JPH10295376A - ヒトｇｐｒ１４レセプターのクローニング - Google Patents

ヒトｇｐｒ１４レセプターのクローニング

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JPH10295376A
JPH10295376A JP10051211A JP5121198A JPH10295376A JP H10295376 A JPH10295376 A JP H10295376A JP 10051211 A JP10051211 A JP 10051211A JP 5121198 A JP5121198 A JP 5121198A JP H10295376 A JPH10295376 A JP H10295376A
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polypeptide
human
human gpr14
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JP10051211A
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Usman Shabon
ウスマン・シャボン
Derk Bergsma
ダーク・バーグスマ
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SmithKline Beecham Corp
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒトＧＰＲ１４ポリペプチドおよびポリヌク
レオチドおよび組換え技術によるかかるポリペプチドの
製造方法を提供すること。 【解決手段】 配列番号：２のポリペプチドをコードし
ているヌクレオチド配列またはその対応するフラグメン
トに対して少なくとも８０％同一性を有するヌクレオチ
ド配列、あるいは該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレ
オチド配列を含むポリヌクレオチドを単離する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新たに同定された
ポリヌクレオチド、それらによってコードされるポリペ
プチドおよびかかるポリヌクレオチドならびにポリペプ
チドの使用、およびそれらの製造に関する。詳細には、
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、Ｇ−
蛋白結合レセプター（以後ヒトＧＰＲ１４と称する）に
関する。本発明はまた、かかるポリヌクレオチドおよび
ポリペプチドの活性の阻害または活性化にも関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】医学
的に重要な生物学的プロセスは、Ｇ−蛋白および／また
は第２メッセンジャー、例えばｃＡＭＰを包含するシグ
ナル変換経路に関与している蛋白によって媒介されるこ
とがよく知られている（Lefkowitz,Nature,1991,351:35
3-354）。本明細書においては、これらの蛋白を、Ｇ−
蛋白またはＰＰＧ蛋白に関する経路に関与する蛋白とい
う。これらの蛋白のいくつかの例は、ＧＰＣレセプタ
ー、例えばアドレナリン作動性薬剤およびドーパミンに
対するものを包含する（Kobilka,B.K.,et al.,Proc.Nat
l Acad.Sci.,USA,1987,84:46-50;Kobilka,B.K.,et al.,
Science,1987,238:650-656;Bunzow,J.R.,Nature,1988,3
36:783-787）。Ｇ−蛋白自体は、例えば、ホスホリパー
ゼＣ、アデニルシクラーゼ、およびホスホジエステラー
ゼのようなエフェクター蛋白、および例えばプロテイン
キナーゼＡならびにプロテオインキナーゼＣのようなア
クチェーター蛋白である（Simon,M.I.,etal.,Science,1
991,1991,252:802-808）。
【０００３】例えば、シグナル変換の１の形態におい
て、ホルモン結合の効果は細胞内の酵素であるアデニレ
ートシクラーゼの活性化である。ホルモンによる酵素の
活性化はヌクレオチドＧＴＰの存在に依存する。またＧ
ＴＰはホルモン結合にも影響する。Ｇ−蛋白はホルモン
レセプターをアデニレートシクラーゼに結合させる。Ｇ
−蛋白は、ホルモンレセプターにより活性化された場
合、ＧＴＰを結合ＧＤＰと交換することが示された。次
いで、ＧＴＰ担持形態は活性化されたアデニレートシク
ラーゼに結合する。Ｇ−蛋白自体により触媒されるＧＴ
ＰのＧＤＰへの加水分解により、Ｇ−蛋白はその基底不
活性形態に戻る。かくして、Ｇ−蛋白は、レセプターか
らエフェクターへのシグナルを中継する中間体、ならび
にシグナル発生期間を調節する時計としての２つの役割
を果たす。
【０００４】Ｇ−蛋白結合レセプターの膜蛋白遺伝子ス
ーパーファミリーは、７個の推定上の膜貫通ドメインを
有することにより特徴づけられている。ドメインは、細
胞外または細胞質ループにより結合されている膜貫通α
−ヘリックスを示すものと考えられている。Ｇ−蛋白結
合レセプターは、例えば、ホルモン、ウイルス、成長因
子および神経レセプターのごとき広範な生物学的活性レ
セプターを包含する。
【０００５】Ｇ−蛋白結合レセプターは、少なくとも８
個の異なる親水性ループに結合している、これらの７個
の保存された疎水的部分（約２０個ないし３０個のアミ
ノ酸）を含むものとして特徴づけられている。結合レセ
プターのＧ−蛋白ファミリーは、精神病および神経学的
疾病の治療に用いる神経遮断薬に結合するドーパミンレ
セプターを包含する。このファミリーのメンバーの他の
例は、カルシトニン、アドレナリン作動薬、エンドセリ
ン、ｃＡＭＰ、アデノシン、ムスカリン作動性薬、アセ
チルコリン、セロトニン、ヒスタミン、トロンビン、キ
ニン、卵胞刺激ホルモン、オプシン、内皮分化遺伝子−
１、ロドプシン、オドラント、およびサイトメガロウイ
ルスレセプターを包含するが、これらに限定するもので
はない。
【０００６】大部分のＧ−蛋白結合レセプター（または
７ＴＭレセプターとして知られている）は、最初の２個
の細胞外ループのそれぞれに１個の保存されたシステイ
ン残基を有し、それらはジスルフィド結合を形成し、機
能的蛋白構造を安定化すると考えられている。７個の膜
貫通領域はＴＭ１、ＴＭ２、ＴＭ３，ＴＭ４、ＴＭ５、
ＴＭ６、およびＴＭ７と呼ばれる。ＴＭ３はシグナル変
換に関与している。
【０００７】システイン残基のホスホリレーションおよ
びリピデーション（パルミチレーションまたはファルネ
シレーション）は、いくつかのＧ−蛋白結合レセプター
のシグナル変換に影響しうる。大部分のＧ−蛋白結合レ
セプターは、３番目の細胞質ループおよび／またはカル
ボキシ末端において潜在的なホスホリレーション部位を
含んでいる。β−アドレナリンレセプターのごとき数種
のＧ−蛋白結合レセプターについては、プロテインキナ
ーゼＡおよび／または特異的レセプターキナーゼによる
ホスホリレーションはレセプターの感受性をなくす。
【０００８】いくつかのレセプターについて、Ｇ−蛋白
結合レセプターのリガンド結合部位は、数個のＧ−蛋白
結合レセプターの膜貫通ドメインにより形成される親水
性ソケットを含むと考えられており、該ソケットはＧ−
蛋白結合レセプターの疎水性残基により囲まれている。
各Ｇ−蛋白結合レセプター膜貫通ヘリックスの親水性部
位は、内側に向いていると考えられ、極性リガンド結合
部位を形成すると考えられる。ＴＭ３は、ＴＭ３アスパ
ラギン酸残基のごときリガンド結合部位を有するものと
して、数個のＧ−蛋白結合レセプターに関連している。
ＴＭ５のセリン、ＴＭ６のアスパラギンおよびＴＭ６ま
たはＴＭ７のフェニルアラニンまたはチロシンもリガン
ド結合に関連している。
【０００９】Ｇ−蛋白結合レセプターは、細胞内におい
て、ヘテロ三量体Ｇ−蛋白により種々の細胞内酵素、イ
オンチャンネルおよびトランスポーターに結合しうる
（例えば、Johnson et al.,Endoc.Rev.,1989,10:317-33
1参照）。異なるＧ−蛋白のα−サブユニットは優先的
に特定のエフェクターを刺激して細胞中の種々の生物学
的機能を転調させる。Ｇ−蛋白結合レセプターの細胞質
残基のホスホリレーションは、いくつかのＧ−蛋白結合
レセプターへのＧ−蛋白結合の調節に関する重要な機構
であると確認されている。Ｇ−蛋白結合レセプターは哺
乳動物宿主中の多くの部位で見いだされる。
【００１０】過去１５年にわたり、７個の膜貫通（７
ＴＭ）レセプターを標的とする約３５０種の治療薬が市
場に導入された。このことは、これらのレセプターが、
治療標的としての歴史を確立され、証明されたことを示
す。明らかに、限定するものではないが、細菌、真菌、
原生動物およびウイルス感染、特にＨＩＶ−１またはＨ
ＩＶ−２によって引き起こされる感染のような感染、疼
痛、癌、食欲不振、病的飢餓、喘息、パーキンソン病、
急性心不全、低血圧、高血圧、尿閉、骨粗鬆症、狭心
症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性前立腺肥大症、
および不安、精神分裂症、躁鬱病、せん妄、痴呆、はげ
しい精神遅滞、ならびにハンチントン病またはジル・ド
・ラ・トゥレット症候群のような運動異常症を包含する
精神ならびに神経障害を包含する機能不全または疾病の
予防、改善または矯正において役割を果たしうるさらな
るレセプターの同定および特徴付けについての必要性が
ある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】一の態様において、本発
明はヒトＧＰＲ１４ポリペプチドおよび組換え物質およ
びそれらの製造方法に関する。本発明の別の態様は、か
かるヒトＧＰＲ１４ポリペプチドおよびポリヌクレオチ
ドを使用する方法に関する。かかる使用は、とりわけ、
細菌、真菌、原生動物およびウイルス感染、特にＨＩＶ
−１またはＨＩＶ−２によって引き起こされる感染のよ
うな感染、疼痛、癌、食欲不振、病的飢餓、喘息、パー
キンソン病、急性心不全、低血圧、高血圧、尿閉、骨粗
鬆症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性前立
腺肥大症、および不安、精神分裂症、躁鬱病、せん妄、
痴呆、はげしい精神遅滞、ならびにハンチントン病また
はジル・ド・ラ・トゥレット症候群のような運動異常症
を包含する精神ならびに神経障害の治療を包含する。ま
た別の態様において、本発明は本発明により提供される
物質を用いるアゴニストおよびアンタゴニストの同定方
法に関し、同定された化合物とヒトＧＰＲ１４のアンバ
ランスに関連する状態を治療する。また、本発明の別の
態様では、不適切なヒトＧＰＲ１４活性またはレベルに
関連する疾病を検出するための診断的アッセイに関す
る。
【００１２】
【発明の実施の形態】
定義 下記の定義は本明細書で頻繁に使用される特定の用語の
理解を容易にするためのものである。「ヒトＧＰＲ１
４」は、一般に、配列番号：２に示すアミノ酸配列を有
するポリペプチド、またはその対立遺伝子変種を示す。
【００１３】「レセプター活性」または「レセプターの
生物学的活性」は、類似の活性または改善された活性ま
たは望ましくない副効果を減じたこれらの活性を包含す
る代謝的もしくは生理学的機能を示す。また、該ヒトＧ
ＰＲ１４の抗原および免疫原活性も包含する。
【００１４】「ヒトＧＰＲ１４ポリペプチド」は、特に
