JPH10239301A - 糖化ヘモグロビンの測定方法 - Google Patents
糖化ヘモグロビンの測定方法Info
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- JPH10239301A JPH10239301A JP9039085A JP3908597A JPH10239301A JP H10239301 A JPH10239301 A JP H10239301A JP 9039085 A JP9039085 A JP 9039085A JP 3908597 A JP3908597 A JP 3908597A JP H10239301 A JPH10239301 A JP H10239301A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ヘモグロビンＡ０の溶出時間を短縮すること
により、ＨｂＡ１ｃ分画周辺のクロマトグラムを変える
ことなく、また、ＨｂＡ１ｃ測定の精度を低下させるこ
となく、測定時間の短縮が図られる糖化ヘモグロビンの
測定方法を提供する。 【解決手段】 ヘモグロビンＡ０の溶出時間が、全ヘモ
グロビンの溶出時間の３０％以下とすることを特徴とす
る液体クロマトグラフィーによる糖化ヘモグロビンの測
定方法、およびヘモグロビンＡ０の溶出時の流速を糖化
ヘモグロビンの溶出時の流速の１．１〜１０倍とするこ
とを特徴とする液体クロマトグラフィーによる糖化ヘモ
グロビンの測定方法。
により、ＨｂＡ１ｃ分画周辺のクロマトグラムを変える
ことなく、また、ＨｂＡ１ｃ測定の精度を低下させるこ
となく、測定時間の短縮が図られる糖化ヘモグロビンの
測定方法を提供する。 【解決手段】 ヘモグロビンＡ０の溶出時間が、全ヘモ
グロビンの溶出時間の３０％以下とすることを特徴とす
る液体クロマトグラフィーによる糖化ヘモグロビンの測
定方法、およびヘモグロビンＡ０の溶出時の流速を糖化
ヘモグロビンの溶出時の流速の１．１〜１０倍とするこ
とを特徴とする液体クロマトグラフィーによる糖化ヘモ
グロビンの測定方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、液体クロマトグラ
フィーによる糖化ヘモグロビンの測定方法に関する。
フィーによる糖化ヘモグロビンの測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】糖化ヘモグロビンとは血液中の糖がその
濃度に比例して赤血球に入った後に、ヘモグロビンと結
合して生成したものであり、その濃度は過去１〜２カ月
間の血液中の平均的な糖濃度を反映すると言われてい
る。そして血糖値や尿糖値に比べ生理的要因に左右され
にくいので、血液中の糖化ヘモグロビンの濃度は、糖尿
病の診断の指標とされ、特に、糖化ヘモグロビンのう
ち、糖化ヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃとい
う）分画が糖尿病の診断の最適な指標として広く使用さ
れている。
濃度に比例して赤血球に入った後に、ヘモグロビンと結
合して生成したものであり、その濃度は過去１〜２カ月
間の血液中の平均的な糖濃度を反映すると言われてい
る。そして血糖値や尿糖値に比べ生理的要因に左右され
にくいので、血液中の糖化ヘモグロビンの濃度は、糖尿
病の診断の指標とされ、特に、糖化ヘモグロビンのう
ち、糖化ヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃとい
う）分画が糖尿病の診断の最適な指標として広く使用さ
れている。
【０００３】血液中の糖化ヘモグロビンの濃度の測定
は、主にカチオン交換反応を利用した液体クロマトグラ
フィー（ＨＰＬＣ）法により行われている（特公平８−
７１９８号公報参照）。血液中のＨｂＡ１ｃの濃度は、
血液試料をＨＰＬＣにかけて得られるクロマトグラムに
おける全ヘモグロビンピーク（糖化ヘモグロビンピーク
＋非糖化ヘモグロビンピーク）面積に対するＨｂＡ１ｃ
ピーク面積の割合（％）として表される。従って、クロ
マトグラムには全ヘモグロビンピークが正確に描かれて
いなければならない。また、この測定方法は、近年で
は、測定時間の短縮化が進み、１検体あたり数分間で測
定が行われている。
は、主にカチオン交換反応を利用した液体クロマトグラ
フィー（ＨＰＬＣ）法により行われている（特公平８−
７１９８号公報参照）。血液中のＨｂＡ１ｃの濃度は、
血液試料をＨＰＬＣにかけて得られるクロマトグラムに
おける全ヘモグロビンピーク（糖化ヘモグロビンピーク
＋非糖化ヘモグロビンピーク）面積に対するＨｂＡ１ｃ
ピーク面積の割合（％）として表される。従って、クロ
マトグラムには全ヘモグロビンピークが正確に描かれて
いなければならない。また、この測定方法は、近年で
は、測定時間の短縮化が進み、１検体あたり数分間で測
定が行われている。
【０００４】上記糖化ヘモグロビンの濃度の測定のため
のカチオン交換反応を利用したＨＰＬＣ法においては、
