ES2241030T3

ES2241030T3 - Preparado farmaceutico para el tratamiento de alteraciones de la coagulacion sanguinea.

Info

Publication number: ES2241030T3
Application number: ES97890051T
Authority: ES
Inventors: Peter Dr. Turecek; Hans-Peter Prof. Schwarz; Johann Dr. Eibl
Original assignee: Baxter AG
Current assignee: Baxter AG
Priority date: 1996-03-20
Filing date: 1997-03-18
Publication date: 2005-10-16
Anticipated expiration: 2017-03-18
Also published as: US6039945A; AU2003204479B2; DE59712322D1; AU1645197A; AU2003204479A1; HU9700603D0; DK0796623T3; US5866122A; EP0796623A3; CZ81997A3; HUP9700603A1; EP0796623A2; AU763466B2; SI0796623T1; JPH1045620A; US6224862B1; CA2200394A1; AU7185600A; US6165974A; AU725442B2

Abstract

SE DESCRIBE UN PREPARADO FARMACEUTICO PARA EL TRATAMIENTO DE TRASTORNOS DE LA COAGULACION SANGUINEA, QUE CONTIENEN FACTORES PROTROMBINASA PURIFICADOS, EN PARTICULAR PROTROMBINA PURIFICADA Y EVENTUALMENTE FACTOR XA PURIFICADO COMO PRINCIPIO ACTIVO

Description

Preparado farmacéutico para el tratamiento de alteraciones de la coagulación sanguínea.

La presente invención se refiere a un preparado farmacéutico, en particular para el tratamiento de alteraciones de coagulación sanguínea, que contiene factores de coagulación integrantes de protrombinasas o pro-protrombinasas.

La protrombinasa es un complejo enzima-sustrato que se forma en una superficie fosfolipídica y posibilita la activación de la protrombina. La protrombinasa, de acuerdo con su definición, está constituida por el factor II (protrombina), el factor X activado (factor Xa), el cofactor V o Va, fosfolípidos e iones calcio. Estos factores se encuentran in vivo formando un complejo de transición para la activación de la protrombina y la formación de la trombina.

De igual forma se define una pro-protrombinasa como un complejo de factores modificados o activados, al menos en parte, implicados en la formación de una protrombinasa. En consecuencia, la pro-protrombinasa se ha de entender como un precursor de la protrombinasa y como un complejo en el que uno o más de sus componentes y precursores se encuentran en forma de cimógenos o proformas y debe su formación a la afinidad existente entre sus componentes.

La hemofilia A se debe a una deficiencia hereditaria recesiva de factor VIII ligada al cromosoma X y se manifiesta en forma de alteraciones de coagulación sanguínea graves. Para contener hemorragias agudas, en la mayoría de los casos se utilizan concentrados de proteínas plasmáticas de efecto coagulante, principalmente concentrados de factor VIII. Sin embargo, en el tratamiento clásico de pacientes de hemofilia A con preparados de factor VIII, aproximadamente en un 20% de los casos se forman anticuerpos contra el factor VIII que conducen a una inhibición del efecto de estos preparados administrados. En estos casos se dice que un paciente ha producido un inhibidor funcional contra el factor VIII y que ha desarrollado la llamada hemofilia con desarrollo de inhibidores del factor VIII o hemofilia adquirida.

Actualmente se utilizan diversos métodos para tratar pacientes de hemofilia A en los que aparece formación de inhibidores del factor VIII:

1) Tratamiento con altas dosis de un preparado de factor VIII

De este modo, el anticuerpo dirigido contra el factor VIII se neutraliza in vivo y el factor VIII en exceso puede desarrollar su actividad como cofactor hemostático. Con una administración reiterada durante un período prolongado, el paciente afectado se desensibiliza contra el factor VIII y después, en muchos casos, puede ser sometido a la terapia habitual con concentrado de factor VIII. Este modo de proceder requiere cantidades sumamente grandes de factor VIII y mucho tiempo, y al comienzo del tratamiento puede conllevar efectos secundarios anafilácticos masivos.

2) Tratamiento con preparados de inmunoglobulina que contienen anticuerpos de factor VIII antiidiotípicos aplicado a pacientes que desarrollan inhibidores del factor VIII

Este método terapéutico está siendo actualmente objeto de una investigación intensiva. Hoy en día no existe ninguna posibilidad de evaluar de forma concluyente la eficacia de un tratamiento de este tipo.

