
低温保存細胞の解凍方法Info
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- JPH10179149A JPH10179149A JP9256534A JP25653497A JPH10179149A JP H10179149 A JPH10179149 A JP H10179149A JP 9256534 A JP9256534 A JP 9256534A JP 25653497 A JP25653497 A JP 25653497A JP H10179149 A JPH10179149 A JP H10179149A
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Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/10—Preservation of living parts
- A01N1/16—Physical preservation processes
- A01N1/162—Temperature processes, e.g. following predefined temperature changes over time
-
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- A01N1/122—Preservation or perfusion media
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Abstract
(57)【要約】
本発明は低温保存細胞を中温（例：３０〜４３℃）で解
凍し、かつ平衡化することにより、低温保存細胞を処理
する方法を提供する。低温保存媒体内の細胞懸濁液を３
５〜４３℃の温度まで解凍する工程と、低温保存媒体を
培養基を用いて３５〜４３℃の温度で平衡化する工程と
のうちの少なくともいずれか一方を実施する。低温保存
細胞を中温において解凍し、かつ平衡化することによ
り、細胞の生存度（特に、カルチャーの３時間後の生存
度）及び代謝活動（即ち、ジアゼパム代謝）を従来の低
温細胞処理（即ち、約２〜８℃の温度における処理）で
処理した場合よりも高くできる。
凍し、かつ平衡化することにより、低温保存細胞を処理
する方法を提供する。低温保存媒体内の細胞懸濁液を３
５〜４３℃の温度まで解凍する工程と、低温保存媒体を
培養基を用いて３５〜４３℃の温度で平衡化する工程と
のうちの少なくともいずれか一方を実施する。低温保存
細胞を中温において解凍し、かつ平衡化することによ
り、細胞の生存度（特に、カルチャーの３時間後の生存
度）及び代謝活動（即ち、ジアゼパム代謝）を従来の低
温細胞処理（即ち、約２〜８℃の温度における処理）で
処理した場合よりも高くできる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は低温で保存された細
胞（Cryopreserved cells；以下、低温保存細胞と称す
る）の処理方法に関する。
胞（Cryopreserved cells；以下、低温保存細胞と称す
る）の処理方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】細胞を
後日使用すべく同細胞を蘇生可能な状態で保存媒体内に
保存できる（例：低温保存）。例えば、卵子、精子及び
肝細胞等の哺乳類の細胞は効果的に低温保存できる。低
温保存技術は過去１０年間にわたって開発され、かつ改
良されてきた。しかし、完全な代謝活動レベルを有する
細胞が必要になるまでの間、解凍した細胞は処理の全期
間を通じて低温（即ち、約４℃）に常には維持される。
解凍した細胞を低温細胞懸濁液（Cold cell suspension
s）として維持し、かつ取扱うことにより、細胞の活動
を損失する危険をともなうことなく同細胞を取扱い、か
つ処置場所まで移動できる。
後日使用すべく同細胞を蘇生可能な状態で保存媒体内に
保存できる（例：低温保存）。例えば、卵子、精子及び
肝細胞等の哺乳類の細胞は効果的に低温保存できる。低
温保存技術は過去１０年間にわたって開発され、かつ改
良されてきた。しかし、完全な代謝活動レベルを有する
細胞が必要になるまでの間、解凍した細胞は処理の全期
間を通じて低温（即ち、約４℃）に常には維持される。
解凍した細胞を低温細胞懸濁液（Cold cell suspension
s）として維持し、かつ取扱うことにより、細胞の活動
を損失する危険をともなうことなく同細胞を取扱い、か
つ処置場所まで移動できる。
【０００３】
【課題を解決するための手段】本発明は低温保存細胞を
中温（例：３０〜４３℃）で解凍し、かつ平衡化するこ
とにより、低温保存細胞を処理する方法を提供する。低
温保存媒体内の細胞懸濁液を３５〜４３℃の温度まで解
凍する工程と、細胞懸濁液を希釈すべく培養基を３５〜
４３℃の温度で加えることにより、低温保存媒体を平衡
化する工程とのうちの少なくともいずれか一方を実施す
る。低温保存細胞を中温において解凍し、かつ平衡化す
ることにより、細胞の生存度（特に、インキュベーター
内に保存されたカルチャーの３時間後の生存度）及び代
謝活動（例：ジアゼパム代謝）を従来の低温細胞処理
（即ち、約２〜８℃の温度における処理）で処理した場
合よりも高くできる。
中温（例：３０〜４３℃）で解凍し、かつ平衡化するこ