レセプターの少なくとも１個の生物学的活性を示す、ヒ
トＧＰＲ１４配列に十分類似したアミノ酸配列を有する
ポリペプチドを示す。「ヒトＧＰＲ１４遺伝子」は、配
列番号：１に示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレ
オチドまたはその対立遺伝子変種および／またはそれら
の補体を示す。
【００１５】「ヒトＧＰＲ１４ポリヌクレオチド」は、
ヒトＧＰＲ１４ポリペプチドまたはそのフラグメントを
コードするヌクレオチド配列、あるいは配列番号：２の
ポリペプチドまたはその対応するフラグメントをコード
しているヌクレオチド配列に対して少なくとも７５．９
％同一性を有するヌクレオチド配列、あるいは増幅する
ためにまたはプローブもしくはマーカーとして使用する
ために使用できる条件下でハイブリダイズするために配
列番号：１に含まれるヌクレオチド配列に対して十分な
同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチ
ドを示す。
【００１６】本明細書中で使用される「抗体」は、ポリ
クローナルおよびモノクローナル抗体、キメラ、１本
鎖、およびヒト化抗体、ならびにＦａｂフラグメント、
Ｆａｂまたは他の免疫グロブリン発現ライブラリーの生
成物を包含する。
【００１７】「単離」とは、「人の手」によって天然状
態から変化させられていることを意味する。天然におい
て組成物または物質が「単離」された場合には、本来の
環境から変化させられ、あるいは本来の環境から除去さ
れること、あるいはその両方を意味する。例えば、生き
た動物中に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチドは「単離」されていないが、天然状態における
共存物質から分離されている同じポリヌクレオチドまた
はポリペプチドは、本明細書の用語によれば「単離」さ
れたものである。
【００１８】一般的には、「ポリヌクレオチド」とはポ
リリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチ
ドをいい、未修飾ＲＮＡまたはＤＮＡあるいは修飾ＲＮ
ＡまたはＤＮＡであってよい。「ポリヌクレオチド」
は、制限なしに、１本鎖および２本鎖ＤＮＡ、１本鎖お
よび２本鎖領域の混ざったＤＮＡ、１本鎖および２本鎖
ＲＮＡ、および１本鎖および２本鎖領域の混ざったＲＮ
Ａ、１本鎖もしくはより典型的には２本鎖、または１本
鎖および２本鎖領域の混ざったものであってもよいＤＮ
ＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子を包含する。さ
らに、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡまたはＤＮＡあ
るいはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含んでなる３本鎖領
域をいう。また、本明細書の用語ポリヌクレオチドは、
１個またはそれ以上の修飾塩基を含むＤＮＡまたはＲＮ
Ａ、および安定性または他の理由のために修飾された骨
格を有するＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。「修飾」
は、例えばトリチル化された塩基およびイノシンのごと
き異常な塩基を包含する。よって、様々な修飾がＤＮＡ
およびＲＮＡについて行われており、「ポリヌクレオチ
ド」は、典型的に天然に見出されるような化学的、酵素
的、あるいは代謝的に修飾された形態のポリヌクレオチ
ド、ならびに、ウイルスおよび細胞の特徴を示すＤＮＡ
およびＲＮＡの化学的形態を包含する。また、「ポリヌ
クレオチド」は、しばしばオリゴヌクレオチドと称され
る比較的短いポリヌクレオチドも包含する。
【００１９】「ポリペプチド」は、ペプチド結合または
修飾されたペプチド結合、すなわちペプチド等量物によ
り互いに結合した２個またはそれ以上のアミノ酸を含ん
でなるいずれのペプチドまたは蛋白をいう。「ポリペプ
チド」は、短鎖（一般に、ペプチド、オリゴペプチドま
たはオリゴマーという）および長鎖（一般的に、蛋白と
いう）の両方をいう。ポリペプチドは、２０個の遺伝子
コードされたアミノ酸以外のアミノ酸を含みうる。「ポ
リペプチド」は、翻訳後修飾プロセッシングのごとき天
然プロセスによってか、または当該分野でよく知られた
化学的修飾法によって修飾されたアミノ酸配列を包含す
る。かかる修飾は、基本的な教科書およびさらに詳細な
研究論文、ならびに膨大な研究文献によく記載されてい
る。ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノ末端およ
びカルボキシル末端を包含するポリペプチドのいずれの
場所においても修飾が起こり得る。同じタイプの修飾が
一定のポリペプチドにおいて同じ部位またはいくぶん異
なった部位において存在しうることが理解されよう。ま
た、一定のポリペプチドは多くのタイプの修飾を含みう
る。ユビキチネーションの結果としてポリペプチドが分
枝され得、それらは、分枝を有するまたは有さないで環
化しうる。環化、分枝したおよび分枝した環化ポリペプ
チドは、翻訳後天然プロセスに起因し、または合成法に
よって作成されてもよい。修飾には、アセチル化、アシ
ル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有
結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレ
オチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有
結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環
化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有結合に
よる架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の
形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシ
レーション、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨ
ウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、蛋白分解的
プロセッシング、ホスホリレーション、プレニレル化、
ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニン化のごと
きトランスファー−ＲＮＡにより媒介される蛋白へのア
ミノ酸付加、およびユビキチネーションがある。例え
ば、PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES,2n
d Ed., T.E.Creighton,W.H.Freeman and Company,New Y
ork(1993)および、POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFI
CATION OF PROTEINS, B.C.Johnson,Ed., Academic Pres
s,New York(1983)中、Wold,F., Posttranslational Pro
tein Modifications: Prespectives and Prospects,pg
s.1-12；Seifter et al.,Analysis for protein modifi
cations and nonprotein cofactors,Meth.Enzymol.182:
626-646(1990)およびRattan et al., Protein Synthesi
s:Posttranslational Modifications and Aging.Ann.N.
Y.Acad.Sci.663:48-62(1992)を参照のこと。
【００２０】本明細書の用語としての「変種」は、本質
的特性を保持するが、各々もとのポリヌクレオチドまた
はポリペプチドとは異なるポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチドである。ポリヌクレオチドの典型的変種は、別
の、もとのポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列にお
いて異なる。変種のヌクレオチド配列における変化は、
もとのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプ
チドのアミノ酸配列を変化させてもよく、または変化さ
せなくてもよい。下記のごとく、ヌクレオチド変化は、
もとの配列によりコードされるポリペプチド中のアミノ
酸置換、付加、欠失、融合および切断を引き起こし得
る。ポリペプチドの典型的変種は、別の、もとのポリペ
プチドとはアミノ酸配列において異なる。一般的には、
相違は、もとのポリペプチドと変種の配列が全体的に極
めて類似し、多くの領域において同一であるようなもの
に限られる。変種ともとのポリペプチドとは、１個また
はそれ以上の置換、付加、欠失のいずれかの組み合わせ
によりアミノ酸配列が異なっていてもよい。置換または
挿入アミノ酸残基は、遺伝コードによってコードされる
ものであってもよく、またはコードされないものであっ
てもよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変種
は、対立遺伝子変種のように天然に起こってもよく、ま
たは天然に起こることが知られていない変種であっても
よい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの非天然変
種は、突然変異技術または直接的合成によって作成され
てもよい。
【００２１】「同一性」は、ヌクレオチド配列またはア
ミノ酸配列の同一性の測定を意味する。一般に、配列
は、最も高いオーダーの合致が得られるように配列され
ている。「同一性」それ自体が、当該分野で認識される
意味を有し、公表されている技術を用いて計算すること
ができる。例えば、（Computational Molecular Biolog
y, Lesk, A.M.,ed.,Oxford University Press, New Yor
k,1988;Biocomputing Informatics and Genome Project
s, Smith, D.W.,ed,Academic Press,New York,1993;Com
puter Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.
M.and Griffin,H.G.,eds,Humana Press,New Jersey,199
4;Srquence Analysis in Molecular Biology,von Heinj
e,G.,Academic Press,1987；およびSequence Analysis
Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.eds.,M Stockton P
ress,New York,1991）参照のこと。２つのポリヌクレオ
チドまたはポリペプチド配列間の同一性を測定するため
の多くの方法が存在するが、用語「同一性」は当業者に
よく知られている（Carillo,H.,and Lipton,D.,SIAM J.