3) Inmunoadsorción

Otro método, aunque costoso, para eliminar los inhibidores del factor VIII consiste en la inmunoadsorción bien en lectinas, que aglutinan inmunoglobulinas (proteína A, proteína G) o bien en un factor VIII inmovilizado, al que se une el anticuerpo formado contra el factor VIII. Este método es complicado para el paciente, dado que ha de estar conectado a una máquina de aféresis; al igual que ocurre con los métodos anteriores puede que so se contenga una hemorragia aguda y además es caro.

4) APCC y derivados

La terapia elegida en la actualidad consiste en la administración de concentrados de complejo de protrombina activados (APCC), FEIBA®, AUTOPLEX®, que también se pueden utilizar para contener hemorragias agudas en caso de pacientes que presentan concentraciones de inhibidor elevadas (véase, por ejemplo, DE-PS 31 27 318 (2)).

Basándose en los concentrados de factores de complejo de protrombina activados se propuso un componente que también aparece en, entre otros, estos concentrados, a saber: el factor VIIa activado, como principio terapéutico en pacientes que desarrollan inhibidores del factor VIII por coagulación extrínseca. Un preparado similar, el factor VIIa recombinante, se encuentra actualmente bajo experimentación clínica (Hedner y col., Transfusion Medicine Reviews 7 (2): 78-83 (1993)). Sin embargo, las investigaciones preclínicas, por ejemplo en perros con hemofilia A, han demostrado que el tratamiento con factor VIIa recombinante es ineficaz. De igual forma, la tasa de éxitos en la aplicación en humanos es sólo variable. Otra desventaja del factor VIIa recombinante consiste en que éste, debido a su breve vida media in vivo, con frecuencia ha de ser administrado en grandes dosis diarias para poder controlar hemorragias graves, si es que se puede. En estos casos se intenta administrar el factor VIIa junto con antifibrinolíticos para reforzar su efecto.

En la literatura (por ejemplo DE 44 16 180 A1) también se ha propuesto la utilización terapéutica de una combinación de factor Xa y fosfolípidos para el tratamiento de pacientes de hemofilia A que desarrollan inhibidores. Los experimentos in vivo en perros con deficiencia de factor VIII y con desarrollo de inhibidores muestran que una dosis adecuada de una combinación de este tipo puede contener una hemorragia aguda. Sin embargo, la amplitud terapéutica de tal preparado es relativamente pequeña, ya que la dosis efectiva y la dosis trombogénica, que se puede deducir por ejemplo en el modelo Wessler en conejos, están muy cerca una de otra, debido a que los fosfolípidos en particular representan un elevado riesgo de trombogenia.

El documento DE 44 30 205 A se refiere a una composición que sirve como antídoto para anticoagulantes de la sangre, seleccionándose los anticoagulantes entre el grupo que incluye, entre otros, glucosaminoglucanos, polisacáridos sulfatados, hirudinas, etc., y presentando, en resumen, un concentrado de complejo de protrombinas y como mínimo otro componente promotor de la coagulación sanguínea. Este componente promotor de la coagulación sanguínea e, por ejemplo, factor V, Va, XI, XII, XIII o factor von Willebrand.

Por consiguiente, la presente invención tiene como objetivo evitar las desventajas de los métodos descritos y poner a disposición un principio terapéutico para el tratamiento de alteraciones de coagulación sanguínea, en particular para el tratamiento de hemofilia con desarrollo de inhibidores de factor VIII, que posibilite, entre otras cosas, una utilización sencilla, un efecto rápido eficaz y una vida media prolongada y que permita evitar efectos secundarios trombogénicos.

Este objetivo se resuelve según la invención con un preparado farmacéutico para el tratamiento de alteraciones de la coagulación sanguínea que contiene como mínimo dos factores de coagulación individuales muy puros, seleccionados entre el grupo consistente en los factores II, V, Va, X y Xa, que forman parte de una protrombinasa o pro-protrombinasa, como componentes activos; en particular con un preparado que contiene protrombina purificada y factor Xa purificado como componentes activos, estando activado preferentemente uno de los factores excepto la protrombina. Preferentemente, los componentes están purificados hasta tal punto que se presentan libres de fosfolípidos endógenos, es decir procedentes del material de partida, pero también principalmente libres de vesículas de fosfolípidos.

De este modo se impide la formación prematura de trombina y se asegura la estabilidad del preparado farmacéutico y, por otra parte, se reduce al mínimo el riesgo de efectos secundarios tromboembólicos.

De acuerdo con la invención, por el concepto "protrombinasa parcial" se entiende una mezcla o complejo de como mínimo dos componentes de protrombinasa.

