JPH10262684A - フマラーゼ遺伝子及び該遺伝子破壊株 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 微生物のフマラーゼ遺伝子破壊株を提供す
る。 【解決手段】 配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮ
Ａ断片もしくはその一部、又はこのＤＮＡと生理的条件
下でハイブリダイズし得るＤＮＡ断片もしくはその一部
がベクターに連結されてなる組換えベクターＤＮＡを、
微生物細胞に導入し、この微生物細胞の染色体ＤＮＡ上
のフマラーゼ遺伝子と前記ＤＮＡ断片との相同組換えに
よりフマラーゼ遺伝子を破壊する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、フマラーゼをコー
ドするＤＮＡ断片及びそれを用いたフマラーゼ遺伝子破
壊株の作成方法に関する。更に詳しくは、ブレビバクテ
リウム・フラバム等のコリネ型細菌由来のフマラーゼを
コードするＤＮＡ断片及びそれを用いた染色体ＤＮＡと
の相同性組換えの原理による、フマラーゼ遺伝子破壊株
の作成方法に関する。フマル酸の水添加物であるリンゴ
酸は、アスパラギン酸、アラニン等の各種ファインケミ
カルズを製造する場合の副生物である。

【０００２】

【従来の技術】フマラーゼは、フマル酸に水添加してリ
ンゴ酸を生成する酵素であるが、大腸菌あるいはコリネ
型細菌等の微生物を用いて、アスパラギン酸、アラニン
等の各種ファインケミカルズを製造しようという場合
は、副生物としてリンゴ酸等を生成する原因となる。そ
こで、従来は、例えばアスパラギン酸製造において副生
物生成の原因となるフマラーゼを失活させる方法とし
て、アスパラギン酸等の存在下に微生物菌体を熱処理す
ることにより熱失活させる方法などが知られていた。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記方
法は、ファインケミカルズの製造に用いる微生物の培養
後、熱処理操作という煩雑な操作等が必要となり、ファ
インケミカルズを製造しようとする場合において作業効
率が低減する結果となる。そこで、このようなフマラー
ゼ失活処理することなしにフマラーゼ活性の低減した菌
株を取得することが望まれていた。

【０００４】フマラーゼ遺伝子の破壊された微生物菌株
としては、大腸菌(Escherichia coli)(J.Bacteriol., V
ol.153, p.588-596)、枯草菌(Bacillus subtilis)、等
で知られているが、これらの菌株を得る方法は、ランダ
ム変異導入法により変異導入した菌株の中からスクリー
ニングするという煩雑な実験操作を要する方法であり、
これまでに、アミノ酸等のファインケミカルズ製造にお
いて産業上重要なコリネ型細菌において取得された例は
なく、フマラーゼ遺伝子の破壊されたコリネ型細菌の簡
便な取得方法が望まれていた。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、遺伝子組換えの手
法を駆使することにより、コリネ型細菌からフマラーゼ
遺伝子ＤＮＡを単離することに成功し、該ＤＮＡ断片を
用いることにより効率的にフマラーゼ遺伝子破壊株を作
製することが可能であることを見い出し、本発明を完成
するに至った。

【０００６】すなわち、本発明の要旨は、下記（Ａ）又
は（Ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡにある。 （Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク
質。 （Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若し
くは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたア
ミノ酸配列からなり、かつ、フマラーゼ活性を有するタ
ンパク質。 上記ＤＮＡとして具体的には、下記（ａ）又は（ｂ）に
示すＤＮＡが挙げられる。 （ａ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡ。 （ｂ）配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡとスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズし、フマラーゼ
活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。 また本発明は、前記ＤＮＡがベクターに連結されてなる
組換えベクターＤＮＡ、及び、配列番号１記載のＤＮＡ
もしくはこのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズするＤＮＡ、又はその一部がベクターに連結
されてなる組換えベクターＤＮＡを提供する。本発明は
さらに、前記ＤＮＡ又は組換えベクターＤＮＡと、微生
物細胞の染色体ＤＮＡ上のフマラーゼ遺伝子との相同組
換えによりフマラーゼ遺伝子が破壊された、微生物のフ
マラーゼ遺伝子破壊株を提供する。本発明はまた、前記
フマラーゼ遺伝子破壊株を培地で培養し、その培養物か
らアスパラギン酸またはアラニンを採取することを特徴
とする、アスパラギン酸またはアラニンの製造方法を提
供する。上記フマラーゼ遺伝子破壊株の親株としては、
コリネ型細菌、より具体的には、ブレビバクテリウム・
フラバム ＭＪ−２３３株が挙げられる。

【０００７】本発明の「フマラーゼ（fumarase）、ある
いは、フマル酸ヒドラターゼ（fumarate hydratase）;
EC 4.2.1.2）」とは、フマル酸に水添加してリンゴ酸を
生成する可逆反応を触媒する酵素を意味する。また、本
明細書では、フマラーゼをコードするＤＮＡを、便宜上
「フマラーゼ遺伝子」ということがある。以下、本発明
について詳細に説明する。

【０００８】

【発明の実施の形態】

【０００９】本発明のＤＮＡは、フマラーゼをコードす
る遺伝子であり、前記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク
質をコードするＤＮＡである。

【００１０】本発明のフマラーゼ遺伝子は、本発明によ
りその塩基配列が決定されたので、この配列に基づいて
合成することも可能であるが、本発明においてはコリネ
型細菌からクローニングすることにより、初めて得られ
たものである。フマラーゼ遺伝子の供給源としては、フ
マラーゼ活性を有するコリネ型細菌であれば特に制限は
ない。

【００１１】上記のようなコリネ型細菌としては、コリ
ネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・
ラクトファーメンタム、ブレビバクテリウム・アンモニ
アゲネス、ブレビバクテリウム・フラバム等が挙げられ
る。さらに具体的には、例えばブレビバクテリウム・フ
ラバムＭＪ−２３３株が挙げられる。本菌株は、昭和５
０年４月２８日に通商産業省工業技術院微生物工業技術
研究所（現生命工学工業技術研究所）に微工研菌寄第３
０６８号として寄託され、昭和５６年５月１日にブダペ
スト条約に基づく国際寄託に移管され、微工研条寄第１
４９７号（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）の受託番号で寄
託されている。

【００１２】以下に、上記微生物からフマラーゼ遺伝子
ＤＮＡ断片を取得する方法、該遺伝子ＤＮＡ断片を用い
たフマラーゼ破壊株の作製方法の一例を説明する。本発
明のフマラーゼ遺伝子ＤＮＡ断片は、コリネ型細菌の染
色体ＤＮＡ、具体的には、ブレビバクテリウム・フラバ
ム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）Ｍ
Ｊ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）株等の染色体
ＤＮＡから以下に述べる方法で単離、塩基配列決定する
ことができる。

【００１３】まず、上記コリネ型細菌、例えばブレビバ
クテリウム・フラバムＭＪ−２３３を常法［例えば、特
開昭５１−１３０５９２参照］に従い培養し、培養物か
ら菌体を集め、該菌体から染色体ＤＮＡを抽出する。染
色体ＤＮＡは、例えば、特開平５−１５３７８の実施例
１（Ａ）に記載の方法等により菌体から容易に抽出する
ことができる。上記菌株より染色体ＤＮＡを抽出する際
には、適当な培地で培養した該菌株の菌体を使用するこ
とができるが、培養した菌体を集菌後に凍結保存した保
存試料を使用することも可能である。