とにより、低温保存細胞を処理する方法を提供する。低
温保存媒体内の細胞懸濁液を３５〜４３℃の温度まで解
凍する工程と、細胞懸濁液を希釈すべく培養基を３５〜
４３℃の温度で加えることにより、低温保存媒体を平衡
化する工程とのうちの少なくともいずれか一方を実施す
る。低温保存細胞を中温において解凍し、かつ平衡化す
ることにより、細胞の生存度（特に、インキュベーター
内に保存されたカルチャーの３時間後の生存度）及び代
謝活動（例：ジアゼパム代謝）を従来の低温細胞処理
（即ち、約２〜８℃の温度における処理）で処理した場
合よりも高くできる。
【０００４】１つの態様において、本発明は低温保存細
胞を蘇生する方法を提供する。同方法は凍結保護媒体
（Cryoprotective medium）内に低温保存された凍結細
胞を第１の細胞懸濁液を形成すべく解凍する工程と、第
１の細胞懸濁液を希釈すべく、第１の量の培養基を添加
する工程と、第２の細胞懸濁液を形成すべく、第２の培
養基または生理食塩水から選択された流体を用いて凍結
保護媒体を除去するために細胞を洗浄する工程とを含
む。前記の解凍工程及び添加工程の少なくとも一方は３
０〜４３℃の温度で実施される。第１の培養基及び第２
の培養基は同一であり得る。
胞を蘇生する方法を提供する。同方法は凍結保護媒体
（Cryoprotective medium）内に低温保存された凍結細
胞を第１の細胞懸濁液を形成すべく解凍する工程と、第
１の細胞懸濁液を希釈すべく、第１の量の培養基を添加
する工程と、第２の細胞懸濁液を形成すべく、第２の培
養基または生理食塩水から選択された流体を用いて凍結
保護媒体を除去するために細胞を洗浄する工程とを含
む。前記の解凍工程及び添加工程の少なくとも一方は３
０〜４３℃の温度で実施される。第１の培養基及び第２
の培養基は同一であり得る。
【０００５】別の態様において、本発明は低温保存され
た肝細胞（以下、低温保存肝細胞と称する）を蘇生する
方法であって、肝細胞懸濁液を形成すべく、低温保存肝
細胞を凍結保護媒体から解凍する工程と、凍結保護媒体
を希釈すべく、第１の培養基を３０〜４３℃の温度で添
加する工程と、最終的な肝細胞懸濁液を形成すべく、肝
細胞を第２の培養基または生理食塩水で洗浄する工程
と、前記の洗浄工程は肝細胞を凍結保護媒体から分離
し、かつ第２の培養基または生理食塩水を添加すること
により行うことを含む方法を提供する。
た肝細胞（以下、低温保存肝細胞と称する）を蘇生する
方法であって、肝細胞懸濁液を形成すべく、低温保存肝
細胞を凍結保護媒体から解凍する工程と、凍結保護媒体
を希釈すべく、第１の培養基を３０〜４３℃の温度で添
加する工程と、最終的な肝細胞懸濁液を形成すべく、肝
細胞を第２の培養基または生理食塩水で洗浄する工程
と、前記の洗浄工程は肝細胞を凍結保護媒体から分離
し、かつ第２の培養基または生理食塩水を添加すること
により行うことを含む方法を提供する。
【０００６】好ましい態様において、前記の添加工程は
３０〜４３℃、好ましくは３５〜４３℃で実施する。別
の好ましい実施の形態において、前記の解凍工程は３０
〜４３℃、好ましくは３５〜４３℃で実施する。最も好
ましくは、前記の添加工程及び解凍工程を３０〜４３
℃、好ましくは３５〜４３℃でそれぞれ実施する。
３０〜４３℃、好ましくは３５〜４３℃で実施する。別
の好ましい実施の形態において、前記の解凍工程は３０
〜４３℃、好ましくは３５〜４３℃で実施する。最も好
ましくは、前記の添加工程及び解凍工程を３０〜４３
℃、好ましくは３５〜４３℃でそれぞれ実施する。
【０００７】好ましい態様において、細胞は肝細胞、膵
島、軟骨細胞（Chondrocytes）、軟骨を構成する細胞
（Cartilage cells）、神経細胞または血液細胞等の哺
乳類の細胞である。最も好ましい哺乳類の細胞は肝細胞
である。
島、軟骨細胞（Chondrocytes）、軟骨を構成する細胞
（Cartilage cells）、神経細胞または血液細胞等の哺
乳類の細胞である。最も好ましい哺乳類の細胞は肝細胞
である。
【０００８】前記の洗浄工程は細胞を凍結保護媒体から
分離（例：遠心分離）し、次いで培養基または生理食塩
水を細胞に添加することにより行い得る。本明細書中に
おける“平衡（Equilibration）”または“平衡化（Equ
ilibrating）”という用語は保護媒体内の細胞懸濁液を
希釈し、かつ細胞を取り囲む溶液の浸透度を低下させる
ことにより保護媒体の除去を促進すべく、ほぼ同一体積
の培養基を添加することを意味する。
分離（例：遠心分離）し、次いで培養基または生理食塩
水を細胞に添加することにより行い得る。本明細書中に
おける“平衡（Equilibration）”または“平衡化（Equ
ilibrating）”という用語は保護媒体内の細胞懸濁液を
希釈し、かつ細胞を取り囲む溶液の浸透度を低下させる
ことにより保護媒体の除去を促進すべく、ほぼ同一体積
の培養基を添加することを意味する。
【０００９】低温保存細胞を蘇生する方法は以下に示す
複数の効果のうちの１つ以上を有し得る。低温保存細胞
（例：肝細胞）を３７℃付近の温度において解凍し、か
つ平衡化することにより、生存度の損失を低減し、かつ
更に高い細胞代謝率（例：ジアゼパム代謝）を実現でき
る。更に、一般的な低温方法によって解凍された細胞と
比べて、細胞は基体に対する改善された付着性と、改善
された生存度と、改善された形態とを示し得る。中温で