流速を一定にし、溶離液として溶出力の弱い液（以下、
溶離液Ａという）と溶出力の強い液（以下、溶離液Ｂと
いう）との２種を用いてステップまたは連続グラジエン
ト法により行われていた。すなわち、溶離液Ａ通液時に
は、試料中の非糖化ヘモグロビンは充填剤に保持され、
糖化ヘモグロビンは分離されて溶出する。そして、溶離
液Ｂは溶出力が強いため、溶離液Ａの後に通液されるこ
とにより保持されていた非糖化ヘモグロビンが速やかに
溶出する。
のカチオン交換反応を利用したＨＰＬＣ法においては、
流速を一定にし、溶離液として溶出力の弱い液（以下、
溶離液Ａという）と溶出力の強い液（以下、溶離液Ｂと
いう）との２種を用いてステップまたは連続グラジエン
ト法により行われていた。すなわち、溶離液Ａ通液時に
は、試料中の非糖化ヘモグロビンは充填剤に保持され、
糖化ヘモグロビンは分離されて溶出する。そして、溶離
液Ｂは溶出力が強いため、溶離液Ａの後に通液されるこ
とにより保持されていた非糖化ヘモグロビンが速やかに
溶出する。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】血液中のＨｂＡ１ｃ濃
度の正常値は、おおよそ４〜６％といわれている。一
方、正常人レベルで非糖化ヘモグロビンの大部分（ヘモ
グロビンＡ０、以下、ＨｂＡ０という）は、９０％程度
であり、ＨｂＡ１ｃのピーク面積の１０倍以上のピーク
面積があるため、溶出に時間がかかる。測定時間の短縮
化のためには、このＨｂＡ０の溶出時間の短縮が極めて
重要である。また、従来の方法において、ＨｂＡ１ｃの
分画は、他の前後するピークと極めて隣接しており、測
定時間短縮のためにＨｂＡ１ｃ分画周辺の分離を改善す
ることはむずかしい。
度の正常値は、おおよそ４〜６％といわれている。一
方、正常人レベルで非糖化ヘモグロビンの大部分（ヘモ
グロビンＡ０、以下、ＨｂＡ０という）は、９０％程度
であり、ＨｂＡ１ｃのピーク面積の１０倍以上のピーク
面積があるため、溶出に時間がかかる。測定時間の短縮
化のためには、このＨｂＡ０の溶出時間の短縮が極めて
重要である。また、従来の方法において、ＨｂＡ１ｃの
分画は、他の前後するピークと極めて隣接しており、測
定時間短縮のためにＨｂＡ１ｃ分画周辺の分離を改善す
ることはむずかしい。
【０００６】また、溶離液Ｂの溶出力を強める（ｐＨや
塩濃度を溶離液Ａに比して大きくする）ことによりＨｂ
Ａ０の溶出時間を短縮することができるが、しかし、溶
離液Ｂの組成を溶離液Ａの組成と大きく異なるものにし
てしまうと、連続的に検体を測定する場合、次の検体の
測定に際して溶離液Ｂの影響がでてしまい、次検体測定
開始時に前検体測定開始時と同じ状態にするための平衡
化時間が長くなり、迅速な測定ができないという問題が
あった。
塩濃度を溶離液Ａに比して大きくする）ことによりＨｂ
Ａ０の溶出時間を短縮することができるが、しかし、溶
離液Ｂの組成を溶離液Ａの組成と大きく異なるものにし
てしまうと、連続的に検体を測定する場合、次の検体の
測定に際して溶離液Ｂの影響がでてしまい、次検体測定
開始時に前検体測定開始時と同じ状態にするための平衡
化時間が長くなり、迅速な測定ができないという問題が
あった。
【０００７】本発明は上記問題点を解決するものであ
り、その目的は、ヘモグロビンＡ０の溶出時間を短縮す
ることにより、ＨｂＡ１ｃ分画周辺のクロマトグラムを
変えることなく、また、ＨｂＡ１ｃ測定の精度を低下さ
せることなく、測定時間の短縮が図られる糖化ヘモグロ
ビンの測定方法を提供することにある。
り、その目的は、ヘモグロビンＡ０の溶出時間を短縮す
ることにより、ＨｂＡ１ｃ分画周辺のクロマトグラムを
変えることなく、また、ＨｂＡ１ｃ測定の精度を低下さ
せることなく、測定時間の短縮が図られる糖化ヘモグロ
ビンの測定方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明の請求項１記載の
糖化ヘモグロビンの測定方法（以下、本発明１という）
は、ヘモグロビンＡ０の溶出時間が、全ヘモグロビンの
溶出時間の３０％以下とすることを特徴とする。
糖化ヘモグロビンの測定方法（以下、本発明１という）
は、ヘモグロビンＡ０の溶出時間が、全ヘモグロビンの
溶出時間の３０％以下とすることを特徴とする。
【０００９】本発明の請求項２記載の糖化ヘモグロビン
の測定方法（以下、本発明２という）は、充填剤として
平均粒径が１〜１０μｍ、その粒度分布の標準偏差が
１．０μｍ以下のものを用いることを特徴とする請求項
１記載の液体クロマトグラフィーによる糖化ヘモグロビ
ンの測定方法である。
の測定方法（以下、本発明２という）は、充填剤として
平均粒径が１〜１０μｍ、その粒度分布の標準偏差が
１．０μｍ以下のものを用いることを特徴とする請求項
１記載の液体クロマトグラフィーによる糖化ヘモグロビ
ンの測定方法である。
【００１０】本発明の請求項３記載の糖化ヘモグロビン
の測定方法（以下、本発明３という）は、ヘモグロビン