【００１４】エシェリヒア・コリ等のフマラーゼの一次
構造（アミノ酸配列）の相同性の高い部分から逆翻訳し
たオリゴデオキシリボヌクレオチドをプライマーとして
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、フマラーゼ遺
伝子の部分断片を得る。このようなプライマーとして
は、配列番号３および４に示すアミノ酸配列に相当する
配列番号５および６に示す塩基配列を有するオリゴヌク
レオチドが挙げられる。配列番号３および４に示すアミ
ノ酸配列は、後記実施例で詳述するように、大腸菌（エ
シェリヒア・コリ(Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ)）、枯草菌（バチルス・サチリス(Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ)）、ブラディリゾビウム・ジャポ
ニカム（Ｂｒａｄｉｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉ
ｃｕｍ）、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）間で、そのア
ミノ酸配列において保存されている領域から選択したも
のである。

【００１５】ＰＣＲで得られたＤＮＡ断片を適当なクロ
ーニングベクター、例えばｐＧＥＭ−Ｔ（プロメガ社
製）へサブクローニングし、エシェリヒア・コリＪＭ１
０９株（宝酒造製）を形質転換する。この形質転換株を
適当な抗生物質選択下で培養し、培養物から菌体を回収
し、菌体から常法、例えばアルカリ−ＳＤＳ法によりプ
ラスミドを抽出する。このプラスミドに挿入されたＤＮ
Ａの塩基配列を決定することにより、本発明のフマラー
ゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を取得することができる。

【００１６】得られたＤＮＡ断片の塩基配列は、例え
ば、ジデオキシヌクレオチド酵素法［Dideoxy chain te
rmination 法；Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad.
sci.U.S.A., Vol.74, p.5463, (1977)］により決定す
ることができる。上記のようにして、後記実施例で得ら
れたフマラーゼ遺伝子の部分断片の塩基配列を決定し、
アミノ酸配列に翻訳して解析した結果、フマラーゼの部
分断片は、配列番号２記載のアミノ酸配列の１９９番目
から３３４番目までで示されるアミノ酸配列にあたる部
分からなり、またそれをコードする遺伝子は、例えば、
配列番号１記載の塩基配列中の５９５番目から１００２
番目までの塩基配列で示される部分にあたるものであっ
た。

【００１７】フマラーゼ遺伝子全体を含むＤＮＡ断片を
得るには、遺伝子の単離に関する公知のいずれの方法も
が使用できるが、例えば、ブレビバクテリウム・フラバ
ムＭＪ２３３等のコリネ型細菌の染色体ＤＮＡライブラ
リーを作製し、上記フマラーゼ遺伝子部分断片をプロー
ブとするハイブリダイゼーションにより、フマラーゼ遺
伝子全体を含む染色体ＤＮＡを単離する方法が挙げられ
る。以下にその一例を説明する。

【００１８】（Ａ）染色体ＤＮＡライブラリーの作製：
上記菌株より抽出した染色体ＤＮＡを適当な制限酵素、
例えばＳａｕ３ＡＩを用いて部分分解し、エシェリヒア
・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等の宿主
−ベクター系を用いて染色体ＤＮＡのライブラリーを作
製する。具体的に使用し得るベクターとしては、例えば
λＦＩＸＩＩ（東洋紡績（株）製）等のラムダファージ
ベクター、ｐＵＣ１１８（宝酒造製）、ｐＢＲ３２２
（宝酒造製）、コスミドｐＷＥ−１５（Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ社製）等のプラスミドベクターが挙げられる。

【００１９】上記部分分解により得られる様々なＤＮＡ
断片の上記ベクターへの挿入、例えばファージベクター
λＦＩＸＩＩ（東洋紡績（株）製）への挿入は、適当な
制限酵素、例えばＳａｕ３ＡＩで開裂したベクターと部
分分解ＤＮＡ断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結
することにより行うことができる。かくして染色体ＤＮ
Ａライブラリーが得られる。

【００２０】（Ｂ）フマラーゼ遺伝子を含むベクターの
選別：上記（Ａ）項で調製した染色体ＤＮＡライブラリ
ーからフマラーゼ遺伝子を含むベクターを選別するに
は、この染色体ＤＮＡライブラリーを用いて宿主微生
物、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ）の形質導入あるいは形質転換を行い、得
られる形質導入体あるいは形質転換体から、適当な手段
によりフマラーゼ遺伝子を保持するクローンを選別すれ
ばよい。

【００２１】具体的には、上記ファージベクターをエシ
ェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ）、例えばＰ２３９２株［Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， Ｖｏ
ｌ．７， ｐ．１５１３ （１９７９）］に感染させ、
これを寒天培地上に重層することによりプラークを形成
させる。次いでこのプラーク中のファージＤＮＡをニト
ロセルロース膜に移し取り、このファージＤＮＡを該ニ
トロセルロース膜に固定し、前記のフマラーゼ遺伝子の
部分断片をプローブとして用いたプラークハイブリダイ
ゼーション［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）］を行う。こうし
て、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株の染色
体ＤＮＡ由来のフマラーゼ遺伝子を有するファージベク
ターを含む形質導入体を検出し、選別することが可能で
ある。

【００２２】あるいは上記プラスミドベクターを用いて
染色体ＤＮＡライブラリーを調製した場合には、このラ
イブラリーＤＮＡでエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９（宝酒造製）を形質
転換し、得られた形質転換体から前記のフマラーゼ遺伝
子の部分断片をプローブとして用いたコロニーハイブリ
ダイゼーション法［Ｒ． Ｂｒｕｃｅ Ｗａｌｌａｃ
ｅ， ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．， Ｖｏｌ．９， ｐ．８７９ （１９８１）］
を行うことによっても選別可能である。

【００２３】更に、上記のようにして選別された形質導
入体あるいは形質転換体よりファージＤＮＡ、あるいは
プラスミドＤＮＡを抽出し、挿入断片を適当な制限酵素
でベクターから切り出すことで本発明のＤＮＡを取得す
ることができる。上記操作によって切り出されたＤＮＡ
断片につき、前記のフマラーゼ遺伝子の部分断片をプロ
ーブとして用いてサザンハイブリダイゼーション［Ｅ．
Ｍ．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏ
ｌ．， Ｖｏｌ．９８， ｐ．５０３ （１９７５）］
を行うことにより、フマラーゼ遺伝子が挿入ＤＮＡ断片
内に存在することを再確認できる。

【００２４】このようにして得られるＤＮＡ断片の１つ
として、上記ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３
株染色体ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断して得られ
る、大きさが約８ｋｂのＤＮＡ断片、および、制限酵素
ＳａｃＩで切断して得られる、大きさが約６．５ｋｂの
ＤＮＡ断片を挙げることができる。さらに、上記ＤＮＡ
断片の塩基配列を決定したところ、両断片中には、図１
に示すようなオープンリーディングフレームの存在が確
認され、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株の
フマラーゼ遺伝子のコード領域は、後記配列表の配列番
号１に示すアミノ酸配列中のアミノ酸番号１〜４６９の
４６９個のアミノ酸配列をコードする１４０７塩基対か
ら構成されることがわかった。また、得られた塩基配列
（配列番号１）には、前記のＰＣＲに用いたプライマー
に相当する配列（配列番号５及び６）を含むことが確認
された。

【００２５】本発明におけるフマラーゼ遺伝子は、天然
の細菌、例えばコリネ型細菌の染色体ＤＮＡから分離さ
れたもののみならず、通常用いられるＤＮＡ合成装置、
例えばベックマン社製／オリゴ１０００Ｍ ＤＮＡ合成
装置（Oligo 1000M DNA Synthesizer）を用いて合成さ
れたものであってもよい。

