JPH1042887A - イソテトラセノン系化合物 - Google Patents
イソテトラセノン系化合物Info
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- JPH1042887A JPH1042887A JP8208093A JP20809396A JPH1042887A JP H1042887 A JPH1042887 A JP H1042887A JP 8208093 A JP8208093 A JP 8208093A JP 20809396 A JP20809396 A JP 20809396A JP H1042887 A JPH1042887 A JP H1042887A
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- Japan
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 ＩＣＡＭ−１接着阻害作用を有する新規な生
理活性物質を提供すること。 【構成】 式 【化５】
理活性物質を提供すること。 【構成】 式 【化５】
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は細胞接着阻害作用を有す
る新規な生理活性物質に関する。
る新規な生理活性物質に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、細胞接着分子はその研究が進み、
炎症、アレルギー、動脈硬化、癌転移、自己免疫疾患、
自己抗原の提示等の病態形成の場において極めて重要な
役割を果たすことが明らかにされている。これまで多く
の種類の細胞接着分子が見いだされているが、各々に機
能分担があり、その発現も厳密にコントロールされてい
ることが明らかになってきた。その中で、ＩＣＡＭ−１
は抗原提示細胞や自己免疫標的細胞上及び血管内皮細胞
上に発現し、Ｔ細胞や炎症関連免疫細胞上のＬＦＡ−１
に結合することによりＴ細胞の機能発現や炎症性細胞の
血管外浸潤に深く関与する。
炎症、アレルギー、動脈硬化、癌転移、自己免疫疾患、
自己抗原の提示等の病態形成の場において極めて重要な
役割を果たすことが明らかにされている。これまで多く
の種類の細胞接着分子が見いだされているが、各々に機
能分担があり、その発現も厳密にコントロールされてい
ることが明らかになってきた。その中で、ＩＣＡＭ−１
は抗原提示細胞や自己免疫標的細胞上及び血管内皮細胞
上に発現し、Ｔ細胞や炎症関連免疫細胞上のＬＦＡ−１
に結合することによりＴ細胞の機能発現や炎症性細胞の
血管外浸潤に深く関与する。
【０００３】すでに、種々の動物疾患モデルにおいて、
抗ＩＣＡＭ−１モノクロナール抗体を投与することによ
り、顕著な免疫抑制作用及び抗炎症作用が認められるこ
とが示されており、ＩＣＡＭ−１接着阻害物質が新しい
作用機作を持つ免疫抑制剤、抗炎症剤及び抗アレルギー
剤となりうると考えられる。
抗ＩＣＡＭ−１モノクロナール抗体を投与することによ
り、顕著な免疫抑制作用及び抗炎症作用が認められるこ
とが示されており、ＩＣＡＭ−１接着阻害物質が新しい
作用機作を持つ免疫抑制剤、抗炎症剤及び抗アレルギー
剤となりうると考えられる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】細胞接着分子ＩＣＡＭ
−１はタンパク質であり、これらのモノクロナール抗体
等の高分子化合物の薬剤化は困難である。従って、ＩＣ
ＡＭ−１接着阻害作用を持ちこれら疾患の治療に用いる
ことのできる、新規の構造の低分子化合物が望まれてい
る。本発明の目的は、ＩＣＡＭ−１接着阻害作用を有す
る新規な生理活性物質を提供することにある。
−１はタンパク質であり、これらのモノクロナール抗体
等の高分子化合物の薬剤化は困難である。従って、ＩＣ
ＡＭ−１接着阻害作用を持ちこれら疾患の治療に用いる
ことのできる、新規の構造の低分子化合物が望まれてい
る。本発明の目的は、ＩＣＡＭ−１接着阻害作用を有す
る新規な生理活性物質を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記目的
の達成のために多数の菌株を土壌及び植物より分離し、
その菌株の代謝産物について種々検討した結果、ある種
の菌株がＩＣＡＭ−１接着阻害作用を有する新規な生理
活性物質を生産することを見いだし、本発明を完成する
に至った。
の達成のために多数の菌株を土壌及び植物より分離し、