Además de los componentes de protrombinasa o pro-protrombinasa, el preparado preferentemente contiene también otros factores de coagulación sanguínea y de fibrinólisis para lograr un efecto atenuado, en particular un refuerzo, debilitamiento, aceleración o retraso de la hemostasia. En consecuencia, también puede contener activadores o proactivadores de la coagulación sanguínea; entre ellos, factores de coagulación sanguínea intrínsecos o extrínsecos como cimógenos o como factores activados, y también sus agonistas o antagonistas o inhibidores. También se pueden utilizar las combinaciones correspondientes en forma de preparados individuales. Entre éstas se encuentra combinaciones con fibrinógeno, adecuada sobre todo para su administración local.

Sin embargo, de acuerdo con una forma de realización preferente, el preparado farmacéutico consiste esencialmente en "protrombinasa parcial", encontrándose preferentemente los componentes de la protrombinasa o pro-protrombinasa unidos formando un complejo. Este complejo se puede purificar y tratar de forma sencilla, en particular se puede tratar química y/o físicamente para inactivar elementos patógenos moleculares, microbianos o víricos.

Los factores presentes en el preparado farmacéutico según la invención lo están de forma que es posible la activación de al menos un factor o donde al menos un factor ya está activado. Como factores se incluyen, preferentemente, factores humanos. En el preparado farmacéutico según la invención, los factores se eligen de entre el grupo consistente en factores II, V, Va, X y Xa.

Como preparados farmacéutico de una protrombinasa parcial o pro-protrombinasa se ponen a disposición, preferentemente, combinaciones de los factores II y V o Va y también X y V o Va. Especialmente el preparado farmacéutico consiste esencialmente en estas combinaciones. Del mismo modo, una pro-protrombinasa que incluye los factores II y X, en caso dado en combinación con el factor V o Va, también es una forma de realización preferente de la presente invención.

En este contexto se pueden utilizar factores nativos, por ejemplo proteínas obtenidas a partir de plasma o fracciones de plasma o sus equivalentes codificados por ejemplo a partir de ácidos nucleicos recombinantes. No obstante, también son adecuados los derivados correspondientes que incluyen las proteínas o fragmentos modificados, siempre que sean activables o que presenten la actividad correspondiente para modular la generación de trombina.

El preparado según la invención tiene la ventaja de que, a pesar de su alta estabilidad in vitro, también es estable in vivo hasta que su efecto se manifiesta mediante la activación de protrombina y el desarrollo de trombina en la zona de la herida o hemorragia. Mediante su contacto con los componentes celulares de la circulación sanguínea, por ejemplo células sanguíneas o paredes vasculares, en particular con superficies que contienen fosfolípidos, se genera trombina in situ y se promueve la hemostasia. Gracias a la actividad local se evitan los efectos secundarios sistémicos, por ejemplo complicaciones tromboembólicas.

Para influir de forma controlada en la hemostasia, preferentemente se utilizan factores altamente purificados, libres de impurezas, en particular de una actividad de trombina. Para ello son adecuados esencialmente factores purificados mediante procedimientos cromatográficos, por ejemplo cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrófoba, cromatografía de afinidad y/o cromatografía de exclusión molecular. De este modo se pueden lograr, en cada caso, actividades específicas de como mínimo un 50% de la pureza teórica, en particular como mínimo un 70%, preferentemente como mínimo un 90% y la pureza teórica para el factor individual. En consecuencia, también es preferible utilizar factores que estén esencialmente libres de productos desnaturalizados y, por tanto, se encuentren en forma de factores activos purificados, enzimas o cimógenos activables.

También es preferible llevar a cabo un tratamiento para inactivar posibles agentes patógenos infecciosos, por ejemplo un tratamiento con sustancias químicas y/o un tratamiento físico, como tratamiento térmico, irradiación o filtración, en particular una nanofiltración. De acuerdo con una variante preferente, los factores del preparado farmacéutico según la invención están tratados con detergentes, lo que conduce a la inactivación de virus y, por otra parte, posiblemente solubiliza fosfolípidos presentes.

Los preparados de factores de la coagulación sanguínea, por ejemplo de plasma o de fracciones de plasma, o de un cultivo celular, pueden contener fosfolípidos. El tratamiento especial de los factores para la separación de los fosfolípidos presentes de forma natural incluye, por una parte, la solubilización de éstos y, por otra, su separación mediante los procedimientos de purificación mencionados.

Si bien el preparado se puede utilizar en combinación con fosfolípidos exógenos, de acuerdo con otra variante preferente de los preparados según la invención éstos están libres de fosfolípidos añadidos y contienen menos de 0,01 mg de fosfolípidos/U de protrombina, lo que, a causa del posible efecto trombogénico de los fosfolípidos, conduce a una considerable reducción adicional del riesgo de trombogenia. De acuerdo con una forma de realización especialmente preferente, los preparados están libres de fosfolípidos detectables.