【００２６】また、フマラーゼ活性を損なわない範囲
で、配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しく
は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミ
ノ酸配列をコードするＤＮＡも、本発明に含まれる。こ
こで「数個」とは、好ましくは４０個以下、より好まし
くは２０個以下である。

【００２７】上記のようなＤＮＡの一態様として、例え
ば、配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮ
Ａとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤ
ＮＡであって、かつ、フマラーゼ活性を有するＤＮＡが
挙げられる。ここでいう「ストリンジェントな条件」と
は、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異
的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件
を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せ
ば、相同性が高い核酸同士、例えば、６０％以上、好ま
しくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブ
リダイズし、それより相同性が低い核酸同士がハイブリ
ダイズしない条件が挙げられる。

【００２８】尚、後述するように、本発明のＤＮＡをコ
リネ型細菌のフマラーゼ遺伝子破壊株の作製に用いる場
合には、該ＤＮＡはフマラーゼ活性を有するタンパク質
をコードする必要はなく、生理的条件下、すなわち微生
物細胞内で、染色体上のフマラーゼ遺伝子と相同組換え
を起こすことができ、それによってフマラーゼ遺伝子を
破壊することができる程度の相同性を有していればよ
い。このような相同性としては、好ましくは９０％以
上、より好ましくは９５％以上の相同性が挙げられる。
また、フマラーゼ遺伝子破壊株の作製に用いるＤＮＡ
は、染色体上のフマラーゼ遺伝子と相同組換えを起こす
ことができ、それによってフマラーゼ遺伝子を破壊する
ことができる程度の大きさであれば、本発明のＤＮＡの
一部であってもよい。ここで一部とは、好ましくは５０
塩基以上、より好ましくは１００塩基以上の長さを有す
るものが挙げられる。

【００２９】本発明のフマラーゼ遺伝子は、例えば、フ
マラーゼやリンゴ酸の製造に用いることができる。すな
わち、本発明のＤＮＡが導入された微生物、例えば本発
明のＤＮＡがベクターに連結されてなる組換えベクター
ＤＮＡで形質転換された微生物は、フマラーゼを高生産
することが予想される。また、本発明のＤＮＡは、コリ
ネ型細菌のフマラーゼ遺伝子破壊株の作製に用いること
ができる。本発明のＤＮＡ又はその一部を用いたコリネ
型細菌のフマラーゼ遺伝子破壊法としては、該ＤＮＡを
カナマイシン耐性遺伝子あるいはクロラムフェニコール
耐性遺伝子等のマーカーと結合した後、電気パルス法(E
lectroporation)等により菌体内に導入した後、マーカ
ーで選択することにより、相同組換えによって該フマラ
ーゼ遺伝子部分断片を宿主微生物染色体上へ組み込むこ
とが可能となる（Biosci. Biotech. Biochem., Vol.57,
p.2036-2038, 1993）。

【００３０】かくして得られる微生物から、フマラーゼ
遺伝子破壊株を効率的に取得することができる。

【００３１】上記のようにして得られるフマラーゼ遺伝
子破壊株は、実質的に活性のあるフマラーゼを産生しな
いので、微生物の熱処理を行わなくても、アスパラギン
酸、アラニン等の各種ファインケミカルズの製造の際の
リンゴ酸の副生を低減することができる。

【００３２】

【実施例】以上に本発明を説明してきたが、下記の実施
例によりさらに具体的に説明する。しかしながら、実施
例は本発明の具体的な認識を得る一助とみなすべきのも
のであり、本発明の範囲を何等限定するものではない。

【００３３】〔実施例１〕ブレビバクテリウム・フラバ
ムＭＪ−２３３由来のフマラーゼ遺伝子断片の一部（Ａ
断片）のクローン化およびその塩基配列の決定

【００３４】（Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３の全ＤＮＡの抽出 半合成培地Ａ培地［組成：尿素２ｇ、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄
７ｇ、Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０．５ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．５ｇ、Ｍ
ｇＳＯ₄ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ６ｍｇ、Ｍｎ
ＳＯ₄・４〜６Ｈ₂Ｏ ６ｍｇ、酵母エキス２．５ｇ、カ
ザミノ酸５ｇ、ビオチン２００μｇ、塩酸チアミン２０
０μｇ、グルコース２０ｇ、蒸留水１Ｌ］１Ｌに、ブレ
ビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−１４９７）を対数増殖期後期まで培養し、菌体を集
めた。得られた菌体を１０ｍｇ／ｍｌの濃度にリゾチー
ムを含む１０ｍＭ ＮａＣｌ−２０ｍＭトリス緩衝液
（ｐＨ８．０）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液１５ｍ
ｌに懸濁した。

【００３５】次に、上記懸濁液にプロテナーゼＫを、最
終濃度が１００μｇ／ｍｌになるように添加し、３７℃
で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最
終濃度が０．５％になるように添加し、５０℃で６時間
保温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール／
クロロホルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに
振盪した後、全量を遠心分離（５，０００×ｇ、２０分
間、１０〜１２℃）し、上清画分を分取し、酢酸ナトリ
ウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２倍量のエタ
ノールをゆっくりと加えた。水層とエタノール層の間に
存在するＤＮＡをガラス棒でまきとり、７０％エタノー
ルで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭ
トリス緩衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎ
ａ溶液５ｍｌを加え、４℃で一晩静置し、鋳型ＤＮＡと
して、ＰＣＲに使用した。

【００３６】（Ｂ）プライマーの選択 フマラーゼ遺伝子は、原核生物では、大腸菌（fumA、fu
mB、又はfumC）（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏｇｙ，１５３，５８８，１９８３，Ｊｏｕｒｎ
ａｌｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ
ｙ，１３１，２９７１，１９８５）枯草菌（citG）（Ｊ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌｏｇｙ，１２９，３０３，１９８３）、ブラディリ
ゾビウム・ジャポニカム(fumA又はfumC）（Ｊｏｕｒｎ
ａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ
ｙ，１３７，９９１，１９９１）等、真核生物ではサッ
カロミセス・セレビジエ(fum)（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６
２，１２２７５，１９８７）等のものが知られている。
これら４種の微生物のフマラーゼにおいて、大腸菌fum
C、枯草菌citG、ブラディリゾビウム・ジャポニカムfum
C、サッカロミセス・セレビジエfum間で、そのアミノ酸
配列において保存されている領域を検討し、配列番号３
および４のアミノ酸配列を基に、配列番号５および６に
示す塩基配列を有する２つのプライマーを選択し、アプ
ライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ）社製３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイ
ザー（ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を用いて合成した。

【００３７】（配列番号５）CCNYTNACNY TNGGNCARGA （配列番号６）TGNGTNGGRT TNACYTTNCC NGGCAT （配列中、ＲはＡ又はＧ、ＹはＣ又はＴ、ＮはＡ、Ｇ、
Ｃ又はＴを示し、ここでＡはアデニン、Ｇはグアニン、
Ｃはシトシン、Ｔはチミンを示す。） これら２つのプライマーを用いて上記（１）で調製した
染色体を鋳型としてＰＣＲを行うと、フマラーゼ遺伝子
が存在する限り、（ａ）と（ｂ）の組み合わせで約４０
０ｂｐの反応産物が得られると期待される。

【００３８】（Ｃ）ＰＣＲ反応 ＰＣＲ反応はパーキンエルマーシータス社製のＤＮＡサ
ーマルサイクラーを用いて下記の条件で行った。

【００３９】反応液： ５０ｍＭ ＫＣｌ １０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４） １．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 鋳型ＤＮＡ ５μｌ

【００４０】上記（Ｂ）で作製したプライマー 各々
０．２５μＭ ｄＮＴＰｓ 各々２００μＭ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造） ２．５ｕｎｉｔ
ｓ 以上を混合し、１００μｌとした。