その菌株の代謝産物について種々検討した結果、ある種
の菌株がＩＣＡＭ−１接着阻害作用を有する新規な生理
活性物質を生産することを見いだし、本発明を完成する
に至った。
【０００６】すなわち、本発明は、式
【０００７】
【化３】
【０００８】で表される化合物（以下、ＡＩ−０９０と
略称する。）、及び式
略称する。）、及び式
【０００９】
【化４】
【００１０】で表される化合物（以下、ＡＩ−０９６と
略称する。）である。
略称する。）である。
【００１１】ＡＩ−０９０及びＡＩ−０９６を生産する
菌株は、本発明者らが自然界から新たに分離した菌株で
あり、微生物の名称「Actinomadura rugatobispora TA-
0291」及び微生物寄託番号「FERM P−15756」として工
業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。
菌株は、本発明者らが自然界から新たに分離した菌株で
あり、微生物の名称「Actinomadura rugatobispora TA-
0291」及び微生物寄託番号「FERM P−15756」として工
業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。
【００１２】この菌株の菌学的性状を以下に示す。 Ａ.形態的特徴 基生菌糸はよく発達し分岐しているが、分断は見られな
い。気菌糸の発達はおおむね貧弱であるが、寒天培地に
よっては良好な着生が見られる。胞子はスターチ・無機
塩寒天培地で良好に形成するが、その他の寒天培地では
胞子の形成は比較的悪い。寒天培地中での胞子形成は認
められない。主軸の気菌糸に側糸が形成され、その側糸
は分岐を持つ。胞子は側糸間上及び側糸末端に生じた短
い胞子柄（０.２〜０.４μｍ程度）の先端に２個連結
（稀に３個）して形成する。胞子の長さは１.５〜２.２
（〜２.４）μｍ、幅が１.０〜１.３μｍ、形は楕円形
〜レモン型、表面はしわ状である。また、胞子嚢や菌核
及び胞子の運動性は認められない。
い。気菌糸の発達はおおむね貧弱であるが、寒天培地に
よっては良好な着生が見られる。胞子はスターチ・無機
塩寒天培地で良好に形成するが、その他の寒天培地では
胞子の形成は比較的悪い。寒天培地中での胞子形成は認
められない。主軸の気菌糸に側糸が形成され、その側糸
は分岐を持つ。胞子は側糸間上及び側糸末端に生じた短
い胞子柄（０.２〜０.４μｍ程度）の先端に２個連結
（稀に３個）して形成する。胞子の長さは１.５〜２.２
（〜２.４）μｍ、幅が１.０〜１.３μｍ、形は楕円形
〜レモン型、表面はしわ状である。また、胞子嚢や菌核
及び胞子の運動性は認められない。
【００１３】Ｂ.各種培地上での培養性状 各種培地上で、２８℃、１４日間培養した場合の肉眼的
観察結果を、次の表１に示した。なお、色の表示は日本
規格協会、ＪＩＳ色名帳（１９８５年）の系統色名を引
用した。
観察結果を、次の表１に示した。なお、色の表示は日本
規格協会、ＪＩＳ色名帳（１９８５年）の系統色名を引
用した。
【００１４】
【表１】
【００１５】Ｃ.生理的性質 生育温度範囲：イースト・麦芽エキス液体培地で１８
〜３９℃の範囲で生育し、最適生育温度は３１〜３６℃
である ゼラチンの液化：陽性 脱脂乳の凝固：陽性 脱脂乳のペプトン化：陽性 メラニン様色素の生産：陰性 でんぷんの加水分解 ：陰性 炭素源の利用性（プリドハム・ゴトリーブ寒天培地上、２８℃、２週間） Ｌ−アラビノース ： ＋ Ｌ−ラムロース ： ＋ Ｄ−キシロース ： − ラフィノース ： − Ｄ−グルコース ： ＋ イノシトール ： − Ｄ−フラクトース ： ＋ Ｄ−マンニトール ： ＋＋ シュクロース ： − Ｄ.化学分類的性質 ジアミノピメリン酸の有無と光学異性型：メソ型のジ
アミノピメリン酸が検出された。ＬＬ型が微量に検出さ
れた。
〜３９℃の範囲で生育し、最適生育温度は３１〜３６℃
である ゼラチンの液化：陽性 脱脂乳の凝固：陽性 脱脂乳のペプトン化：陽性 メラニン様色素の生産：陰性 でんぷんの加水分解 ：陰性 炭素源の利用性（プリドハム・ゴトリーブ寒天培地上、２８℃、２週間） Ｌ−アラビノース ： ＋ Ｌ−ラムロース ： ＋ Ｄ−キシロース ： − ラフィノース ： − Ｄ−グルコース ： ＋ イノシトール ： − Ｄ−フラクトース ： ＋ Ｄ−マンニトール ： ＋＋ シュクロース ： − Ｄ.化学分類的性質 ジアミノピメリン酸の有無と光学異性型：メソ型のジ
アミノピメリン酸が検出された。ＬＬ型が微量に検出さ
