JPH10191963A

JPH10191963A - Ｎａｄ及びグルタチオン高含有酵母

Info

Publication number: JPH10191963A
Application number: JP1766497A
Authority: JP
Inventors: Kazuhiro Hamazawa; 和宏濱澤; Hirokazu Maekawa; 博和前川; Shogo Furue; 省吾古江
Original assignee: Kohjin Holdings Co Ltd; Kohjin Co
Current assignee: Kohjin Holdings Co Ltd; Kohjin Co
Priority date: 1997-01-17
Filing date: 1997-01-17
Publication date: 1998-07-28

Abstract

(57)【要約】【目的】ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド及び
グルタチオンを同時に著量蓄積する酵母、及び該酵母を
使用したニコチンアミドアデニンジヌクレオチド及びグ
ルタチオンの製造方法を提供する。【構成】エチオニン及び亜硫酸塩の存在下で生育可能
であり、ニコチンアミド又はニコチン酸前駆体存在下、
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを１％以上、グ
ルタチオンを５％以上生成蓄積するキャンディダ・ウチ
リスの変異株。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤと略称する。）及
びグルタチオンを同時に著量蓄積するキャンディダ・ウ
チリスの変異株、及び該変異株を使用したＮＡＤ及びグ
ルタチオンの製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】一般にグルタチオンはバクテリア、酵母
及び動物の肝臓等に広く分布しており、生体内の酸化還
元反応に深く関与しているトリペプチドであり、肝機能
回復作用や解毒作用さらには活性酸素の消去による細胞
の老化を防ぐ作用などの、重要な役割を果たすものとし
て、極めて有用な物質である。一方、ＮＡＤは生体内に
おける種々の酸化還元酵素の補酵素として、生体内のエ
ネルギー代謝に関与したり、各種生合成経路の補酵素と
して重要な役割をする物質として知られている。特に最
近では臨床検査用の試薬、各種有用物質の生産のための
補酵素としての需要が高まってきている。

【０００３】従来、グルタチオン並びにＮＡＤは、主と
して酵母菌体中に著量に蓄積されることが見いだされて
おり、特にグルタチオンについては、サッカロミセス・
セレヴィジエやキャンディダ・ウチリスにおいてバッチ
培養または連続培養において著量の蓄積量を示す変異株
が報告されている。（特公平３−１８８７２号公報）

【０００４】一方、ＮＡＤについては、前駆物質である
ニコチンアミドやアデニンを添加してコリネバクテリウ
ムアンモニアゲネスの培養菌体と混合して製造する方
法（アグリカルチュラル・バイオロジカル・ケミストリ
ー、第３２巻、１３３１ページ、１９８６年）、サッカ
ロミセス属の酵母で高含有の菌株からＮＡＤを製造する
方法（特公昭４１−１２６６４号公報、特開昭４８−５
６８９１号公報）、細菌、放線菌、カビ等にＮＡＤ前駆
体を添加して、ＮＡＤを抽出、採取して製造する方法
（特公昭４７−１９７４９号公報）、更に培養中に界面
活性剤等を添加してＮＡＤを培養液中に蓄積させて、回
収して製造する方法（特公昭４５−２９４３６号公報）
が知られている。このように、グルタチオン及びＮＡＤ
の製造は、現在主として酵母やバクテリアなどの微生物
を培養して、その菌体からの抽出液または培養上澄液か
ら精製する方法が採られていた。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかしながらこれらは
いずれもＮＡＤあるいはグルタチオンのいずれか一方の
蓄積量は多いものの他方は低く、酵母を培養して両者を
同時に著量取得することは困難であった。工業的な規模
での発酵生産物の製造を考えた場合、資源の有効利用と
いう面から考えると、酵母を培養して２種類以上の有用
物質を同時に抽出して精製することができれば、それぞ
れの物質の製造コストを大幅に低減できるメリットがあ
る。かかる観点から、例えば特開昭５１−１５１３１８
号公報には、酵母の熱水抽出液からＮＡＤ及びグルタチ
オンを取得する製造方法が報告されている。しかしなが
ら該公報に記載の酵母はＮＡＤ及びグルタチオンの蓄積
量が非常に低く、工業的な製法としてはとても満足でき
るものではなかった。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らはかかる課題
を解決すべく鋭意研究の結果、グルタチオン高含有の酵
母に突然変異処理を行うことによりグルタチオンの含量
を低下させることなくＮＡＤの含量も高い酵母が得られ
ること、該酵母を培養し酵母を熱水抽出することにより
ＮＡＤ及びグルタチオンが多量に製造できること、培地
にアデニン等を添加することなくニコチンアミドあるい
はニコチン酸誘導体だけを添加して培養してもグルタチ
オンに影響を与えることなくＮＡＤの含量だけさらに向
上させることができることを見いだし、本発明を完成す
るに至った。すなわち本発明は、ＮＡＤ及びグルタチオ
ンを同時に著量に生成するキャンディダ・ウチリスの変
異株、及び該変異株を使用したＮＡＤ及びグルタチオン
の製造方法を提供するものである。