Applied Math.,48:1073(1988)）。２つの配列間の同一
性または類似性を決定するために一般に使用される方法
は、限定はしないが、Guide to huge Computers, Marti
n J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994
およびCarillo, H., and Lipton, D., SIAM J Applied
Math (1988)48:1073に開示されている。同一性および類
似性を決定する方法は、コンピュータープログラムにお
いて集成されている。２つの配列間の同一性および類似
性の決定に好ましいコンピュータープログラム法は、Ｇ
ＣＳプログラムパッケージ（Devereux,J.,et al.,Nucle
ic Acids Research 12(1):387(1984)）、BLASTP,BLASTA
N,FASTA（Atschul,S.F.et al.,J.Molec.Biol.215:403(1
990)）を包含するが、これらに限らない。
【００２２】本発明のポリペプチド 本発明のヒトＧＰＲ１４ポリペプチドは、配列番号：２
のポリペプチド（特に成熟ポリペプチド）ならびに配列
番号：２のポリペプチドまたは関連部分に対して少なく
とも８４．２５％の同一性を有し、より好ましくは配列
番号：２に対して少なくとも８５％の同一性、さらによ
り好ましくは少なくとも９０％の同一性、またさらによ
り好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するヒトＧ
ＰＲ１４ポリペプチドを包含する。ヒトＧＰＲ１４ポリ
ペプチドは、「成熟」蛋白の形態であってもよく、また
は融合蛋白のごとき大きな蛋白の一部であってもよい。
しばしば、分泌またはリーダー配列、プロ配列、複数の
ヒスチジン残基のように精製を補助する配列、または組
換え体生産の間の安定性のための付加的な配列を含む付
加アミノ酸配列を包含することは都合がよい。
【００２３】ヒトＧＰＲ１４ポリペプチドの生物学的に
活性なフラグメントも本発明に包含される。フラグメン
トは、前記のヒトＧＰＲ１４ポリペプチドのアミノ酸配
列の全てではないが一部が完全に同じアミノ酸配列を有
するポリペプチドである。ヒトＧＰＲ１４ポリペプチド
の場合、フラグメントは「フリー−スタンディング（fr
ee−standing）」であってもよく、あるいはより大きな
ペプチドに含まれていて、その一部または領域、最も好
ましくは単一の連続した領域を形成してもよい。本発明
のポリペプチドフラグメントの典型例は、例えば、ヒト
ＧＰＲ１４ポリペプチドのおよそのアミノ酸番号１〜２
０、２１〜４０、４１〜６０、６１〜８０、８１〜１０
０および１０１〜末端由来のフラグメントを包含する。
この文脈において、「およそ」とは、特に列挙した範囲
よりも、片方の端または両端において数個、５、４、
３、２、または１個のアミノ酸の分だけ大きいまたは小
さい範囲を包含する。
【００２４】好ましいフラグメントは、例えば、ヒトＧ
ＰＲ１４ポリペプチドのアミノ酸配列を有する末端切断
(truncation)ポリペプチドを包含するが、アミノ末端を
含む連続した一連の残基の欠失、またはカルボキシル末
端を含む連続した一連の残基の欠失、または１つはアミ
ノ末端を含み、もう１つはカルボキシル末端を含む２つ
の連続した一連の残基の欠失は除く。また好ましくは、
アルファ−ヘリックスおよびアルファ−ヘリックス形成
領域、ベータ−シートおよびベータ−シート形成領域、
ターンおよびターン形成領域、コイルおよびコイル形成
領域、親水性領域、疎水性領域、アルファ両親媒性領
域、ベータ両親媒性領域、フレキシブル領域、表面形成
領域、基質結合領域、および高抗原性インデックス領域
を含んでなるフラグメントのごとき構造的または機能的
特性によって特徴付けられたフラグメントである。生物
学的に活性なフラグメントは、レセプター活性を媒介す
るフラグメントであって、類似した活性または改善され
た活性を有するフラグメント、あるいは望ましくない活
性を減少させたフラグメントを包含する。また、動物、
特にヒトにおいて抗原性または免疫原性であるものも包
含される。
【００２５】よって、本発明のポリペプチドは、配列番
号：２のポリペプチドに対して少なくとも８４．２５％
同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、または
配列番号：２の対応するフラグメントに対して少なくと
も８４．２５％の同一性を有するそのフラグメントを包
含する。好ましくは、これらのポリペプチドの全ては、
該レセプターの生物学的活性を保持しており、抗原活性
を包含している。このグループにおいて、定義された配
列およびフラグメントの変種を包含する。好ましい変種
は、保存的アミノ酸置換によって元のものとは異なる変
種、すなわち、残基を同様の特性の別の残基で置換する
ものである。典型的なかかる置換は、Ａｌａ、Ｖａｌ、
ＬｅｕおよびＩｌｅ間、ＳｅｒおよびＴｈｒ間、酸性残
基ＡｓｐおよびＧｌｕ間、ＡｓｎおよびＧｌｎ間、塩基
性残基ＬｙｓおよびＡｒｇ間、または芳香族残基Ｐｈｅ
およびＴｙｒ間の置換である。特に好ましいものは、い
ずれかの組み合わせにおいて数個、５〜１０、１〜５、
または１〜２個のアミノ酸が置換、欠失、または付加さ
れた変種である。
【００２６】本発明のヒトＧＰＲ１４ポリペプチドは、
いずれかの適当な方法で調製できる。かかるポリペプチ
ドは、単離天然ポリペプチド、組換え技術で製造したポ
リペプチド、合成的に製造したポリペプチド、またはこ
れらの方法を組み合わせて製造したポリペプチドを包含
する。かかるポリペプチドの調製方法は、当該分野にお
いてよく理解されている。
【００２７】本発明のポリヌクレオチド 本発明の別の態様は、ヒトＧＰＲ１４ポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドおよびそれらに密接に関連し
たポリヌクレオチドに関する。ヒトＧＰＲ１４をコード
しているｃＤＮＡの配列決定結果によって明らかなよう
に、本発明のヒトＧＰＲ１４は、構造的にＧ−蛋白結合
レセプターの他の蛋白に関連する。ｃＤＮＡ配列は、推
定分子量３９０ｋＤａの蛋白をコードしているオープン
リーディングフレームを含有する。図１〜３（配列番
号：２）のヒトＧＰＲ１４は、３８７アミノ酸残基にお
いて、ドブネズミ（Rattus norvegicus）ＧＰＲ１４オ
ーファンレセプターと約８４．２５％の同一性（Fasta
を使用）を有する（A. Marches, et al., Genomics 29
(2):335-344, 1995）。さらに、ヒトＧＰＲ１４（配列
番号：２）は、３３１アミノ酸残基にわたるヒト・ソマ
トスタチン−３レセプターに対して３１．７％同一であ
る（Y. Yamada et al., Mol. Endocrinol. 6(12):2136-
2142, 1992）。図１〜３（配列番号：１）のヒトＧＰＲ
１４遺伝子は、１５３９ｂｐヌクレオチド残基におい
て、ドブネズミＧＰＲ１４オーファンレセプターと約７
５．９％の同一性（blastを使用）を有する（A. Marche
s, et al., Genomics 29(2):335-344, 1995）。さら
に、ヒトＧＰＲ１４（配列番号：１）は、ドブネズミＧ
−蛋白結合レセプターＳＥＮＲに対して、７８３ｂｐに
わたって７９％同一である（M. Tal et al., Biochem.
Biophys. Res.Commun. 209(2):752-759 1995）。
【００２８】ヒトＧＰＲ１４をコードしている本発明の
一のポリヌクレオチドを、標準的クローニングおよびス
クリーニングを用いて、発現配列タグ（ＥＳＴ）分析を
用いて得られたヒト胎盤の細胞中ｍＲＮＡ由来ｃＤＮＡ
ライブラリーから得てもよい（Adams, M.D., et al., S
cience (1991) 252:1651-1656; Adams, M.D., et al.,
Nature, (1992) 355:632-634; Adams, M.D., et al., N
ature (1995)377 Supp:3-174）。また、本発明のポリヌ
クレオチドをゲノムＤＮＡライブラリーのごとき天然資
源から得ることもでき、またはよく知られた市販の技術
を用いて合成することができる。
【００２９】よって、ヒトＧＰＲ１４ポリペプチドをコ
ードしているヌクレオチド配列は、全長にわたり図１〜
３（配列番号：１）におけるコーディング配列に対して
同一であってもよく、または配列番号：２のポリペプチ
ドをコードしている該ヌクレオチド配列の縮重形態であ
ってもよく、または配列番号：２のポリペプチドをコー
ドするヌクレオチド配列に対して大いに同一であっても
よい。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、ヒト
ＧＰＲ１４ポリペプチドをコードしているヌクレオチド
配列と大いに同一、少なくとも７５．９％同一、または
図１〜３（配列番号：１）に示すコード化ヌクレオチド
配列と少なくとも７５．９％同一、または配列番号：２
のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列に対
して少なくとも７５．９％同一であるヌクレオチド配列
を含む。
【００３０】本発明のポリヌクレオチドをヒトＧＰＲ１
４ポリペプチドの組換え体生産に使用する場合、該ポリ
ヌクレオチドは、ひとりでに成熟ポリペプチドまたはそ
のフラグメントのコーディング配列、すなわち、他のコ
ーディング配列を有するリーディングフレームにおける
成熟ポリペプチドまたはフラグメントのコーディング配
列、例えば、リーダーまたは分泌配列、プレ−、または
プロ−またはプレプロ−蛋白配列、あるいは他の融合ペ
プチド部分をコードしている配列を包含する。例えば、
融合されたポリペプチドの精製を容易にするマーカー配
列をコードしうる。本発明のこの態様の特定の好ましい
具体例において、マーカー配列は、ｐＱＥベクター（Qi
agen,Inc）中に提供されるようなヘキサ−ヒスチジンペ
プチドであり、Gentz et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA
86,821-824(1989)に記載されており、またはＨＡタグ
である。また、ポリヌクレオチドは、転写、非翻訳配
列、スプライシングおよびポリアデニレーションシグナ
ル、リボソーム結合部位およびｍＲＮＡを安定化する配
列のごとき非コーディング５’および３’配列を含んで
もよい。
【００３１】本発明のなかでも特に好ましい具体例は、
図１〜３（配列番号：２）に示すアミノ酸配列を有する
ヒトＧＰＲ１４ポリペプチドをコードしているポリヌク
レオチドおよびそれらの変種である。さらに好ましい具
体例は、いずれかの組み合わせで数個、５〜１０個、１
〜５個、１〜３個、１〜２個または１個のアミノ酸残基
が置換、欠失または付加されている図１〜３（配列番
号：２）のヒトＧＰＲ１４のアミノ酸配列を有するヒト
ＧＰＲ１４変種をコードしているポリヌクレオチドであ
る。
【００３２】本発明のさらに好ましい具体例は、全長に
わたり、図１〜３（配列番号：２）に示すアミノ酸配列
を有するヒトＧＰＲ１４ポリペプチドをコードしている
ポリヌクレオチドに対して少なくとも７５．９％同一で
あるポリヌクレオチド、およびかかるポリヌクレオチド
に対して相補的なポリヌクレオチドである。この点にお
いて、全長にわたり同様なポリヌクレオチドに対して少
なくとも８０％同一なポリヌクレオチドが特に好まし
く、少なくとも９０％同一なものはとりわけ好ましい。
さらに、少なくとも９７％同一なものは、大いに好まし
く、少なくとも９８〜９９％同一なものはさらに大いに
好ましく、少なくとも９９％同一なものは最も好まし
い。
【００３３】さらに本発明は、前記の配列にハイブリダ
イズするポリヌクレオチドに関する。この点において、
本発明は、特に、厳密な条件下で前記のポリヌクレオチ
ドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本
明細書中で使用される場合、用語「厳密な条件」とは、
ハイブリダイゼーションが、配列間に少なくとも９５％
および好ましくは９７％の同一性が存在するかどうかの
場合にのみ起こるであろうことを意味する。
【００３４】配列番号：１に含まれるヌクレオチド配列
に対して十分同一である本発明のポリヌクレオチドは、
ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーション
プローブとして使用でき、ヒトＧＰＲ１４をコードして
いる全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローン、およびヒトＧ