れた。
【００１６】細胞壁のアミノ酸組成：アラニンとグル
タミン酸が明瞭に検出された。グリシンはごく微量に検
出された。
タミン酸が明瞭に検出された。グリシンはごく微量に検
出された。
【００１７】全菌体の還元糖の種類：リボース、マジ
ュロース、マンノース、ガラクトース及びグルコースが
検出された。 メナキノン： ＭＫ−９（Ｈ6）が主成分として検出さ
れた。ＭＫ−９（Ｈ0）、 ＭＫ−９（Ｈ2）、ＭＫ−
９（Ｈ4）及びＭＫ−９（Ｈ8）も少量検出された。
ュロース、マンノース、ガラクトース及びグルコースが
検出された。 メナキノン： ＭＫ−９（Ｈ6）が主成分として検出さ
れた。ＭＫ−９（Ｈ0）、 ＭＫ−９（Ｈ2）、ＭＫ−
９（Ｈ4）及びＭＫ−９（Ｈ8）も少量検出された。
【００１８】リン脂質：ジホスファチジルグリセロー
ル、ホスファチジルイノシトールが検出された。未知の
グルコサミン含有リン脂質は検出されなかった。
ル、ホスファチジルイノシトールが検出された。未知の
グルコサミン含有リン脂質は検出されなかった。
【００１９】ＴＡ−０２９１株は、上記したように
１）ジアミノピメリン酸はｍｅｓｏ型が検出され、また
アミノ酸についてはグリシンを含有しない。 ２）還元
糖としてマジュロースを含む。（以上より細胞壁組成は
IIIＢ型） ３）メナキノンはＭＫ−９（Ｈ6）を主成分
とする。 ４）リン脂質はＰＩ型である。これらの結果
から、本菌株は Actinomadura 属の１菌種であることが
明かとなった。更に１）胞子は主軸の気菌糸から生じた
側糸上に形成される。 ２）２個連結した胞子が主に形
成される。 ３）胞子表面はしわ状である。 ４）気菌
糸の色調は灰緑色である。以上の性質から本菌株を Act
inomadura rugatobispora TA-0291 と命名した。
１）ジアミノピメリン酸はｍｅｓｏ型が検出され、また
アミノ酸についてはグリシンを含有しない。 ２）還元
糖としてマジュロースを含む。（以上より細胞壁組成は
IIIＢ型） ３）メナキノンはＭＫ−９（Ｈ6）を主成分
とする。 ４）リン脂質はＰＩ型である。これらの結果
から、本菌株は Actinomadura 属の１菌種であることが
明かとなった。更に１）胞子は主軸の気菌糸から生じた
側糸上に形成される。 ２）２個連結した胞子が主に形
成される。 ３）胞子表面はしわ状である。 ４）気菌
糸の色調は灰緑色である。以上の性質から本菌株を Act
inomadura rugatobispora TA-0291 と命名した。
【００２０】ＡＩ−０９０及び０９６の生産は、大略一
般の発酵生成物を生産する場合に準じ、各種の栄養物質
を含む培地で Actinomadura rugatobispora TA-0291を
好気的条件下で培養することにより行う。
般の発酵生成物を生産する場合に準じ、各種の栄養物質
を含む培地で Actinomadura rugatobispora TA-0291を
好気的条件下で培養することにより行う。
【００２１】培地は主として液体培地を用い、炭素源、
窒素源、無機塩よりなり、必要に応じてビタミン類、先
駆物質、消泡剤を加えることができ、ｐＨは７前後に調
整する。炭素源としては、例えばグルコース、マルトー
ス、デキストリン、グリセリン、澱粉などを単独かまた
は混合して用いる。窒素源としては、例えば酵母エキ
ス、ペプトン、肉エキス、大豆粉、コーン・スティープ
・リカー、尿素、アンモニウム塩などを単独かまたは混
合して用いる。無機塩としては、例えばリン酸一カリウ
ム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウ
ムなどを単独かまたは混合して用いる。消泡剤としては
アデカノール、シリコン化合物などを用いることができ
る。
窒素源、無機塩よりなり、必要に応じてビタミン類、先
駆物質、消泡剤を加えることができ、ｐＨは７前後に調
整する。炭素源としては、例えばグルコース、マルトー
ス、デキストリン、グリセリン、澱粉などを単独かまた
は混合して用いる。窒素源としては、例えば酵母エキ
ス、ペプトン、肉エキス、大豆粉、コーン・スティープ
・リカー、尿素、アンモニウム塩などを単独かまたは混
合して用いる。無機塩としては、例えばリン酸一カリウ
ム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウ
ムなどを単独かまたは混合して用いる。消泡剤としては
アデカノール、シリコン化合物などを用いることができ
る。
【００２２】培養方法としては振盪培養、通気攪拌培養
