JPH10313871A - マレイン酸異性化酵素をコードするｄｎａおよびその利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 フマル酸の製造に好適なマレイン酸異性化酵
素をコードするＤＮＡ、及びそれを用いたフマル酸の製
造方法を提供する。 【解決手段】 下記の（Ａ）又は（Ｂ）のいずれかのタ
ンパク質をコードするＤＮＡが導入されることにより形
質転換された形質転換体、またはこの形質転換体の培養
物から採取したマレイン酸異性化酵素の粗精製画分もし
くは精製酵素をマレイン酸を含有する水性溶液に加え、
マレイン酸を異性化してフマル酸を生成せしめる。 （Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク
質。 （Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若し
くは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転移を有す
るアミノ酸配列を有し、かつマレイン酸を異性化してフ
マル酸を生成する活性を有するタンパク質。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、マレイン酸異性化酵素
をコードするＤＮＡ及びその利用に関し、詳しくは、デ
レヤ・ハロフィラ（Deleya halophila）由来であり、マ
レイン酸を異性化してフマル酸を生成する活性を有する
酵素をコードするＤＮＡ、このＤＮＡを保持する形質転
換体、及びこの形質転換体を用いた前記酵素の製造法並
びにフマル酸の製造法に関する。マレイン酸の異性化物
であるフマル酸は、アスパラギン酸、リンゴ酸等の各種
ファインケミカルズの原料として利用できる有用な有機
酸である。

【０００２】

【従来の技術】マレイン酸を異性化してフマル酸を製造
する方法としては、主に化学的方法が提案されているが
（米国特許第２，８１６，９２３号、同第２，９５５，
１３６号、同第２，３３２，９９２号）、反応平衡によ
りフマル酸への変換率が制約を受けること、この方法は
高温反応であるためにマレイン酸あるいはフマル酸の劣
化が起こり、副生物を生成するため収率が低下するなど
の問題点を有している。

【０００３】一方、酵素反応によるフマル酸の製造に関
しては、マレイン酸異性化酵素（maleate cis-trans -i
somerase）がマレイン酸をフマル酸へと異性化すること
が知られている。マレイン酸異性化酵素を産生する微生
物としては、例えばシュードモナス・エスピー（Pseudo
monas sp.）［K. Otsuka, Agric. Biol. Chem., Vol.2
5, No.9, p.726 (1961)］、アルカリゲネス・フェカリ
ス（Alcaligenes faecalis）IB-14［Takamura, Agric.
Biol. Chem., Vol.33, p.718(1969)］、シュードモナス
・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）ATCC2
3728［Scher, J. Biol. Chem., Vol.244, p.1878 (196
9)］が知られている。

【０００４】また、本発明者らは、バチルス・ステアロ
サーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、バ
チルス・ブレビス（Bacillus brevis）、アルカリゲネ
ス・フェカリス、セラチア・マルセッセンス（Serratia
marcescens)からマレイン酸異性化酵素をコードするＤ
ＮＡ断片を単離し、遺伝子組換え技術によりこれらのＤ
ＮＡ断片を用いてマレイン酸異性化酵素及びフマル酸を
製造することに成功している（WO 96/19571号国際公開
パンフレット）。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】酵素反応によるマレイ
ン酸のフマル酸への異性化反応は、マレイン酸を原料と
するアスパラギン酸の製造に利用されている（特公昭４
２−１１９９３号公報、同１１９９４号公報、同１１９
９６号公報、米国特許第３，３９１，０５９号等）。し
かし、マレイン酸異性化酵素はアスパラギン酸による阻
害を受けるため、効率よくアスパラギン酸を製造するた
めには、この阻害が少ないことが好ましい。

【０００６】本発明は、フマル酸の製造に好適なマレイ
ン酸異性化酵素をコードするＤＮＡ、及びそれを用いた
フマル酸の製造方法を提供することを課題とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、デレヤ・
ハロフィラ（Deleya halophila）の微生物からマレイン
酸異性化酵素をコードする遺伝子ＤＮＡ断片の単離を目
的として鋭意研究を重ねた結果、同遺伝子ＤＮＡ断片を
単離し、これをベクターに組み込んで組換えベクターと
し、更にこの組換えベクターで微生物を形質転換して、
マレイン酸異性化酵素活性が向上した形質転換体を調製
し、これを使用してフマル酸あるいはフマル酸を原料と
した各種誘導体を効率的に製造することに成功し、本発
明を完成するに至った。

【０００８】かくして本発明によれば、（１）下記の
（Ａ）又は（Ｂ）のいずれかのタンパク質をコードする
ＤＮＡ、（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有する
タンパク質、（Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列にお
いて、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又
は転移を有するアミノ酸配列を有し、かつマレイン酸を
異性化してフマル酸を生成する活性を有するタンパク
質、（２）下記の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである
前記（１）のＤＮＡ、（ａ）配列番号１に示す塩基配列
を有するＤＮＡ、（ｂ）配列番号１に示す塩基配列を有
するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ズし、かつマレイン酸を異性化してフマル酸を生成する
活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（３）前
記（１）又は（２）のＤＮＡがベクターに連結されてな
る組換えベクター、（４）前記（１）又は（２）のＤＮ
Ａが導入されることにより形質転換された形質転換体、
（５）前記（４）の形質転換体を培地で培養し、その培
養物からマレイン酸異性化酵素を採取することを特徴と
するマレイン酸異性化酵素の製造法、及び（６）上記
（４）の形質転換体、またはこの形質転換体の培養物か
ら採取したマレイン酸異性化酵素の粗精製画分もしくは
精製酵素をマレイン酸を含有する水性溶液に加え、マレ
イン酸を異性化してフマル酸を生成せしめることを特徴
とするフマル酸の製造法、が提供される。

【０００９】以下、本発明について詳細に説明する。本
発明の「マレイン酸異性化酵素（maleate cis-trans -i
somerase; EC5.2.1.1)」とは、マレイン酸（シス型）を
異性化してフマル酸（トランス型）を生成する反応を触
媒する酵素を意味する。また、本明細書では、マレイン
酸異性化酵素をコードするＤＮＡを、便宜上「マレイン
酸異性化酵素遺伝子」ということがある。

【００１０】本発明のマレイン酸異性化酵素遺伝子の塩
基配列としては、配列番号２に示すアミノ酸配列中のア
ミノ酸番号１〜アミノ酸番号２５０に示すアミノ酸配列
をコードし得る塩基配列が挙げられる。また、本発明の
ＤＮＡは、この配列に限定されるものではなく、前記ア
ミノ酸配列のうち１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠
失、挿入又は転移を有するアミノ酸配列を有し、かつマ
レイン酸を異性化してフマル酸を生成する活性を有する
タンパク質をコードするＤＮＡ、更にまた、これらのＤ
ＮＡにハイブリダイズし得るマレイン酸異性化酵素をコ
ードするＤＮＡのいずれもが本発明の遺伝子ＤＮＡに包
含されるものである。尚、上記のようなアミノ酸の置
換、欠失、挿入又は転移を有するアミノ酸配列を有する
マレイン酸異性化酵素は、マレイン酸を異性化してフマ
ル酸を生成する活性に対するアスパラギン酸による阻害
が、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するマレイン酸
異性化酵素よりも大きくないこと、言い換えれば、アミ
ノ酸の置換、欠失、挿入又は転移によって前記阻害が増
大しないことが好ましい。

【００１１】本発明のマレイン酸異性化酵素遺伝子の塩
基配列としてより具体的には、配列番号１に示す塩基配
列が挙げられる。

【００１２】本発明のマレイン酸異性化酵素遺伝子は、
デレヤ・ハロフィラからクローニングすることにより、
初めて得られたものであるが、本発明によりその塩基配
列が決定されたので、この配列に基づいて合成すること
も可能である。

【００１３】デレヤ・ハロフィラとしては、デレヤ・ハ
ロフィラ ＭＩ−１１１株が挙げられる。本菌株は、後
記実施例１に示すようにして本発明者らにより単離され
た株であり、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研
究所にＦＥＲＭ Ｐ−１６０１８の受託番号で寄託され
ている。

【００１４】以下に、上記微生物からマレイン酸異性化
酵素遺伝子を取得する方法、該遺伝子産物であるマレイ
ン酸異性化酵素の製造法、及びマレイン酸を異性化しフ
マル酸を生成させる方法の一例を説明する。