De acuerdo con otra forma de realización, el preparado según la invención también contiene iones magnesio. Estos iones compiten con los iones calcio y pueden desplazar dichos iones calcio en la protrombinasa o pro-protrombinasa. De este modo se impide una formación prematura de trombina en la solución de preparado según la invención y, con ello, éste se estabiliza hasta tal punto que permanece estable en solución incluso durante horas.

Se ha comprobado que el preparado farmacéutico se puede poner a disposición incluso en forma de solución para infusión estable, sobre todo cuando es seguro que no contiene ningún ión calcio libre. Para la formación de complejos con los iones calcio también es adecuada la presencia de un formador de quelatos farmacéuticamente aceptable, por ejemplo EDTA, y estructuras afines, como citratos.

El preparado según la invención presenta una eficacia biológica comparable a la de la FEIBA® en modelos animales y puede reducir claramente el tiempo de coagulación de un plasma con inhibidores del factor VIII. Puede normalizar por completo tiempos de hemorragia prolongados y la tendencia a la hemorragia en conejos con inhibidores del factor VIII y de conejos con inhibidores del factor von Willebrand. La toxicidad del preparado según la invención en comparación con la de la FEIBA® se reduce claramente facilitando factores de coagulación sanguínea purificados, por ejemplo protrombina purificada y factor Xa purificado. Por ejemplo, la combinación efectiva de factor Xa y protrombina resulta negativa en el modelo de trombosis Wessler (J. Appl. Phys. 14 (1959), 943-946); es decir, con esta combinación no se puede apreciar ningún efecto trombogénico en el modelo Wessler incluso con dosis mayores que en el caso del complejo de protrombina activado.

En este modelo de trombogenia se narcotizan conejos con pentobarbital, después se descubre la vena yugular, bajo anestesia local adicional, y se le realizan ligaduras sueltas a una distancia de 2 cm. Por último, la sustancia a ensayar se inyecta en la vena de la oreja opuesta a la vena yugular en un plazo de 15 segundos. Veinticinco segundos después se cierran las ligaduras y se espera 10 minutos hasta que se extrae el tramo de vena estrangulado para cortarlo y evaluarlo en una placa petri que contiene un tampón citrato. Los criterios de evaluación modificados según Wessler son: ninguna formación de trombos = 0, algunos trombos pequeños = 0,5 - 1, algunos trombos de tamaño medio y muchos trombos pequeños = 2, muchos trombos de tamaño medio = 3, algunos trombos grandes = 3,5, trombos coherentes
= 4.

Preferentemente, los componentes del preparado farmacéutico según la invención están purificados hasta un grado de pureza tal que, incluso en caso de una dosis de como mínimo 150 U de protrombina/kg, el preparado está libre de efectos secundarios tromboembólicos, expresándose este resultado en el modelo de trombosis Wessler con una calificación de como máximo 3 puntos, preferentemente como máximo 2, en particular menos de 2 puntos. Preferentemente, la protrombina está presente en el preparado combinado según la invención con una actividad específica de como mínimo 5 U/mg de proteína, especialmente como mínimo 6, en particular como mínimo 7, correspondiente a un 50, 60 ó 70% de la pureza teórica. El preparado de factor X o Xa utilizado debería presentar, preferentemente, una actividad específica de como mínimo 100 U/mg de proteína, donde el factor Xa preferentemente aparece en esencia en su forma Xa\beta. El factor V o Va se utiliza como cofactor en una proporción aproximadamente equimolar con respecto al factor de coagulación de la protrombinasa parcial o pro-protrombinasa. La proporción es preferentemente (0,01-2):1 (mol/mol), en especial de (0,5-2):1.

A ser posible, el preparado utilizado debería estar libre de trombina, pudiendo comprobarse esta ausencia de trombina realizando los ensayos adecuados, preferentemente ensayos cromógenos (por ejemplo con el sustrato cromógeno TH-1 de IMMUNO AG.).

Se ha comprobado que cuando el preparado según la invención contiene los factores de coagulación, por ejemplo protrombina y factor Xa, en forma de complejos, el preparado presenta una mayor estabilidad en comparación con otros preparados convencionales, y además el complejo puede someterse a un tratamiento adicional de purificación y/o inactivación viral. En una forma de realización preferente del preparado según la invención, éste incluye adicionalmente antitrombina III en cantidades estabilizadoras, dado el caso junto con heparina, pudiendo demostrarse también en un preparado de este tipo la ausencia de efectos secundarios tromboembólicos según el ensayo Wessler en ausencia o también después del desenmascaramiento de la heparina; es decir, la neutralización y/o separación de la heparina, en el sentido de que no se alcanza el valor de 3 puntos.