などの好気的培養が適しており、ｐＨ５〜７、２５〜３
５℃で４〜７日間、望ましくはｐＨ５〜７、２７〜３２
℃で４〜５日間培養する。この培養により生産されたＡ
Ｉ−０９０及び０９６を単離するには、発酵生産物を採
取する一般的な方法に準じて行えばよい。すなわち、培
養終了後、遠心分離または濾過により培養濾液を得、ダ
イヤイオンＨＰ−２０（商品名、三菱化成社製）などの
ポリスチレン樹脂に活性物質を吸着させた後、低級アル
コール、アセトンなどの有機溶媒で溶出させる。溶出液
を減圧濃縮し有機溶媒を除去した後、酢酸エチル、ベン
ゼン、塩化メチレンなどの非水溶性有機溶媒に転溶し、
これを減圧濃縮してシロップ状とする。このシロップを
再度酢酸エチル、ベンゼン、塩化メチレン、アセトン、
メタノールなどの有機溶媒に溶解し、シリカゲルを用い
たカラムクロマトグラフィー、セファデックスＬＨ−２
０などのゲル濾過クロマトグラフィー、逆相分配用シリ
カゲルＯＤＳを充填したカラムクロマトグラフィー及び
高速液体クロマトグラフィーに付すことによりＡＩ−０
９０及び０９６を精製、単離することができる。
などの好気的培養が適しており、ｐＨ５〜７、２５〜３
５℃で４〜７日間、望ましくはｐＨ５〜７、２７〜３２
℃で４〜５日間培養する。この培養により生産されたＡ
Ｉ−０９０及び０９６を単離するには、発酵生産物を採
取する一般的な方法に準じて行えばよい。すなわち、培
養終了後、遠心分離または濾過により培養濾液を得、ダ
イヤイオンＨＰ−２０（商品名、三菱化成社製）などの
ポリスチレン樹脂に活性物質を吸着させた後、低級アル
コール、アセトンなどの有機溶媒で溶出させる。溶出液
を減圧濃縮し有機溶媒を除去した後、酢酸エチル、ベン
ゼン、塩化メチレンなどの非水溶性有機溶媒に転溶し、
これを減圧濃縮してシロップ状とする。このシロップを
再度酢酸エチル、ベンゼン、塩化メチレン、アセトン、
メタノールなどの有機溶媒に溶解し、シリカゲルを用い
たカラムクロマトグラフィー、セファデックスＬＨ−２
０などのゲル濾過クロマトグラフィー、逆相分配用シリ
カゲルＯＤＳを充填したカラムクロマトグラフィー及び
高速液体クロマトグラフィーに付すことによりＡＩ−０
９０及び０９６を精製、単離することができる。
【００２３】以上の精製によって得られた本発明の目的
物質であるＡＩ−０９０及び０９６は、その分子量、紫
外線吸収スペクトル、1Ｈ−ＮＭＲスペクトル、13Ｃ−
ＮＭＲスペクトル等の解析結果より化１、化２のように
その化学構造が決定された。
物質であるＡＩ−０９０及び０９６は、その分子量、紫
外線吸収スペクトル、1Ｈ−ＮＭＲスペクトル、13Ｃ−
ＮＭＲスペクトル等の解析結果より化１、化２のように
その化学構造が決定された。
【００２４】ＡＩ−０９０の理化学的性質は以下の通り
である。 （ａ）外観：黄色粉末 （ｂ）融点：１８６〜１８９℃ （ｃ）分子量： ３３２ （ｄ）分子式：Ｃ20Ｈ12Ｏ5 （ｅ）ＨＲＥＩマススペクトル： 実測値 ３３２.０６８４ 理論値 ３３２.０６８５（Ｃ20Ｈ12Ｏ5として計
算） （ｆ）ＥＩマススペクトル：ｍ／ｚ ３３２ （Ｍ+） （ｇ）比旋光度： ＋１２.４゜（ｃ＝０.１，クロロホ
ルム溶液中で測定） （ｉ）赤外吸収スペクトル：ＫＢｒ法で測定した結果を
図１に示す。
である。 （ａ）外観：黄色粉末 （ｂ）融点：１８６〜１８９℃ （ｃ）分子量： ３３２ （ｄ）分子式：Ｃ20Ｈ12Ｏ5 （ｅ）ＨＲＥＩマススペクトル： 実測値 ３３２.０６８４ 理論値 ３３２.０６８５（Ｃ20Ｈ12Ｏ5として計
算） （ｆ）ＥＩマススペクトル：ｍ／ｚ ３３２ （Ｍ+） （ｇ）比旋光度： ＋１２.４゜（ｃ＝０.１，クロロホ
ルム溶液中で測定） （ｉ）赤外吸収スペクトル：ＫＢｒ法で測定した結果を
図１に示す。
【００２５】（ｊ）1Ｈ−ＮＭＲスペクトル：ＣＤＣｌ3
中、５００ＭＨｚで測定した結果を図２に示す。
中、５００ＭＨｚで測定した結果を図２に示す。
【００２６】（ｋ）13Ｃ−ＮＭＲスペクトル：ＣＤＣｌ
3中、１２５ＭＨｚで測定した結果を図３に示す。
3中、１２５ＭＨｚで測定した結果を図３に示す。
【００２７】（ｌ）溶剤に対する溶解性： クロロホルム、酢酸エチル、アセトン、ジメチルスルホ
キシド、アセトニトリルに可溶 メタノール、エタノールに難溶 ｎ−ヘキサン、水に不溶 （ｍ）呈色反応： 陽性：Ｈ2ＳＯ4、モリブデン酸アンモニウム硫酸、Ｉ2、
アニスアルデヒド、リンモリブデン酸 陰性：ニンヒドリン、塩化第二鉄 （ｎ）塩基性、酸性、中性の区別：中性。 ＡＩ−０９６の理化学的性質は以下の通りである。