の細胞解凍及び平衡化は低温保存肝細胞の収量及び機能
を高め得る。一般的に、３７℃において解凍され、かつ
平衡化された肝細胞の平均的なジアゼパン機能は活発な
細胞の機能の７０％を示す。その一方、４℃で解凍さ
れ、かつ平衡化された肝細胞は活発な細胞の機能の２７
％という低い値のジアゼパン代謝を有し得る。３７℃に
おける解凍または平衡化は低温保存細胞を４℃で解凍し
た際に生じる細胞の膨張及び死を防止すること等によ
り、安定した細胞を実現し得る。中温処理した細胞は更
に小さな膨張、更に少ない小水疱形成、及び更に少ない
量の血球影を示す。これは低温において発生し得る細胞
膜の損傷が防止されていることを示すと考えられる。更
に、中温処理における処理温度は環境温度に近いため、
中温処理は簡単である。
複数の効果のうちの１つ以上を有し得る。低温保存細胞
（例：肝細胞）を３７℃付近の温度において解凍し、か
つ平衡化することにより、生存度の損失を低減し、かつ
更に高い細胞代謝率（例：ジアゼパム代謝）を実現でき
る。更に、一般的な低温方法によって解凍された細胞と
比べて、細胞は基体に対する改善された付着性と、改善
された生存度と、改善された形態とを示し得る。中温で
の細胞解凍及び平衡化は低温保存肝細胞の収量及び機能
を高め得る。一般的に、３７℃において解凍され、かつ
平衡化された肝細胞の平均的なジアゼパン機能は活発な
細胞の機能の７０％を示す。その一方、４℃で解凍さ
れ、かつ平衡化された肝細胞は活発な細胞の機能の２７
％という低い値のジアゼパン代謝を有し得る。３７℃に
おける解凍または平衡化は低温保存細胞を４℃で解凍し
た際に生じる細胞の膨張及び死を防止すること等によ
り、安定した細胞を実現し得る。中温処理した細胞は更
に小さな膨張、更に少ない小水疱形成、及び更に少ない
量の血球影を示す。これは低温において発生し得る細胞
膜の損傷が防止されていることを示すと考えられる。更
に、中温処理における処理温度は環境温度に近いため、
中温処理は簡単である。
【００１０】本発明の他の特徴及び効果は以下に詳述す
る本発明の詳細な説明及び請求の範囲から明らかであ
る。
る本発明の詳細な説明及び請求の範囲から明らかであ
る。
【００１１】
【発明の実施の形態】約３０〜４３℃の中温で平衡化し
た低温保存細胞は保護媒体を実質的に含まないことが可
能である。中温平衡化工程前に、液体窒素温度または液
体窒素温度付近の温度から中温まで解凍した低温保存細
胞は改善された生存度及び代謝活動を示した。一般的
に、中温で処理した細胞と比較して、４℃で解凍し、４
℃で平衡化し、かつ４℃で洗浄することによって蘇生さ
せた細胞は低い収量、低い生存度及び低い機能を示す。
特に重要な点としては、解凍から３時間経過した後での
生存度（３７℃に維持されたインキュベーター内で３時
間培養した細胞の生存度）が挙げられる。低温処理した
細胞の場合、解凍から３時間経過した後における生存度
は中温処理した細胞と比べて極端に低い。従来の低温処
理技術を用いて蘇生させた低温保存肝細胞を３７℃に維
持されたペトリ皿内の生体外カルチャーにおいて培養し
た場合、同肝細胞は解凍直後の生存度の約２５〜４０％
を最初の３時間以内に常には損失する。これとは対照的
に、中温での平衡化によって蘇生させた細胞は解凍直後
の生存度の約８％を３時間の培養後に失ったのみであ
る。初期解凍または平衡化を４℃より高い温度で実施し
た任意の低温保存細胞は更に高い生存度及び代謝活動を
示す。更に、解凍及び平衡化を更に高い温度で実施した
細胞は更に高い生存度及びパフォーマンスを示す。細胞
の代謝レベルを活性細胞（Active cells）が必要になる
まで低く維持すべく、最後に実施する洗浄は低温の生理
食塩水または媒体を用いて行う必要がある。
た低温保存細胞は保護媒体を実質的に含まないことが可
能である。中温平衡化工程前に、液体窒素温度または液
体窒素温度付近の温度から中温まで解凍した低温保存細
胞は改善された生存度及び代謝活動を示した。一般的
に、中温で処理した細胞と比較して、４℃で解凍し、４
℃で平衡化し、かつ４℃で洗浄することによって蘇生さ
せた細胞は低い収量、低い生存度及び低い機能を示す。
特に重要な点としては、解凍から３時間経過した後での
生存度（３７℃に維持されたインキュベーター内で３時
間培養した細胞の生存度）が挙げられる。低温処理した
細胞の場合、解凍から３時間経過した後における生存度
は中温処理した細胞と比べて極端に低い。従来の低温処
理技術を用いて蘇生させた低温保存肝細胞を３７℃に維
持されたペトリ皿内の生体外カルチャーにおいて培養し
た場合、同肝細胞は解凍直後の生存度の約２５〜４０％
を最初の３時間以内に常には損失する。これとは対照的
に、中温での平衡化によって蘇生させた細胞は解凍直後
の生存度の約８％を３時間の培養後に失ったのみであ
る。初期解凍または平衡化を４℃より高い温度で実施し
た任意の低温保存細胞は更に高い生存度及び代謝活動を
示す。更に、解凍及び平衡化を更に高い温度で実施した
細胞は更に高い生存度及びパフォーマンスを示す。細胞
の代謝レベルを活性細胞（Active cells）が必要になる
まで低く維持すべく、最後に実施する洗浄は低温の生理
食塩水または媒体を用いて行う必要がある。
【００１２】当業者は更なる詳述を要することなく本明
細書に基づいて本発明を完全に利用できる。本明細書中
に開示する全ての引用文献は本開示をもって全ての内容
を本明細書中に開示したものとする。従って、以下の特