Ａ０の溶出時の流速を糖化ヘモグロビンの溶出時の流速
の１．１〜１０倍とすることを特徴とする液体クロマト
グラフィーによる糖化ヘモグロビンの測定方法である。
の測定方法（以下、本発明３という）は、ヘモグロビン
Ａ０の溶出時の流速を糖化ヘモグロビンの溶出時の流速
の１．１〜１０倍とすることを特徴とする液体クロマト
グラフィーによる糖化ヘモグロビンの測定方法である。
【００１１】以下、本発明１および２について説明す
る。本発明１および２の糖化ヘモグロビンの測定方法に
おいて、ＨｂＡ０の溶出時間が、全ヘモグロビンの溶出
時間の３０％以下とする。ＨｂＡ０の溶出時間が、全ヘ
モグロビンの溶出時間の３０％を超えると測定時間の短
縮が不十分となる。
る。本発明１および２の糖化ヘモグロビンの測定方法に
おいて、ＨｂＡ０の溶出時間が、全ヘモグロビンの溶出
時間の３０％以下とする。ＨｂＡ０の溶出時間が、全ヘ
モグロビンの溶出時間の３０％を超えると測定時間の短
縮が不十分となる。
【００１２】本発明１および２において、ＨｂＡ０の溶
出時間が、全ヘモグロビンの溶出時間の３０％以下とす
るための方法としては、例えば、充填剤の平均粒径を制
限する；充填剤の粒度分布を制限する；カラムのサイズ
を制限する；溶離液Ｂの組成を制限する；溶離液Ｂの通
液時間を制限するなどの方法が挙げられる。これらの方
法は、単独でも組み合わせてもよい。
出時間が、全ヘモグロビンの溶出時間の３０％以下とす
るための方法としては、例えば、充填剤の平均粒径を制
限する；充填剤の粒度分布を制限する；カラムのサイズ
を制限する；溶離液Ｂの組成を制限する；溶離液Ｂの通
液時間を制限するなどの方法が挙げられる。これらの方
法は、単独でも組み合わせてもよい。
【００１３】本発明１および２において用いられる充填
剤としては、公知のカチオン交換充填剤が用いられる。
カチオン交換充填剤としては、ポリマー系充填剤（例え
ば、ポリスチレン、ポリアクリレート等の合成高分子；
ポリアミノ酸、多糖類等の天然高分子など）、無機系充
填剤（例えば、シリカ粒子など）などが挙げられる。カ
チオン交換充填剤の官能基としては、例えば、カルボキ
シル基、スルホン酸基などが挙げられる。カチオン交換
充填剤は、多孔性粒子でも非多孔性粒子でもよい。
剤としては、公知のカチオン交換充填剤が用いられる。
カチオン交換充填剤としては、ポリマー系充填剤（例え
ば、ポリスチレン、ポリアクリレート等の合成高分子；
ポリアミノ酸、多糖類等の天然高分子など）、無機系充
填剤（例えば、シリカ粒子など）などが挙げられる。カ
チオン交換充填剤の官能基としては、例えば、カルボキ
シル基、スルホン酸基などが挙げられる。カチオン交換
充填剤は、多孔性粒子でも非多孔性粒子でもよい。
【００１４】本発明１および２において、カチオン交換
充填剤としては、平均粒径１〜１０μｍ、その粒度分布
の標準偏差が１．０μｍ以下のものが特に好ましく、本
発明２においては、上記平均粒径および粒度分布の標準
偏差がこの範囲に限定される。
充填剤としては、平均粒径１〜１０μｍ、その粒度分布
の標準偏差が１．０μｍ以下のものが特に好ましく、本
発明２においては、上記平均粒径および粒度分布の標準
偏差がこの範囲に限定される。
【００１５】本発明１および２において用いられるカラ
ムとしては、公知のカラムが用いられる。その材質とし
ては、金属製（例えば、ステンレス）、合成樹脂製（例
えば、ポリテトラフルオルエチレン、ポリエーテルエー
テルケトン等）、ガラス製などが挙げられる。
ムとしては、公知のカラムが用いられる。その材質とし
ては、金属製（例えば、ステンレス）、合成樹脂製（例
えば、ポリテトラフルオルエチレン、ポリエーテルエー
テルケトン等）、ガラス製などが挙げられる。
【００１６】本発明１および２において、カラムサイズ
としては、内径２〜１０ｍｍ、長さ１０〜１００ｍｍの
ものが特に好ましい。
としては、内径２〜１０ｍｍ、長さ１０〜１００ｍｍの
ものが特に好ましい。
【００１７】本発明１および２において、液体クロマト
グラフィーの溶離条件については、溶離液は、少なくと
も２種類（溶離液Ａおよび溶離液Ｂ）用いる。溶離液Ａ
はＨｂＡ１ｃ分画をより精度よく分離するためのもので
あり、溶離液ＢはＨｂＡ０を溶出させるものである。上
記溶離液Ｂの組成は充填剤の組成によって変わる。一般
にヘモグロビンのカチオン交換分析では、溶離液のｐＨ
が高くなるほど溶出力が増す。また、溶離液のイオン強
度が大きくなるほど溶出力が増す。ＨｂＡ０はヘモグロ
ビン成分の中で最もカチオン交換充填剤に親和性があ
り、従って、最も遅く溶出する。溶離液Ｂの組成は、溶
離液Ａよりも、溶出力の強い液性を有するものである。
グラフィーの溶離条件については、溶離液は、少なくと
も２種類（溶離液Ａおよび溶離液Ｂ）用いる。溶離液Ａ
はＨｂＡ１ｃ分画をより精度よく分離するためのもので
あり、溶離液ＢはＨｂＡ０を溶出させるものである。上
記溶離液Ｂの組成は充填剤の組成によって変わる。一般
にヘモグロビンのカチオン交換分析では、溶離液のｐＨ