キシド、アセトニトリルに可溶 メタノール、エタノールに難溶 ｎ−ヘキサン、水に不溶 （ｍ）呈色反応： 陽性：Ｈ2ＳＯ4、モリブデン酸アンモニウム硫酸、Ｉ2、
アニスアルデヒド、リンモリブデン酸 陰性：ニンヒドリン、塩化第二鉄 （ｎ）塩基性、酸性、中性の区別：中性。 ＡＩ−０９６の理化学的性質は以下の通りである。
【００２８】（ａ）外観：黄色粉末 （ｂ）融点：９９〜１０３℃ （ｃ）分子量： ３５０ （ｄ）分子式：Ｃ20Ｈ14Ｏ6 （ｅ）ＨＲＦＡＢマススペクトル： 実測値 ３５１.０８７９ 理論値 ３５１.０８６９（Ｃ20Ｈ15Ｏ6として計
算） （ｆ）ＦＡＢマススペクトル：ｍ／ｚ ３５１ （Ｍ＋
Ｈ）＋ （ｇ）比旋光度： −５２０．４゜（ｃ＝０.０４，ク
ロロホルム溶液中で測定） （ｉ）赤外吸収スペクトル：ＫＢｒ法で測定した結果を
図４に示す。
算） （ｆ）ＦＡＢマススペクトル：ｍ／ｚ ３５１ （Ｍ＋
Ｈ）＋ （ｇ）比旋光度： −５２０．４゜（ｃ＝０.０４，ク
ロロホルム溶液中で測定） （ｉ）赤外吸収スペクトル：ＫＢｒ法で測定した結果を
図４に示す。
【００２９】（ｊ）1Ｈ−ＮＭＲスペクトル：ＤＭＳＯ
−ｄ6中、５００ＭＨｚで測定した結果を図５に示す。
−ｄ6中、５００ＭＨｚで測定した結果を図５に示す。
【００３０】（ｋ）13Ｃ−ＮＭＲスペクトル：ＤＭＳＯ
−ｄ6中、１２５ＭＨｚで測定した結果を図６に示す。
−ｄ6中、１２５ＭＨｚで測定した結果を図６に示す。
【００３１】（ｌ）溶剤に対する溶解性： クロロホルム、酢酸エチル、アセトン、メタノール、エ
タノール、ジメチルスルホキサイドに可溶 ｎ−ヘキサン 、水に不溶 （ｍ）呈色反応； 陽性：Ｈ2ＳＯ4、モリブデン酸アンモニウム硫酸、Ｉ2、
アニスアルデヒド、リンモリブデン酸 陰性：ニンヒドリン、塩化第二鉄 （ｎ）塩基性、酸性、中性の区別：中性
タノール、ジメチルスルホキサイドに可溶 ｎ−ヘキサン 、水に不溶 （ｍ）呈色反応； 陽性：Ｈ2ＳＯ4、モリブデン酸アンモニウム硫酸、Ｉ2、
アニスアルデヒド、リンモリブデン酸 陰性：ニンヒドリン、塩化第二鉄 （ｎ）塩基性、酸性、中性の区別：中性
【００３２】
【発明の効果】ＩＣＡＭ−１細胞接着阻害活性を有する
本発明の化合物ＡＩ−０９０及び０９６は、免疫抑制
薬、抗炎症薬及び抗リウマチ薬として有用である。
本発明の化合物ＡＩ−０９０及び０９６は、免疫抑制
薬、抗炎症薬及び抗リウマチ薬として有用である。
【００３３】
【実施例】以下、実施例及び試験例を示し、本発明を更
に詳細に説明する。 実施例 可溶性デンプン２.０％、グルコース０.５％、ＮＺケー
ス（和光純薬）０.３％、酵母エキス０.２％、肉エキス
（ミクニ化学産業）０.５％，炭酸カルシウム０.３％を
含むｐＨ７の液体培地１００ｍＬを５００ｍＬの三角フ
ラスコに入れ１２０℃、２気圧で２０分間殺菌した。次
いで、この無菌液体培地にActinomadura rugatobispora
TA-0291株を接種し、２８℃、９６時間回転振盪機（２
００ＲＰＭ）上で培養し、種培養液とした。次に内容量
５０Ｌのジャーファーメンター５基に、オートミール
２.０％、グルコース２.０％、肉エキス０.３％、炭酸
カルシウム０.３％、塩化ナトリウム０.３％、硫酸第二
鉄０.０４％、塩化マンガン０.０４％からなる生産培地
３０Ｌを入れ、ｐＨ７.０に調製して滅菌した後、前記
種培養液６００ｍｌを接種し、２８℃、９６時間通気攪
拌培養（３００ＲＰＭ）を行った。
に詳細に説明する。 実施例 可溶性デンプン２.０％、グルコース０.５％、ＮＺケー
ス（和光純薬）０.３％、酵母エキス０.２％、肉エキス
（ミクニ化学産業）０.５％，炭酸カルシウム０.３％を
含むｐＨ７の液体培地１００ｍＬを５００ｍＬの三角フ
ラスコに入れ１２０℃、２気圧で２０分間殺菌した。次
いで、この無菌液体培地にActinomadura rugatobispora
TA-0291株を接種し、２８℃、９６時間回転振盪機（２
００ＲＰＭ）上で培養し、種培養液とした。次に内容量
５０Ｌのジャーファーメンター５基に、オートミール
２.０％、グルコース２.０％、肉エキス０.３％、炭酸
カルシウム０.３％、塩化ナトリウム０.３％、硫酸第二
鉄０.０４％、塩化マンガン０.０４％からなる生産培地
３０Ｌを入れ、ｐＨ７.０に調製して滅菌した後、前記
種培養液６００ｍｌを接種し、２８℃、９６時間通気攪
拌培養（３００ＲＰＭ）を行った。
【００３４】培養終了後、得られた培養液１５０Ｌを遠