【００４１】ＰＣＲサイクル： デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒 アニーリング過程：５５℃ １２０秒 エクステンション過程：７２℃ １８０秒 以上を１サイクルとし、３０サイクル行った。

【００４２】（Ｄ）反応物の検出 上記（Ｃ）で生成した反応液１０μｌを２％アガロース
ゲルにより電気泳動を行って約４００ｂｐの断片の検出
を行った。

【００４３】（Ｅ）増幅断片のクローン化 上記（Ｃ）項で得た反応液３μｌと、ＰＣＲ産物クロー
ニングベクターｐＧＥＭ−Ｔ（ＰＲＯＭＥＧＡより市
販）１μｌを混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．
６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、
１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂及びＴ4 ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉ
ｔの各成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度であ
る）、４℃で１５時間反応させ、結合させた。

【００４４】得られたプラスミド混液を用い、塩化カル
シウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９，１９７０）によりエシ
ェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換し、
アンピシリン５０ｍｇを含む培地［トリプトン１０ｇ、
イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天
１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。

【００４５】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、挿入断片を確認した。この
結果、プラスミドｐＧＥＭ−Ｔの長さ３．０ｋｂのＤＮ
Ａ断片に加え、長さ約４００ｂｐの挿入断片が認められ
た。

【００４６】（Ｆ）増幅断片の塩基配列の決定 （Ｅ）項で得られた長さが約４００ｂｐの増幅断片につ
いて、その塩基配列をジデオキシヌクレオチド酵素法
（ｄｉｄｅｏｘｙｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ
法）（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ, ７４，５４６３，
１９７７）により決定した。その結果得られたＤＮＡ塩
基配列およびその翻訳アミノ酸配列を配列表配列番号１
および２に示す。本アミノ酸配列は、大腸菌、あるい
は、枯草菌のフマラーゼのアミノ酸配列の一部分と高い
相同性を示し、本ＤＮＡ断片がブレビバクテリウム・フ
ラバムＭＪ−２３３株由来のフマラーゼ遺伝子の部分断
片であることが明らかになった。

【００４７】〔実施例２〕フマラーゼ遺伝子部分断片を
用いたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来
染色体フマラーゼ遺伝子の破壊 （Ｇ）遺伝子破壊に用いるプラスミドベクターの構築 上記（Ｅ）項で得たプラスミドを２０μｌについて、５
０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）、１ｍＭジチオスレ
イトール、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１００ｍＭＮａＣ
ｌ、制限酵素ＳｐｈＩおよびＳａｌＩ １ｕｎｉｔの各
成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度である）、３７
℃で１時間反応させ、フマラーゼ遺伝子部分断片約４０
０ｂｐとｐＧＥＭ−Ｔベクター領域約３ｋｂの２つの断
片を得た。得られたＤＮＡ溶液からＧｅｎｅ Ｃｌｅａ
ｎＩＩ（フナコシ社製）を用いて４００ｂｐ断片の回収
を行い、該ＤＮＡ溶液１０μｌと、クロラムフェニコー
ル耐性のクローニングベクターｐＨＳＧ３９６（宝酒造
社製）１μｌのＳｐｈＩ、ＳａｌＩ分解物と混合し、５
０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオス
レイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂及
びＴ4 ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し（各
成分の濃度は最終濃度である）、４℃で１５時間反応さ
せ、結合させた。

【００４８】得られたプラスミド混液を用い、塩化カル
シウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９，１９７０）によりエシ
ェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換し、
アンピシリン５０ｍｇを含む培地［トリプトン１０ｇ、
イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天
１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。

【００４９】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、挿入断片を確認した。この
結果、プラスミドｐＨＳＧ３９６の長さ２．２ｋｂのＤ
ＮＡ断片に加え、長さ約４００ｂｐの挿入断片が認めら
れた。

【００５０】（Ｈ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３株フマラーゼ遺伝子破壊株の作成 上記（Ｇ）項で得られたプラスミドはＭＪ−２３３菌体
内で複製不可能なプラスミドである。該プラスミドを、
電気パルス法（Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、Vol.14
4, p.181-185, 1993）によりブレビバクテリウム・フラ
バムＭＪ−２３３に導入し、クロラムフェニコール ５
μｇ／ｍｌを含む培地［尿素 ２ｇ、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄
７ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．５ｇ、Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０．５ｇ、Ｍ
ｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ６
ｍｇ、ＭｎＳＯ₄・４−５Ｈ₂Ｏ６ｍｇ、ビオチン ２０
０μｇ、チアミン １００μｇ、イーストエキストラク
ト １ｇ、カザミノ酸 １ｇ、グルコース ２０ｇ、及
び、寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。

【００５１】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液より染色体ＤＮＡを抽出し、以下に述べるゲ
ノミックサザンハイブリダイゼーションにより染色体上
のフマラーゼ遺伝子の破壊を確認した。染色体ＤＮＡを
適当な制限酵素で分解した後、ナイロンフィルター（Ｈ
ｙｂｏｎｄ Ｎ アマシャム社製）にブロッティング
し、上記で得た４００ｂｐのフマラーゼ部分断片をプロ
ーブとしてランダムプライマーラベリングキット（³²Ｐ
［ｄＣＴＰ］使用）（宝酒造社製）によりラベル化し、
ゲノミックサザンハイブリダイゼーションを行った。野
生株より抽出した染色体ＤＮＡを用いたゲノミックサザ
ンハイブリダイゼーションのパターンと比較して、遺伝
子破壊株のパターンは（Ｇ）項で導入したプラスミド
３．４ｋｂ分長いバンドが検出され、染色体上のフマラ
ーゼ遺伝子の破壊が確認できた。

【００５２】［実施例３］ブレビバクテリウム・フラバ
ムＭＪ−２３３由来のフマラーゼ遺伝子全体のクローン
化およびその塩基配列の決定 （Ｉ）ゲノミック・サザンハイブリダイゼーション 上記（Ａ）項で得たブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３株の染色体ＤＮＡ溶液の９０μｌに制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ、あるいは、ＳａｃＩ、５０Ｕ（ｕｎｉｔｓ）
を加え、３７℃で１時間反応させ完全分解し、アガロー
スゲル電気泳動に供した後、アガロースゲルよりＤＮＡ
をナイロン膜上に移し取った。前記（Ｅ）項で取得した
フマラーゼ遺伝子部分断片を、宝酒造製 Random Primer
DNA Labeling Kit Ver.2 を用いて、Exo-free Klenow
Fragment 及び［α−³²Ｐ］ｄＣＴＰによりラジオアイ
ソトープラベル［Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５
８，３０７−３１５（１９８６）］した。アイソトープ
ラベルされたプローブを用い、常法［Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８
９）］に従ってサザンハイブリダイゼーションを行っ
た。

【００５３】その結果、ＥｃｏＲＩ処理したものは上記
ナイロン膜上の約８ｋｂの位置に、ＳａｃＩ処理したも
のは上記ナイロン膜上の約６．５ｋｂの位置に、上記プ
ローブが強くハイブリダイズするＤＮＡ断片の存在を確
認した。