【０００７】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
変異株は、例えば、既に本発明者らにより既に微工研に
寄託されているキャンディダ・ウチリスＫＪＳ−０５７
１（ＦＥＲＭＰ−６９０７）を親株とし、ＵＶ照射や
ニトロソグアニジン処理によって突然変異を起こさせ、
高濃度のエチオニン及び亜硫酸塩を含む培地に生育でき
る菌株を分離、合成培地で生育の良い菌株を選択し、そ
れぞれの分離株を更に培養し、グルタチオンの生産量が
親株と同等でありかつＮＡＤの生成量が親株よりも高い
菌株を取得する。このようにして本発明では、キャンデ
ィダ・ウチリスＫＪＳ−０５７１からキャンディダ・ウ
チリス２３９Ｄ５（ＦＥＲＭＰ−１６０１７）が得ら
れた。通常キャンディダ・ウチリスの菌体内ＮＡＤ含量
は、ニコチンアミド等の前駆体を添加してもせいぜい
０．４％程度であるにもかかわらず、本発明の変異株
は、グルタチオンを５％以上、ＮＡＤを１％以上と著量
含有するものである。なお、本発明の変異株はエチオニ
ン及び亜硫酸塩の存在下で生育可能なものであり、例え
ば、キャンディダ・ウチリス２３９Ｄ５はエチオニン１
０００ｐｐｍ及び亜硫酸塩５００ｐｐｍの存在下で生育
可能である。

【０００８】次にキャンディダ・ウチリス（Ｃａｎｄｉ
ｄａｕｔｉｌｉｓ）２３９Ｄ５の菌学的性質を述べ
る。１．ＤＬ−エチオニン１ｇ／ｌ及び亜硫酸ナトリウム
０．５ｇ／ｌを含む培地に生育する。２．亜硫酸ナトリウム０．５ｇ／ｌを含む培地に生育す
る。３．一般培地によく生育し、著量のグルタチオン並びに
ＮＡＤを蓄積することができる。４．ＹＭ寒天培地上で全縁、半レンズ状隆起、表面滑ら
かで鈍い光沢、クリーム色で軟質のコロニーを形成す
る。５．ダルモー平板状で仮性菌糸を形成する。６．酢酸ソーダ寒天斜面、麦芽エキス寒天斜面、Ｖ８ジ
ュース寒天斜面、コーンミール寒天斜面の培養で子嚢胞
子の形成は認められない。７．グルコース、シュクロース、ラフィノースを発酵
し、ガラクトース、マルトース、トレハロース、ラクト
ースを発酵しない。８．グルコース、シュクロース、マルトース、セロビオ
ース、トレハロース、ラフィノース、メレジトース、キ
シロース、エタノール、マンニトール、乳酸、クエン
酸、ＫＮＯ₃ を同化する。９．ビタミンフリー培地での生育良好。

【０００９】本発明では、更に該変異株を培養後、菌体
を熱水抽出することによるＮＡＤ及びグルタチオンの製
造方法が提供される。培地組成として、炭素源としては
通常微生物の培養に利用されるグルコース、蔗糖、酢
酸、エタノール、糖蜜、亜硫酸パルプ廃液等が用いら
れ、窒素源としては、尿素、アンモニア、硫酸アンモニ
ウム、塩化アンモニウム硝酸塩等が使用される。燐
酸、カリウム、マグネシウム源も燐酸カリウム、燐酸ア
ンモニウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マ
グネシウム等が用いられる。その他微量金属としては、
亜鉛、銅、マンガン、鉄イオン等の無機塩が有効であ
る。さらに必要に応じて、コーンスチープリカー、カゼ
イン、酵母エキス、ペプトン等の有機物を添加しても良
い。培養温度は２０〜３３℃の範囲で生育可能である
が、望ましくは２１℃〜２５℃の比較的低温が、グルタ
チオンの生成が促進されること、ＮＡＤの生成も良好で
あること、から好ましい。培養ｐＨは、３．５〜８．
０、好ましくは４．０〜６．０である。