が高くなるほど溶出力が増す。また、溶離液のイオン強
度が大きくなるほど溶出力が増す。ＨｂＡ０はヘモグロ
ビン成分の中で最もカチオン交換充填剤に親和性があ
り、従って、最も遅く溶出する。溶離液Ｂの組成は、溶
離液Ａよりも、溶出力の強い液性を有するものである。
【００１８】上記溶離液としては、具体的には、一般の
カチオン交換液体クロマトグラフィー用の緩衝液などが
用いられる。例えば、リン酸、塩酸、酢酸、水酸化ナト
リウム、水酸化カリウムなどの無機酸や無機塩基または
それらの塩；クエン酸、フタル酸などの有機酸またはそ
れらの塩；あるいは、これらの混合物；を用いた緩衝液
などが挙げられる。
カチオン交換液体クロマトグラフィー用の緩衝液などが
用いられる。例えば、リン酸、塩酸、酢酸、水酸化ナト
リウム、水酸化カリウムなどの無機酸や無機塩基または
それらの塩；クエン酸、フタル酸などの有機酸またはそ
れらの塩；あるいは、これらの混合物；を用いた緩衝液
などが挙げられる。
【００１９】本発明１および２で用いられる液体クロマ
トグラフのシステムは、公知の液体クロマトグラフのシ
ステムが用いられる。すなわち、例えば、図１のような
システムである。溶離液１として溶離液１Ａ（例えば、
上記の溶離液Ａ）が電磁弁２を通り、送液ポンプ３によ
り試料導入装置４を経由して、充填剤が充填された分離
カラム５に入り、この分離カラム５により試料中の糖化
ヘモグロビン成分が分離される。分離された糖化ヘモグ
ロビン成分は検出器６によって、例えば、吸光度を測定
する等によって検出される。次いで、電磁弁２が切り換
えられ、溶離液１として溶離液１Ｂ（例えば、上記の溶
離液Ｂ）が同様にして送液され、分離カラム５に吸着し
ているＨｂＡ０が溶出され、検出器６によって同様にし
て検出される。
トグラフのシステムは、公知の液体クロマトグラフのシ
ステムが用いられる。すなわち、例えば、図１のような
システムである。溶離液１として溶離液１Ａ（例えば、
上記の溶離液Ａ）が電磁弁２を通り、送液ポンプ３によ
り試料導入装置４を経由して、充填剤が充填された分離
カラム５に入り、この分離カラム５により試料中の糖化
ヘモグロビン成分が分離される。分離された糖化ヘモグ
ロビン成分は検出器６によって、例えば、吸光度を測定
する等によって検出される。次いで、電磁弁２が切り換
えられ、溶離液１として溶離液１Ｂ（例えば、上記の溶
離液Ｂ）が同様にして送液され、分離カラム５に吸着し
ているＨｂＡ０が溶出され、検出器６によって同様にし
て検出される。
【００２０】液体クロマトグラフィー測定の具体的な条
件は、流速は０．３〜５ｍｌ／分程度、検出には４１５
ｎｍの吸光度測定が適当である。測定試料は、血液抗凝
固剤を含むヒト全血を界面活性剤を含む溶血剤で溶血希
釈して液体クロマトグラフィーに供する。また、必要に
より不安定型ＨｂＡ１ｃ除去試薬（ホウ酸やポリリン酸
など）を添加してもよい。溶血試料の液体クロマトグラ
フへの注入量は５〜１００μｌ程度が適当である。
件は、流速は０．３〜５ｍｌ／分程度、検出には４１５
ｎｍの吸光度測定が適当である。測定試料は、血液抗凝
固剤を含むヒト全血を界面活性剤を含む溶血剤で溶血希
釈して液体クロマトグラフィーに供する。また、必要に
より不安定型ＨｂＡ１ｃ除去試薬（ホウ酸やポリリン酸
など）を添加してもよい。溶血試料の液体クロマトグラ
フへの注入量は５〜１００μｌ程度が適当である。
【００２１】以下、本発明３について説明する。本発明
３においては、ＨｂＡ０の溶出時の流速（以下、流速ｂ
という）を糖化ヘモグロビンの溶出時の流速（以下、流
速ａという）の１．１〜１０倍とする。流速ｂが流速ａ
の１．１倍未満では、ＨｂＡ０の溶出に時間がかかり流
速を変化させた効果が小さくなり、流速ｂが流速ａの１
０倍を超えると、カラム内の圧力が上昇し、装置や測定
値に悪影響を与えるようになる。
３においては、ＨｂＡ０の溶出時の流速（以下、流速ｂ
という）を糖化ヘモグロビンの溶出時の流速（以下、流
速ａという）の１．１〜１０倍とする。流速ｂが流速ａ
の１．１倍未満では、ＨｂＡ０の溶出に時間がかかり流
速を変化させた効果が小さくなり、流速ｂが流速ａの１
０倍を超えると、カラム内の圧力が上昇し、装置や測定
値に悪影響を与えるようになる。
【００２２】流速ａは、充填剤のヘモグロビンに対する
保持容量によって異なるが、０．１〜５ｍｌ／分が好ま
しい。
保持容量によって異なるが、０．１〜５ｍｌ／分が好ま
しい。
【００２３】流速を上記のように切り換える機構は、通
常の液体クロマトグラフィー分析におけるステップグラ
ジエント溶出方法で用いられる電磁弁などにより行われ
る。上記切り換えのタイミングは、電磁弁から検出器ま
での流路の長さにより異なるが、クロマトグラム上にお
いてＨｂＡ０の溶出する直前に、流速ａから流速ｂに切
り換え、ＨｂＡ０の溶出直後に流速ｂから流速ａに戻す
のが好ましい。
常の液体クロマトグラフィー分析におけるステップグラ
ジエント溶出方法で用いられる電磁弁などにより行われ
る。上記切り換えのタイミングは、電磁弁から検出器ま