【００５４】（Ｊ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３株の染色体ＤＮＡライブラリーの作製 上記（Ａ）項で得たブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３株の染色体ＤＮＡ溶液の９０μｌに制限酵素Ｓ
ａｕ３ＡＩ ５ｕｎｉｔｓを加え、３７℃で１０分間反
応させて部分分解した。この様々な長さの部分分解ＤＮ
Ａと、制限酵素ＸｈｏＩで切断後、ＤＮＡポリメラーゼ
クレノウフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗｆｒａｇｍｅｎ
ｔ）を用いてｄＴＴＰ（２’−デオキシチミジン５’−
トリフォスフェート）、ｄＣＴＰ（２’−デオキシシチ
ジン５’−トリフォスフェート）で切断末端を埋めたフ
ァージベクターλＦＩＸＩＩ（λＦＩＸＩＩ／ＸｈｏＩ
−ｐａｒｔｉａｌ ｆｉｌｌ−ｉｎ ｔｒｅａｔｅｄ
ＤＮＡ：東洋紡績（株）社製）とを混合し、５０ｍＭト
リス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオスレイトー
ル、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、および、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し（各成
分の濃度は最終濃度である）、１６℃で１０時間反応さ
せて部分分解ＤＮＡとベクターとを連結させ、染色体Ｄ
ＮＡのλＤＮＡライブラリーを得た。

【００５５】（Ｋ）目的組換え体ＤＮＡの選別 上記（Ｊ）項で作製したλＤＮＡライブラリーファージ
溶液（２〜５×１０⁴ｐｆｕ；ＳＭ緩衝液希釈）と、エ
シェリヒア・コリＰ２３９２の培養液を当量混合し、３
７℃で１５分間保温した。これに５０℃にて保温してお
いた３〜４ｍｌのλ培地（１％ トリプトン、０．５％
酵母エキス、０．５％ ＮａＣｌ、０．２％ ＭｇＳ
Ｏ₄・７Ｈ₂Ｏ、０．５％ 寒天）を加え、λプレート
（１％ トリプトン、０．５％ ＮａＣｌ、０．２％
ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、１％ 寒天）に均一に塗布し、３
７℃で１２〜１６時間培養した。

【００５６】この培地上にニトロセルロースフィルター
を載せ、培地上に形成されたプラークをフィルターに吸
着させ、順次５分間ずつ以下イ）〜ハ）の試薬に浸した
濾紙上にフィルターをのせて処理した。 イ）０．５Ｍ ＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌ ロ）０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１．
５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ ハ）２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ；ＮａＣｌ １７５．３
ｇ，クエン酸三ナトリウム二水和物 ８８．２ｇを蒸留
水１Ｌに溶解）

【００５７】上記フィルターを風乾後、８０℃にて２時
間乾熱処理をしてＤＮＡを固定した。前記フマラーゼ遺
伝子部分断片をプローブとして用い、上記で作製したフ
ィルターにつきプラークハイブリダイゼーションを常法
［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰ
ｒｅｓｓ（１９８９）］に従って行った。

【００５８】この結果、上記フマラーゼ遺伝子部分断片
をプローブとしてハイブリダイゼーション陽性のプラー
クＬＦＵＭＣ２３３を選択した。ＬＦＵＭＣ２３３から
ファージＤＮＡを抽出し、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳ
ａｃＩにより切断したところ、ゲノミック・サザンハイ
ブリダイゼーションの結果と一致する、長さ約８ｋｂの
ＥｃｏＲＩ挿入断片、および、６．５ｋｂのＳａｃＩ挿
入断片をアガロースゲル電気泳動により確認することが
できた。

【００５９】（Ｌ）フマラーゼ遺伝子のサブクローニン
グ：上記（Ｋ）項で得られた長さが約８ｋｂのＥｃｏＲ
Ｉ−ＤＮＡ断片、および、約６．５ｋｂのＳａｃＩ−Ｄ
ＮＡ断片上に存在するフマラーゼ遺伝子の位置をさらに
特定するために、該ＤＮＡ断片を下記のようにプラスミ
ドｐＵＣ１１８（宝酒造（株）社製）へサブクローニン
グした。

【００６０】上記ＬＦＵＭＣ２３３から抽出したファー
ジＤＮＡからＥｃｏＲＩあるいはＳａｃＩで切り出され
るＤＮＡ断片と、クローニングベクターｐＵＣ１１８
（宝酒造（株）製）を、各々制限酵素ＥｃｏＲＩ、ある
いは、ＳａｃＩで切断した後、脱リン酸化処理したもの
を混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０
ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ２およびＴ４ＤＮＡリガーゼ １ｕｎｉｔの各
成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度である）、１６
℃で１０時間反応させ、上記ＥｃｏＲＩ断片、および、
ＳａｃＩ断片とベクターを連結させた。

【００６１】得られた連結反応液を用い、塩化カルシウ
ム法［Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５３， ｐ．１５９（１９７
０）］により エシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造
（株）社製）を形質転換し、アンピシリン ５０μｇ／
ｍｌを含む培地［トリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、
ＮａＣｌ ５ｇおよび寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解］
に塗抹した。この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを各々制限酵素ＥｃｏＲＩ、あるいは、ＳａｃＩによ
り切断し、ハイブリダイゼーション法を用いて挿入断片
を調べたところ、プラスミドｐＵＣ１１８の長さ３．４
ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ約８ｋｂのＥｃｏＲＩ−
ＤＮＡ断片、および、約６．５ｋｂのＳａｃＩ−ＤＮＡ
断片が確認された。

【００６２】上記で得られたプラスミドを各々ｐＦＵＭ
Ｃ−ＥＣＯ、および、ｐＦＵＭＣ−ＳＡＣと命名し、該
プラスミドで形質転換されたエシェリヒア・コリＪＭ１
０９株（宝酒造（株）製）を各々、ＥＣＦＵＭＣ−ＥＣ
Ｏ、および、ＥＣＦＵＭＣ−ＳＡＣと命名した。

【００６３】（Ｍ）塩基配列の決定 上記（Ｌ）項で得られたフマラーゼ遺伝子を含む長さが
約８ｋｂのＤＮＡ（ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ）断片、お
よび、約６．５ｋｂのＤＮＡ（ＳａｃＩ−ＳａｃＩ）断
片について、その塩基配列をｐＵＣ１１８（宝酒造
（株）社製）を用いるジデオキシヌクレオチド酵素法
（ｄｉｄｅｏｘｙｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ
法）［Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ． ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，Ｖｏｌ．
７４，ｐ．５４６３，（１９７７）］により決定した。

【００６４】塩基配列決定の結果、約８ｋｂのＤＮＡ
（ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ）断片、および、約６．５ｋ
ｂのＤＮＡ（ＳａｃＩ−ＳａｃＩ）断片は、図１に示す
ような重なりをもった断片であることがわかった。さら
に、その塩基配列中のオープンリーデイングフレームの
存在から、フマラーゼ遺伝子は、後記配列表の配列番号
１に示す塩基配列を有し、４６９個のアミノ酸をコード
する１４０７塩基対より構成されることが判明した。こ
の遺伝子がコードするアミノ酸配列を、配列番号２に示
す。尚、この塩基配列の中には、実施例２の（Ｆ）項で
決定した塩基配列に相当する配列が含まれていることが
確認された。

【００６５】〔実施例４〕 ブレビバクテリウム・フラ
バムＭＪ−２３３由来のフマラーゼ遺伝子（fumC遺伝
子）の発現 （Ｎ）ＭＪ−２３３由来フマラーゼ遺伝子発現ベクター
の構築 実施例３で確認された１４０７塩基対より構成される、
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来フマラ
ーゼ遺伝子のオープンリーディングフレームについて、
エシェリヒア・コリ菌体内での発現を確認するため、該
ＤＮＡ断片を下記のようにプラスミドｐＫＫ２２３−３
（ファルマシア社製）へサブクローニングした。