ＰＲ１４遺伝子に対して高い類似性を有する他の遺伝子
のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離できる。かかる
ハイブリダイゼーション技術は当業者にとって周知であ
る。典型的にこれらのヌクレオチド配列は、対照のヌク
レオチド配列に対して７０％同一、好ましくは８０％同
一、より好ましくは９０％同一である。一般にプローブ
は、少なくとも１５ヌクレオチドを含むであろう。好ま
しくは、かかるプローブは少なくとも３０ヌクレオチド
を有してもよく、および少なくとも５０ヌクレオチドを
有してもよい。特に好ましいプローブは、３０〜５０ヌ
クレオチド範囲であろう。
【００３５】本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドは、動物およびヒトの疾病に対する治療および診断
を発見するための研究試薬および材料として使用されう
る。
【００３６】ベクター、宿主細胞、発現 また、本発明は、本発明ポリヌクレオチドを含むベクタ
ー、本発明のベクターを用いて遺伝子操作された宿主細
胞および組み換え法による本発明のポリペプチドの製造
に関する。また、無細胞翻訳系を使用して、本発明のＤ
ＮＡ構築物から得たＲＮＡを用いてかかる蛋白を製造す
ることができる。
【００３７】組換え体生産の場合、宿主細胞を遺伝子操
作して、本発明のポリヌクレオチドのための発現系また
はそれらの一部を組み込むことができる。ポリヌクレオ
チドの宿主細胞への導入は、多くの標準的研究室マニュ
アル、例えばリン酸カルシウムトランスフェクション、
ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、ト
ランスベクション、ミクロインジェクション、カチオン
性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポーレー
ション、形質導入、クレープ負荷、バリスティック導入
または感染のごとき、Davis et al., BASIC METHODS IN
MOLECULAR BIOLOGY(1986)およびSambrook et al., MOL
ECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,2nd Ed., Cold S
pring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
N.Y.(1989)に記載の方法によって達成できる。
【００３８】適当な宿主の典型例は、ストレプトコッカ
ス（streptococcus）、スタフィロコッカス（staphyloc
occus）、イー・コリ（E.coli）、ストレプトミセス（S
treptomyces）およびバチルス・ズブチリス（Bacillus
subtilis）細胞のごとき細菌細胞；酵母細胞およびアス
ペルギルス（Aspergillus）細胞のごとき真菌細胞；シ
ョウジョウバエ（Drosophila）S2およびスポドプテラ
（Spodoptera）Sf9細胞のごとき昆虫細胞；ＣＨＯ、Ｃ
Ｏ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ２９３および
ボウズ（Bowes）メラノーマ細胞のごとき動物細胞；な
らびに植物細胞を包含する。
【００３９】非常に様々な発現系が使用されうる。かか
る系は、とりわけ、染色体、エピソームおよびウイルス
由来の系、例えば、細菌プラスミド由来、バクテリオフ
ァージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由
来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、
バキュロウイルス、ＳＶ４０のごときパポーバウイル
ス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイル
ス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスのごとき
ウイルス由来のベクター、ならびにコスミドおよびファ
ージミドのごときプラスミドおよびバクテリオファージ
の遺伝エレメント由来のベクターのごときそれらの組み
合わせ由来のベクターを包含する。該発現系は、発現を
生ずると同様にレギュレートする調節領域を含む。一般
的には、宿主中でポリペプチドを生じるためにポリヌク
レオチドを維持、増殖または発現するのに適した系また
はベクターが使用されうる。適当なヌクレオチド配列
を、様々な周知の日常的な技法、例えばSambrook et a
l., MOLECULAR CLONING，A LABORATORY MANUAL（supr
a）に示される技法のいずれかによって発現系へ挿入し
うる。
【００４０】翻訳された蛋白の小胞体ルーメン中、ペリ
プラズム空間中または細胞外環境中への分泌のために、
適当な分泌シグナルを所望のポリペプチド中に組み込む
ことができる。これらのシグナルはポリペプチドに対す
る内在性のものであってもよく、あるいは異種シグナル
であってもよい。
【００４１】ヒトＧＰＲ１４ポリペプチドをスクリーニ
ングアッセイでの使用のために発現させる場合、一般
に、該ポリペプチドを細胞表面で生じることが好まし
い。この場合、スクリーニングアッセイで使用する前に
細胞を採取することができる。ヒトＧＰＲ１４ポリペプ
チドが培地中へ分泌される場合、ポリペプチドを回収お
よび精製するために該培地を回収でき；細胞内に生じる
場合、ポリペプチドを回収する前に、まず細胞を溶菌し
なければならない。
【００４２】ヒトＧＰＲ１４ポリペプチドを硫酸アンモ
ニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたは
カチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースク
ロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシル
アパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマト
グラフィーを包含するよく知られた方法により、組み換
え細胞培養物から回収し、精製することができる。最も
好ましくは、高速液体クロマトグラフィーを精製に用い
る。単離または精製中にポリペプチドが変性する場合、
蛋白の再生のためのよく知られた方法を用いて活性コン
ホーメーションを再生しうる。
【００４３】診断アッセイ 本発明はまた、診断試薬としての使用のためのヒトＧＰ
Ｒ１４ポリヌクレオチドの使用に関する。機能不全に関
連したヒトＧＰＲ１４遺伝子の変異型の検出は、ヒトＧ
ＰＲ１４の低発現、過剰発現または変化した発現から生
じる疾病またはかかる疾病に対する感受性の診断に付加
しうる、あるいはかかる診断を明確化しうる診断道具を
提供するであろう。ヒトＧＰＲ１４遺伝子における変異
を有する個体を、種々の技法により、ＤＮＡレベルで検
出することができる。
【００４４】診断用の核酸を、対象の細胞から、例えば
血液、尿、唾液、組織生検または剖検材料から得ること
ができる。ゲノムＤＮＡを検出用に直接使用してもよ
く、あるいは分析前にＰＣＲまたは他の増幅技法を用い
ることにより酵素的に増幅してもよい。ＲＮＡまたはｃ
ＤＮＡを同じように使用してもよい。正常遺伝子型との
比較における増幅産物のサイズの変化により、欠失およ
び挿入を検出することができる。増幅したＤＮＡを標識
ヒトＧＰＲ１４ヌクレオチド配列とハイブリダイズさせ
ることにより、点突然変異を同定することができる。好
ましくは、ＲＮａｓｅ消化または融点温度の相違によ
り、マッチした配列をミスマッチ２本鎖から区別するこ
とができる。また、ＤＮＡ配列の相違を、変性剤有りま
たは無しのゲル中のＤＮＡフラグメントの電気泳動移動
度における変化によって、あるいは直接ＤＮＡ配列決定
によって検出することができる（例えば、Myers et a
l., Science (1985)230:1242）参照）。ＲＮａｓｅおよ
びＳ１保護のごときヌクレアーゼ保護アッセイまたは化
学的開裂法により、特定の位置での配列の変化も明らか
となる（Cotton et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,85:4
397-4401(1985)参照）。
【００４５】該診断アッセイは、記載の方法によりヒト
ＧＰＲ１４遺伝子における変異の検出によって、細菌、
真菌、原核生物およびウイルス感染、特にＨＩＶ−１ま
たはＨＩＶ−２によって引き起こされる感染のような感
染、疼痛、癌、食欲不振、病的飢餓、喘息、パーキンソ
ン病、急性心不全、低血圧、高血圧、尿閉、骨粗鬆症、
狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性前立腺肥大
症、および不安、精神分裂症、躁鬱病、せん妄、痴呆、
はげしい精神遅滞、ならびにハンチントン病またはジル
・ド・ラ・トゥレット症候群のような運動異常症を包含
する精神ならびに神経障害に対する感受性を診断する、
あるいは決定する方法を提供する。
【００４６】さらに、細菌、真菌、原生動物およびウイ
ルス感染、特にＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２によって引
き起こされる感染のような感染、疼痛、癌、食欲不振、
病的飢餓、喘息、パーキンソン病、急性心不全、低血
圧、高血圧、尿閉、骨粗鬆症、狭心症、心筋梗塞、潰
瘍、アレルギー、良性前立腺肥大症、および不安、精神
分裂症、躁鬱病、せん妄、痴呆、はげしい精神遅滞、な
らびにハンチントン病またはジル・ド・ラ・トゥレット
症候群のような運動異常症を包含する精神ならびに神経
障害を、対象由来の試料から異常に減少したまたは増加
したレベルのヒトＧＰＲ１４ポリペプチドまたはヒトＧ
ＰＲ１４ｍＲＮＡを検出することを特徴とする方法によ
って診断することができる。減少したまたは増加した発
現を、当該分野でよく知られたポリヌクレオチドを定量
化する方法、例えばＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ
保護、ノーザンブロッティングおよび他のハイブリダイ
ゼーション法のいずれかを用いてＲＮＡレベルで測定す
ることができる。ヒトＧＰＲ１４のごとき蛋白のレベル
を宿主由来の試料中で測定するために用いることができ
るアッセイ技術は、当業者に周知である。かかるアッセ
イ法は、ラジオイムノアッセイ、競争結合アッセイ、ウ
ェスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイを包含
する。
【００４７】染色体アッセイ 本発明のヌクレオチド配列は染色体の同定にも価値があ
る。配列は個々のヒト染色体上の特定位置に特別に標的
化されており、これとハイブリダイズしうる。本発明に
よる染色体への関連配列のマッピングは、配列を疾病関
連遺伝子と関連づけることにおいて重要な最初の工程で
ある。一旦、配列を正確な染色体位置へマッピングした
ならば、染色体上での該配列の物理的位置を遺伝地図デ
ータと関連付けることができる。かかるデータは、例え
ば、V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man（Joh
n Hopkins University Welch Medical Libraryによりオ
ンラインで入手可能）において見られる。次いで、同じ
染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾病との関係
は、連鎖解析（物理的に隣接した遺伝子の同時遺伝）に
より、同定される。罹患したおよび罹患していない個体
間のｃＤＮＡまたはゲノム配列における相違を決定する
こともできる。次に、罹患した個体のいくつかまたは全
てにおいて変異が観察されるが、正常な個体のいずれに
おいても観察されない場合、その変異は疾病の病因であ
る可能性がある。
【００４８】抗体 本発明のポリペプチド、それらのフラグメントまたはそ
れらのアナログ、またはそれらを発現する細胞を免疫原
として用いて、ヒトＧＰＲ１４ポリペプチドに免疫特異
的な抗体を作製することもできる。「免疫特異的」なる
語は、先行分野における他の関連したポリペプチドに対
する親和性よりも、本発明のポリペプチドに対して高い
親和性を有する抗体を意味する。
【００４９】ヒトＧＰＲ１４ポリペプチドに対して生じ
た抗体は、日常的なプロトコールを用いて、該ポリペプ
チドあるいはエピトープを有するフラグメント、アナロ
グまたは細胞を動物、特にヒト以外に投与することによ
って得られる。モノクローナル抗体の調製場合、連続的
な細胞系の培養により生じた抗体を提供する方法を用い
ることができる。例は、ハイブリドーマ法（Kohler G.