での流路の長さにより異なるが、クロマトグラム上にお
いてＨｂＡ０の溶出する直前に、流速ａから流速ｂに切
り換え、ＨｂＡ０の溶出直後に流速ｂから流速ａに戻す
のが好ましい。
【００２４】本発明３において用いられる充填剤として
は、溶離液が流速ｂで通液される際に十分耐圧性があれ
ばよく、公知のカチオン交換充填剤が使用され、その例
としては、本発明１の説明に例示された充填剤が挙げら
れる。
は、溶離液が流速ｂで通液される際に十分耐圧性があれ
ばよく、公知のカチオン交換充填剤が使用され、その例
としては、本発明１の説明に例示された充填剤が挙げら
れる。
【００２５】本発明３において用いられる溶離液として
は、本発明１の説明に述べた溶離液Ａおよび溶離液Ｂと
同様である。
は、本発明１の説明に述べた溶離液Ａおよび溶離液Ｂと
同様である。
【００２６】本発明３において用いられるカラム、カラ
ムサイズ、液体クロマトグラフのシステム、測定試料お
よび溶血試料の液体クロマトグラフへの注入量などは、
本発明ｌと同様である。
ムサイズ、液体クロマトグラフのシステム、測定試料お
よび溶血試料の液体クロマトグラフへの注入量などは、
本発明ｌと同様である。
【００２７】
【発明の実施の形態】以下、本発明の実施例及び比較例
を挙げることにより、本発明を詳細に説明するが、本発
明はこれに限定されるものではない。
を挙げることにより、本発明を詳細に説明するが、本発
明はこれに限定されるものではない。
【００２８】実施例１ 液体クロマトグラフシステムとして図１のシステムと
した。送液ポンプ３としては、島津製作所社製、ＬＣ−
９Ａとし、試料導入装置４としては、積水化学工業社
製、ＡＳＵ−４２０とし、検出器６としては、島津製作
所社製、ＳＰＤ−６ＡＶとした。
した。送液ポンプ３としては、島津製作所社製、ＬＣ−
９Ａとし、試料導入装置４としては、積水化学工業社
製、ＡＳＵ−４２０とし、検出器６としては、島津製作
所社製、ＳＰＤ−６ＡＶとした。
【００２９】充填剤の調製 特公平８−７１９７号公報の方法により充填剤を調製し
た。すなわち、ジエチレングリコールジメタクリレート
（新中村化学社製）１００ｇ、ジビニルベンゼン（キシ
ダ化学社製）２００ｇを混合したものに、ベンゾイルパ
ーオキサイド（重合開始剤、和光純薬社製）１ｇを溶解
した。この混合物を４重量％ポリビニルアルコール（日
本合成社製）水溶液２．５リットルに添加し、攪拌しな
がら調粒した後、窒素置換下で８０℃に加熱し重合を行
った。８０℃で２時間重合を行った後、アクリル酸５０
ｇを添加し更に８０℃で２時間重合し、生成物を熱水お
よびアセトンで順次洗浄し、乾燥した。
た。すなわち、ジエチレングリコールジメタクリレート
（新中村化学社製）１００ｇ、ジビニルベンゼン（キシ
ダ化学社製）２００ｇを混合したものに、ベンゾイルパ
ーオキサイド（重合開始剤、和光純薬社製）１ｇを溶解
した。この混合物を４重量％ポリビニルアルコール（日
本合成社製）水溶液２．５リットルに添加し、攪拌しな
がら調粒した後、窒素置換下で８０℃に加熱し重合を行
った。８０℃で２時間重合を行った後、アクリル酸５０
ｇを添加し更に８０℃で２時間重合し、生成物を熱水お
よびアセトンで順次洗浄し、乾燥した。
【００３０】分級と粒度分布の測定 得られた粒子を、空気分級機（日鉄鉱業社製、ターボク
ラシファイアＴＣ−１５Ｎ）により分級した。分級後、
コールター社製コールターカウンターを用いて粒度分布
を測定し、平均粒径と粒度分布を算出した。その結果、
以下の通りであった。 充填剤Ａ：平均粒径５μｍ、粒度分布の標準偏差０．８
μｍ 充填剤Ｂ：平均粒径５μｍ、粒度分布の標準偏差０．５
μｍ 充填剤Ｃ：平均粒径３μｍ、粒度分布の標準偏差０．８
μｍ 充填剤Ｄ：平均粒径１０μｍ、粒度分布の標準偏差０．
８μｍ
ラシファイアＴＣ−１５Ｎ）により分級した。分級後、
コールター社製コールターカウンターを用いて粒度分布
を測定し、平均粒径と粒度分布を算出した。その結果、
以下の通りであった。 充填剤Ａ：平均粒径５μｍ、粒度分布の標準偏差０．８
μｍ 充填剤Ｂ：平均粒径５μｍ、粒度分布の標準偏差０．５
μｍ 充填剤Ｃ：平均粒径３μｍ、粒度分布の標準偏差０．８
μｍ 充填剤Ｄ：平均粒径１０μｍ、粒度分布の標準偏差０．
８μｍ
【００３１】カラムへの充填 該充填剤Ａ〜Ｄを内径６ｍｍ、長さ７５ｍｍのステンレ
ス製カラムに充填した。
ス製カラムに充填した。
【００３２】ＨｂＡ１ｃの測定 溶離条件：溶離液Ａ１（リン酸緩衝液：ｐＨ６）および
溶離液Ｂ１（３００ｍＭリン酸緩衝液：ｐＨ７）の２液
を用いステップグラジエント溶出を行った。なお、溶離
液Ａ１は、それぞれの充填剤において、ＨｂＡ１ｃが同
一保持時間となるよう濃度を調整した。流速：２．０ｍ
ｌ／分 検出：４１５ｎｍ 試料：同一人（健常人）の血液を採血後、直ちにヘパリ
ン添加したものを用い、その血液検体を、積水化学工業
社製、溶血液２１Ｈ（不安定型糖化ヘモグロビン除去試
薬および界面活性剤を含む溶血試薬）にて２９０倍に溶
血・希釈したものを試料とした。