【００１５】マレイン酸異性化酵素遺伝子は、通常上記
の供給源微生物の染色体上に存在し、染色体由来のＤＮ
Ａライブラリーから以下に述べるハイブリダイゼーショ
ン法により分離・取得することができる。

【００１６】（１）マレイン酸異性化酵素の精製及びそ
のアミノ酸配列の部分的決定とそれに基づくＤＮＡプロ
ーブの作製：デレヤ・ハロフィラ ＭＩ−１１１株の菌
体からマレイン酸異性化酵素を抽出・精製する方法は、
公知の酵素の精製に関するいずれの方法も使用できる。

【００１７】例えば菌体の破壊法としては、超音波破
砕；フレンチプレス、ホモジナイザーなどを用いた機械
的破壊法；リゾチームなどを用いた酵素的破壊法を用い
ることができる。マレイン酸異性化酵素は、この菌体破
壊物より可溶性画分を分離することにより、粗酵素液と
して得ることができる。

【００１８】得られた粗酵素液からのマレイン酸異性化
酵素の精製法としては、通常、（イ）沈澱法による分
離、例えば硫安沈澱法、（ロ）クロマトグラフィーによ
る分離法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフ
ィニティ吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグ
ラフィー等、（ハ）電気泳動による分離法等を組み合わ
せることによって実施することができ、その一例を実施
例２に詳述する。

【００１９】上記精製過程におけるマレイン酸異性化酵
素画分の検出は、マレイン酸異性化酵素活性を大塚らの
方法［Agric. Biol. Chem., Vol.25, p.726 (1961)］に
従い、ブタ心臓由来フマラーゼ（ベーリンガーマンハイ
ム社製）存在下、マレイン酸異性化酵素活性による基質
マレイン酸の減少を２４０ｎｍの吸光度減少として測定
することにより、行うことができる。

【００２０】精製されたマレイン酸異性化酵素を、Ｄａ
ｖｉｓ法［B. J. Davis, Ann. N. Y. Acad. Sci., Vol.
121, p.404 (1964)］またはＬａｅｍｍｌｉ法［U. K. L
aemmli, Nature, Vol.227, p.680 (1970)］によるポリ
アクリルアミドゲル電気泳動に供し、クマシーブルー色
素液［組成：０．２％（ｗ／ｖ）クマシーブリリアント
ブルーＲ２５０、４０％（ｖ／ｖ）メタノール、１０％
（ｖ／ｖ）酢酸］、あるいは銀染色キット（和光純薬
製）等を用いて酵素タンパク質を染色することにより、
精製純度およびマレイン酸異性化酵素の分子量等を知る
ことができる。

【００２１】精製されたマレイン酸異性化酵素のアミノ
酸配列の部分的決定は、同酵素をこれを構成するサブユ
ニットに分離後、各サブユニットのＮ末端からのアミノ
酸配列、あるいは適当なタンパク質分解酵素により各サ
ブユニットを消化して得られるペプチド断片のＮ末端か
らのアミノ酸配列を、エドマン分解法によるアミノ酸シ
ーケンサー（アプライドバイオシステムズ社製、４７３
Ａ型）を用いて決定することにより、行うことができ
る。

【００２２】次いで、得られたアミノ酸配列から予想さ
れる塩基配列を持ったプローブをＤＮＡ合成装置（例え
ば、アプライドバイオシステムズ社製、３９４型）を用
いて合成する。

【００２３】上記のようにして得られたマレイン酸異性
化酵素の部分アミノ酸配列の一例を、配列番号３に示し
た。また、該アミノ酸配列より推定されるプローブＤＮ
Ａの配列の一例を配列番号４及び５に示した。

【００２４】（２）マレイン酸異性化酵素遺伝子を含む
染色体ＤＮＡ断片の単離：デレヤ・ハロフィラ ＭＩ−
１１１株の菌体から、マレイン酸異性化酵素遺伝子を含
む染色体ＤＮＡを単離する方法は、遺伝子の単離に関す
る公知のいずれの方法もが使用できる。以下にその一例
を説明する。

【００２５】（Ａ）染色体ＤＮＡライブラリーの作製：
上記菌株より染色体ＤＮＡを抽出する際には、適当な培
地で培養した該菌株の菌体を使用することができるが、
培養した菌体を集菌後に凍結保存した保存試料を使用す
ることも可能である。

【００２６】得られた染色体ＤＮＡを適当な制限酵素、
例えばＳａｕ３ＡＩを用いて部分分解し、エシェリヒア
・コリ（Escherichia coli）等の宿主−ベクター系を用
いて染色体ＤＮＡのライブラリーを作製する。具体的に
使用し得るベクターとしては、例えばλＦＩＸＩＩ（東
洋紡績（株）製）等のラムダファージベクター、ｐＵＣ
１１８（宝酒造製）、ｐＢＲ３２２（宝酒造製）、コス
ミドｐＷＥ−１５（Stratagene社製）等のプラスミドベ
クターが挙げられる。

【００２７】上記部分分解により得られる様々なＤＮＡ
断片の上記ベクターへの挿入、例えばファージベクター
λＦＩＸＩＩ（東洋紡績（株）製）への挿入は、適当な
制限酵素、例えばＳａｕ３ＡＩで開裂したベクターと部
分分解ＤＮＡ断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結
することにより行うことができる。かくして染色体ＤＮ
Ａライブラリーが得られる。

【００２８】（Ｂ）マレイン酸異性化酵素遺伝子を含む
ベクターの選別：上記（Ａ）項で調製した染色体ＤＮＡ
ライブラリーからマレイン酸異性化酵素遺伝子を含むベ
クターを選別するには、この染色体ＤＮＡライブラリー
を用いて宿主微生物、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の形質導入あるいは形
質転換を行い、得られる形質導入体あるいは形質転換体
から、適当な手段によりマレイン酸異性化酵素遺伝子を
保持するクローンを選別すればよい。

【００２９】具体的には、上記ファージベクターをエシ
ェリヒア・コリ（Escherichia coli）、例えばＰ２３９
２株［Ausubel et al., Nucleic Acids Res., Vol.7,
p.1513 (1979)］に感染させ、これを寒天培地上に重層
することによりプラークを形成させる。

【００３０】次いでこのプラーク中のファージＤＮＡを
ニトロセルロース膜に移し取り、このファージＤＮＡを
該ニトロセルロース膜に固定し、前記（１）項で作製し
たプローブ、例えば配列番号４及び５に示す塩基配列を
有する合成オリゴヌクレオチドを用いたプラークハイブ
リダイゼーション［Molecular Cloning, Cold SpringHa
rbor Laboratory Press (1989)］を行う。

【００３１】こうして、デレヤ・ハロフィラの染色体Ｄ
ＮＡ由来のマレイン酸異性化酵素遺伝子を有するファー
ジベクターを含む形質導入体を検出し、選別することが
可能である。

【００３２】あるいは上記プラスミドベクターを用いて
染色体ＤＮＡライブラリーを調製した場合には、このラ
イブラリーＤＮＡでエシェリヒア・コリ（Escherichia
coli）ＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換し、得られた
形質転換体から前記（１）で作製したプローブ、例えば
配列番号４及び５に示す塩基配列を有する合成オリゴヌ
クレオチドを用いたコロニーハイブリダイゼーション法
［R. Bruce Wallace,et al., Nucleic Acids Res., Vo
l.9, p.879 (1981)］を行うことによっても選別可能で
ある。

【００３３】更に、上記のようにして選別された形質導
入体あるいは形質転換体よりファージＤＮＡ、あるいは
プラスミドＤＮＡを抽出し、挿入断片を適当な制限酵素
でベクターから切り出すことで本発明のＤＮＡを取得す
ることができる。

【００３４】上記操作によって切り出されたＤＮＡ断片
につき、前記（１）で作製したプローブ、例えば配列番
号４及び５に示す塩基配列を有するプローブを用いてサ
ザンハイブリダイゼーション［E. M. Southern, J. Mo
l. Biol., Vol.98, p.503 (1975)］を行うことにより、
マレイン酸異性化酵素遺伝子が挿入ＤＮＡ断片内に存在
することを再確認できる。