心分離により濾液と菌体に分けた。得られた濾液をダイ
ヤイオンＨＰ−２０（商品名、三菱化成社製）８Ｌに吸
着させた後、１６Ｌの８０％水性アセトンで２回溶出し
た。これらを合わせ減圧下溶媒留去後、得られた水層を
酢酸エチル３Ｌで３回抽出し、酢酸エチル層を合わせ、
無水硫酸ナトリウムで脱水後減圧濃縮し、褐色のシロッ
プ状物質２５.５ｇを得た。
心分離により濾液と菌体に分けた。得られた濾液をダイ
ヤイオンＨＰ−２０（商品名、三菱化成社製）８Ｌに吸
着させた後、１６Ｌの８０％水性アセトンで２回溶出し
た。これらを合わせ減圧下溶媒留去後、得られた水層を
酢酸エチル３Ｌで３回抽出し、酢酸エチル層を合わせ、
無水硫酸ナトリウムで脱水後減圧濃縮し、褐色のシロッ
プ状物質２５.５ｇを得た。
【００３５】この褐色シロップ状物質２５.５ｇを塩化
メチレンに溶解し、塩化メチレンで調製したシリカゲル
［Silica gel 60 （Ｍｅｒｃｋ社製）］の８００ｍＬの
カラムに吸着させた。塩化メチレンで洗浄後、塩化メチ
レン−メタノール（１００：０）、（９９：１）、（９
０：１０）の混合溶媒２Ｌで順次溶出を行った。塩化メ
チレン−メタノール（９９：１）の溶出画分を濃縮乾固
し、黄色物質７８３ｍｇを得た。この黄色物質をメタノ
ールに溶解し、得られた沈殿を濾過により集めて粗精製
物９０ｍｇを得た。この物質を少量の塩化メチレン−ヘ
キサン（３０：２０）に溶解し、同じ溶媒で調製したシ
リカゲル１８０ｍｌのカラムで溶出させ、得られた活性
画分を集め減圧下濃縮することによりＡＩ−０９０の黄
色粉末（７８ｍｇ）を得た。続いて溶出される画分は減
圧濃縮して少量のメタノールに溶解し、メタノールで調
製したセファデックスＬＨ−２０（商品名、ファルマシ
ア社製）を充填した２０ｍｌのカラムを用いて、メタノ
ールを溶媒としてゲル濾過を行い、活性画分を減圧下濃
縮乾固し、黄色物質ＡＩ−０９６（３.８ｍｇ）を得
た。
メチレンに溶解し、塩化メチレンで調製したシリカゲル
［Silica gel 60 （Ｍｅｒｃｋ社製）］の８００ｍＬの
カラムに吸着させた。塩化メチレンで洗浄後、塩化メチ
レン−メタノール（１００：０）、（９９：１）、（９
０：１０）の混合溶媒２Ｌで順次溶出を行った。塩化メ
チレン−メタノール（９９：１）の溶出画分を濃縮乾固
し、黄色物質７８３ｍｇを得た。この黄色物質をメタノ
ールに溶解し、得られた沈殿を濾過により集めて粗精製
物９０ｍｇを得た。この物質を少量の塩化メチレン−ヘ
キサン（３０：２０）に溶解し、同じ溶媒で調製したシ
リカゲル１８０ｍｌのカラムで溶出させ、得られた活性
画分を集め減圧下濃縮することによりＡＩ−０９０の黄
色粉末（７８ｍｇ）を得た。続いて溶出される画分は減
圧濃縮して少量のメタノールに溶解し、メタノールで調
製したセファデックスＬＨ−２０（商品名、ファルマシ
ア社製）を充填した２０ｍｌのカラムを用いて、メタノ
ールを溶媒としてゲル濾過を行い、活性画分を減圧下濃
縮乾固し、黄色物質ＡＩ−０９６（３.８ｍｇ）を得
た。
【００３６】純度の確認は、カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ
ＡＭ−３０２ ＯＤＳ−ＡＭ（４.６φ×１５０ｍ
ｍ）を用い、ＵＶ吸収２１５ｎｍでモニターしながら４
０％ＣＨ3ＣＮ、流速１.０ｍｌ／ｍｉｎで行った。ＡＩ
−０９０はＲＴ１１.１８ｍｉｎ、ＡＩ−０９６はＲＴ
３.８６ｍｉｎであった。
ＡＭ−３０２ ＯＤＳ−ＡＭ（４.６φ×１５０ｍ
ｍ）を用い、ＵＶ吸収２１５ｎｍでモニターしながら４
０％ＣＨ3ＣＮ、流速１.０ｍｌ／ｍｉｎで行った。ＡＩ
−０９０はＲＴ１１.１８ｍｉｎ、ＡＩ−０９６はＲＴ
３.８６ｍｉｎであった。
【００３７】試験例１ ［ＪＹ細胞凝集阻害作用試験］ ＩＣＡＭ−１細胞接着阻害作用は、ＪＹ細胞凝集試験を
用いて評価した。ＪＹ細胞（ヒトＢリンパ腫細胞）にホ
ルボールエステル（ＰＭＡ）を作用させＬＦＡ−１を活
性化させると、細胞はＩＣＡＭ−１，ＬＦＡ−１の接着
により自己凝集を起こす。そこに検体を添加し、凝集を
解除する様子を顕微鏡下に観察することにより、細胞接
着阻害活性を評価した。
用いて評価した。ＪＹ細胞（ヒトＢリンパ腫細胞）にホ
ルボールエステル（ＰＭＡ）を作用させＬＦＡ−１を活
性化させると、細胞はＩＣＡＭ−１，ＬＦＡ−１の接着
により自己凝集を起こす。そこに検体を添加し、凝集を
解除する様子を顕微鏡下に観察することにより、細胞接
着阻害活性を評価した。
【００３８】（検体）実施例で得られた黄色粉末のＡＩ
−０９０及び０９６をＤＭＳＯに溶解し用いた。