溶離液Ｂ１（３００ｍＭリン酸緩衝液：ｐＨ７）の２液
を用いステップグラジエント溶出を行った。なお、溶離
液Ａ１は、それぞれの充填剤において、ＨｂＡ１ｃが同
一保持時間となるよう濃度を調整した。流速：２．０ｍ
ｌ／分 検出：４１５ｎｍ 試料：同一人（健常人）の血液を採血後、直ちにヘパリ
ン添加したものを用い、その血液検体を、積水化学工業
社製、溶血液２１Ｈ（不安定型糖化ヘモグロビン除去試
薬および界面活性剤を含む溶血試薬）にて２９０倍に溶
血・希釈したものを試料とした。
【００３３】評価方法 ・ＨｂＡ１ｃ値の算出：充填剤Ａを用いて、上記測定条
件で分析した場合の、クロマトグラムを図２に示す。こ
のクロマトグラムにおいて、ピーク１は糖化ヘモグロビ
ンＨｂＡ１ａ及びＨｂＡ１ｂ、ピーク２は胎児性ヘモグ
ロビンＨｂＦ、ピーク３は糖化ヘモグロビンＨｂＡ１
ｃ、ピーク４は非糖化（正常）ヘモグロビンＨｂＡ０で
ある。ＨｂＡ１ｃ値は、各ピーク面積から以下の算出式
により求められる。 ＨｂＡ１ｃ（％）＝〔（ＨｂＡ１ｃの面積）／（ＨｂＡ
１ａ及びＨｂＡ１ｂの面積＋ＨｂＦの面積＋ＨｂＡ１ｃ
の面積＋ＨｂＡ０の面積）〕×１００ ・ＨｂＡ０ピーク幅の測定：図２のクロマトグラムにお
いて、ＨｂＡ０ピークの立ち上がり点５から溶出終了点
６までの時間ＴＡ０を測定し、全ヘモグロビンの溶出時
間Ｔｗに対する比率Ｔを求めた。 Ｔ（％）＝（ＴＡ０／Ｔｗ）×１００
件で分析した場合の、クロマトグラムを図２に示す。こ
のクロマトグラムにおいて、ピーク１は糖化ヘモグロビ
ンＨｂＡ１ａ及びＨｂＡ１ｂ、ピーク２は胎児性ヘモグ
ロビンＨｂＦ、ピーク３は糖化ヘモグロビンＨｂＡ１
ｃ、ピーク４は非糖化（正常）ヘモグロビンＨｂＡ０で
ある。ＨｂＡ１ｃ値は、各ピーク面積から以下の算出式
により求められる。 ＨｂＡ１ｃ（％）＝〔（ＨｂＡ１ｃの面積）／（ＨｂＡ
１ａ及びＨｂＡ１ｂの面積＋ＨｂＦの面積＋ＨｂＡ１ｃ
の面積＋ＨｂＡ０の面積）〕×１００ ・ＨｂＡ０ピーク幅の測定：図２のクロマトグラムにお
いて、ＨｂＡ０ピークの立ち上がり点５から溶出終了点
６までの時間ＴＡ０を測定し、全ヘモグロビンの溶出時
間Ｔｗに対する比率Ｔを求めた。 Ｔ（％）＝（ＴＡ０／Ｔｗ）×１００
【００３４】測定結果 上記充填剤Ａ〜Ｄを用いて測定した結果（ＨｂＡ１ｃ
値、ＨｂＡ０幅Ｔ）を表１に示した。
値、ＨｂＡ０幅Ｔ）を表１に示した。
【００３５】比較例１ 実施例１と同様にして充填剤を調製した。分級条件を
変更し、以下の充填剤を得た。 充填剤Ｅ：平均粒径５μｍ、粒度分布の標準偏差１．５
μｍ 充填剤Ｆ：平均粒径１５μｍ、粒度分布の標準偏差１．
２μｍ 充填剤Ｇ：平均粒径２０μｍ、粒度分布の標準偏差１．
２μｍ
変更し、以下の充填剤を得た。 充填剤Ｅ：平均粒径５μｍ、粒度分布の標準偏差１．５
μｍ 充填剤Ｆ：平均粒径１５μｍ、粒度分布の標準偏差１．
２μｍ 充填剤Ｇ：平均粒径２０μｍ、粒度分布の標準偏差１．
２μｍ
【００３６】上記の充填剤Ｅ〜Ｇを用いて、実施例１
と同様に操作して評価した。
と同様に操作して評価した。
【００３７】測定結果 ・充填剤Ｅを用いた場合に得られたクロマトグラムを図
３に示した。実施例１の充填剤Ａ（図２）に比べ、Ｈｂ
Ａ１ｃの保持時間が殆ど変わらないのに、ＨｂＡ０の溶
出に時間がかかるため、全体の測定時間も余分にかかっ
てしまう。 ・また、上記充填剤Ｅ〜Ｇを用いて測定した結果（Ｈｂ
Ａ１ｃ値、ＨｂＡ０幅Ｔ）を表１に示した。実施例１に
比較してＨｂＡ０幅Ｔが大きいことが分かる。
３に示した。実施例１の充填剤Ａ（図２）に比べ、Ｈｂ
Ａ１ｃの保持時間が殆ど変わらないのに、ＨｂＡ０の溶
出に時間がかかるため、全体の測定時間も余分にかかっ
てしまう。 ・また、上記充填剤Ｅ〜Ｇを用いて測定した結果（Ｈｂ
Ａ１ｃ値、ＨｂＡ０幅Ｔ）を表１に示した。実施例１に
比較してＨｂＡ０幅Ｔが大きいことが分かる。
【００３８】
【表１】
【００３９】比較例２ 実施例１で得られた充填剤Ａを用いた。実施例１の測定
条件における、溶離液Ｂ１の濃度を表２にように代えた
ことの他は、実施例１と同様に操作した。測定結果（Ｈ
ｂＡ０幅Ｔ）を表２に示した。なお、溶離液Ｂ１の濃度
を１００ｍＭとしたときのクロマトグラムは、上記の図
３と同様であった。
条件における、溶離液Ｂ１の濃度を表２にように代えた
ことの他は、実施例１と同様に操作した。測定結果（Ｈ
ｂＡ０幅Ｔ）を表２に示した。なお、溶離液Ｂ１の濃度
を１００ｍＭとしたときのクロマトグラムは、上記の図
３と同様であった。
【００４０】
【表２】
【００４１】実施例２、３および比較例３〜５ 液体クロマトグラフシステムとして、実施例１と同様
のシステムとした。 充填剤の調製 実施例１と同様にして充填剤を調製した。 分級 得られた粒子を、空気分級機（日鉄鉱業社製、ターボク
ラシファイアＴＣ−１５Ｎ）により分級し、平均粒径１
０μｍの充填剤粒子を得た。 カラムへの充填 上記充填剤を内径６ｍｍ、長さ７５ｍｍのステンレス製
カラムに充填した。