【００３５】このようにして得られるＤＮＡ断片の１つ
として、上記デレヤ・ハロフィラＭＩ−１１１株染色体
ＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩの完全分解により切断して得
られる、大きさが約２ｋｂのＤＮＡ断片を挙げることが
できる。

【００３６】（３）塩基配列の決定：前記（２）項で得
られたＰｓｔＩの２ｋｂのＤＮＡ断片の全塩基配列は、
例えばプラスミドｐＵＣ１１８ベクタ−（宝酒造（株）
製）を用いるダイデオキシヌクレオチド酵素法［dideox
y chain termination法、Sanger et al.,Proc. Natl.Aca
d. Sci. USA, Vol.74, p.5463 (1977)］により決定する
ことができる。

【００３７】このようにして決定された上記約２ｋｂの
ＤＮＡ断片の塩基配列には、オープンリーデイングフレ
ームの存在が確認され、デレヤ・ハロフィラ ＭＩ−１
１１株のマレイン酸異性化酵素遺伝子は、後記配列表の
配列番号２に示すアミノ酸配列中のアミノ酸番号１〜２
５０の２５０個のアミノ酸配列及び終始コドンをコード
する７５３塩基対から構成されることがわかった。ま
た、得られた塩基配列（配列番号１）には、前記（１）
で決定した配列番号３に示すアミノ酸配列から予想され
る塩基配列に相当する配列を含むことが再確認された。

【００３８】上記の塩基配列を包含する本発明のマレイ
ン酸異性化酵素遺伝子は、天然のデレヤ・ハロフィラの
染色体ＤＮＡから分離されたもののみならず、通常用い
られるＤＮＡ合成装置、例えばアプライド・バイオシス
テムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製
３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを用いて合成され
たものであってもよい。

【００３９】本発明のＤＮＡは、上記配列番号２に示す
アミノ酸配列をコードするＤＮＡの他に、配列番号２に
示すアミノ酸配列のうち、マレイン酸を異性化してフマ
ル酸を生成する活性を実質的に害さない限り、さらに好
ましくは前記活性に対するアスパラギン酸による阻害が
増大しない限り、アミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は
転移を有するマレイン酸異性化酵素をコードするＤＮ
Ａ、更にまた、これらのＤＮＡにハイブリダイズし得る
マレイン酸異性化酵素をコードするＤＮＡのいずれもが
包含される。

【００４０】アミノ酸残基の置換、欠失、挿入を有する
マレイン酸異性化酵素をコードするＤＮＡの作製は、突
然変異剤を用いる方法や部位特異的変異法等の通常の変
異操作によって得られる。

【００４１】部位特異的変異の手法には、様々な手法
（R. Higuchi et al. Recombinant PCR in "PCR Protoc
ols: A Guide to Methods and Applications" p.177, A
cademic Press, 1990： Sambrook, Fritsch and Mania
tis, "Molecular Cloning" Chapter 15 Site-directed
Mutagenesis of Cloned DNA, Cold Spring Harbor Labo
ratory Press, 1989 等）があるが、部位特異的に変異
を導入する手法であれば何れの手法を用いてもよい。

【００４２】また、アミノ酸残基の置換、欠失、挿入を
有するマレイン酸異性化酵素をコードするＤＮＡは、野
生型マレイン酸異性化酵素遺伝子又はこれを有する細胞
に変異処理を行って得られるＤＮＡ若しくはデレヤ属微
生物から、配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡ
とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮ
Ａであって、マレイン酸を異性化してフマル酸を生成す
る活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを選択す
ることによっても、得ることができる。ここでいう「ス
トリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブ
リッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成され
ない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困
難であるが、一例を示せば、相同性が高い核酸同士、例
えば、６０％以上、好ましくは８０％以上の相同性を有
するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が
低い核酸同士がハイブリダイズしない条件が挙げられ
る。

【００４３】上記のようにして得られる、特定の部位又
は未知の部位が変異した改変ＤＮＡ断片を、適当な細胞
で発現させ、その発現産物について、大塚らの方法［Ag
ric.Biol.Chem., Vol.25, p.726 (1961)］等にしたがっ
てマレイン酸異性化酵素活性を調べ、この活性を有する
タンパク質をコードするＤＮＡを選択することにより、
目的のＤＮＡを取得することができる。尚、上記のよう
にして得られる変異を有するマレイン酸異性化酵素の活
性に対するアスパラギン酸による阻害が増大していない
ことを確認しておくことが好ましい。

【００４４】（４）マレイン酸異性化酵素遺伝子を有す
る組換えベクター及びこの組換えベクターを保持する形
質転換体の作製：本発明のマレイン酸異性化酵素遺伝子
またはこれを含むＤＮＡ断片は、これらを適当なベクタ
ーに連結して組換えベクターを調製し、この組換えベク
ターで適当な宿主を形質転換することにより、発現させ
ることができる。組換えベクターを調製する際には、通
常、マレイン酸異性化酵素遺伝子を宿主に適したプロモ
ーターとともに、このプロモーターの下流に該遺伝子の
コード領域の５’末端側が連結されるようにして、ベク
ターに挿入する。あるいはプロモーターを含む発現ベク
ターを用い、これにマレイン酸異性化酵素遺伝子を挿入
してもよい。

【００４５】このような発現ベクターを用いた発現方法
の他に、プロモーターを連結したマレイン酸異性化酵素
遺伝子を含むＤＮＡ断片を、宿主の染色体中に直接導入
する相同組換え技術［A. A. Vertes, et al., Biosci.
Biotechnol. Biochem., Vol.57, p.2036 (1993）等］、
あるいはトランスポゾンや挿入配列等を用いて導入する
技術［A. A. Vertes et al., Molecular Microbiol., V
ol.11, p.739 (1994)等］によっても発現させることが
できる。

【００４６】マレイン酸異性化酵素遺伝子を導入する宿
主としては、特に限定されるものではないが、好ましく
は微生物、具体的にはエシェリヒア（Escheichia）属細
菌、バチルス（Bacillus）属細菌、セラチア（Ｓｅｒｒ
ａｔｉａ）属細菌、シュードモナス（Pseudomonas）属
細菌、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属細
菌、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属細菌、ロ
ドコッカス（Rhodococcus）属細菌、ラクトバチルス（L
actobacillus）属細菌、ストレプトマイセス（Streptom
yces）属細菌、サーマス（Thermus）属細菌、ストレプ
トコッカス（Streptococcus）属細菌等を好適に用いる
ことができる。

【００４７】より具体的には、エシェリヒア・コリ（Es
herichia coli）、バチルス・サチリス（Bacillus subt
ilis）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バ
チルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothe
rmophilus）、セラチア・マーセッセンス（Seratia mar
cescens）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonasputi
da）、シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas ae
ruginosa）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Cory
nebacterium glutamicum）、ブレビバクテリウム・フラ
バム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム
・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermen
tum）、ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus e
rythropolis）、サーマス・サーモフィラス（Thermus t
hermophilus）、ストレプトコッカス・ラクティス（Str
eptococcus lactis）、ラクトバチルス・カゼイ（Lacto
bacillus casei）、ストレプトマイセス・リビダンス
（Streptomyces lividans）等を用いることができる。

【００４８】発現ベクターとしては、宿主内で複製増殖
可能であれば特に制限されるものではないが、プラスミ
ドベクター、ファージベクターのいずれかを用いること
ができる。具体的なプラスミドベクターとしては、ｐＢ
Ｒ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＨＳＧ２９８、ｐＵＣ１１
８、ｐＳＴＶ２８、ｐＴＷＶ２２８、ｐＨＹ３００ＰＬ
Ｋ（以上のプラスミドベクターは、例えば宝酒造（株）
から購入できる）、ｐＫＫ２２３−３、ｐＰＬ−Ｌａｍ
ｂｄａ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
Ｖｅｃｔｏｒ（以上は、例えばファルマシア社から購入
できる）、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ、ｐＣＲＹ３
ＫＸ（米国特許第５，１８５，２６２号）、あるいはこ
れらの誘導体等を挙げることができる。