−０９０及び０９６をＤＭＳＯに溶解し用いた。
【００３９】（試験細胞）ＪＹ細胞（ヒトＢリンパ腫細
胞） （試験方法）１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ培地（ギ
ブコ社製）にＪＹ細胞を１×１０６細胞／ｍｌの濃度に
調製して懸濁し、９６孔プレート（Ｕ底、スミロン社
製）へ５０ｕｌ／穴づつまく。検体を１０％ＤＭＳＯを
含むリン酸緩衝液（０．２５ＭのＣａＣｌ2を含む）に
溶解し、最終濃度が下記表２に示す各種濃度になるよう
に調製して５ｕｌ／穴を添加し、３７℃、２時間静置培
養した。その後ホルボールエステル（ＰＭＡ、１ｕｇ／
ｍｌリン酸緩衝液溶液）を１０ｕｇ／穴添加し、３７℃
で１.５時間振とう培養した後、ＪＹ細胞の凝集を顕微
鏡下に観察した。
胞） （試験方法）１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ培地（ギ
ブコ社製）にＪＹ細胞を１×１０６細胞／ｍｌの濃度に
調製して懸濁し、９６孔プレート（Ｕ底、スミロン社
製）へ５０ｕｌ／穴づつまく。検体を１０％ＤＭＳＯを
含むリン酸緩衝液（０．２５ＭのＣａＣｌ2を含む）に
溶解し、最終濃度が下記表２に示す各種濃度になるよう
に調製して５ｕｌ／穴を添加し、３７℃、２時間静置培
養した。その後ホルボールエステル（ＰＭＡ、１ｕｇ／
ｍｌリン酸緩衝液溶液）を１０ｕｇ／穴添加し、３７℃
で１.５時間振とう培養した後、ＪＹ細胞の凝集を顕微
鏡下に観察した。
【００４０】観察結果を細胞の凝集形態により４段階に
分類し、全く細胞の凝集が見られないものを３ポイン
ト、２０％程度の細胞の凝集が観察されるものを２ポイ
ント、２０〜５０％の細胞の凝集が見られるものを１ポ
イント、５０％以上の細胞が凝集しているものを０ポイ
ントとする。同じ試験を２度行い、そのスコアの合計点
が４ポイント以上を示した場合、活性有りと判断する。
活性が認められた場合は、トリパンブルー染色を行い細
胞生存率を求めた。なお比較として、ＤＭＳＯのみを加
えた培地（対照）も調製した。コントロールとしてＬＦ
Ａ−１抗体を用いた。
分類し、全く細胞の凝集が見られないものを３ポイン
ト、２０％程度の細胞の凝集が観察されるものを２ポイ
ント、２０〜５０％の細胞の凝集が見られるものを１ポ
イント、５０％以上の細胞が凝集しているものを０ポイ
ントとする。同じ試験を２度行い、そのスコアの合計点
が４ポイント以上を示した場合、活性有りと判断する。
活性が認められた場合は、トリパンブルー染色を行い細
胞生存率を求めた。なお比較として、ＤＭＳＯのみを加
えた培地（対照）も調製した。コントロールとしてＬＦ
Ａ−１抗体を用いた。
【００４１】（結果）結果を表２に示した。
【００４２】
【表２】
【００４３】試験例２ ［混合リンパ球反応（ＭＬＲ）
試験］ Ｔ細胞に対する作用をＭＬＲ試験にて評価した。 （検体）実施例で得られた黄色粉末のＡＩ−０９０をＤ
ＭＳＯに溶解し用いた。 （試験細胞）C57BL/6 マウス脾細胞、C3H/HeN マウス脾
細胞 （試験方法）６週令C57BL/6 雄性マウスから脾細胞を単
離し、９６穴Ｕ底プレートに１穴あたり３×１０5 Cell
s を添加した。また、８週令C3H/HeN 雄性マウスから脾
細胞を単離し、マイトマイシンＣを最終濃度６０ μｇ
／ｍｌ となるよう添加し、３０分インキュベートし
た。このマイトマイシンＣ処理脾細胞を抗原として１穴
あたり３×１０5 Cells を添加した。ここに上記検体を
同時添加して７２時間培養後さらに［3Ｈ］Thymidine
を１穴あたり０.５μＣｉ／ｍｌとなるよう添加して４
時間のパルスラベルを行った。その後、C57BL/6 マウス
脾細胞に取り込まれたＲＩ量を測定し、リンパ球幼若化
の指標とした。リンパ球幼若化抑制率（％）は以下に従
い求めた。
試験］ Ｔ細胞に対する作用をＭＬＲ試験にて評価した。 （検体）実施例で得られた黄色粉末のＡＩ−０９０をＤ
ＭＳＯに溶解し用いた。 （試験細胞）C57BL/6 マウス脾細胞、C3H/HeN マウス脾
細胞 （試験方法）６週令C57BL/6 雄性マウスから脾細胞を単
離し、９６穴Ｕ底プレートに１穴あたり３×１０5 Cell
s を添加した。また、８週令C3H/HeN 雄性マウスから脾
細胞を単離し、マイトマイシンＣを最終濃度６０ μｇ
／ｍｌ となるよう添加し、３０分インキュベートし
た。このマイトマイシンＣ処理脾細胞を抗原として１穴
あたり３×１０5 Cells を添加した。ここに上記検体を