定の例は本発明を単に例示することを目的としており、
本発明を限定するものではない。
細書に基づいて本発明を完全に利用できる。本明細書中
に開示する全ての引用文献は本開示をもって全ての内容
を本明細書中に開示したものとする。従って、以下の特
定の例は本発明を単に例示することを目的としており、
本発明を限定するものではない。
【００１３】例えば、低温保存された豚の肝細胞（以
下、低温保存豚肝細胞と称する）を凍結保護媒体から蘇
生させた場合、同肝細胞は培養基または生理食塩水中の
生きた細胞の懸濁液を形成する。蘇生させる細胞の数量
は処理後の細胞の用途に基づいて決定される。生物学的
人工肝臓サポート・システム（Bioartificial liver su
pport system）では、約５ｘ１０9個の生きた細胞が容
器内に含まれている。低温保存肝細胞の例は１９９３年
に発行された低温生物学（Cryobiology）第３０刊の１
〜１１頁に記載されているカサイ他の文献に開示されて
いる。
下、低温保存豚肝細胞と称する）を凍結保護媒体から蘇
生させた場合、同肝細胞は培養基または生理食塩水中の
生きた細胞の懸濁液を形成する。蘇生させる細胞の数量
は処理後の細胞の用途に基づいて決定される。生物学的
人工肝臓サポート・システム（Bioartificial liver su
pport system）では、約５ｘ１０9個の生きた細胞が容
器内に含まれている。低温保存肝細胞の例は１９９３年
に発行された低温生物学（Cryobiology）第３０刊の１
〜１１頁に記載されているカサイ他の文献に開示されて
いる。
【００１４】凍結した低温保存肝細胞の解凍は細胞懸濁
液を保護媒体内に形成すべく実施され、同解凍は低温保
存細胞を有するフレキシブル・バッグ（例：バクスター
・クリオサイト・バッグ（Baxter CRYOCYTE bag））を
温度制御した水浴中に浸漬することによって行われる。
より詳細には、バッグを液体窒素温度または液体窒素温
度付近の温度に維持された冷凍庫から取出す。各冷凍バ
ッグは約１０〜２００ｍｌの体積と、約１〜４ｘ１０9
個の生存細胞とを有する。次いで、低温保存肝細胞を含
む複数のバッグを前記の水浴中において常には同時に解
凍する。一般的に、解凍に使用する水浴はヒーター
（例：３０Ｗ／リットル以上のパワーを有するヒータ
ー）及び少なくとも１４リットルのキャパシティを有
し、かつ約３７〜４３℃の温度に維持される。凍結細胞
を凍結保護媒体内に有するバッグは解凍する体積に基づ
いて約２分間にわたって中温水中に浸漬される。この
間、バッグの内容物は約３５〜４３℃（例：３７℃）ま
で暖められる。
液を保護媒体内に形成すべく実施され、同解凍は低温保
存細胞を有するフレキシブル・バッグ（例：バクスター
・クリオサイト・バッグ（Baxter CRYOCYTE bag））を
温度制御した水浴中に浸漬することによって行われる。
より詳細には、バッグを液体窒素温度または液体窒素温
度付近の温度に維持された冷凍庫から取出す。各冷凍バ
ッグは約１０〜２００ｍｌの体積と、約１〜４ｘ１０9
個の生存細胞とを有する。次いで、低温保存肝細胞を含
む複数のバッグを前記の水浴中において常には同時に解
凍する。一般的に、解凍に使用する水浴はヒーター
（例：３０Ｗ／リットル以上のパワーを有するヒータ
ー）及び少なくとも１４リットルのキャパシティを有
し、かつ約３７〜４３℃の温度に維持される。凍結細胞
を凍結保護媒体内に有するバッグは解凍する体積に基づ
いて約２分間にわたって中温水中に浸漬される。この
間、バッグの内容物は約３５〜４３℃（例：３７℃）ま
で暖められる。
【００１５】細胞懸濁液を保護媒体内において中温まで
解凍した後、細胞を培養基を用いて平衡化する。この工
程において、培養基はバッグ内に案内され、同バッグは
解凍した細胞懸濁液を保護媒体内に有する。添加する培
養基の体積は解凍した細胞懸濁液の体積にほぼ等しいこ
とを要する。重力供給方式または自動細胞プロセッサ
（Automated cell processor）を用いることにより、培
養基を再シール可能なポート等を通じてバッグ内に案内
可能である。この工程では、外来汚染物質の侵入を防止
することが重要である。平衡化に使用する培養基を解凍
された細胞懸濁液へ添加する前に、同培養基を約３７〜
４３℃に加温する。平衡化工程は溶液の浸透度を低減す
ることにより、保護媒体内に含まれる凍結保護剤（Cryo
protectant）を細胞環境から除去することを促進する。
完全な平衡化は３０秒を越す時間を必要とする。
解凍した後、細胞を培養基を用いて平衡化する。この工
程において、培養基はバッグ内に案内され、同バッグは
解凍した細胞懸濁液を保護媒体内に有する。添加する培
養基の体積は解凍した細胞懸濁液の体積にほぼ等しいこ
とを要する。重力供給方式または自動細胞プロセッサ
（Automated cell processor）を用いることにより、培
養基を再シール可能なポート等を通じてバッグ内に案内
可能である。この工程では、外来汚染物質の侵入を防止
することが重要である。平衡化に使用する培養基を解凍
された細胞懸濁液へ添加する前に、同培養基を約３７〜
４３℃に加温する。平衡化工程は溶液の浸透度を低減す
ることにより、保護媒体内に含まれる凍結保護剤（Cryo
protectant）を細胞環境から除去することを促進する。
完全な平衡化は３０秒を越す時間を必要とする。
【００１６】適切な培養基はチー必須培養基（Chee's e