【００４９】また、ファージベクターとしては、（λＦ
ｉｘＩＩベクタ−（Stratagene社から購入できる）等を
挙げることができる。本発明のマレイン酸異性化酵素遺
伝子を発現させるためのプロモーターは、宿主が保有す
るプロモーターを一般に用いることができるが、それに
限られるものではなく、マレイン酸異性化酵素遺伝子の
転写を開始させるための塩基配列であればいかなるプロ
モーターであっても良い。具体的には、宿主がエシェリ
ヒア・コリの場合には、ラクトースオペロンのプロモー
ター、トリプトファンオペロンのプロモーター、λファ
ージ由来のＰＬプロモーター、トリプトファンラクトー
ス雑種（ｔａｃ）プロモーター［H. A. Bose et al., P
roc. Natl. Acad. Sci.U. S. A., Vol.80, p.21 (198
3)］等が挙げられる。また、デレヤ属細菌由来のプロモ
ーターが機能可能な微生物を宿主として用いる場合に
は、得られたマレイン酸異性化酵素遺伝子固有のプロモ
ーターを使用してもよい。さらに、プロモーターの塩基
配列が分かっている場合には、通常用いられるＤＮＡ合
成装置、例えばアプライド・バイオシステムズ（Applie
d Biosystems）社製３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザ
ーを用いて合成されたものであってもよい。

【００５０】これらのプローモーターのうち、発現効率
を向上させる目的で、誘導性のあるプロモーターを使用
することもできる。例えば、上記ラクトースオペロンの
プロモーターの場合には、ラクトースやイソプロピル−
β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加すること
により遺伝子発現を誘導することができる。

【００５１】上記宿主微生物への遺伝子の導入法として
はコンピテントセル法［Journal ofMolecular Biology,
Vol.53, p.159 (1970)］、パルス波通電法［J. Indust.
Microbiol., Vol.5, p.159 (1990)］等による形質転換
法、ファージを用いた形質導入法［E. Ohtsubo, Geneti
cs, Vol.64, p.189 (1970)］、接合伝達法［J. G.C. Ot
tow, Ann. Rev.Microbiol., Vol.29, p.80 (1975)］、
細胞融合法［M. H.Gabor, J. cteriol., Vol.137, p.13
46 (1979)］等を用いることができる。

【００５２】（５）本発明の形質転換体を用いたマレイ
ン酸異性化酵素の製造、及びマレイン酸異性化酵素を用
いたマレイン酸のフマル酸への異性化反応：上記（４）
のようにして得られる形質転換体またはこの形質転換体
の培養物から採取したマレイン酸異性化酵素の粗精製画
分もしくは精製酵素をマレイン酸を含有する水性溶液に
加えることにより、マレイン酸を異性化してフマル酸を
生成せしめることができる。ここで培養物とは、形質転
換体の菌体又は／及び培養後の培地（培養に液体培地を
用いた場合にはその培養上清）をいう。

【００５３】上記形質転換体の培養は、炭素源、窒素
源、無機塩、各種ビタミン等を含む通常の栄養培地で行
うことができ、炭素源としては、例えばブドウ糖、ショ
糖、果糖、麦芽糖等の糖類、エタノール、メタノール等
のアルコール類、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸、マレ
イン酸、フマル酸等の有機酸類、廃糖蜜等が用いられ
る。窒素源としては、例えばアンモニア、硫酸アンモニ
ウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等が
それぞれ単独もしくは混合して用いられる。また、無機
塩としては、例えばリン酸一水素カリウム、リン酸二水
素カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この他
にペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンステイープ
リカー、カザミノ酸、ビオチン等の各種ビタミン等の栄
養素を培地に添加することができる。

【００５４】培養は、通常、通気攪拌、振とう等の好気
条件下で行う。培養温度は、宿主微生物の生育し得る温
度であれば特に制限はなく、また、培養途中のｐＨにつ
いても宿主微生物が生育し得るｐＨであれば特に制限は
ない。培養中のｐＨ調整は、酸またはアルカリを添加し
て行うことができる。

【００５５】かくして得られる培養物から遠心分離等に
より菌体を集めることにより、マレイン酸異性化酵素遺
伝子の発現産物、すなわちマレイン酸異性化酵素を含有
する菌体を取得することができる。

【００５６】本発明のフマル酸の製造法に用いられる形
質転換体としては、該形質転換体を培養した培養液から
分離した菌体はもちろんのこと、培養液、菌体の破砕
物、抽出物、形質転換体より得られる粗酵素標品、精製
した酵素標品を使用してもよい。さらに、上記形質転換
体、その破砕物、抽出物または精製酵素を担体に固定化
したものも使用することができる。

【００５７】形質転換体を担体に固定化する場合には、
培養物から回収されたまま、あるいは適当な緩衝液、例
えば０．０２〜０．２Ｍ程度のリン酸緩衝液（ｐＨ６〜
１０）等で洗浄された菌体を使用することができる。ま
た、培養物から回収された菌体を、超音波、圧搾等の手
段で破砕して得られる破砕物、該破砕物を水等で抽出し
て得られるマレイン酸異性化酵素を含有する抽出物、該
抽出物を更に硫安塩析、カラムクロマトグラフィー等の
処理を行って得られるマレイン酸異性化酵素の部分精製
成分等を担体に固定化したものも、本発明のフマル酸の
製造に使用することができる。

【００５８】これら菌体、菌体破砕物、抽出物または精
製酵素の固定化は、それ自体既知の通常用いられている
方法に従い、アクリルアミドモノマー、アルギン酸、ま
たはカラギーナン等の適当な担体に菌体等を固定化させ
る方法により行うことができる。

【００５９】反応に用いる水性溶液は、マレイン酸を含
有する水溶液または適当な緩衝液、例えば０．０２〜
０．２Ｍ程度のリン酸緩衝液（ｐＨ６〜１０）とするこ
とができる。この水性溶液には、更に菌体の細胞膜の物
質透過性を高める必要のあるときには、トルエン、キシ
レン、非イオン性界面活性剤等を０．０５〜２％（ｗ／
ｖ）添加することもできる。

【００６０】水性溶液中の反応原料となるマレイン酸濃
度は、０．１〜２Ｍ程度が適当である。マレイン酸の形
態は、酸あるいは塩の形態のみならず、その無水物を用
いることもできる。無水マレイン酸は水溶液とすること
により容易にマレイン酸に変換する。マレイン酸の塩と
しては、例えばナトリウム塩、カリウム塩等を挙げるこ
とができる。

【００６１】上記の水性溶液における酵素反応温度およ
びｐＨは特に限定されないが、通常１０〜６０℃、好ま
しくは１５〜５０℃が適当であり、反応液中のｐＨは５
〜１０、好ましくは６〜９付近とすることができる。ま
た、ｐＨの調整は、酸またはアルカリを添加して行うこ
とができる。かくして得られるフマル酸を含有する水性
溶液は、そのままリンゴ酸、アスパラギン酸等の製造原
料として用いることができる。

【００６２】特に、本発明のＤＮＡがコードするマレイ
ン酸異性化酵素は、アスパラギン酸による阻害が少な
く、高濃度のアスパラギン酸存在下においても活性を保
持しているので、マレイン酸を原料とするアスパラギン
酸の酵素的製造に好適に利用され得る。以上に本発明を
説明してきたが、下記の実施例により更に具体的に説明
する。

【００６３】しかしながら、実施例は本発明の具体的な
認識を得る一助とみなすべきものであり、本発明の範囲
を限定するものではない。

【００６４】

【実施例】

〔実施例１〕マレイン酸異性化酵素活性を有する微生物
の分離 （１）マレイン酸資化性微生物の分離 自然界から採取した土壌試料を、培地Ａ［組成：塩化ナ
トリウム １０ｇ、マレイン酸二ナトリウム ５ｇ、Ｋ
Ｈ₂ＰＯ₄ ０．７ｇ、Ｋ₂ＨＰＯ₄ １．４ｇ、ＮＨ₄Ｎ
Ｏ₃ １ｇ、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．２ｇ、ビオチン
０．２ｍｇ、チアミン・塩酸塩 ０．２ｍｇ、ＦｅＳ
Ｏ₄・７Ｈ₂Ｏ ２０ｍｇ、ＭｎＳＯ₄ ２０ｍｇ、蒸留
水 １Ｌ（ｐＨ７．２）］１０ｍｌに投入し、４０℃に
て２日間、好気的に振とう培養する。この培養物１ｍｌ
を、上記培地Ａ１０ｍｌに植え継ぎ、更に２日間培養し
た。この集積培養の操作を２回行った後、寒天２％を含
む上記培地Ａの組成を有する平板培地に塗抹し、４０℃
にて２〜４日培養した。この平板培地上に生育したコロ
ニーを単離した。