のシステムとした。 充填剤の調製 実施例１と同様にして充填剤を調製した。 分級 得られた粒子を、空気分級機（日鉄鉱業社製、ターボク
ラシファイアＴＣ−１５Ｎ）により分級し、平均粒径１
０μｍの充填剤粒子を得た。 カラムへの充填 上記充填剤を内径６ｍｍ、長さ７５ｍｍのステンレス製
カラムに充填した。
【００４２】ＨｂＡ１ｃの測定 溶離条件：溶離液Ａ２（５０ｍＭリン酸緩衝液：ｐＨ
６）により、糖化ヘモグロビンピークを分離した。この
際の溶離液Ａ２の流速ａは１．０ｍｌ／分に固定した。
リン酸緩衝液からなる溶離液Ｂ２により、ＨｂＡ０を溶
出させた。溶離液Ｂ２のｐＨ、濃度および流速ｂを表３
に示したように変えて、ＨｂＡ１ｃの測定を行った。な
お、それぞれの実施例および比較例において、連続１０
検体同一検体を測定した際、ＨｂＡ１ｃの保持時間のバ
ラツキが±０．０５分以内となった条件をそれぞれの確
定条件とした。 検出：４１５ｎｍ 試料（検体）：実施例１と同様にして調製した試料を用
いた。
６）により、糖化ヘモグロビンピークを分離した。この
際の溶離液Ａ２の流速ａは１．０ｍｌ／分に固定した。
リン酸緩衝液からなる溶離液Ｂ２により、ＨｂＡ０を溶
出させた。溶離液Ｂ２のｐＨ、濃度および流速ｂを表３
に示したように変えて、ＨｂＡ１ｃの測定を行った。な
お、それぞれの実施例および比較例において、連続１０
検体同一検体を測定した際、ＨｂＡ１ｃの保持時間のバ
ラツキが±０．０５分以内となった条件をそれぞれの確
定条件とした。 検出：４１５ｎｍ 試料（検体）：実施例１と同様にして調製した試料を用
いた。
【００４３】評価方法 上記測定条件で分析した場合の実施例２で得られたクロ
マトグラムを図４に示す。このクロマトグラムにおい
て、ピーク７は糖化ヘモグロビンＨｂＡ１ａ及びＨｂＡ
１ｂ、ピーク８は胎児性ヘモグロビンＨｂＦ、ピーク９
は糖化ヘモグロビンＨｂＡ１ｃ、ピーク１０は非糖化ヘ
モグロビンＨｂＡ０である。得られたクロマトグラムか
ら、図４に参照番号１１として示した測定時間（分）お
よび参照番号１２として示したＨｂＡ０ピークの幅
（分）を測定した。
マトグラムを図４に示す。このクロマトグラムにおい
て、ピーク７は糖化ヘモグロビンＨｂＡ１ａ及びＨｂＡ
１ｂ、ピーク８は胎児性ヘモグロビンＨｂＦ、ピーク９
は糖化ヘモグロビンＨｂＡ１ｃ、ピーク１０は非糖化ヘ
モグロビンＨｂＡ０である。得られたクロマトグラムか
ら、図４に参照番号１１として示した測定時間（分）お
よび参照番号１２として示したＨｂＡ０ピークの幅
（分）を測定した。
【００４４】測定結果 実施例２、３および比較例３〜５の測定結果（測定時間
およびＨｂＡ０ピークの幅）を表３に示した。
およびＨｂＡ０ピークの幅）を表３に示した。
【００４５】
【表３】
【００４６】表３より、以下のことが分かる。実施例２
では流速ｂを５．０ｍｌ／分とすることにより、溶離液
Ａ２と溶離液Ｂ２とを同一としても短時間で測定でき
た。実施例３では溶離液Ａ２と溶離液Ｂ２とは異なって
いるが、溶離液Ａ２と溶離液Ｂ２との間の組成の差異
（溶出力の差異）が小さいため比較的短時間で測定でき
た。一方、流速ａと流速ｂが同一の比較例３〜５では、
溶離液Ｂ２の組成を溶離液Ａ２の組成に比して大きく変
えないと溶出は困難であった。
では流速ｂを５．０ｍｌ／分とすることにより、溶離液
Ａ２と溶離液Ｂ２とを同一としても短時間で測定でき
た。実施例３では溶離液Ａ２と溶離液Ｂ２とは異なって
いるが、溶離液Ａ２と溶離液Ｂ２との間の組成の差異
（溶出力の差異）が小さいため比較的短時間で測定でき
た。一方、流速ａと流速ｂが同一の比較例３〜５では、
溶離液Ｂ２の組成を溶離液Ａ２の組成に比して大きく変
えないと溶出は困難であった。
【００４７】
【発明の効果】本発明１の糖化ヘモグロビンの測定方法
の構成は、上記の通りであり、この方法を用いると、Ｈ
ｂＡ１ｃ分画周辺のクロマトグラムを変えることなく、
また、ＨｂＡ１ｃ測定の精度を低下させることなく、測
定時間の短縮が図られる。
の構成は、上記の通りであり、この方法を用いると、Ｈ
ｂＡ１ｃ分画周辺のクロマトグラムを変えることなく、
また、ＨｂＡ１ｃ測定の精度を低下させることなく、測
定時間の短縮が図られる。
【００４８】本発明２の糖化ヘモグロビンの測定方法の
構成は、上記の通りであり、この方法を用いると、Ｈｂ
Ａ１ｃ分画周辺のクロマトグラムを変えることなく、ま
た、ＨｂＡ１ｃ測定の精度を低下させることなく、測定
時間の短縮が図られる。
構成は、上記の通りであり、この方法を用いると、Ｈｂ
Ａ１ｃ分画周辺のクロマトグラムを変えることなく、ま
た、ＨｂＡ１ｃ測定の精度を低下させることなく、測定
時間の短縮が図られる。
【００４９】本発明３の糖化ヘモグロビンの測定方法の
構成は、上記の通りであり、この方法を用いると、Ｈｂ
Ａ１ｃ分画周辺のクロマトグラムを変えることなく、ま
た、ＨｂＡ１ｃ測定の精度を低下させることなく、測定
時間の短縮が図られる。
構成は、上記の通りであり、この方法を用いると、Ｈｂ
Ａ１ｃ分画周辺のクロマトグラムを変えることなく、ま