and Milstein C., Nature 1975 256:495-497）、トリオ
ーマ法、ヒト・Ｂ細胞ハイブリドーマ法（Kozbor et a
l.,Immunology Today 1983 4:72）およびＥＢＶ−ハイ
ブリドーマ法（Cole et al.Monoclonal Antibodies and
Cancer Therapy.Alan R.Liss,Inc,pp 77-96(1985)）を
包含する。
【００５０】１本鎖抗体の製造に関する方法（米国特許
第４，９４６，７７８号）を適用して、本発明のポリペ
プチドに対する１本鎖抗体を製造することもできる。ま
た、トランスジェニックマウスまたは他の哺乳動物を包
含する他の生物を用いて、ヒト化抗体を発現させてもよ
い。
【００５１】前記抗体を用いて、ポリペプチドを発現す
るクローンを単離または同定してもよく、あるいはアフ
ィニティークロマトグラフィーによってポリペプチドを
精製してもよい。
【００５２】また、ヒトＧＰＲ１４ポリペプチドに対す
る抗体を用いて、とりわけ、細菌、真菌、原生動物およ
びウイルス感染、特にＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２によ
って引き起こされる感染のような感染、疼痛、癌、食欲
不振、病的飢餓、喘息、パーキンソン病、急性心不全、
低血圧、高血圧、尿閉、骨粗鬆症、狭心症、心筋梗塞、
潰瘍、アレルギー、良性前立腺肥大症、および不安、精
神分裂症、躁鬱病、せん妄、痴呆、はげしい精神遅滞、
ならびにハンチントン病またはジル・ド・ラ・トゥレッ
ト症候群のような運動異常症を包含する精神ならびに神
経障害を治療してもよい。
【００５３】ワクチン 本発明の別の態様は、哺乳動物において免疫学的応答を
誘導する方法であって、抗体および／またはＴ細胞免疫
応答を生じるのに十分なヒトＧＰＲ１４ポリペプチド、
またはそのフラグメントを哺乳動物に接種し、該動物を
とりわけ、細菌、真菌、原生動物およびウイルス感染、
特にＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２によって引き起こされ
る感染のような感染、疼痛、癌、食欲不振、病的飢餓、
喘息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧、高血圧、
尿閉、骨粗鬆症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギ
ー、良性前立腺肥大症、および不安、精神分裂症、躁鬱
病、せん妄、痴呆、はげしい精神遅滞、ならびにハンチ
ントン病またはジル・ド・ラ・トゥレット症候群のよう
な運動異常症を包含する精神ならびに神経障害から保護
することを特徴とする方法に関する。本発明のまた別の
態様は、哺乳動物において免疫学的応答を誘導する方法
であって、かかる免疫学的応答を誘導して疾病から該動
物を保護するための抗体を産生するために、ヒトＧＰＲ
１４ポリペプチドの発現をイン・ビボで指示するベクタ
ーを介してヒトＧＰＲ１４遺伝子を伝播することを特徴
とする方法に関する。
【００５４】本発明のさらなる態様は、哺乳動物宿主中
へ導入されるとき、ヒトＧＰＲ１４ポリぺプチドに対し
て該哺乳動物内で免疫学的応答を誘導する免疫学的／ワ
クチン処方(組成物）、ヒトＧＰＲ１４ポリペプチドま
たはヒトＧＰＲ１４遺伝子を含む組成物に関する。ワク
チン処方は、さらに適当な担体を含んでもよい。ヒトＧ
ＰＲ１４ポリペプチドは胃の中で破壊されうるので、好
ましくは非経口的に（皮下、筋内、静脈、皮内等の注射
を包含する）投与される。非経口投与に適する処方は、
抗酸化剤、緩衝液、静菌剤およびレシピエントの血液と
等張の処方を与える溶質を含有しうる水性ならびに非水
性滅菌注射溶液、および懸濁剤または濃化剤を包含しう
る水性ならびに非水性滅菌懸濁液を包含する。処方を、
単位投与または複数投与容器、例えば密封アンプルおよ
びバイアル中に存在させてもよく、および使用直前に滅
菌液体担体の添加のみを要する凍結乾燥状態で保存して
もよい。またワクチン処方は、処方の免疫原性を増幅さ
せるアジュバンド系、例えば水中油系および当該分野で
知られた他の系を包含しうる。投与量は、ワクチンの特
異的活性に依存し、慣例の実験によって容易に決定でき
る。
【００５５】スクリーニングアッセイ レセプターを結合する化合物および本発明のレセプター
ポリペプチドの活性を活性化する（アゴニスト）または
阻害する（アンタゴニスト）化合物のスクリーニング過
程において本発明のヒトＧＰＲ１４を用いてもよい。よ
って、本発明のポリペプチドを用いて、小分子基質とリ
ガンドの結合を、例えば、細胞、無細胞調製物、化学ラ
イブラリー、および天然産物混合物において評価しても
よい。これらの基質およびリガンドは、天然の基質およ
びリガンドであってもよく、または構造的もしくは機能
的模倣物であってもよい。Coligan et al., Curent Pro
tocols in Immunology 1(2):Chapter 5(1991)を参照。
【００５６】ヒトＧＰＲ１４蛋白は、哺乳動物宿主中に
偏在しており、多くの病状を包含する多くの生物学的機
能の原因となる。よって、一方でヒトＧＰＲ１４を刺激
し、他方でヒトＧＰＲ１４の機能を阻害しうる化合物お
よび薬物を見出すことが望ましい。一般に、アゴニスト
は、細菌、真菌、原生動物およびウイルス感染、特にＨ
ＩＶ−１またはＨＩＶ−２によって引き起こされる感染
のような感染、疼痛、癌、食欲不振、病的飢餓、喘息、
パーキンソン病、急性心不全、低血圧、高血圧、尿閉、
骨粗鬆症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性
前立腺肥大症、および不安、精神分裂症、躁鬱病、せん
妄、痴呆、はげしい精神遅滞、ならびにハンチントン病
またはジル・ド・ラ・トゥレット症候群のような運動異
常症を包含する精神ならびに神経障害のごとき状態の治
療および予防目的に使用される。アンタゴニストは、細
菌、真菌、原生動物およびウイルス感染、特にＨＩＶ−
１またはＨＩＶ−２によって引き起こされる感染のよう
な感染、疼痛、癌、食欲不振、病的飢餓、喘息、パーキ
ンソン病、急性心不全、低血圧、高血圧、尿閉、骨粗鬆
症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性前立腺
肥大症、および不安、精神分裂症、躁鬱病、せん妄、痴
呆、はげしい精神遅滞、ならびにハンチントン病または
ジル・ド・ラ・トゥレット症候群のような運動異常症を
包含する精神ならびに神経障害のごとき状態の様々な治
療および予防目的に使用されうる。
【００５７】一般に、かかるスクリーニング法は、細胞
表面に本発明のレセプターポリペプチドを発現させる適
当な細胞の生産を含む。かかる細胞は、哺乳動物、酵
母、ショウジョウバエまたはイー・コリ由来の細胞を包
含する。次いで、レセプターを発現している細胞（また
は発現レセプターを含有する細胞膜）を試験化合物と接
触させて、結合あるいは機能的応答の刺激または阻害を
観察する。
【００５８】一のスクリーニング技法は、レセプター活
性化によって引き起こされる細胞外ｐＨまたは細胞内カ
ルシウム変化を測定する系における本発明のレセプター
を発現させる細胞（例えばトランスフェクトされたＣＨ
Ｏ細胞）の使用を包含する。該技法において、化合物を
本発明のレセプターポリペプチドを発現している細胞と
接触させてもよい。次いで、第２メッセンジャー応答、
例えばシグナル変換、ｐＨ変化、またはカルシウムレベ
ル変化を測定して、潜在的に化合物がレセプターを活性
化または阻害するかどうかを決定する。
【００５９】別の方法は、レセプターによって媒介され
たｃＡＭＰおよび／またはアデニレートシクラーゼ蓄積
の阻害または刺激を測定することによる、レセプター阻
害剤のスクリーニングを含む。かかる方法は、本発明の
レセプターを有する真核細胞をトランスフェクトして、
細胞表面にレセプターを発現させることを含む。次い
で、細胞を本発明のレセプターの存在下で潜在的アンタ
ゴニストに曝露する。次いで、ｃＡＭＰ蓄積量を測定す
る。潜在的アンタゴニストがレセプターを結合し、よっ
てレセプター結合を阻害する場合、レセプターによって
媒介されたｃＡＭＰ、またはアデニレートシクラーゼ活
性のレベルは、減少または増加するであろう。
【００６０】本発明のレセプターに対するアゴニストま
たはアンタゴニストを検出する別の方法は、米国特許第
５４８２８３５号に記載されているような酵母を基本と
する方法である。
【００６１】アッセイは、単に、レセプターを有する細
胞への結合を候補化合物と直接または非直接的に結合し
た標識によって、または標識された競合物との競合を含
むアッセイにおいて検出される候補化合物の結合を試験
してもよい。さらに、これらのアッセイは、細胞表面に
レセプターを有する細胞に適当な検出系を用いて、候補
化合物がレセプターの活性化によるシグナル発生を生じ
るかどうかを試験してもよい。一般に、活性化の阻害剤
は、既知アゴニストの存在下でアッセイされ、候補化合
物の存在によるアゴニストによる活性化への影響を観察
する。かかるスクリーニングアッセイを行うための標準
的な方法は、当該分野においてよく理解されている。
【００６２】潜在的ヒトＧＰＲ１４アンタゴニストの例
は、抗体、またはいくつかの場合、ヒトＧＰＲ１４のリ
ガンドに密接に関連したオリゴヌクレオチドもしくは蛋
白、例えば、リガンドのフラグメント、またはレセプタ
ーに結合するが応答を顕在化せず、レセプターの活性を
妨害する小分子を包含する。
【００６３】予防および治療方法 本発明は、過剰なおよび不十分量のヒトＧＰＲ１４活性
の両方に関連した異常な症状の治療方法を提供する。
【００６４】ヒトＧＰＲ１４の活性が過剰な場合、いく
つかのアプローチが利用できる。一のアプローチは、リ
ガンドのヒトＧＰＲ１４への結合をブロックすることに
より、あるいは第２のシグナルを阻害することにより活
性化を阻害するのに有効量の前記阻害剤化合物（アンタ
ゴニスト）を医薬上許容される担体とともに対象に投与
し、そのことにより異常な症状を軽減することを特徴と
する。
【００６５】別のアプローチにおいて、内在性ヒトＧＰ
Ｒ１４との競合において依然としてリガンドへ結合でき
る可溶性形態のヒトＧＰＲ１４ポリペプチドを投与して
もよい。かかる競合剤の典型的な具体例は、ヒトＧＰＲ
１４ポリペプチドのフラグメントを含む。
【００６６】また別のアプローチにおいて、内在性ヒト
ＧＰＲ１４をコードしている遺伝子の発現を発現ブロッ
キング技法を用いて阻害することができる。既知のかか
る技法は、内部に生じるか、または別々に投与されるア
ンチセンス配列の使用を含む。例えば、O'Connor, J Ne
urochem(1991)56:560 in Oligodeoxynucleotides asAnt
isense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, B
oca Raton, FL(1988)参照。別法で、遺伝子と共に三重