【００６５】（２）マレイン酸異性化酵素活性を有する
微生物の選定 上記（１）で単離された微生物を前記培地Ａ５ｍｌを用
い、４０℃にて１日振とう培養し、遠心分離（３，００
０×ｇ、４℃、２０分間）により菌体を回収した。次い
で得られた菌体を、ジチオスレイトール（１ｍＭ）を含
有する０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）１ｍｌに懸濁
し、超音波破砕器（Ｃｏｓｍｏ Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ
ＵＣＤ−２００Ｔ）により、菌体を破砕し（４℃、１５
分間）、破砕物を遠心分離した上清を回収し酵素液とし
た。

【００６６】マレイン酸異性化酵素活性の検出は、上記
で得られた酵素液を、反応液Ａ［組成：マレイン酸ナト
リウム ５０ｍＭ、ジチオスレイトール １ｍＭ、トリ
ス塩酸緩衝液 １００ｍＭ（ｐＨ８）］０．５ｍｌに添
加し、４０℃にて２４時間反応させた。得られた反応液
について、有機酸分析カラム［ＳｅｑｕｅＴａｇ
^TM（０．５×２５ｃｍ、ＭｉｌｌｉＧｅｎ／Ｂｉｏｓｅ
ａｒｃｈ， Ｕ．Ｓ．Ａ．］、ＵＶ検出器（２４０ｎ
ｍ）を用いた高速液体クロマトグラフィー分析（島津社
製、ＬＣ−５Ａ）に供した（移動相：５ｍＭ ＫＨ₂Ｐ
Ｏ₄及び５ｍＭ Ｈ₃ＰＯ₄を含む３５％メタノール溶
液）。上記（１）で分離された微生物の内、マレイン酸
異性化酵素活性を有する微生物は、原料マレイン酸のピ
ークの他にフマル酸のピークが生じている微生物として
選出した。上記分離操作により得られたマレイン酸異性
化酵素活性を有する微生物１株を取得した。この分離菌
株の菌学的性質を示す。

【００６７】１．形態学的性質 形態：桿菌 胞子：形成せず グラム染色性：陰性 運動性：あり 鞭毛：周毛

【００６８】２．生理的性質（＋：陽性、−：陰性） 酸素に対する態度 ：好気性 オキシダーゼ ：＋ カタラーゼ ：＋ ＯＦテスト ：Ｏ 集落の色調 ：特徴的集落色素を生成せず。 Ｎａ⁺要求性 ：＋ 塩類要求性 ：＋ ０％ＮａＣｌ培地での生育：− １％ＮａＣｌ培地での生育：＋ 海水培地での生育 ：＋ ゼラチンの液化 ：− デンプンの分解 ：− エスクリンの加水分解：−（非典型性状） 尿素の分解 ：＋ 硝酸塩の還元 ：＋ 脱窒反応 ：＋ 硫化水素の生成 ：＋ 有機物の資化性 グルコース ：＋ ガラクトース ：＋ マルトース ：＋ D-マンノース ：＋ シュークロース ：＋ マンニトール ：＋ D-トレハロース ：＋ L-アラビノース ：＋ ソルビトール ：＋ アドニトール ：− イノシトール ：− マレイン酸異性化酵素活性 ：＋

【００６９】３．菌体成分の特徴 菌体内ＤＮＡのＧＣ含量（モル％）：６６％ キノン系 ：Ｑ−７

【００７０】以上の菌学的諸性質を、バージェイズ・マ
ニュアル・オブ・デタミネーティブ・バクテリオロジー
（Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, N
inthEdition [J.G.Holt, N.R.Krieg, P.H.A.Sneath, J.
T.Staley and S.T.Williams(1994) Williams & Wilkin
s]）、及び関連の文献［M.J.Valderrama,et al., Int.
J.Syst.Bacteriol., vol.41, p.382 (1991), E.Quesad
a, et al., Int.J.Syst.Bacteriol., vol.34, p.287 (1
984)］に従って調べたところ、デレヤ・ハロフィラ(Del
eya halophila)に属する新規の菌株であることが判明し
た。本発明者らは、本菌をＭＩ−１１１株と命名した。
尚、本菌は生命工学工業技術研究所に受託番号：ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１６０１８として寄託されている。

【００７１】〔実施例２〕デレヤ・ハロフィラ ＭＩ−
１１１株由来のマレイン酸異性化酵素遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片のクローン化 （１）マレイン酸異性化酵素の精製及びアミノ酸配列の
部分的決定とそれに基づくＤＮＡプローブの作製：培地
Ａ［組成：マレイン酸二ナトリウム ５ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄
０．７ｇ、Ｋ₂ＨＰＯ₄ １．４ｇ、ＮＨ₄ＮＯ₃ １
ｇ、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．２ｇ、ビオチン ０．２
ｍｇ、チアミン塩酸塩 ０．２ｍｇ、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂
Ｏ ２０ｍｇ、ＭｎＳＯ₄ ２０ｍｇ、蒸留水 １Ｌ
（ｐＨ７．２に調整）］１００ｍｌを５００ｍｌ容の三
角フラスコに分注し、１２０℃、２０分間滅菌処理した
ものに、デレヤ・ハロフィラ ＭＩ−１１１株を植菌
し、４０℃にて２４時間振とう培養した。

【００７２】次いで、上記と同様の培地１０００ｍｌを
３Ｌ容のジャーファーメンターに入れ、１２０℃、２０
分間滅菌処理したものに、上記培養物３０ｍｌを接種
し、４０℃にて２４時間通気攪拌培養した。培養後の培
養液を遠心分離（３，５００×ｇ、４℃、２０分間）し
菌体を回収した。

【００７３】得られた菌体からのマレイン酸異性化酵素
の抽出は、菌体を０．５ｍＭジチオスレイトールを含む
リン酸緩衝液（２０ｍＭ，ｐＨ７．２）に懸濁し、超音
波破砕器（ブランソン社製）により菌体を破砕すること
により行った。菌体破砕物を遠心分離（１０，０００×
ｇ、４℃、３０分間）し、上清の可溶性画分を粗酵素液
として得た。

【００７４】次に、この粗酵素液を硫安分画（３５〜７
０％）し、上記リン酸緩衝液中に対して４℃で一夜透析
した。次いで、この透析液をＤＥＡＥセファロース（フ
ァルマシア社製）カラムクロマトグラフィー、ゲル濾過
（セファクリルＳ−２００、ファルマシア社製）カラム
クロマトグラフィー、モノＱ（ファルマシア社製）カラ
ムクロマトグラフィーにかけ、マレイン酸異性化酵素の
活性画分を得た。

【００７５】マレイン酸異性化酵素の活性の検出は、大
塚らの方法［Agric.Biol.Chem., Vol.25, p.726 (196
1)］に従い、ブタ心臓由来フマラーゼ（ベーリンガーマ
ンハイム社製）存在下、マレイン酸の減少を２４０ｎｍ
の吸光度変化として測定した。

【００７６】上記マレイン酸異性化酵素の精製画分をポ
リアクリルアミドゲル（４〜２０％グラジエントゲル）
電気泳動［２５ｍＭトリス−１９２ｍＭグリシンからな
る緩衝液（ｐＨ８．４）中にて、４０ｍＡ定電流で１時
間泳動］により分離し、クマシーブルー色素［組成：
０．２％（ｗ／ｖ）クマシーブリリアントブルーＲ２５
０、４０％（ｖ／ｖ）メタノール、１０％（ｖ／ｖ）酢
酸］によって染色したところ、分子量約６０ｋＤａの単
一バンドが検出された。更に同精製画分をドデシル硫酸
ナトリウム（ＳＤＳ）処理液［組成：６２．５ｍＭトリ
ス−塩酸（ｐＨ６．８）、２％ＳＤＳ、１０％グリセロ
ール、５％ ２−メルカプトエタノール、０．００１％
ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）］に溶解し、９５℃
にて３分間熱変性処理後、ポリアクリルアミドゲル（１
０〜２０％グラジエントゲル）電気泳動［２５ｍＭトリ
ス−１９２ｍＭグリシン−０．１％ＳＤＳからなる緩衝
液（ｐＨ８．４）中にて、４０ｍＡ定電流で１時間泳
動］により分離し、上記と同様に染色したところ、分子
量約３０ｋＤａのバンドのみを検出した。これらの結果
より、該マレイン酸異性化酵素の構成は、分子量約３０
ｋＤａのサブユニットから成る分子量約６０ｋＤａの２
量体であることが推定された。