ssential medium：CEM）、修飾イーグル培養基（Modifi
ed eagle medium: MEM）、ダルベッコ修飾イーグル培養
基（Dulbecco's modified eagle medium: DMEM）、レー
ボヴィッツ培養基（Leibowitz's medium）、ウェイマウ
ス培養基（Waymouth's medium）及びクレブ培養基（Kre
b's medium）を含む。従来の培養基はアミノ酸または哺
乳類の血清等の別の成分を含む。本明細書中に開示する
豚肝細胞のための好ましい培養基は胎仔ウシ血清（Feta
l bovine serum: FBS）を含むＣＥＭ及びＤＭＥＭであ
る。保護媒体は添加物（例：凍結保護剤）を加えた培養
基である。従って、保護媒体中に懸濁された細胞は低温
保存処理に耐えて生き残り得る。一般的な保護媒体は最
大で１５％、好ましくは１０％のジメチルスルホキシド
（ＤＭＳＯ）を凍結保護剤として含む培養基である。保
護媒体は最大で２０％のＦＢＳを含み得る。
ssential medium：CEM）、修飾イーグル培養基（Modifi
ed eagle medium: MEM）、ダルベッコ修飾イーグル培養
基（Dulbecco's modified eagle medium: DMEM）、レー
ボヴィッツ培養基（Leibowitz's medium）、ウェイマウ
ス培養基（Waymouth's medium）及びクレブ培養基（Kre
b's medium）を含む。従来の培養基はアミノ酸または哺
乳類の血清等の別の成分を含む。本明細書中に開示する
豚肝細胞のための好ましい培養基は胎仔ウシ血清（Feta
l bovine serum: FBS）を含むＣＥＭ及びＤＭＥＭであ
る。保護媒体は添加物（例：凍結保護剤）を加えた培養
基である。従って、保護媒体中に懸濁された細胞は低温
保存処理に耐えて生き残り得る。一般的な保護媒体は最
大で１５％、好ましくは１０％のジメチルスルホキシド
（ＤＭＳＯ）を凍結保護剤として含む培養基である。保
護媒体は最大で２０％のＦＢＳを含み得る。
【００１７】細胞懸濁液を培養基を用いてバッグ内で平
衡化した後、同細胞懸濁液はコウビー２９９１細胞プロ
セッサ（COBE 2991 cell processor）等の細胞プロセッ
サ内に移送可能である。細胞プロセッサは液体を移動さ
せるためのポンプ及び管と、洗浄のための遠心分離器と
を有する。低温保存肝細胞の洗浄工程は細胞プロセッサ
内において実行できる。細胞プロセッサ内において、解
凍された細胞懸濁液を培養基で希釈する。遠心分離器を
使用することにより、細胞は媒体の混合物から実質的に
分離される。そして、実質的に細胞を含まない媒体は吸
引により細胞ペレットから除去される。この時点におい
て、細胞は凍結保護剤から実施的に分離される。細胞ペ
レットを培養基または生理食塩水等の別の流体を用いて
更に洗浄し得る。平衡化工程及び洗浄工程に使用する培
養基は同一であり得る。より詳細には、流体を細胞に添
加し、同細胞及び流体の混合物を細胞懸濁液を形成すべ
く攪拌する。そして、洗浄された細胞ペレットを形成す
べく、細胞懸濁液を遠心分離する。媒体、砕片及び凍結
保護剤を細胞から更に除去すべく洗浄を複数回繰り返し
得る。
衡化した後、同細胞懸濁液はコウビー２９９１細胞プロ
セッサ（COBE 2991 cell processor）等の細胞プロセッ
サ内に移送可能である。細胞プロセッサは液体を移動さ
せるためのポンプ及び管と、洗浄のための遠心分離器と
を有する。低温保存肝細胞の洗浄工程は細胞プロセッサ
内において実行できる。細胞プロセッサ内において、解
凍された細胞懸濁液を培養基で希釈する。遠心分離器を
使用することにより、細胞は媒体の混合物から実質的に
分離される。そして、実質的に細胞を含まない媒体は吸
引により細胞ペレットから除去される。この時点におい
て、細胞は凍結保護剤から実施的に分離される。細胞ペ
レットを培養基または生理食塩水等の別の流体を用いて
更に洗浄し得る。平衡化工程及び洗浄工程に使用する培
養基は同一であり得る。より詳細には、流体を細胞に添
加し、同細胞及び流体の混合物を細胞懸濁液を形成すべ
く攪拌する。そして、洗浄された細胞ペレットを形成す
べく、細胞懸濁液を遠心分離する。媒体、砕片及び凍結
保護剤を細胞から更に除去すべく洗浄を複数回繰り返し
得る。
【００１８】細胞ペレット内の細胞は移送用細胞懸濁液
を形成すべく移送媒体内に再び懸濁される。移送媒体は
生理食塩水または培養基であり得る。凍結保護剤を実質
的に含まない移送用細胞懸濁液を細胞プロセッサから容
器内に移す。
を形成すべく移送媒体内に再び懸濁される。移送媒体は
生理食塩水または培養基であり得る。凍結保護剤を実質
的に含まない移送用細胞懸濁液を細胞プロセッサから容
器内に移す。
【００１９】好ましい容器としては、シール可能な複数
のポートを有するフレキシブル・バッグ（例：シーディ
ング容器（Seeding vessel））が挙げられる。容器内に
含まれる細胞の濃度を測定すべく、細胞懸濁液のサンプ
ルを容器から取り出し得る。細胞は血球計数器等を用い
て数える。複数のポートは容器内の液体を環境から隔離
した状態（即ち、無菌状態）でサンプリングすることを
可能にする。更に、複数のポートは細胞懸濁液の完全性
を犠牲にすることなくサンプルを品質管理のために採取
することを可能にする。容器内に含まれる細胞の全数を