らせんを形成するオリゴヌクレオチドを提供することが
できる。例えば、Lee et al., Nucleic Acids Res(197
9) 6:3073,; Cooney et al., Science(1988)241:456; D
ervan et al., Science(1991)251:1360参照。これらの
オリゴマー自体を投与でき、または適切なオリゴマーを
イン・ビボで発現させることができる。
【００６７】ヒトＧＰＲ１４の低発現およびその活性に
関連した異常な症状を治療する場合も、いくつかのアプ
ローチを利用できる。一のアプローチは、前記のごとく
ヒトＧＰＲ１４を活性化する化合物、すなわちアゴニス
トの治療上有効量を医薬上許容される担体と組み合わせ
て対象に投与し、そのことにより異常な症状を軽減する
ことを特徴とする。別法で、遺伝子治療を用いて、対象
中の適当な細胞によるヒトＧＰＲ１４の内在性生産をも
たらしてもよい。例えば、本発明のポリヌクレオチドを
前記のように、複製欠陥レトロウイルスベクター中にお
ける発現のために操作してもよい。次いで、レトロウイ
ルス発現構築物を単離し、本発明のポリペプチドをコー
ドしているＲＮＡを含有するレトロウイルスプラスミド
ベクターで形質導入されたパッケージング細胞中へ導入
して、パッケージング細胞が対象遺伝子を含有する感染
性ウイルス粒子を生産するようにしてもよい。これらの
プロデューサー細胞をイン・ビボでの細胞の操作および
イン・ビボでのポリペプチド発現のために、対象へ投与
してもよい。遺伝子治療のあらましは、Chapter 20, Ge
ne Therapy and other Molecular Genetic-based Thera
peutic Approches,(および、そこに挙げられた参考文
献）in Human Molecular Genetics, T Starchan and A
P Read, BIOS Scientific Publishers Ltd(1996)を参照
する。
【００６８】処方および投与 可溶性形態のヒトＧＰＲ１４ポリペプチドのごときペプ
チドおよびアゴニストならびにアンタゴニストペプチド
または小分子を適当な医薬担体と組み合わせて処方して
もよい。かかる処方は、治療上有効量のポリペプチドま
たは化合物、および医薬上許容される担体または賦形剤
を含む。かかる担体は、セーライン、セーライン緩衝
液、デキストロース、水、グリセロール、エタノールお
よびそれらの混合物を包含するが、これらに限らない。
処方は投与様式に合わせるべきであり、当該分野の技術
内である。本発明はさらに、１またはそれ以上の本発明
の前記組成物の成分で満たされた１またはそれ以上の容
器を含む医薬パックおよびキットに関する。
【００６９】本発明のポリペプチドおよび化合物を単独
かまたは治療化合物のごとき他の化合物と組み合わせて
使用してもよい。
【００７０】医薬組成物の好ましい全身投与形態は、典
型的に静脈注射による注射を包含する。皮下、筋内、ま
たは腹膜内のごとき他の注射経路を用いることができ
る。全身投与の別法は、胆汁酸またはフシジン酸または
他の洗浄剤のごとき浸透剤を用いる粘膜貫通および皮膚
貫通投与を包含する。さらに、腸溶性またはカプセルに
包まれた処方において適当に処方される場合、経口投与
も可能でありうる。これらの化合物の投与は、また、軟
膏、泥膏、ゲル等の形態において局所および／または局
部であってもよい。
【００７１】要求される投与用量範囲は、ペプチドの選
択、投与経路、処方の性質、対象の症状の性質、および
往診する開業医の判断に依存する。しかしながら、適当
な投与用量は、対象の０．１〜１００μｇ／ｋｇの範囲
である。しかしながら、必要な投与用量における広範囲
な変化は、様々な化合物が利用でき、種々の投与経路の
有効度が異なることを考慮して、予想できる。例えば、
経口投与は、静脈注射による投与よりも多い投与用量を
要することが予想されるであろう。当該分野でよく理解
されているように、これらの投与用量レベルにおける変
化を標準的な経験的慣例を用いて最適に調整することが
できる。
【００７２】また、前記のごとくしばしば「遺伝子治療」
と称される治療様式において、治療に使用されるポリペ
プチドを対象において内発的に生じることができる。よ
って、例えば、対象由来の細胞をＤＮＡまたはＲＮＡの
ごときポリヌクレオチドと共に操作して、例えば、レト
ロウイルスプラスミドベクターの使用によって、エクス
・ビボでポリペプチドをコードしてもよい。次いで細胞
を対象中に導入する。
【００７３】
【実施例】下記実施例は、別に詳細に記載しない限り、
当業者によく知られた、日常的な標準技術を用いて行わ
れる。実施例は本発明を説明するが、制限しない。
【００７４】実施例１ ドブネズミオーファンレセプター（ＧＰＲ１４，A. Mar
chese et al., Genomics, 29(2):335-44, 1995）全コー
ディング領域に対応する１．２ｋｂＰＣＲフラグメント
をプローブとして使用して、ヒトゲノム胎盤ライブラリ
ー（Stratagene, LaJolla CA, Cat.#946206）由来の．
７５Ｍプラーク全体をスクリーニングした。ゲノムライ
ブラリースクリーニング方法は、Elgin, et al., Strat
atgies 4:8-9,1991によって記載されている。Random Pr
imed Labeling Kit（BoheringerManheim, Germany，Ca
t.#1585584）を用いてプローブをα−３２Ｐ標識し、Se
phadex G-50カラム（Pharmacia Biotech．Cat.#17-0855
-02）に付すことによって精製した。ハイブリダイゼー
ションおよび洗浄条件は、J. Sambrook, E.F.Fritch an
d T. Maniatis(1989) A Laboratory Manual Second. E
d. Vol. 1pp. 2.69-2.81 Cold Spring Harbor Laborato
ry Press, Cold Spring Harbor, New Yorkに従った。前
記スクリーニングより得られた一の陽性ファージクロー
ンをさらに精製した。サザン分析を消化したファージＤ
ＮＡ上で行い、９ｋｂのSacIフラグメントを該クローン
にハイブリダイズした。該フラグメントをｐBlueScript
KSベクター中へサブクローン化し、さらにEcoRIで消化
して、サザン分析した。前記のラットＧＰＲ１４プロー
ブに対してハイブリダイズされたより小さな５ｋｂフラ
グメントを配列分析のためにpBlueScript中へサブクロ
ーン化し、自動シークエンサーによって配列を決定し
た。ペプチド３９０残基をコードしているオープンリー
ディングフレームを包含する２１２６ｂｐ全体を配列決
定した。配列比較によって、またGenbankヌクレオチド
データベースに対するfasta分析によって明らかなよう
に、該配列は、ラットＧＰＲ１４と非常に一致する。
【００７５】実施例２ 哺乳動物細胞発現 本発明のレセプターをヒト胎児腎２９３（ＨＥＫ２９
３）細胞かまたは付着性dhfrＣＨＯ細胞のいずれかにお
いて発現させる。レセプター発現を最大化するために、
典型的には、ｐＣＤＮまたはｐＣＤＮＡ３ベクターへの
挿入の前に、全ての５’および３’非翻訳領域（ＵＴ
Ｒ）をレセプターｃＤＮＡから除去する。リポフェクチ
ンによって細胞を個々のレセプターｃＤＮＡでトランス
フェクトし、４００ｍｇ／ｍｌＧ４１８存在下で選抜す
る。選抜３週間後、個々のクローンを拾い上げ、さらな
る分析を行う。ベクターのみでトランスフェクトしたＨ
ＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞を負の対照として用いる。
個々のレセプターを安定に発現する細胞系を単離するた
めに、典型的に約２４個のクローンを選択し、ノーザン
ブロット分析によって分析する。レセプターｍＲＮＡ
は、一般的にＧ４１８−耐性クローンの約５０％におい
て検出される。
【００７６】実施例３ 結合および機能アッセイのためのリガンドバンク 推定の２００を超えるレセプターリガンドのバンクをス
クリーニングのために作製した。該バンクは、ヒト７回
膜貫通型（７ＴＭ）レセプターを介して作用することが
知られている伝達物質、ホルモンおよびケモカイン；ヒ
ト７ＴＭレセプターの推定アゴニストであってもよい天
然化合物、哺乳動物での対応物がいまだ同定されていな
い非哺乳動物の生物学的に活性なペプチド；天然に見出
されないが未知の天然リガンドで７ＴＭレセプターを活
性化する化合物を含んでなる。最初に、該バンクを使用
して、機能（すなわち、カルシウム、ｃＡＭＰ、ミクロ
フィジオメーター、卵母細胞、電気生理学等、下記参
照）ならびに結合アッセイの両方を用いて、既知リガン
ドに対するレセプターをスクリーニングする。
【００７７】実施例４ リガンド結合アッセイ リガンド結合アッセイは、レセプター薬理学を確認する
直接的方法を提供し、高処理量フォーマットに適応す
る。レセプターの精製リガンドを結合研究のために、高
比活性（５０〜２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）に対して放射
能標識する。次いで、放射能標識のプロセスがレセプタ
ーに対するリガンドの活性を減少させないように測定が
行われる。緩衝液、イオン、ｐＨおよびヌクレオチドの
ごとき他のモジュレーターのアッセイ条件を、膜および
全細胞レセプター供給源の両方について使用可能なシグ
ナル対ノイズ比を確立するために最適化する。これらの
アッセイについて、特異的レセプター結合は、全結合放
射活性マイナス過剰な非標識化競合リガンドの存在下で
測定した放射活性として定義される。可能ならば、１個
よりも多くの競合リガンドを使用して、残存する非特異
的結合を定義付ける。
【００７８】実施例５ アフリカツメガエル卵母細胞における機能アッセイ 本発明のレセプターｃＤＮＡをコードしている線状化プ
ラスミド鋳型由来のキャップＲＮＡ転写産物を、標準法
に従って、ＲＮＡポリメラーゼを用いてイン・ビトロで
合成する。イン・ビトロ転写産物を最終濃度０．２ｍｇ
／ｍｌで水に懸濁する。卵巣葉を成熟雌カエルから取り
出し、ステージＶ脱卵胞卵母細胞を得、ＲＮＡ転写産物
（１０ｎｇ／卵母細胞）をミクロインジェクション装置
を用いて５０ｎｌ塊に注射する。２個の電極電圧クラン
プを使用して、アゴニスト曝露に応答した個々のアフリ
カツメガエル卵母細胞からの電流を測定する。室温にて
Ｃａ2+無しのバース（Ｂａｒｔｈ）培地中で記録を行
う。アフリカツメガエル系を用いて、既知リガンドおよ
びリガンドを活性化するための組織／細胞抽出物をスク
リーニングすることができる。
【００７９】実施例６ ミクロフィジオメーターアッセイ 非常に多様な二次メッセンジャー系の活性化により、細
胞から少量の酸の放出がおこる。生成した酸は、主に、
細胞内シグナル伝達プロセスにエネルギーを供給するた
めに必要とされる代謝活性の増加の結果である。細胞周