【００６６】まず、上記オープンリーディングフレーム
の両端に制限酵素ＳｍａＩの切断部位を連結したＤＮＡ
断片を、下記に示すプライマーを用いてＰＣＲにより、
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株の染色体
ＤＮＡを鋳型として増幅した。該ＰＣＲ断片とクローニ
ングベクターｐＫＫ２２３−３（ファルマシア社製）
を、各々制限酵素ＳｍａＩで切断した後、脱リン酸化処
理したものを混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．
６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、
１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂およびＴ４ＤＮＡリガーゼ １ｕ
ｎｉｔの各成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度であ
る）、１６℃で１０時間反応させ、上記ＳｍａＩ断片と
ベクターを連結させた。

【００６７】（配列番号７）ＴＣＣＣＣＣＧＧＧＡＴＧ
ＡＣＣＡＣＣＡＣＴ （配列番号８）ＴＣＣＣＣＣＧＧＧＣＴＡＧＧＡＧＧＣ
ＧＡＧ

【００６８】得られた連結反応液を用い、塩化カルシウ
ム法［Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５３， ｐ．１５９（１９７
０）］により エシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造
（株）社製）を形質転換し、アンピシリン ５０μｇ／
ｍｌを含む培地［トリプトン１０ｇ，イーストエキスト
ラクト ５ｇ，ＮａＣｌ ５ｇおよび寒天１６ｇを蒸留
水１Ｌに溶解］に塗抹した。

【００６９】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素ＳｍａＩにより切断し、ハイブリダイゼー
ション法を用いて挿入断片を調べたところ、プラスミド
ｐＫＫ２２３−３の長さ４．６ｋｂのＤＮＡ断片に加
え、長さ約１．４ｋｂのＤＮＡ断片が確認された。

【００７０】このプラスミドについて、１．４ｋｂの挿
入断片の方向性の確認を行った。プラスミドｐＫＫ２２
３−３上に存在するｔａｃプロモーターに対して、順方
向に１．４ｋｂの挿入断片が挿入された場合、計６ｋｂ
の長さのプラスミドは、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの処理
によって、１３０ｂｐと５．９ｋｂの断片が生じる。逆
方向に挿入された場合は、１．３ｋｂと４．７ｋｂの断
片が生じる。このようにして、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ
処理により、プラスミドｐＫＫ２２３−３上に存在する
ｔａｃプロモーターに対して、順方向に１．４ｋｂの挿
入断片が挿入されたプラスミドを選択し、ｐｔａｃＦＵ
ＭＣと命名した。

【００７１】プラスミドｐｔａｃＦＵＭＣを塩化カルシ
ウム法［Journal of Molecular Biology，Vol.53, p.15
9 (1970)］により エシェリヒア・コリ フマラーゼ欠
損株ＣＧＳＣ＃７３０９（fumA1）［Guest & Roberts 1
983 J.Bacteriol.153:588］を形質転換し、アンピシリ
ン ５０μｇ／ｍｌを含む培地［トリプトン１０ｇ，イ
ーストエキストラクト ５ｇ，ＮａＣｌ ５ｇおよび寒天
１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。これより得ら
れた形質転換株をＥＣｆｕｍＡ１ｔａｃＦＵＭＣと命名
した。

【００７２】（Ｏ）ＭＪ−２３３由来フマラーゼ遺伝子
によるエシェリヒア・コリ フマラーゼ欠損株（fumA
1）の相補試験 上記（Ｎ）に記載したエシェリヒア・コリ フマラーゼ
欠損株ＣＧＳＣ＃７３０９（fumA1）は、フマラーゼ欠
損によりフマル酸を唯一の炭素源とする最少培地（フマ
ル酸最少培地）に生育不可能である。そこでＭＪ−２３
３株由来フマラーゼ遺伝子の機能の確認として、（Ｎ）
で作製したＥＣｆｕｍＡ１ｔａｃＦＵＭＣ株を用いて、
相補性試験を行った。

【００７３】対照として、外来遺伝子を含まないプラス
ミドｐＫＫ２２３−３によるフマラーゼ欠損株ＣＧＳＣ
＃７３０９（fumA1）の形質転換体、ＥＣｆｕｍＡ１ｐ
ＫＫ２２３を用いた。

【００７４】これらＥＣｆｕｍＡ１ｔａｃＦＵＭＣ株、
および、ＥＣｆｕｍＡ１ｐＫＫ２２３をアンピシリン
５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地［トリプトン１０ｇ，イ
ーストエキストラクト ５ｇ，ＮａＣｌ ５ｇ）に植菌
し、３０℃で１５時間好気的に振とう培養した。得られ
た培養物を遠心分離（３，０００×ｇ、４℃、２０分
間）して菌体を回収後、最少培地［組成：ＫＨ₂ＰＯ₄
２ｇ、Ｋ₂ＨＰＯ₄ ７ｇ、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ １ｇ、Ｍ
ｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．１ｇ］で菌体を洗浄し、該懸濁
液をフマル酸最少寒天培地［組成：ＫＨ₂ＰＯ₄ ２ｇ、
Ｋ₂ＨＰＯ₄ ７ｇ、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ １ｇ、ＭｇＳＯ₄
・７Ｈ₂Ｏ ０．１ｇ、Ａｇａｒ１５ｇ］＋４０ｍＭフ
マル酸ナトリウム（ｐＨ７．３）に塗布し、３０℃で培
養を行った。その結果、ＥＣｆｕｍＡ１ｐＫＫ２２３−
３株は生育不可であったのに対し、ＥＣｆｕｍＡ１ｔａ
ｃＦＵＭＣ株はフマル酸最少寒天培地上で生育した。

【００７５】（Ｐ）フマラーゼ酵素の製造および活性の
確認 上記（Ｎ）で作製したＥＣｆｕｍＡ１ｔａｃＦＵＭＣ株
をアンピシリン ５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地［トリ
プトン１０ｇ，イーストエキストラクト ５ｇ，ＮａＣ
ｌ ５ｇ）に植菌し、３０℃で１５時間好気的に振とう
培養した。得られた培養物を遠心分離（３，０００×
ｇ、４℃、２０分間）して菌体を回収後、ナトリウム−
リン酸緩衝液［組成：50mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH
7.3)］で洗浄した。

【００７６】次いで、洗浄菌体０．５ｇ（湿重量）を上
記ナトリウム−リン酸緩衝液２ｍｌに懸濁し、氷冷下で
超音波破砕器（ブランソン社製）にかけ菌体破砕物を得
た。該破砕物を遠心分離（１０，０００×ｇ，４℃，３
０分間）し、上清を粗酵素液として得た。対照として、
ＥＣｆｕｍＡ１ｐＫＫ２２３株の粗酵素液を同様に調製
し、以下の活性測定に供した。

【００７７】フマラーゼ酵素活性の確認は、両粗酵素液
について、リンゴ酸を基質としたフマル酸の生成を２５
０ｎｍの吸光度変化として測定した［L.Kanarek and R.
Ｌ.Hill, J. Biol. Chem.239, 4202 (1964)］。反応
は、５０ｍＭ ナトリウム−リン酸緩衝液(pH7.3)、５０
ｍＭ リンゴ酸存在下、３０℃にて行った。その結果、
ＥＣｆｕｍＡ１ｐＫＫ２２３から調製された粗酵素液に
ついては、２５０ｎｍにおいて吸光度の変化が検出され
なかったのに対し、ＥＣｆｕｍＡ１ｔａｃＦＵＭＣ株か
ら調製された粗酵素液については、２５０ｎｍにおいて
０．１ ｄＡ／ｍｉｎ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ の吸
光度の増加が検出され、フマラーゼ酵素活性が確認され
た。