た、ＨｂＡ１ｃ測定の精度を低下させることなく、測定
時間の短縮が図られる。
【図１】本発明で用いられる液体クロマトグラフのシス
テムの例を示す説明図である。
テムの例を示す説明図である。
【図２】実施例１において、充填剤Ａを用いて得られた
クロマトグラムである。
クロマトグラムである。
【図３】比較例１において、充填剤Ｅを用いて得られた
クロマトグラムである。
クロマトグラムである。
【図４】実施例２により得られたクロマトグラムであ
る。
る。
１、１Ａ、１Ｂ 溶離液 ２ 電磁弁 ３ 送液ポンプ ４ 試料導入装置 ５ 分離カラム ６ 検出器
フロントページの続き (72)発明者 谷川 典子 山口県新南陽市開成町4560 徳山積水工業 株式会社内
Claims (3)
- 【請求項１】 ヘモグロビンＡ０の溶出時間が、全ヘモ
グロビンの溶出時間の３０％以下とすることを特徴とす
る液体クロマトグラフィーによる糖化ヘモグロビンの測
定方法。 - 【請求項２】 充填剤として平均粒径が１〜１０μｍ、
その粒度分布の標準偏差が１．０μｍ以下のものを用い
ることを特徴とする請求項１記載の液体クロマトグラフ
ィーによる糖化ヘモグロビンの測定方法。 - 【請求項３】 ヘモグロビンＡ０の溶出時の流速を糖化
ヘモグロビンの溶出時の流速の１．１〜１０倍とするこ
とを特徴とする液体クロマトグラフィーによる糖化ヘモ
グロビンの測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9039085A JPH10239301A (ja) | 1997-02-24 | 1997-02-24 | 糖化ヘモグロビンの測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9039085A JPH10239301A (ja) | 1997-02-24 | 1997-02-24 | 糖化ヘモグロビンの測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10239301A true JPH10239301A (ja) | 1998-09-11 |
Family
ID=12543259
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9039085A Pending JPH10239301A (ja) | 1997-02-24 | 1997-02-24 | 糖化ヘモグロビンの測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10239301A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009243956A (ja) * | 2008-03-28 | 2009-10-22 | Sekisui Chem Co Ltd | ヘモグロビン類の測定方法 |
| JP2013011632A (ja) * | 2012-10-19 | 2013-01-17 | Sekisui Chem Co Ltd | ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法 |
| CN110636899A (zh) * | 2017-06-30 | 2019-12-31 | 昭和电工株式会社 | 液相色谱用填充剂及液相色谱用柱 |
| CN113219075A (zh) * | 2018-12-29 | 2021-08-06 | 江山德瑞医疗科技有限公司 | 一种测定抗凝静脉全血糖化血红蛋白的试剂盒 |
-
1997
- 1997-02-24 JP JP9039085A patent/JPH10239301A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009243956A (ja) * | 2008-03-28 | 2009-10-22 | Sekisui Chem Co Ltd | ヘモグロビン類の測定方法 |
| JP2013011632A (ja) * | 2012-10-19 | 2013-01-17 | Sekisui Chem Co Ltd | ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法 |
| CN110636899A (zh) * | 2017-06-30 | 2019-12-31 | 昭和电工株式会社 | 液相色谱用填充剂及液相色谱用柱 |
| CN113219075A (zh) * | 2018-12-29 | 2021-08-06 | 江山德瑞医疗科技有限公司 | 一种测定抗凝静脉全血糖化血红蛋白的试剂盒 |
| CN113219075B (zh) * | 2018-12-29 | 2023-03-21 | 江山德瑞医疗科技有限公司 | 一种测定抗凝静脉全血糖化血红蛋白的试剂盒 |
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