囲の培地中のｐＨ変化はとても小さいが、ＣＹＴＯＳＥ
ＮＳＯＲミクロフィジオメーター（Molecular Dervices
Ltd., Menlo Park, CA）によって検出できる。よっ
て、ＣＹＴＯＳＥＮＳＯＲは、本発明のＧ−蛋白結合レ
セプターのごとく、細胞内シグナル伝達経路を使用する
エネルギーに結合するレセプターの活性化を検出でき
る。
【００８０】実施例７ 抽出物／細胞上清スクリーニング 多数の哺乳動物レセプターが存在し、それらについてま
だ同種の活性化リガンド（アゴニスト）は残存しない。
よって、これらのレセプターの活性リガンドは、今まで
に同定されたようなリガンドバンク内に包含されなくて
もよい。従って、また天然リガンドを同定するために、
組織抽出物に対して本発明の７ＴＭレセプターを機能的
に（カルシウム、ｃＡＭＰ、ミクロフィジオメーター、
卵母細胞電気生理学等の機能的スクリーニング）スクリ
ーニングする。活性化しているリガンドを単離同定する
まで、正の機能的応答を生じる抽出物を連続的に細分画
することができる。
【００８１】実施例８ カルシウムおよびｃＡＭＰ機能アッセイ ＨＥＫ２９３細胞中で発現する７ＴＭレセプターは、Ｐ
ＬＣの活性およびカルシウム移動および／またはｃＡＭ
Ｐ刺激または阻害に機能的に共役していることが明らか
にされた。レセプタートランスフェクトした、またはベ
クター制御細胞におけるＨＥＫ２９３細胞中の基礎的カ
ルシウムレベルは、通常１００ｎＭ〜２００ｎＭ範囲で
あることが観察された。組換えレセプターを発現してい
るＨＥＫ２９３細胞をfura２と共に負荷し、一日に＞１
５０の選択リガンドまたは組織／細胞抽出物をカルシウ
ム移動を誘導したアゴニストに対して評価する。同様
に、組換えレセプターを発現しているＨＥＫ２９３細胞
を、標準ｃＡＭＰ定量化アッセイを用いて、ｃＡＭＰ生
産の刺激または阻害に対して評価する。一時的カルシウ
ム移動またはｃＡＭＰ変動を与えるアゴニストをベクタ
ー制御細胞中でテストし、応答がレセプターを発現する
トランスフェクトされた細胞に特有のものであるかどう
かを決定する。
【００８２】
【配列表】 （１）一般的情報 （ｉ）出願人：ウスマン・シャボン ダーク・バーグスマ （ｉｉ）発明の名称：ヒトＧＰＲ１４レセプターのクローニング （ｉｉｉ）配列の数：２ （ｉｖ）連絡先： （Ａ）宛て名：スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション （Ｂ）通り名：スウェードランド・ロード７０９番 （Ｃ）都市名：キング・オブ・プルシア （Ｄ）州名：ペンシルバニア （Ｅ）国名：アメリカ合衆国 （Ｆ）ＺＩＰ：１９４０６ （ｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム （Ａ）媒体タイプ：ディスケット （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭコンパチブル （Ｃ）オペレーティング・システム：ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：Windowsヴァージョン2.0用 FastSEQ （ｖｉ）現出願データ： （Ａ）出願番号：未詳 （Ｂ）出願日：１９９７年１月２７日 （Ｃ）分類：未詳 （ｖｉｉ）先の出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （ｖｉｉｉ）代理人等の情報： （Ａ）氏名：ウイリアム・ティー・ハン （Ｂ）登録番号：３４３４４ （Ｃ）代理人等における処理番号：Ｐ５０６１０ （ｉｘ）テレコミュニケーションの情報： （Ａ）電話番号：６１０−２７０−５２１９ （Ｂ）ファックス番号：６１０−２７０−４０２６ （Ｃ）テレックス：
【００８３】（２）配列番号：１に関する情報：（ｉ）
配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２１２６塩基対（Ｂ）
配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：１本（Ｄ）トポロジー：
直鎖状（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ（ｘｉ）配列の記
載：配列番号：１ GACAAAACTG GGTACGGGCC CCCCTCGAGG TCGACGGTAT CGATAAGCTT GATATCGAAT 60 TCGTTTCCCT GTATGAGAAA TGGAGATTGC AGAGGCCTTC CTCTCCTTAC ATGTTCTTCT 120 ATTTGGACTT TTAAAGTCAG TAGCTACTAG TTTTGCAATC TAAAGAAAAC ATTTTTTTAA 180 ATGTACAAGT CAAATAAATA CGAGAAAGGA CTCAGGAGTA AGTGGGCCCC ACCTGTGCAC 240 AGACAAGAAA GTGAGGCCTG GGGGGGCGCA CTGGGCAGAG CCCAGGACTC CCAGTTCTGT 300 CCACTGCCGA CCTCTGCCCC AGGGGCTGCC CTCCTGTGTT CCGGCTTTCA GAAAAGCCCA 360 GTTCATCCCA GAGGCCATGG GACCTACAGT GAGGGGGGGG CAGGGGTCCT GCTGGGGCAT 420 GCGGGGGTCG GGGAGGGGGG TTGGGGCAGC TCGTCTGGTG GCTCTTGAGT CCTCCTGCAG 480 AGCTGGTGGC TTCCAGAGAG TCCCGAGAGT TGGAGGGCAC TGGGGAGCCC ACGTGACTCT 540 GTGGGAACGA GGCCATCACA GTGGCCTCCT GGGAGCGGAA GGTGTTGCCT GATTTGCTTC 600 TTTCCCCACA GGCTGAGCTG GTTGCCCACA GGGGCCCCCG CCCCATCTCA GGGAGTGTCC 660 ACCCAGCCCT GAGCCCGTCG TGAGGGGTCA GAGATGGCGC TGACCCCCGA GTCCCCGAGC 720 AGCTTCCCTG GGCTGGCCGC CACCGGCAGC TCTGTGCCGG AGCCGCCTGG CGGCCCCAAC 780 GCAACCCTCA ACAGCTCCTG GGCCAGCCCG ACCGAGCCCA GCTCCCTGGA GGACCTGGTG 840 GCCACGGGCA CCATTGGGAC TCTGCTGTCG GCCATGGGCG TGGTGGGCGT GGTGGGCAAC 900 GCCTACACGC TGGTGGTCAC CTGCCGCTCC CTGCGTGCGG TGGCCTCCAT GTACGTCTAC 960 GTGGTCAACC TGGCGCTGGC CGACCTGCTG TACCTGCTCA GCATCCCCTT CATCGTGGCC 1020 ACCTACGTCA CCAAGGAGTG GCACTTCGGG GACGTGGGCT GCCGCGTGCT CTTCGGCCTG 1080 GACTTCCTGA CCATGCACGC CAGCATCTTC ACGCTGACCG TCATGAGCAG CGAGCGCTAC 1140 GCTGCGGTGC TGCGGCCGCT GGACACCGTG CAGCGCCCCA AGGGCTACCG CAAGCTGCTG 1200 GCGCTGGGCA CCTGGCTGCT GGCGCTGCTG CTGACGCTGC CCGTGATGCT GGCCATGCGG 1260 CTGGTGCGCC GGGGTCCCAA GAGCCTGTGC CTGCCCGCCT GGGGCCCGCG CGCCCACCGC 1320 GCCTACCTGA CGCTGCTCTT CGCCACCAGC ATCGCGGGGC CCGGGCTGCT CATCGGGCTG 1380 CTCTACGCGC GCCTGGCCCG CGCCTACCGC CGCTCGCAGC GCGCCTCCTT CAAGCGGGCC 1440 CGGCGGCCGG GGGCGCGCGC GCTGCGCCTG GTGCTGGGCA TCGTGCTGCT CTTCTGGGCC 1500 TGCTTCCTGC CCTTCTGGCT GTGGCAGCTG CTCGCCCAGT ACCACCAGGC CCCGCTGGCG 1560 CCGCGGACGG CGCGCATCGT CAACTACCTG ACCACCTGCC TCACCTACGG CAACAGCTGC 1620 GCCAACCCCT TCCTCTACAC GCTGCTCACC AGGAACTACC GCGACCACCT GCGCGGCCGC 1680 GTGCGGGGCC CGGGCAGCGG GGGAGGCCGG GGGCCCGTTC CCTCCCTGCA GCCCCGCGCC 1740 CGCTTCCAGC GCTGTTCGGG CCGCTCCCTG TCTTCCTGCA GCCCACAGCC CACTGACAGC 1800 CTCGTGCTGG CCCCAGCGGC CCCGGCCCGA CCTGCGCCCG AGGGTCCCAG GGCCCCGGCG 1860 TGAGCACGCG GAGGGGCGGC TGGAGTCCAG GCGGGGACGC GCCCCAAAGC CCCAGCCACT 1920 CCCGGGAGCC CCCCCAACTC CCAAATCACA GGCCCTGCCC CTCCTCCGTC CCCTTCTGGA 1980 AAGATCCTGC TCGCTTCCCC TCAGCGCCCT TCCCGTGATG CCCAGAAGCG CCCACCCGCC 2040 TCCCTGAGGG TCTCCAGGAG GCTCCAGCGC AGTCCCGGCT TCTGGAGACA TGGCTTCGTC 2100 ACAGAGGGCA GCAGGCGCCA TTGCCC 2126
【００８４】（２）配列番号：２に関する情報：（ｉ）
配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：３８９アミノ酸（Ｂ）
配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：１本（Ｄ）トポロジ
ー：直鎖状（ｉｉ）分子の型：蛋白（ｘｉ）配列の記