求めるべく、容器内の細胞懸濁液の全体積を重量分析ま
たは体積分析により測定し得る。細胞の量が所望の量よ
り多い場合、余剰細胞の量に等しい細胞懸濁液の重量
（または対応する体積）を取り除き得る。システムの全
体積を維持すべく、取り除いた体積を生理食塩水または
他の適切な媒体で補充し得る。細胞懸濁液の全ての操作
は無菌状態で実施されるため、細胞懸濁液は無菌状態に
維持される。含水マイクロキャリア（Hydrated microca
rriers）を必要に応じて肝細胞懸濁液に無菌状態で加え
得る。次いで、肝細胞を人工肝臓アプリケーションに使
用し得る。
のポートを有するフレキシブル・バッグ（例：シーディ
ング容器（Seeding vessel））が挙げられる。容器内に
含まれる細胞の濃度を測定すべく、細胞懸濁液のサンプ
ルを容器から取り出し得る。細胞は血球計数器等を用い
て数える。複数のポートは容器内の液体を環境から隔離
した状態（即ち、無菌状態）でサンプリングすることを
可能にする。更に、複数のポートは細胞懸濁液の完全性
を犠牲にすることなくサンプルを品質管理のために採取
することを可能にする。容器内に含まれる細胞の全数を
求めるべく、容器内の細胞懸濁液の全体積を重量分析ま
たは体積分析により測定し得る。細胞の量が所望の量よ
り多い場合、余剰細胞の量に等しい細胞懸濁液の重量
（または対応する体積）を取り除き得る。システムの全
体積を維持すべく、取り除いた体積を生理食塩水または
他の適切な媒体で補充し得る。細胞懸濁液の全ての操作
は無菌状態で実施されるため、細胞懸濁液は無菌状態に
維持される。含水マイクロキャリア（Hydrated microca
rriers）を必要に応じて肝細胞懸濁液に無菌状態で加え
得る。次いで、肝細胞を人工肝臓アプリケーションに使
用し得る。
【００２０】洗浄に使用する媒体の温度は細胞を使用す
る時期に基づいて決定する。蘇生した低温保存細胞を即
座に使用する場合、中温媒体を洗浄工程に使用すること
により十分な効果を得られる。この場合、媒体は約１５
〜４３℃の温度を有し得る。これに代えて、細胞を即座
に使用しない場合（即ち、１〜５時間以内に使用しない
場合）、最後の洗浄媒体を低温にする必要があるうえ、
活性細胞が必要（即ち、患者を人工肝臓サポート・シス
テムで治療するため）になるまでの間、培養基内または
生理食塩水内に存在する洗浄された細胞を４℃または４
℃付近の温度で保存する必要がある。低温媒体は約２〜
１５℃（好ましくは２〜８℃）の温度を有し得る。
る時期に基づいて決定する。蘇生した低温保存細胞を即
座に使用する場合、中温媒体を洗浄工程に使用すること
により十分な効果を得られる。この場合、媒体は約１５
〜４３℃の温度を有し得る。これに代えて、細胞を即座
に使用しない場合（即ち、１〜５時間以内に使用しない
場合）、最後の洗浄媒体を低温にする必要があるうえ、
活性細胞が必要（即ち、患者を人工肝臓サポート・シス
テムで治療するため）になるまでの間、培養基内または
生理食塩水内に存在する洗浄された細胞を４℃または４
℃付近の温度で保存する必要がある。低温媒体は約２〜
１５℃（好ましくは２〜８℃）の温度を有し得る。
【００２１】約３７℃における培養基を用いた細胞の平
衡化、または約３７℃における解凍（“中温処理”）の
影響を従来の方法に基づくコントロールとしての４℃に
おける解凍及び平衡化（“低温処理”）と比較すべく、
低温保存細胞を蘇生する方法は低温保存豚肝細胞を用い
て行った。生体外実験において、蘇生した低温保存肝細
胞の機能をジアゼパムを代謝する能力によって測定し、
細胞生存度を１：６で希釈したトリパンブルーの排除に
よって評価する一方で、血球計数器当たり８フィールド
のカウントを実施した。
衡化、または約３７℃における解凍（“中温処理”）の
影響を従来の方法に基づくコントロールとしての４℃に
おける解凍及び平衡化（“低温処理”）と比較すべく、
低温保存細胞を蘇生する方法は低温保存豚肝細胞を用い
て行った。生体外実験において、蘇生した低温保存肝細
胞の機能をジアゼパムを代謝する能力によって測定し、
細胞生存度を１：６で希釈したトリパンブルーの排除に
よって評価する一方で、血球計数器当たり８フィールド
のカウントを実施した。
【００２２】細胞蘇生プロセスは以下の通り実施した。
平衡化工程に使用した培養基（ＤＭＥＭ）を使用前に適
切な環境（例：３７〜４３℃の水浴、または３７〜４３
℃のインキュベーター）内に少なくとも４５分間にわた
って留置することにより、同培養基を約３７℃まで加温
した。クリオサイト・バッグ（１００ｍｌ）をクリオシ
ッパー（Cryoshipper）内の液体窒素貯蔵庫または気体
窒素貯蔵庫から取出し、次いで３７〜４３℃に維持され
た水浴中に迅速に浸漬した。バッグを１２０秒間にわた
って穏やかに攪拌した。この時点において、細胞懸濁液
は解凍され、かつ約３７℃まで加温された。解凍された
バッグを水浴から取出し、さらには細胞プロセッサ（即
ち、アメリカ合衆国カリフォルニア州レイクウッドに所
在するコウビー（Cobe）が製造したコウビー２９９１細
胞プロセッサ）に対して無菌状態で連結した。細胞懸濁
液を中温ＤＭＥＭを用いて平衡化した。細胞の１００ｍ
ｌバッグを解凍する場合、ＤＭＥＭはバッグを攪拌した
状態で同バッグに無菌状態で加えられ、同ＤＭＥＭの添
加はバッグの約半分が満たされるまで継続される。バッ
グをＤＭＥＭ溶液の添加から視覚的に読取った。
平衡化工程に使用した培養基（ＤＭＥＭ）を使用前に適