【００７８】

【発明の効果】本発明のＤＮＡおよびそれを含む組換え
ベクターは、微生物のフマラーゼ遺伝子破壊株の作製に
用いることができる。フマラーゼ遺伝子破壊株を用いる
と、培養後の熱処理を行わなくても、アスパラギン酸、
アラニン等の各種ファインケミカルズの製造の際のリン
ゴ酸の副生を低減することができる。また、本発明のＤ
ＮＡは、フマラーゼの製造に利用することができる。

【００７９】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１４１０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：ブレビバクテリウム フラバム 株名：ＭＪ２３３ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１−１４１０ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 ATG ACC ACC ACT TTT AGC TCC ACC CGC ACC GAA CAT GAC CTC ATC GGC 48 Met Thr Thr Thr Phe Ser Ser Thr Arg Thr Glu His Asp Leu Ile Gly 5 10 15 GAC GCC GAA GTC CCA GCT CAC GTG TAT TGG GGC GTT CAC ACC ATG CGC 96 Asp Ala Glu Val Pro Ala His Val Tyr Trp Gly Val His Thr Met Arg 20 25 30 GCT GCA GAG AAT TTC CAG ATC ACC GAT CAA AAG CTT GCC GAT AAT CCT 144 Ala Ala Glu Asn Phe Gln Ile Thr Asp Gln Lys Leu Ala Asp Asn Pro 35 40 45 TTC CTC ATC GCA GCT CTT GCG CGC GTC AAA CAG GCC GCC GCC CGC GCC 192 Phe Leu Ile Ala Ala Leu Ala Arg Val Lys Gln Ala Ala Ala Arg Ala 50 55 60 AAC CTA CAA CTT GGA CTG CTT GAT CAA ACT CGC GCT GAA GCA ATC GAT 240 Asn Leu Gln Leu Gly Leu Leu Asp Gln Thr Arg Ala Glu Ala Ile Asp 65 70 75 80 CAG GCC TGT GAC CGC GTT GCT GCC GGA GAA TTC AAT GAA CAA TTC ATT 288 Gln Ala Cys Asp Arg Val Ala Ala Gly Glu Phe Asn Glu Gln Phe Ile 85 90 95 CTC GAC CCG ATT CAG GGC GGC GCT GGC ACA AGC ACC AAC ATG AAT GCC 336 Leu Asp Pro Ile Gln Gly Gly Ala Gly Thr Ser Thr Asn Met Asn Ala 100 105 110 AAT GAG GTC ATT GCC AAC GTA GCG CTG GAG ATT CTT GGG CAT GAA AAG 384 Asn Glu Val Ile Ala Asn Val Ala Leu Glu Ile Leu Gly His Glu Lys 115 120 125 GGC GAC TAC CAG CAC CTT CAC CCC AAT GAT CAC GTG AAT CTT TCA CAA 432 Gly Asp Tyr Gln His Leu His Pro Asn Asp His Val Asn Leu Ser Gln 130 135 140 TCC ACC AAC GAT GCA TAC CCC ACG GCA GTA AAA ATC GCC ACC TGT TTT 480 Ser Thr Asn Asp Ala Tyr Pro Thr Ala Val Lys Ile Ala Thr Cys Phe 145 150 155 160 GCC GCC CGC CCG CTG CTC GAC GCC CTG ACT GAG CTT GAG CAA GCA TGC 528 Ala Ala Arg Pro Leu Leu Asp Ala Leu Thr Glu Leu Glu Gln Ala Cys 165 170 175 CGC AGC AAA GCC GTG GAA TTT CGG ACC GTA GTG AAA ATG GGA CGC ACC 576 Arg Ser Lys Ala Val Glu Phe Arg Thr Val Val Lys Met Gly Arg Thr 180 185 190 CAA CTG CAA GAC GCC GTC CCC ATG ACC GTC GGC CAA GAA TTC GGC GGA 624 Gln Leu Gln Asp Ala Val Pro Met Thr Val Gly Gln Glu Phe Gly Gly 195 200 205 TGG GCC GTC ACA CTG CGG GAA GAC CAC GAT CGT TTA GAG GAA TCC CTC 672 Trp Ala Val Thr Leu Arg Glu Asp His Asp Arg Leu Glu Glu Ser Leu 210 215 220 AAG CTC GTC ACC GAA ATC AAC CTC GGC GCA ACC GCG ATC GGC ACC GGA 720 Lys Leu Val Thr Glu Ile Asn Leu Gly Ala Thr Ala Ile Gly Thr Gly 225 230 235 240 CTT AAC GCA CCA GAA GGA TAC GCC GAA GCC GCA CGC AAG CAC CTG GCA 768 Leu Asn Ala Pro Glu Gly Tyr Ala Glu Ala Ala Arg Lys His Leu Ala 245 250 255 GAA CTC ACC GCC CTG CCG CTG TCC ACC AGC CCA CAC CTC GTC GAA GCA 816 Glu Leu Thr Ala Leu Pro Leu Ser Thr Ser Pro His Leu Val Glu Ala 260 265 270 ACC AGC GAC GTC GGA GCC TTC GTC CAC CTC TCC GGA GTA CTC AAA CGC 864 Thr Ser Asp Val Gly Ala Phe Val His Leu Ser Gly Val Leu Lys Arg 275 280 285 GTC GCC GTG AAA CTC TCC AAA ATC TGC AGC GAC CTG CGA CTA CTC TCC 912 Val Ala Val Lys Leu Ser Lys Ile Cys Ser Asp Leu Arg Leu Leu Ser 290 295 300 TCC GGG CCA CGC GCA GGC CTC AAC GAC ATC CAA CTA CCC GCT GTA CAA 960 Ser Gly Pro Arg Ala Gly Leu Asn Asp Ile Gln Leu Pro Ala Val Gln 305 310 315 320 TCC GGC TCC TCC ATC ATG CCC GGC AAA GTC AAC CCC GTC ATC CCT GAA 1008 Ser Gly Ser Ser Ile Met Pro Gly Lys Val Asn Pro Val Ile Pro Glu 325 330 335 GTT GTC AAC CAA ATC GCC TAC CAA GTA GTC GGC TAC GAC GCC ACC GTC 1056 Val Val Asn Gln Ile Ala Tyr Gln Val Val Gly Tyr Asp Ala Thr Val 340 345 350 ACC ATG GCC GCA GAA GGC GGA CAA CTC CAG CTC AAC GCC TTC GAA CCC 1104 Thr Met Ala Ala Glu Gly Gly Gln Leu Gln Leu Asn Ala Phe Glu Pro 355 360 365 GTC ATC ATG CAC TCT ATC GGA CTG TCG ATG AAA CAC CTC GCC AAC GGC 1152 Val Ile Met His Ser Ile Gly Leu Ser Met Lys His Leu Ala Asn Gly 370 375 380 TGT AGC ACG CTA GCC CGC AAG TGC ATT GCG GGC ATC ACG GTC GAC GAA 1200 Cys Ser Thr Leu Ala Arg Lys Cys Ile Ala Gly Ile Thr Val Asp Glu 385 390 395 400 GAT GCT TTA CGA CGC CAA GTT GAA CAA TCA ATC GGC CTC GTC ACC GCA 1248 Asp Ala Leu Arg Arg Gln Val Glu Gln Ser Ile Gly Leu Val Thr Ala 405 410 415 CTC AAC CCC GCC CTT GGC TAT ACC CAA TCC ACC ATG ATC GCC ATG GAA 1296 Leu Asn Pro Ala Leu Gly Tyr Thr Gln Ser Thr Met Ile Ala Met Glu 420 425 430 GCC CTC CAC ACC GGA CGC GGC GTT GCC GAA CTC GTC CTC GAA CGT GAG 1344 Ala Leu His Thr Gly Arg Gly Val Ala Glu Leu Val Leu Glu Arg Glu 435 440 445 CTC CTC ACC GAA GCC GAA CTC TCC GAA CTG CTT CGC CCC GAA CGA CTC 1392 Leu Leu Thr Glu Ala Glu Leu Ser Glu Leu Leu Arg Pro Glu Arg Leu 450 455 460 GCC AAC CTC GCC TCC TAG 1410 Ala Asn Leu Ala Ser 465 469