【００７７】この精製異性化酵素のＮ末端からのアミノ
酸配列をアミノ酸シーケンサー（アプライドバイオシス
テムズ社製、４７３Ａ型）を用いて決定し、その結果を
配列番号３に示した。次いで、得られたアミノ酸配列か
ら予想される配列番号４及び５に示した塩基配列を有す
るプローブＤＮＡをＤＮＡ合成装置（アプライドバイオ
システムズ社製、３９４型）を用いて合成した。

【００７８】（２）マレイン酸異性化酵素遺伝子を含む
染色体ＤＮＡ断片の調製：デレヤ・ハロフィラ ＭＩ−
１１１株を前記培地Ａを用いて４０℃で対数増殖期後期
まで振とう培養し、菌体を集めた。

【００７９】得られた菌体を１０ｍｇ／ｍｌの濃度にな
るよう、リゾチームを含む１０ｍＭＮａＣｌ−２０ｍＭ
トリス緩衝液（ｐＨ８．０）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎ
ａ溶液１５ｍｌに懸濁した。次にプロテナーゼＫ（宝酒
造（株）社製）を最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるよ
うに添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル
硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を 最終濃度が０．５％にな
るように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌させた。
この溶菌液に、等量のフェノール／クロロホルム溶液を
添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を
遠心分離（５，０００×ｇ，２０分間，１０〜１２℃）
し、上清画分を分取した。この上清に酢酸ナトリウムを
０．３Ｍとなるよう添加した後、２倍量のエタノールを
ゆっくりと加えた。水層とエタノール層の間に存在する
ＤＮＡをガラス棒でまきとり、７０％エタノールで洗浄
した後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩
衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５
ｍｌを加え、４℃で一晩静置し染色体ＤＮＡ溶液を得
た。

【００８０】次に、染色体ＤＮＡ溶液の９０μｌに制限
酵素ＰｓｔＩ、５０Ｕ（ｕｎｉｔｓ）を加え、３７℃で
１時間反応させ完全分解し、アガロース電気泳動に供し
た。このアガロースゲルよりＤＮＡをナイロン膜上に移
し取り、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造製）及
び［γ−³²Ｐ］ＡＴＰを用いて５’末端リン酸基をラジ
オアイソトープラベル［Anal.Biochem., 158, 307-315
(1986)］した配列番号４及び５に示した合成プローブを
用い、常法［Molecular Cloning,Cold SpringHarbor La
boratory Press(1989)］に従ってサザンハイブリダイゼ
ーションを行った。

【００８１】その結果、上記ナイロン膜上の約２ｋｂの
位置に、上記合成プローブが強くハイブリダイズするＤ
ＮＡ断片の存在を確認した。

【００８２】（３）染色体ＤＮＡのベクターへの挿入：
上記（２）項で得たデレヤ・ハロフィラＭＩ−１１１株
の染色体ＤＮＡ溶液の９０μｌに制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ
５ｕｎｉｔｓを加え、３７℃で１０分間反応させて部
分分解した。この様々な長さの部分分解ＤＮＡと、制限
酵素ＸｈｏＩで切断後、ＤＮＡポリメラーゼクレノウフ
ラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔ）を用い
てＴ（チミジン）、Ｃ（デオキシシトシン）を埋めたフ
ァージベクターλＦＩＸＩＩ（λFIXII/XhoI-partial f
ill-in treated DNA：東洋紡績（株）社製）とを混合
し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジ
チオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２およびＴ４ＤＮＡリガーゼ １ｕｎｉｔの各成分を
添加し（各成分の濃度は最終濃度である）、１６℃で１
０時間反応させて部分分解ＤＮＡとベクターとを連結さ
せ、染色体ＤＮＡのλＤＮＡライブラリーを得た。

【００８３】（４）形質転換体の作製及び目的組換え体
ＤＮＡの選別：上記（３）で作製したλＤＮＡライブラ
リーファージ溶液（２〜５×１０⁴ｐｆｕ；ＳＭ緩衝液
希釈）と、エシェリヒア・コリＰ２３９２の培養液を当
量混合し、３７℃で１５分間保温した。これに５０℃に
て保温しておいた ３〜４ｍｌのλ培地（１％ Ｔｒｙ
ｐｔｏｎ，０．５％Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ，０．
５％ＮａＣｌ，０．２％ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ，０．５
％Ａｇａｒ）を加え、λプレート（１％ Ｔｒｙｐｔｏ
ｎ，０．５％ ＮａＣｌ，０．２％ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂
Ｏ，１％Ａｇａｒ）に均一に塗布し、３７℃で１２〜１
６時間培養した。

【００８４】この培地上にニトロセルロースフィルター
を載せ、培地上に形成されたプラークをフィルターに吸
着させ、順次５分間ずつ以下イ）〜ハ）の試薬に浸した
濾紙上にフィルターをのせて処理した。

【００８５】イ）０．５Ｍ ＮａＯＨ，１．５Ｍ Ｎａ
Ｃｌ ロ）０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１．
５Ｍ ＮａＣｌ，０．００１Ｍ ＥＤＴＡ ハ）２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ；ＮａＣｌ １７５．３
ｇ，クエン酸三ナトリウム二水和物 ８８．２ｇを蒸留
水１Ｌに溶解）

【００８６】上記フィルターを風乾後、８０℃にて２時
間乾熱処理をしてＤＮＡを固定した。前記（１）で作製
した配列番号３及び４に示したプローブを用い、上記で
作製したフィルターにつきプラークハイブリダイゼーシ
ョンを常法［Molecular Cloning, Cold Spring Harbor
Laboratory Press(1989)］に従って行った。この結果、
両方のプローブについてハイブリダイゼーション陽性の
プラークを選択し、そこからファージＤＮＡを抽出し
て、制限酵素ＰｓｔＩで切り出される長さ約２ｋｂの挿
入断片をアガロースゲル電気泳動により確認した。

【００８７】（５）マレイン酸異性化酵素遺伝子のサブ
クローニング：上記（４）で得られた長さが約２ｋｂの
ＤＮＡ（ＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ）断片上に存在するマレイ
ン酸異性化酵素遺伝子の位置をさらに特定するために、
該ＤＮＡ断片を下記のようにプラスミドｐＵＣ１１８
（宝酒造（株）社製）へサブクローニングした。

【００８８】上記ＰｓｔＩで切り出されるＤＮＡ断片
と、クローニングベクターｐＵＣ１１８（宝酒造（株）
製）を、各々制限酵素ＰｓｔＩで切断した後、脱リン酸
化処理したものを混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ
７．６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴ
Ｐ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂およびＴ４ＤＮＡリガーゼ１
ｕｎｉｔの各成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度で
ある）、１６℃で１０時間反応させ、上記ＰｓｔＩ−Ｐ
ｓｔＩ断片とベクターを連結させた。

【００８９】得られた連結反応液を用い、塩化カルシウ
ム法［Journal of Molecular Biology,Vol.53, p.159(1
970)］により エシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造
（株）社製）を形質転換し、アンピシリン ５０μｇ／
ｍｌを含む培地［トリプトン１０ｇ，イーストエキスト
ラクト ５ｇ，ＮａＣｌ ５ｇおよび寒天１６ｇを蒸留
水１Ｌに溶解］に塗抹した。

【００９０】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素ＰｓｔＩにより切断し、ハイブリダイゼー
ション法を用いて挿入断片を調べたところ、プラスミド
ｐＵＣ１１８の長さ３．４ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長
さ約２ｋｂのＤＮＡ断片が確認された。上記で得られた
プラスミドをｐＭＩ−１１１と命名し、該プラスミドで
形質転換されたエシェリヒア・コリＪＭ１０９株（宝酒
造（株）製）をＥＣＭＩ−１１１と命名した。