同時添加して７２時間培養後さらに［3Ｈ］Thymidine
を１穴あたり０.５μＣｉ／ｍｌとなるよう添加して４
時間のパルスラベルを行った。その後、C57BL/6 マウス
脾細胞に取り込まれたＲＩ量を測定し、リンパ球幼若化
の指標とした。リンパ球幼若化抑制率（％）は以下に従
い求めた。
【００４４】
【数１】
【００４５】なお、比較として、ＤＭＳＯのみを加えた
培地（対照）も調整した。コントロールとして用いた抗
ＩＣＡＭ−１抗体、抗ＬＦＡ−１抗体は各々３０μｇ／
ｍｌで完全に［3Ｈ］Thymidine の取込を阻害した。 （結果）結果を表３に示した。
培地（対照）も調整した。コントロールとして用いた抗
ＩＣＡＭ−１抗体、抗ＬＦＡ−１抗体は各々３０μｇ／
ｍｌで完全に［3Ｈ］Thymidine の取込を阻害した。 （結果）結果を表３に示した。
【００４６】
【表３】
【図１】ＫＢｒ法で測定したＡＩ−０９０の赤外線吸収
スペクトルを示す。
スペクトルを示す。
【図２】ＣＤＣｌ3 中、５００ＭＨｚで測定したＡＩ−
０９０の 1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
０９０の 1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図３】ＣＤＣｌ3 中、１２５ＭＨｚで測定したＡＩ−
０９０の 13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。
０９０の 13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図４】ＫＢｒ法で測定したＡＩ−０９６の赤外線吸収
スペクトルを示す。
スペクトルを示す。
【図５】ＤＭＳＯ−ｄ6 中、５００ＭＨｚで測定したＡ
Ｉ−０９６の 1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
Ｉ−０９６の 1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図６】ＤＭＳＯ−ｄ6 中、１２５ＭＨｚで測定したＡ
Ｉ−０９６の 13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。
Ｉ−０９６の 13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 31/12 ＡＥＤ Ａ６１Ｋ 31/12 ＡＥＤ Ｃ０７Ｃ 50/36 8114−4Ｈ Ｃ０７Ｃ 50/36 //(Ｃ１２Ｐ 15/00 Ｃ１２Ｒ 1:03） (72)発明者 斉藤 雅子 東京都豊島区高田３丁目24番１号 大正製 薬株式会社内 (72)発明者 山本 晴昭 東京都豊島区高田３丁目24番１号 大正製 薬株式会社内
Claims (2)
- 【請求項１】 式 【化１】 で表される化合物。
- 【請求項２】 式 【化２】 で表される化合物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8208093A JPH1042887A (ja) | 1996-08-07 | 1996-08-07 | イソテトラセノン系化合物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8208093A JPH1042887A (ja) | 1996-08-07 | 1996-08-07 | イソテトラセノン系化合物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1042887A true JPH1042887A (ja) | 1998-02-17 |
Family
ID=16550529
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8208093A Pending JPH1042887A (ja) | 1996-08-07 | 1996-08-07 | イソテトラセノン系化合物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1042887A (ja) |
-
1996
- 1996-08-07 JP JP8208093A patent/JPH1042887A/ja active Pending
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