切な環境（例：３７〜４３℃の水浴、または３７〜４３
℃のインキュベーター）内に少なくとも４５分間にわた
って留置することにより、同培養基を約３７℃まで加温
した。クリオサイト・バッグ（１００ｍｌ）をクリオシ
ッパー（Cryoshipper）内の液体窒素貯蔵庫または気体
窒素貯蔵庫から取出し、次いで３７〜４３℃に維持され
た水浴中に迅速に浸漬した。バッグを１２０秒間にわた
って穏やかに攪拌した。この時点において、細胞懸濁液
は解凍され、かつ約３７℃まで加温された。解凍された
バッグを水浴から取出し、さらには細胞プロセッサ（即
ち、アメリカ合衆国カリフォルニア州レイクウッドに所
在するコウビー（Cobe）が製造したコウビー２９９１細
胞プロセッサ）に対して無菌状態で連結した。細胞懸濁
液を中温ＤＭＥＭを用いて平衡化した。細胞の１００ｍ
ｌバッグを解凍する場合、ＤＭＥＭはバッグを攪拌した
状態で同バッグに無菌状態で加えられ、同ＤＭＥＭの添
加はバッグの約半分が満たされるまで継続される。バッ
グをＤＭＥＭ溶液の添加から視覚的に読取った。
【００２３】細胞懸濁液を平衡化した後、細胞を約３７
℃の温度で洗浄した。平衡化された細胞懸濁液を細胞プ
ロセッサの遠心分離器内に位置する細胞処理バッグ内に
移し、細胞懸濁液を同細胞プロセッサ内で約１．２５分
間にわたって攪拌した。懸濁媒体からの細胞ペレットの
分離を実現する十分な時間にわたって遠心分離器を６０
０ｒｐｍで回転させた。約１．５分間の回転後、上澄み
液を細胞ペレットから吸引して取り除いた。この吸引は
細胞処理バッグ内の周辺部に残された細胞ペレット及び
上澄み液を十分除去するまで継続した。この時点におい
て、細胞を培養基内に再懸濁した。
℃の温度で洗浄した。平衡化された細胞懸濁液を細胞プ
ロセッサの遠心分離器内に位置する細胞処理バッグ内に
移し、細胞懸濁液を同細胞プロセッサ内で約１．２５分
間にわたって攪拌した。懸濁媒体からの細胞ペレットの
分離を実現する十分な時間にわたって遠心分離器を６０
０ｒｐｍで回転させた。約１．５分間の回転後、上澄み
液を細胞ペレットから吸引して取り除いた。この吸引は
細胞処理バッグ内の周辺部に残された細胞ペレット及び
上澄み液を十分除去するまで継続した。この時点におい
て、細胞を培養基内に再懸濁した。
【００２４】解凍工程及び平衡化工程を溶液及び懸濁液
を用いて約４℃で実施した点を除いて、低温処理を同様
に行った。３７℃に露出することにより改善された細胞
安定度及び生存度を実現する細胞処理中のポイントを確
認すべく複数の段階的実験を実施した。低温保存細胞の
１つのセットを４℃で解凍し、低温保存細胞の第２のセ
ットを３７℃で解凍した。各セットを２つのサンプルに
分割し、中温（３７℃）培養基または低温（４℃）培養
基を同２つのサンプルに対して添加した。更に、媒体を
用いた中温洗浄及び低温洗浄を実施すべく、各サンプル
を２つのバッチに分割した。
を用いて約４℃で実施した点を除いて、低温処理を同様
に行った。３７℃に露出することにより改善された細胞
安定度及び生存度を実現する細胞処理中のポイントを確
認すべく複数の段階的実験を実施した。低温保存細胞の
１つのセットを４℃で解凍し、低温保存細胞の第２のセ
ットを３７℃で解凍した。各セットを２つのサンプルに
分割し、中温（３７℃）培養基または低温（４℃）培養
基を同２つのサンプルに対して添加した。更に、媒体を
用いた中温洗浄及び低温洗浄を実施すべく、各サンプル
を２つのバッチに分割した。
【００２５】４℃での解凍及び平衡化（“低温処理”）
の後、細胞の生存度は細胞の蘇生直後に測定された７３
％の解凍直後初期生存度から生体外カルチャーでの３時
間培養後に測定された５０％まで低下した。３７℃での
解凍及び平衡化（“中温処理”）によって蘇生した細胞
は解凍直後に測定された７１％から生体外カルチャーで
の３時間培養後に測定された７０％まで低減したのみで
あった。更に、低温処理した細胞と比べて、中温処理し
た細胞はヴィトロゲン・プレート上における更に高いジ
アゼパム代謝、改善された細胞付着性、細胞生存度及び
細胞形態を蘇生後１日目に示した。低温処理された低温
保存肝細胞は１．４１μｇ／時間／１０ 6のジアゼパム
代謝を示した一方、中温処理された低温保存肝細胞は
３．１６μｇ／時間／１０6のジアゼパム代謝を示し
た。低温における細胞の解凍及び中温における細胞の平
衡化は蘇生した細胞の質を悪化させなかった。低温処理
した細胞は僅かな付着性を示した一方、３７℃で処理し
た細胞は更に強力な付着性を示した。細胞の強力な付着
性は細胞を拡げることと、融合性肝細胞単層のプラーク
（Plaques of confluent hepatocyte monolayers）の形
成とを可能にし、同融合性肝細胞単層のプラークは一般
的な活発な細胞の単層カルチャー（Fresh cell monolay
er culture）とは僅かに異なる。更に、中温処理した細
胞は更に小さな膨張、更に少ない小水疱形成、及び更に
少ない量の血球影を示す。これは低温において発生し得
る細胞膜の損傷が防止されていることを示すと考えられ
る。
の後、細胞の生存度は細胞の蘇生直後に測定された７３
％の解凍直後初期生存度から生体外カルチャーでの３時
間培養後に測定された５０％まで低下した。３７℃での
解凍及び平衡化（“中温処理”）によって蘇生した細胞
は解凍直後に測定された７１％から生体外カルチャーで
の３時間培養後に測定された７０％まで低減したのみで