【００９１】〔実施例３〕塩基配列の決定：実施例２の
（５）項で得られたマレイン酸異性化酵素遺伝子を含む
長さが約２ｋｂのＤＮＡ（ＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ）断片に
ついて、その塩基配列をｐＵＣ１１８（宝酒造（株）社
製）を用いるジデオキシヌクレオチド酵素法（dideoxyc
haintermination法）［Sanger, F. et al.,Proc.Natl.A
cad.Sci.U.S.A.,Vol.74,p.5463,(1977)］により決定し
た。

【００９２】その塩基配列中のオープンリーデイングフ
レームの存在から、マレイン酸異性化酵素遺伝子は、後
記配列表の配列番号１に示す塩基配列を有し、２５０個
のアミノ酸及び終始コドンをコードする７５３塩基対よ
り構成されることが判明した。

【００９３】尚、この塩基配列の中には、実施例２の
（１）項で決定したアミノ酸配列（配列番号３）から予
想される塩基配列の全てに相当する配列が含まれている
ことが確認された。

【００９４】〔実施例４〕マレイン酸異性化酵素の製造
および活性の確認 実施例２で作製したＥＣＭＩ−１１１株を、アンピシリ
ン ５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地［トリプトン１０
ｇ，イーストエキストラクト ５ｇ，ＮａＣｌ５ｇ）に
植菌し、３０℃で１５時間好気的に振とう培養した。得
られた培養物を遠心分離（３，０００×ｇ、４℃、２０
分間）して菌体を回収後、リン酸緩衝液［組成：２０ｍ
Ｍ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）、０．５ｍＭ
ジチオスレイトール］で洗浄した。次いで、洗浄菌体
０．５ｇ（湿重量）を上記リン酸緩衝液２ｍｌに懸濁
し、氷冷下で超音波破砕器（ブランソン社製）にかけ菌
体破砕物を得た。該破砕物を遠心分離（１０，０００×
ｇ，４℃，３０分間）し、上清を粗酵素液として得た。

【００９５】対照として、外来遺伝子を含まないプラス
ミドｐＵＣ１１８について、実施例２（５）と全く同様
にエシェリヒア・コリＪＭ１０９株に形質転換し、該形
質転換体から上記と同様に粗酵素液を調製し、以下の活
性測定に供した。

【００９６】マレイン酸異性化酵素活性の確認は、これ
らの粗酵素液について、前記実施例２の（１）項と同様
に、ブタ心臓由来フマラーゼ（ベーリンガーマンハイム
社製）存在下、マレイン酸の減少を２４０ｎｍの吸光度
変化として測定した［K.Otsuka,Agric.Biol.Chem.,25,7
26(1961)］。その結果、ＥＣＭＩ−１１１から調製され
た粗酵素液についてのみ２４０ｎｍの吸光度が減少し、
マレイン酸異性化酵素活性を検出し得た。

【００９７】〔実施例５〕マレイン酸異性化酵素を含む
形質転換体によるマレイン酸の異性化反応 実施例４と同様に、実施例２で作製したＥＣＭＩ−１１
１株を、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含む上記ＬＢ培
地に植菌し、３０℃で１５時間好気的に振とう培養し
た。得られた培養物を遠心分離（３，０００×ｇ、４
℃、２０分間）して菌体を回収後、０．９％（ｗ／ｖ）
ＮａＣｌで洗浄した。

【００９８】次いで、洗浄菌体０．１ｇ（湿重量）を
０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ １ｍｌに懸濁し、反応液
［組成：マレイン酸ナトリウム ８４ｇ／Ｌ、Ｔｒｉｔ
ｏｎＸ−１００ １ｇ／ｌ］１ｍｌを添加後、４５℃で
１時間振とうして反応させた。反応後の反応液を遠心分
離（３，０００×ｇ、４℃、２０分間）し、得られた上
清液について有機酸カラム（島津製作所製ＳＣＲ−１０
１Ｈカラム）、ＵＶ検出器（２１０ｎｍ）を用いた高速
液体クロマトグラフィー分析（島津社製、ＬＣ−５Ａ）
に供した。その結果、原料マレイン酸のピークの他にフ
マル酸のピークを検出し得た。また、上記反応により、
原料のマレイン酸が減少していることも確認された。

【００９９】以上の結果より、上記形質転換体が含有す
るマレイン酸異性化酵素の作用によりマレイン酸がフマ
ル酸へと異性化されていることが確認された。

【０１００】〔実施例６〕アスパラギン酸によるマレイ
ン酸イソメラーゼ活性の阻害の測定。 （１）マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物の培
養 マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物として、WO
96/19571 記載の大腸菌遺伝子組換え体、エシェリヒア
・コリＥＣＭＩ１３、および、実施例２記載のエシェリ
ヒア・コリＥＣＭＩ−１１１を用いた。エシェリヒア・
コリＥＣＭＩ１３は、アルカリゲネス・フェカリス（Al
caligenes faecalis）IFO13111株のマレイン酸イソメラ
ーゼの遺伝子組換え体である。

【０１０１】実施例４と同様に、エシェリヒア・コリＥ
ＣＭＩ１３、および、エシェリヒア・コリＥＣＭＩ１１
１株を、アンピシリン ５０μｇ／ｍｌを含む上記ＬＢ
培地に植菌し、３０℃で１５時間好気的に振とう培養し
た。得られた培養物を遠心分離（３，０００×ｇ、４
℃、２０分間）して菌体を回収後、０．９％（ｗ／ｖ）
ＮａＣｌで洗浄した。

【０１０２】次いで、洗浄菌体０．１ｇ（湿重量）を
０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ １ｍｌに懸濁し、基本反
応液［組成：マレイン酸ナトリウム ８４ｇ／Ｌ、Trito
n X-100 １ｇ／Ｌ］１ｍｌを添加後、３０℃で１時間振
とうして反応させた。反応後の反応液を遠心分離（３，
０００×ｇ、４℃、２０分間）し、得られた上清液につ
いて有機酸カラム（島津製作所製ＳＣＲ−１０１Ｈカラ
ム）、ＵＶ検出器（２１０ｎｍ）を用いた高速液体クロ
マトグラフィー分析（島津社製、ＬＣ-５Ａ）に供し
た。また、同様にして基本反応液に２０％、３０％、４
０％、６０％のアスパラギン酸を添加したもの（最終濃
度：１０％、１５％、２０％、３０％、ｐＨ：アンモニ
アで９．６に調整）を用いて反応を行い、同様にＨＰＬ
Ｃにて分析した。ＨＰＬＣにより検出されるマレイン酸
の減少よりマレイン酸イソメラーゼの活性を測定した結
果を表１に示す。活性は、各菌株のアスパラギン酸無添
加（０％）時における活性を１００とした相対値で示し
た。

【表１】 表１ ──────────────────────────────────── 菌 株 アスパラギン酸濃度（ｗｔ／ｖｏｌ） ０％ １０％ １５％ ２０％ ３０％ ──────────────────────────────────── ＥＣＭＩ１３ １００ ８０ ７０ ６０ ３０ ＥＣＭＩ−１１１ １００ ９０ ８５ ８０ ６０ ────────────────────────────────────

【０１０３】以上の結果より、デレヤ・ハロフィラＭＩ
−１１１株由来のマレイン酸イソメラーゼは、高濃度の
アスパラギン酸による阻害が軽減されている酵素であ
り、高濃度のアスパラギン酸生産に好適であることが判
った。

【０１０４】

【発明の効果】本発明により、デレヤ・ハロフィラ由来
のマレイン酸異性化酵素をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡ
を有する組換えベクター、及び該組換えベクターを含有
する形質転換体が提供される。本発明のマレイン酸異性
化酵素遺伝子を含有する形質転換体により、通常塩濃度
条件下はもちろんのこと、高塩濃度条件下においても安
定に活性を保持するマレイン酸異性化酵素を著量生産す
ることができ、本菌体あるいは本菌から調製したマレイ
ン酸異性化酵素を利用することにより、マレイン酸から
フマル酸を効率よく製造することができる。