【００１０】菌体内のＮＡＤ含量を増加させるため、ニ
コチンアミドあるいはニコチン酸誘導体、例えばキヌレ
ニン、キノリン酸、ニコチン酸等、を培地に添加するこ
とが好ましい。添加量は、５０〜５００ｐｐｍ、好まし
くは１５０〜２００ｐｐｍ程度で十分である。通常、Ｎ
ＡＤの生成量を増加させるためには、ニコチンアミド類
と共にアデニン誘導体を併用する必要があるが、本発明
ではニコチンアミド類の添加だけで十分であり、この点
も本発明の特徴の一つである。

【００１１】培養された菌体は、例えば遠心分離等によ
り集菌され、熱水抽出される。熱水抽出は公知の方法、
例えば集菌した菌体を６〜１０％程度の濃度になるよう
に懸濁し、８０〜１００℃、好ましくは９５〜１００℃
の熱水中で１〜１０分程度保持することにより実施され
る。抽出液からＮＡＤ及びグルタチオンの単離は、常
法、例えば銅塩としてグルタチオンを、銅塩反応液の上
清を樹脂処理することによりＮＡＤを、それぞれ容易に
単離精製することができる。

【００１２】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明す
る。なお、菌体中に蓄積されたグルタチオンの含量は、
菌体抽出液についてグリオキサラーゼ法（「メソツド・
イン・エンザイモロジー」第１巻第５４０ページ、アカ
デミックプレス社、１９５５年版）により、ＮＡＤの定
量は、菌体抽出液についてアルコールデヒドロゲナーゼ
を用いる酵素法（「メソツズ・オブ・エンザイマテイツ
ク・アナリシス第３版第７巻第２５３ページ、アカデミ
ックプレス社、１９８４年版）によりそれぞれ測定し
た。また、グルタチオン及びＮＡＤの純度検定は高速液
体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて行った。測定条件カラム：東ソー製ＴＳＫＧＥＬＯＤＳ８０ＴＭ移動相：５％メタノールを含む０．０５Ｍ燐酸カリウム水溶液測定波長：２１０ｎｍ

【００１３】実施例１キャンディダ・ウチリスＫＪＳ−０５７１（微工研寄託
番号ＦＥＲＭＰ−６９０７）を殺菌したＹＰＤ培地
（グルコース２％、ポリペプトン２％、イーストエキス
１％）で２４℃、４０時間培養し、集菌水洗後、トリス
マレイン酸バッファー（トリスヒドロキシルメチルアミ
ノメタン０．６１％、マレイン酸０．５８％、硫酸マグ
ネシウム０．０１％、硫安０．１％、クエン酸ナトリウ
ム０．０５％、ｐＨ６．０）に懸濁し、ニトロソグアニ
ジンを３００〜６００μｇ／ｍｌになるように添加し、
死滅率が約９０％になるまで適当な時間インキュベート
した。その後トリスマレイン酸バッファーで２回洗浄
後、ＹＰＤ培地に移し、２４℃、４８時間で固定培養を
行った。このニトロソグアニジン処理菌体を、生育限界
濃度よりやや濃い濃度のエチオニン及び亜硫酸ナトリウ
ムを含むＹＰＤ培地プレートに蒔いた。生育してきたコ
ロニーについて、グルコース６．５％、燐酸一アンモニ
ウム０．２６％、硫酸アンモニウム０．１５％、硫酸マ
グネシウム０．０９％、塩化カリウム０．２％、硫酸マ
ンガン２ｐｐｍ、硫酸亜鉛２ｐｐｍ、硫酸銅０．４ｐｐ
ｍ、ニコチンアミド０．０１５％を含む培地３０ｍｌを
添加した５００ｍｌ容三角フラスコに接種し、２４℃、
４８時間培養し、菌体中のグルタチオン及びＮＡＤ濃度
を測定した。その中でＮＡＤ含量の向上した菌株を選抜
し、その菌を親株として同様の変異処理を行うことによ
り、エチオニン１０００ｐｐｍ及び亜硫酸ナトリウム１
０００ｐｐｍを含むＹＰＤ培地プレートに生育する菌株
中より、キャンディダ・ウチリス２３９Ｄ５（ＦＥＲＭ
Ｐ−１６０１７）を得た。ＮＡＤ含量の向上は、亜硫
酸ナトリウムの濃度に依存している傾向が見られた。