【００８０】配列番号：２ 配列の長さ：４６９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Thr Thr Thr Phe Ser Ser Thr Arg Thr Glu His Asp Leu Ile Gly 5 10 15 Asp Ala Glu Val Pro Ala His Val Tyr Trp Gly Val His Thr Met Arg 20 25 30 Ala Ala Glu Asn Phe Gln Ile Thr Asp Gln Lys Leu Ala Asp Asn Pro 35 40 45 Phe Leu Ile Ala Ala Leu Ala Arg Val Lys Gln Ala Ala Ala Arg Ala 50 55 60 Asn Leu Gln Leu Gly Leu Leu Asp Gln Thr Arg Ala Glu Ala Ile Asp 65 70 75 80 Gln Ala Cys Asp Arg Val Ala Ala Gly Glu Phe Asn Glu Gln Phe Ile 85 90 95 Leu Asp Pro Ile Gln Gly Gly Ala Gly Thr Ser Thr Asn Met Asn Ala 100 105 110 Asn Glu Val Ile Ala Asn Val Ala Leu Glu Ile Leu Gly His Glu Lys 115 120 125 Gly Asp Tyr Gln His Leu His Pro Asn Asp His Val Asn Leu Ser Gln 130 135 140 Ser Thr Asn Asp Ala Tyr Pro Thr Ala Val Lys Ile Ala Thr Cys Phe 145 150 155 160 Ala Ala Arg Pro Leu Leu Asp Ala Leu Thr Glu Leu Glu Gln Ala Cys 165 170 175 Arg Ser Lys Ala Val Glu Phe Arg Thr Val Val Lys Met Gly Arg Thr 180 185 190 Gln Leu Gln Asp Ala Val Pro Met Thr Val Gly Gln Glu Phe Gly Gly 195 200 205 Trp Ala Val Thr Leu Arg Glu Asp His Asp Arg Leu Glu Glu Ser Leu 210 215 220 Lys Leu Val Thr Glu Ile Asn Leu Gly Ala Thr Ala Ile Gly Thr Gly 225 230 235 240 Leu Asn Ala Pro Glu Gly Tyr Ala Glu Ala Ala Arg Lys His Leu Ala 245 250 255 Glu Leu Thr Ala Leu Pro Leu Ser Thr Ser Pro His Leu Val Glu Ala 260 265 270 Thr Ser Asp Val Gly Ala Phe Val His Leu Ser Gly Val Leu Lys Arg 275 280 285 Val Ala Val Lys Leu Ser Lys Ile Cys Ser Asp Leu Arg Leu Leu Ser 290 295 300 Ser Gly Pro Arg Ala Gly Leu Asn Asp Ile Gln Leu Pro Ala Val Gln 305 310 315 320 Ser Gly Ser Ser Ile Met Pro Gly Lys Val Asn Pro Val Ile Pro Glu 325 330 335 Val Val Asn Gln Ile Ala Tyr Gln Val Val Gly Tyr Asp Ala Thr Val 340 345 350 Thr Met Ala Ala Glu Gly Gly Gln Leu Gln Leu Asn Ala Phe Glu Pro 355 360 365 Val Ile Met His Ser Ile Gly Leu Ser Met Lys His Leu Ala Asn Gly 370 375 380 Cys Ser Thr Leu Ala Arg Lys Cys Ile Ala Gly Ile Thr Val Asp Glu 385 390 395 400 Asp Ala Leu Arg Arg Gln Val Glu Gln Ser Ile Gly Leu Val Thr Ala 405 410 415 Leu Asn Pro Ala Leu Gly Tyr Thr Gln Ser Thr Met Ile Ala Met Glu 420 425 430 Ala Leu His Thr Gly Arg Gly Val Ala Glu Leu Val Leu Glu Arg Glu 435 440 445 Leu Leu Thr Glu Ala Glu Leu Ser Glu Leu Leu Arg Pro Glu Arg Leu 450 455 460 Ala Asn Leu Ala Ser 465 469

【００８１】配列番号：３ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Pro Leu Thr Leu Gly Gln Glu 1 5

【００８２】配列番号：４ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Pro Gly Lys Val Asn Pro Thr Gln 1 5

【００８３】配列番号：５ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴： 特徴を表す記号： 存在位置： 特徴を決定した方法： その他の情報：RはA又はG、YはC又はT、NはA、G、C又は
Tを示す。 CCNYTNACNY TNGGNCARGA 20

【００８４】配列番号：６ 配列の長さ：26 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴： 特徴を表す記号： 存在位置： 特徴を決定した方法： その他の情報：RはA又はG、YはC又はT、NはA、G、C又は
Tを示す。 配列 TGNGTNGGRT TNACYTTNCC NGGCAT 26

【００８５】配列番号：７ 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TCCCCCGGGA TGACCACCACT 21

【００８６】配列番号：８ 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TCCCCCGGGC TAGGAGGCGAG 21

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩクローニング断片、
及びＳａｃＩ−ＳａｃＩクローニング断片と、オープン
リーデイングフレームとの関係を示す図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:13） (72)発明者 湯川 英明 茨城県稲敷郡阿見町中央八丁目３番１号三 菱化学株式会社筑波研究所内

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質
   をコードするＤＮＡ。 （Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク
   質。 （Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若し
   くは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたア
   ミノ酸配列からなり、かつ、フマラーゼ活性を有するタ
   ンパク質。
2. 【請求項２】 下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡであ
   る請求項１記載のＤＮＡ。 （ａ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡ。 （ｂ）配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡとスト
   リンジェントな条件下でハイブリダイズし、フマラーゼ
   活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
3. 【請求項３】 請求項１記載のＤＮＡがベクターに連結
   されてなる組換えベクターＤＮＡ。
4. 【請求項４】 配列番号１記載のＤＮＡもしくはこのＤ
   ＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする
   ＤＮＡ、又はその一部がベクターに連結されてなる組換
   えベクターＤＮＡ。
5. 【請求項５】 請求項１若しくは請求項２記載のＤＮ
   Ａ、又は請求項３若しくは請求項４記載の組換えベクタ
   ーＤＮＡと、微生物細胞の染色体ＤＮＡ上のフマラーゼ
   遺伝子との相同組換えによりフマラーゼ遺伝子が破壊さ
   れた、微生物のフマラーゼ遺伝子破壊株。
6. 【請求項６】 フマラーゼ遺伝子破壊株の親株が、コリ
   ネ型細菌であることを特徴とする請求項５記載のフマラ
   ーゼ遺伝子破壊株。
7. 【請求項７】 コリネ型細菌が、ブレビバクテリウム・
   フラバム ＭＪ−２３３株であることを特徴とする請求
   項５記載のフマラーゼ遺伝子破壊株。
8. 【請求項８】 請求項５〜７のいずれか一項に記載のフ
   マラーゼ遺伝子破壊株を培地で培養し、その培養物から
   アスパラギン酸またはアラニンを採取することを特徴と
   する、アスパラギン酸またはアラニンの製造方法。