載：配列番号：２ Met Ala Leu Thr Pro Glu Ser Pro Ser Ser Phe Pro Gly Leu Ala Ala 1 5 10 15 Thr Gly Ser Ser Val Pro Glu Pro Pro Gly Gly Pro Asn Ala Thr Leu 20 25 30 Asn Ser Ser Trp Ala Ser Pro Thr Glu Pro Ser Ser Leu Glu Asp Leu 35 40 45 Val Ala Thr Gly Thr Ile Gly Thr Leu Leu Ser Ala Met Gly Val Val 50 55 60 Gly Val Val Gly Asn Ala Tyr Thr Leu Val Val Thr Cys Arg Ser Leu 65 70 75 80 Arg Ala Val Ala Ser Met Tyr Val Tyr Val Val Asn Leu Ala Leu Ala 85 90 95 Asp Leu Leu Tyr Leu Leu Ser Ile Pro Phe Ile Val Ala Thr Tyr Val 100 105 110 Thr Lys Glu Trp His Phe Gly Asp Val Gly Cys Arg Val Leu Phe Gly 115 120 125 Leu Asp Phe Leu Thr Met His Ala Ser Ile Phe Thr Leu Thr Val Met 130 135 140 Ser Ser Glu Arg Tyr Ala Ala Val Leu Arg Pro Leu Asp Thr Val Gln 145 150 155 160 Arg Pro Lys Gly Tyr Arg Lys Leu Leu Ala Leu Gly Thr Trp Leu Leu 165 170 175 Ala Leu Leu Leu Thr Leu Pro Val Met Leu Ala Met Arg Leu Val Arg 180 185 190 Arg Gly Pro Lys Ser Leu Cys Leu Pro Ala Trp Gly Pro Arg Ala His 195 200 205 Arg Ala Tyr Leu Thr Leu Leu Phe Ala Thr Ser Ile Ala Gly Pro Gly 210 215 220 Leu Leu Ile Gly Leu Leu Tyr Ala Arg Leu Ala Arg Ala Tyr Arg Arg 225 230 235 240 Ser Gln Arg Ala Ser Phe Lys Arg Ala Arg Arg Pro Gly Ala Arg Ala 245 250 255 Leu Arg Leu Val Leu Gly Ile Val Leu Leu Phe Trp Ala Cys Phe Leu 260 265 270 Pro Phe Trp Leu Trp Gln Leu Leu Ala Gln Tyr His Gln Ala Pro Leu 275 280 285 Ala Pro Arg Thr Ala Arg Ile Val Asn Tyr Leu Thr Thr Cys Leu Thr 290 295 300 Tyr Gly Asn Ser Cys Ala Asn Pro Phe Leu Tyr Thr Leu Leu Thr Arg 305 310 315 320 Asn Tyr Arg Asp His Leu Arg Gly Arg Val Arg Gly Pro Gly Ser Gly 325 330 335 Gly Gly Arg Gly Pro Val Pro Ser Leu Gln Pro Arg Ala Arg Phe Gln 340 345 350 Arg Cys Ser Gly Arg Ser Leu Ser Ser Cys Ser Pro Gln Pro Thr Asp 355 360 365 Ser Leu Val Leu Ala Pro Ala Ala Pro Ala Arg Pro Ala Pro Glu Gly 370 375 380 Pro Arg Ala Pro Ala 385
【図面の簡単な説明】
【図１】 ヒトＧＰＲ１４のヌクレオチド（配列番号：
１）および推定アミノ酸（配列番号：２）配列を示す。
【図２】 ヒトＧＰＲ１４のヌクレオチド（配列番号：
１）および推定アミノ酸（配列番号：２）配列を示す。
【図３】 ヒトＧＰＲ１４のヌクレオチド（配列番号：
１）および推定アミノ酸（配列番号：２）配列を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ０７Ｋ 16/44 16/44 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/00 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/00 Ａ６１Ｋ 37/02 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (72)発明者 ダーク・バーグスマ アメリカ合衆国19312ペンシルベニア州バ ーウィン、アイリッシュ・ロード271番

Claims (25)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列番号：２のポリペプチドまたはその
    対応するフラグメントをコードしているヌクレオチド配
    列に対して少なくとも８０％同一性を有するヌクレオチ
    ド配列、あるいは該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレ
    オチド配列を含む単離ポリヌクレオチド。
  2. 【請求項２】 ＤＮＡまたはＲＮＡである請求項１記載
    のポリヌクレオチド。
  3. 【請求項３】 ヌクレオチド配列が配列番号：１に含ま
    れるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％同一で
    ある請求項１記載のポリヌクレオチド。
  4. 【請求項４】 ヌクレオチド配列が配列番号：１に含ま
    れる請求項３記載のポリヌクレオチド。
  5. 【請求項５】 コード化ヌクレオチド配列が配列番号：
    ２のポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする
    請求項１記載のポリヌクレオチド。
  6. 【請求項６】 請求項３記載のポリヌクレオチドの少な
    くとも１５個の連続したヌクレオチドを含むポリヌクレ
    オチドプローブまたはプライマー。
  7. 【請求項７】 発現系が適合性宿主細胞中に存在する場
    合、配列番号：２のポリペプチドまたはそのフラグメン
    トをコードしているヌクレオチド配列と少なくとも８０
    ％同一性を有するヒトＧＰＲ１４またはそのフラグメン
    トを生産する能力を有する発現系を含むＤＮＡまたはＲ
    ＮＡ分子。
  8. 【請求項８】 請求項７記載の発現系を含む宿主細胞。
  9. 【請求項９】 ヒトＧＰＲ１４ポリペプチドまたはフラ
    グメントの生産に十分な条件下で請求項８記載の宿主を
    培養することを特徴とするヒトＧＰＲ１４ポリペプチド
    またはフラグメントの生産方法。
  10. 【請求項１０】 該ポリペプチドまたはフラグメントを
    細胞表面で発現させる請求項９記載の方法。
  11. 【請求項１１】 請求項１０記載の方法によって生産さ
    れる細胞。
  12. 【請求項１２】 さらに培養体からポリペプチドまたは
    フラグメントを回収することを包含する請求項９記載の
    方法。
  13. 【請求項１３】 ヒトＧＰＲ１４ポリペプチドまたはそ
    のフラグメントを生産する細胞を製造する方法であっ
    て、適当な培養条件下で宿主細胞がヒトＧＰＲ１４ポリ
    ペプチドまたはフラグメントを生産するように宿主細胞
    を請求項７記載の発現系で形質転換またはトランスフェ
    クトすることを特徴とする方法。
  14. 【請求項１４】 配列番号：２に含まれるアミノ酸配列
    に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含
    むヒトＧＰＲ１４ポリペプチドまたはそのフラグメン
    ト。
  15. 【請求項１５】 配列番号：２のアミノ酸配列を含む請
    求項１４記載のポリペプチドまたはそのフラグメント。
  16. 【請求項１６】 請求項１２記載の方法によって調製さ
    れたヒトＧＰＲ１４ポリペプチドまたはフラグメント。
  17. 【請求項１７】 請求項１４記載のヒトＧＰＲ１４ポリ
    ペプチドに免疫特異的な抗体。
  18. 【請求項１８】 ヒトＧＰＲ１４活性を増幅させる必要
    のある対象の治療方法であって、 （ａ）治療上有効量の該レセプターのアゴニストを対象
    に投与すること；および／または（ｂ）イン・ビボで該
    レセプター活性の生産をもたらすような形態でヒトＧＰ
    Ｒ１４ポリヌクレオチドを対象に提供することを特徴と
    する方法。
  19. 【請求項１９】 ヒトＧＰＲ１４活性を阻害する必要の
    ある対象の治療方法であって、 （ａ）治療上有効量の該レセプターのアンタゴニストを
    対象に投与すること；および／または（ｂ）該レセプタ
    ーをコードしているヌクレオチド配列の発現を阻害する
    核酸分子を対象に投与すること；および／または（ｃ）
    リガンドに対して該レセプターと拮抗する治療上有効量
    のポリペプチドを対象に投与することを特徴とする方
    法。
  20. 【請求項２０】 対象におけるヒトＧＰＲ１４の発現ま
    たは活性に関連する対象における疾病または疾病に対す
    る感受性の診断方法であって、（ａ）対象のゲノムにお
    いてヒトＧＰＲ１４をコードしているヌクレオチド配列
    における変異の有無を決定すること；および／または
    （ｂ）対象由来の試料におけるヒトＧＰＲ１４発現の存
    在または量を分析することを特徴とする方法。
  21. 【請求項２１】 ヒトＧＰＲ１４に結合する化合物の同
    定方法であって、 （ａ）請求項１１記載の細胞を候補化合物と接触させる
    こと；および（ｂ）該候補化合物の該細胞に結合する能
    力を評価することを特徴とする方法。
  22. 【請求項２２】 さらに候補化合物が、細胞表面でヒト
    ＧＰＲ１４ポリペプチドの活性化によるシグナル発生を
    もたらすかどうか（ここで、該シグナルの産生をもたら
    す候補化合物は、アゴニストと同定される）を決定する
    ことを包含する請求項２１記載の方法。
  23. 【請求項２３】 請求項２２記載の方法によって同定さ
    れるアゴニスト。
  24. 【請求項２４】 さらに、細胞をヒトＧＰＲ１４の既知
    アゴニストと接触させること；および該アゴニストによ
    って生じたシグナルが候補化合物存在下で減少されるか
    どうか（ここで、該シグナルの減少をもたらす候補化合
    物は、ヒトＧＰＲ１４のアンタゴニストと同定される）
    を決定することを包含する請求項２１記載の方法。
  25. 【請求項２５】 請求項２４記載の方法によって同定さ
    れるアンタゴニスト。
JP10051211A 1997-01-27 1998-01-27 ヒトｇｐｒ１４レセプターのクローニング Pending JPH10295376A (ja)

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