【０１０５】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：７５３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：デレヤ・ハロフィラ 株名：ＭＩ−１１１ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：1..753 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 ATG ACC AAG ACA TAC CGT ATC GGC CAG ATC GTA CCC AGT TCC AAC ATC 48 Met Thr Lys Thr Tyr Arg Ile Gly Gln Ile Val Pro Ser Ser Asn Ile 1 5 10 15 ACC ATG GAG ACG GAA ATC CCC GCC ATG CTG GCT GCG AGG CAG CTG ATT 96 Thr Met Glu Thr Glu Ile Pro Ala Met Leu Ala Ala Arg Gln Leu Ile 20 25 30 CGC CCA GAG CGT TTC ACT TTC CAC TCC AGC CGC ATG CGC ATG AAG ACC 144 Arg Pro Glu Arg Phe Thr Phe His Ser Ser Arg Met Arg Met Lys Thr 35 40 45 GTG AGC AAG GAC GAG CTG GCT GCC ATG GAT GCC GAG TCC GAC CGC TGT 192 Val Ser Lys Asp Glu Leu Ala Ala Met Asp Ala Glu Ser Asp Arg Cys 50 55 60 GCG CTG GAG CTC TCT GAC GCG GCA GTG GAC GTG ATG GGC TAC GCC TGC 240 Ala Leu Glu Leu Ser Asp Ala Ala Val Asp Val Met Gly Tyr Ala Cys 65 70 75 80 CTG GTG GCG ATC ATG TCC ATG GGA CCG GGA TAC CAC CGC GAA TCC CAG 288 Leu Val Ala Ile Met Ser Met Gly Pro Gly Tyr His Arg Glu Ser Gln 85 90 95 CGG CGC CTG CGT AGC CGC ACC GAG GAG AAC GGT TGC GAC ACC CCG GTG 336 Arg Arg Leu Arg Ser Arg Thr Glu Glu Asn Gly Cys Asp Thr Pro Val 100 105 110 GTC ACC AGC GCT GGC GCC CTG GTG GAT GCC CTG GGT GTG ATG AAG GCC 384 Val Thr Ser Ala Gly Ala Leu Val Asp Ala Leu Gly Val Met Lys Ala 115 120 125 AAG CGC GTG GTG GTG GTG GCG CCC TAC ATG AAG CCG CTC ACC GAG ATG 432 Lys Arg Val Val Val Val Ala Pro Tyr Met Lys Pro Leu Thr Glu Met 130 135 140 GTG GTG GAT TAT ATC CGT GAG GAG GGC GTC GAG GTG GTC GAC TAT CGC 480 Val Val Asp Tyr Ile Arg Glu Glu Gly Val Glu Val Val Asp Tyr Arg 145 150 155 160 GCG CTA GAG ATT TCC AAC AAT CTC GAC GTG GCT CGC CAC GAC CCC GCC 528 Ala Leu Glu Ile Ser Asn Asn Leu Asp Val Ala Arg His Asp Pro Ala 165 170 175 AAT CTG CCG GAG ATT GTC GCC GGC CTC GAC TAC AGC GAT GTG GAT GCC 576 Asn Leu Pro Glu Ile Val Ala Gly Leu Asp Tyr Ser Asp Val Asp Ala 180 185 190 ATC GTG CTC TCT GCT TGT GTG CAG ATG CCC TCG CTG GCC GCC GTC TCC 624 Ile Val Leu Ser Ala Cys Val Gln Met Pro Ser Leu Ala Ala Val Ser 195 200 205 AAG GTT GAA GCG ATC ACT GGC AAG CCG GTG GTC ACC GCA GCC ATT GCC 672 Lys Val Glu Ala Ile Thr Gly Lys Pro Val Val Thr Ala Ala Ile Ala 210 215 220 ACC ACC TAC GCC ATG CTC AAG GCC CTC GAT CTC GAA CCG GTG GTG CCG 720 Thr Thr Tyr Ala Met Leu Lys Ala Leu Asp Leu Glu Pro Val Val Pro 225 230 235 240 GGA GCC GGC GCT TTG CTG TCG GGC GCC TAC TGA 753 Gly Ala Gly Ala Leu Leu Ser Gly Ala Tyr 245 250

【０１０６】配列番号：２ 配列の長さ：２５０ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Thr Lys Thr Tyr Arg Ile Gly Gln Ile Val Pro Ser Ser Asn Ile 1 5 10 15 Thr Met Glu Thr Glu Ile Pro Ala Met Leu Ala Ala Arg Gln Leu Ile 20 25 30 Arg Pro Glu Arg Phe Thr Phe His Ser Ser Arg Met Arg Met Lys Thr 35 40 45 Val Ser Lys Asp Glu Leu Ala Ala Met Asp Ala Glu Ser Asp Arg Cys 50 55 60 Ala Leu Glu Leu Ser Asp Ala Ala Val Asp Val Met Gly Tyr Ala Cys 65 70 75 80 Leu Val Ala Ile Met Ser Met Gly Pro Gly Tyr His Arg Glu Ser Gln 85 90 95 Arg Arg Leu Arg Ser Arg Thr Glu Glu Asn Gly Cys Asp Thr Pro Val 100 105 110 Val Thr Ser Ala Gly Ala Leu Val Asp Ala Leu Gly Val Met Lys Ala 115 120 125 Lys Arg Val Val Val Val Ala Pro Tyr Met Lys Pro Leu Thr Glu Met 130 135 140 Val Val Asp Tyr Ile Arg Glu Glu Gly Val Glu Val Val Asp Tyr Arg 145 150 155 160 Ala Leu Glu Ile Ser Asn Asn Leu Asp Val Ala Arg His Asp Pro Ala 165 170 175 Asn Leu Pro Glu Ile Val Ala Gly Leu Asp Tyr Ser Asp Val Asp Ala 180 185 190 Ile Val Leu Ser Ala Cys Val Gln Met Pro Ser Leu Ala Ala Val Ser 195 200 205 Lys Val Glu Ala Ile Thr Gly Lys Pro Val Val Thr Ala Ala Ile Ala 210 215 220 Thr Thr Tyr Ala Met Leu Lys Ala Leu Asp Leu Glu Pro Val Val Pro 225 230 235 240 Gly Ala Gly Ala Leu Leu Ser Gly Ala Tyr 245 250

【０１０７】配列番号：３ 配列の長さ：２４ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Lys Thr Tyr Arg Ile Gly Gln Ile Val Pro Ser Ser Asn Ile 1 5 10 15 Thr Met Glu Thr Glu Ile Pro Ala Met 20 24

【０１０８】配列番号：４ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成オリゴヌクレオチド） 配列の特徴： 特徴を表す記号： 存在位置： 特徴を決定した方法： その他の情報：Ｎはイノシンを表す 配列 ACNAARACNT AYCGNATYGG NCARATYGT 29

【０１０９】配列番号：５ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成オリゴヌクレオチド） 配列 配列の特徴： 特徴を表す記号： 存在位置： 特徴を決定した方法： その他の情報：Ｎはイノシンを表す。 AAYATYACNA TGGARACNGA RATYCCNGCN ATG 33

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/90 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 7/46 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 湯川 英明 茨城県稲敷郡阿見町中央８−３−１三菱化 学株式会社筑波研究所内

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の（Ａ）又は（Ｂ）のいずれかのタ
   ンパク質をコードするＤＮＡ。 （Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク
   質。 （Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若し
   くは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転移を有す
   るアミノ酸配列を有し、かつマレイン酸を異性化してフ
   マル酸を生成する活性を有するタンパク質。
2. 【請求項２】 下記の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡで
   ある請求項１記載のＤＮＡ。 （ａ）配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡ。 （ｂ）配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡとスト
   リンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつマレイ
   ン酸を異性化してフマル酸を生成する活性を有するタン
   パク質をコードするＤＮＡ。
3. 【請求項３】 請求項１又は２記載のＤＮＡがベクター
   に連結されてなる組換えベクター。
4. 【請求項４】 請求項１又は２記載のＤＮＡが導入され
   ることにより形質転換された形質転換体。
5. 【請求項５】 請求項４記載の形質転換体を培地で培養
   し、その培養物からマレイン酸異性化酵素を採取するこ
   とを特徴とするマレイン酸異性化酵素の製造法。
6. 【請求項６】 請求項４記載の形質転換体、またはこの
   形質転換体の培養物から採取したマレイン酸異性化酵素
   の粗精製画分もしくは精製酵素をマレイン酸を含有する
   水性溶液に加え、マレイン酸を異性化してフマル酸を生
   成せしめることを特徴とするフマル酸の製造法。