あった。更に、低温処理した細胞と比べて、中温処理し
た細胞はヴィトロゲン・プレート上における更に高いジ
アゼパム代謝、改善された細胞付着性、細胞生存度及び
細胞形態を蘇生後１日目に示した。低温処理された低温
保存肝細胞は１．４１μｇ／時間／１０ 6のジアゼパム
代謝を示した一方、中温処理された低温保存肝細胞は
３．１６μｇ／時間／１０6のジアゼパム代謝を示し
た。低温における細胞の解凍及び中温における細胞の平
衡化は蘇生した細胞の質を悪化させなかった。低温処理
した細胞は僅かな付着性を示した一方、３７℃で処理し
た細胞は更に強力な付着性を示した。細胞の強力な付着
性は細胞を拡げることと、融合性肝細胞単層のプラーク
（Plaques of confluent hepatocyte monolayers）の形
成とを可能にし、同融合性肝細胞単層のプラークは一般
的な活発な細胞の単層カルチャー（Fresh cell monolay
er culture）とは僅かに異なる。更に、中温処理した細
胞は更に小さな膨張、更に少ない小水疱形成、及び更に
少ない量の血球影を示す。これは低温において発生し得
る細胞膜の損傷が防止されていることを示すと考えられ
る。
【００２６】前記の説明から、本発明の重要な特徴を確
認し得る。本発明の精神及び範囲から逸脱することな
く、各種の用途及び条件に適合させるべく本発明の実施
の形態の各種の変更及び修正が可能である。従って、他
の実施の形態も請求の範囲内に含まれる。
認し得る。本発明の精神及び範囲から逸脱することな
く、各種の用途及び条件に適合させるべく本発明の実施
の形態の各種の変更及び修正が可能である。従って、他
の実施の形態も請求の範囲内に含まれる。
フロントページの続き (72)発明者 カーミット エム．ボーランド アメリカ合衆国 01545 マサチューセッ ツ州シュルーズベリー パーク ストリー ト 43 (72)発明者 シュワン ピー．カイン アメリカ合衆国 01863 マサチューセッ ツ州ノース チェルムズフォード ウェル マン アヴェニュー 319 (72)発明者 クラウディ ジェイ−ピー ムロン アメリカ合衆国 01701 マサチューセッ ツ州フレーミングハム プロスペクト ス トリート 163
Claims (19)
- 【請求項１】 低温保存細胞を蘇生する方法であって、 凍結保護媒体内に低温保存された凍結細胞を第１の細胞
懸濁液を形成すべく解凍する工程と、 前記第１の細胞懸濁液を希釈すべく、第１の培養基を添
加する工程と、 第２の細胞懸濁液を形成すべく、第２の培養基または生
理食塩水から選択された流体を用いて凍結保護媒体を除
去するために前記細胞を洗浄する工程と、 前記解凍工程及び添加工程の少なくとも一方を３０〜４
３℃の温度で実施することを含む方法。 - 【請求項２】 前記細胞は哺乳類の細胞である請求項１
に記載の方法。 - 【請求項３】 前記哺乳類の細胞は肝細胞、膵島、軟骨
細胞、軟骨を構成する細胞、神経細胞または血液細胞で
ある請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】 前記哺乳類の細胞は肝細胞である請求項
２に記載の方法。 - 【請求項５】 前記添加工程は３０〜４３℃で実施する
請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】 前記解凍工程は３０〜４３℃で実施する
請求項５に記載の方法。 - 【請求項７】 前記解凍工程は３５〜４３℃で実施する
請求項５に記載の方法。 - 【請求項８】 前記細胞は哺乳類の細胞である請求項７
に記載の方法。 - 【請求項９】 前記哺乳類の細胞は肝細胞、膵島、軟骨
細胞、軟骨を構成する細胞、神経細胞または血液細胞で
ある請求項８に記載の方法 - 【請求項１０】 前記哺乳類の細胞は肝細胞である請求
項８に記載の方法。 - 【請求項１１】 前記添加工程は３５〜４３℃で実施す
る請求項１に記載の方法。 - 【請求項１２】 前記解凍工程は３０〜４３℃で実施す
る請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１３】 前記解凍工程は３５〜４３℃で実施す
る請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１４】 前記細胞は哺乳類の細胞である請求項
１３に記載の方法。 - 【請求項１５】 前記哺乳類の細胞は肝細胞、膵島、軟
骨細胞、軟骨を構成する細胞、神経細胞または血液細胞
である請求項１４に記載の方法。 - 【請求項１６】 前記哺乳類の細胞は肝細胞である請求
項１４に記載の方法。 - 【請求項１７】 低温保存肝細胞を蘇生する方法であっ
て、 肝細胞懸濁液を形成すべく、低温保存肝細胞を凍結保護
媒体から解凍する工程と、 前記凍結保護媒体を希釈すべく、第１の培養基を３０〜
４３℃の温度で添加する工程と、 最終的な肝細胞懸濁液を形成すべく、前記肝細胞を凍結
保護媒体から分離し、かつ第２の培養基または生理食塩
水を添加することにより、前記肝細胞を第２の培養基ま
たは生理食塩水で洗浄する工程とを含む方法。 - 【請求項１８】 前記解凍工程は３０〜４３℃の温度で
実施する請求項１７に記載の方法。 - 【請求項１９】 前記添加工程は３５〜４３℃で実施す
る請求項１７に記載の方法。
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