【００１４】実施例２ＹＰＤ培地（グルコース２％、ポリペプトン２％、イー
ストエキス１％）１００ｍｌずつを５００ｍｌ容の三角
フラスコ４本に分注し１２１℃で１５分間殺菌後、実施
例１で得たキャンディダ・ウチリス２３９Ｄ５又は親株
であるキャンディダ・ウチリスＫＪＳ−０５７１をそれ
ぞれ１白金耳植菌し、２４℃で４８時間振とう培養し種
菌とした。これらを３０ｌ容発酵槽に全量植菌した。培
地としてはグルコース６．５％、燐酸一アンモニウム
０．２６％、硫酸アンモニウム０．１５％、硫酸マグネ
シウム０．０９％、塩化カリウム０．２％、硫酸マンガ
ン２ｐｐｍ、硫酸亜鉛２ｐｐｍ、硫酸銅０．４ｐｐｍ、
ニコチンアミド０．０１５％を用い、バッチ培養を行っ
た。培養条件は、槽内液量１５ｌ、培養温度２４℃、通
気量１５ｌ／分、撹拌４００ｒｐｍ、ｐＨ４．５（アン
モニア添加による自動コントロール）にてバッチ培養を
行った。培養の終了は、グルコースが完全に消費された
時点とした。培養終了後、菌体を遠心分離により集菌
し、菌体内のＮＡＤ及びグルタチオン量を測定した。結
果を表１に示す。

【００１５】

【表１】

【００１６】集菌したキャンディダ・ウチリス２３９Ｄ
５の菌体全量を１００℃、５分間熱水抽出した。この抽
出液に硫酸を０．５Ｎになるように添加し、亜酸化銅を
加えグルタチオンを銅塩として析出させた。銅塩は水洗
後硫化水素を通気させることにより硫酸銅として除去
し、減圧下濃縮し結晶化することによりグルタチオン
１．７３ｇを得た。銅塩を分離したのちの上清は、アン
バーライトＸＡＤ−４、ＤＯＷＥＸ１×２（蟻酸型）で
順次処理したのちＮＡＤ画分を減圧下濃縮し結晶化する
ことにより結晶ＮＡＤ０．３９ｇを得た。得られたグル
タチオン及びＮＡＤの純度は、ＨＰＬＣで分析した結
果、それぞれ９９．５％及び９９．８％であった。

【００１７】実施例３実施例２と同様の種母培地１００ｍｌを５００ｍｌ容の
三角フラスコに入れて殺菌後、１白金耳のキャンディダ
・ウチリス２３９Ｄ５を接種して２４℃、４８時間種母
培養後、本培養培地組成を１ｌ張り込んで殺菌した２ｌ
容発酵槽に、３％になるように種母を接種して実施例２
と同様の条件で培養した。なお本培養培地組成として
は、実施例２の培地成分のうちニコチンアミドに代え
て、キヌレニン、キノリン酸、あるいはニコチン酸を１
５０ｐｐｍ用いた。培養後菌体を遠心分離により集菌し
ＮＤＡ及びグルタチオン含量を測定した。結果を表２に
示す。表２から明らかな通り、キヌレニン、キノリン
酸、ニコチン酸もニコチンアミドとほぼ同様のＮＡＤ含
量を示すこと、このときのグルタチオン含量には影響は
見られないことが分かる。

【００１８】

【表２】

【００１９】

【発明の効果】以上説明してきたように、本発明によれ
ば、ＮＡＤ及びグルタチオンを同時に著量生成するキャ
ンディダ・ウチリスの変異株、及び該変異株を使用した
ＮＡＤ及びグルタチオンの製造方法が提供され、一度の
培養で両化合物を多量に取得できるという、工業的に優
れた効果を奏する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:72） (Ｃ１２Ｐ 19/36 Ｃ１２Ｒ 1:72） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:72）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】エチオニン及び亜硫酸塩の存在下で生育
可能であり、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド及
びグルタチオンを同時に著量生成するキャンディダ・ウ
チリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）の変異株。
【請求項２】変異株がキャンディダ・ウチリス２３９
Ｄ５（ＦＥＲＭＰ−１６０１７）である請求項１記載
の変異株。
【請求項３】突然変異処理によりエチオニン及び亜硫
酸塩を含む培地に生育可能となったキャンディダ・ウチ
リスの変異株を好気的に培養して該菌体中に著量のニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド及びグルタチオンを
生成蓄積せしめ、次いで該菌体を熱水抽出することを特
徴とする、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド及び
グルタチオンの製造方法。
【請求項４】培地にニコチンアミド、またはニコチン
酸前駆体が添加されたものである、請求項３記載の製造
方法。