El término "complejo de protrombinasa parcial" significa básicamente un complejo que consiste en como mínimo dos factores de coagulación que forman parte de una protrombinasa o pro-protrombinasa. La actividad de un preparado basado en este complejo se puede incrementar a un múltiplo de la misma si están presentes iones calcio, por ejemplo cloruro de calcio. También se ha comprobado que un preparado que contiene este complejo y además iones calcio se puede utilizar para preparar un reactivo con fines diagnósticos. Un reactivo que además presenta actividad de trombina y en caso dado contiene fosfolípidos es adecuado, por ejemplo, para determinar la actividad de cofactor de factor V. Un procedimiento diagnóstico empleando este reactivo con o sin proteína C activada, un inactivador proteolítico del factor V, permite además estimar la magnitud de la inactivación del factor V o una resistencia frente a la proteína C activada condicionada por mutación.

Preferentemente, la protrombina está purificada hasta un grado de pureza tal que, incluso en caso de una dosis de como mínimo 150 U de protrombina/kg, no se producen efectos secundarios tromboembólicos, poseyendo una calificación en el modelo de trombosis Wessler de como máximo 3, preferentemente de como máximo 2, en particular menos de 2 puntos.

El preparado combinado según la invención contiene, preferentemente, menos de 0,1 U de factor VIII:C o factor VIII:Ag/U de protrombina, o menos de 0,1 U de factor IX/U de protrombina, o menos de 0,1 U de factor X/U de protrombina. De este modo se puede impedir con más eficacia la formación no deseada de anticuerpos contra estas proteínas o la reacción con dichos anticuerpos, y reducir el riesgo de efectos secundarios.

La dosificación de los preparados según la invención se determina según la dosificación de los componentes equivalentes en FEIBA®. La actividad Factor Eight Inhibitor Bypassing-Activity (FEIBA) (actividad de derivación de inhibidor del factor VIII) se define como la actividad de un preparado de este tipo que reduce al 50% del valor control el tiempo de coagulación de un plasma con inhibidor del factor VIII en un ensayo de coagulación, tal como se describe en AT 350726. Las ventajas de los preparados según la invención en comparación con la FEIBA consisten en que el paciente recibe una carga menor de proteínas plasmáticas debido a la alta pureza de los componentes. En particular, la ausencia de factor VIII:Ag excluye la posibilidad de efectos secundarios anafilácticos. Por consiguiente, los preparados según la invención se pueden concentrar hasta tal punto que se puede administrar una dosis que corresponda, por ejemplo, a como mínimo 50 U de protrombina/kg de peso corporal, pudiendo administrarse esta dosis incluso en una inyección por primera vez en este tipo de preparados, gracias a la ausencia de efectos secundarios, con lo que se puede evitar la administración prolongada de este tipo de altas dosis necesaria en otros casos.

Normalmente, en los preparados según la invención se administra una dosis de, por ejemplo, 50 a 150 U de protrombina/kg de peso corporal. No obstante, las dosis máximas también pueden ser muy superiores a 150 U/kg de peso corporal (por ejemplo hasta 300 o hasta 500) sin que haya posibilidad de efectos secundarios tromboembólicos.

Por consiguiente, otro objeto de la presente invención consiste en formas de administración de los preparados farmacéuticos según la invención que incluyen una dosis de como mínimo 50 U de protrombina/kg de peso corporal, preferentemente entre 50 y 500 U/kg de peso corporal.

Estas formas de administración pueden consistir en ampollas ya listas para su administración directa, inyecciones o formas de administración similares, directas o indirectas. Entre ellas se encuentran infusores, administración intramuscular o subcutánea, o en un conjunto consistente en los principios activos liofilizados y una solución farmacéuticamente aceptable para reconstituir el liofilizado. Normalmente, la solución farmacéuticamente aceptable o el preparado farmacéutico contiene sales, conservantes, tampones y similares en solución acuosa (véase Remington's Pharmaceutical Sciences, 15ª edición, Easton: Mack Publishing Co., pp. 1405-1412 y 1461-1487 (1975) y The National Formulary XIV, 14ª ed. Washington: American Pharmaceutical Association (1975)). Soluciones no acuosas son, por ejemplo, propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales y ésteres orgánicos inyectables, como oleato de etilo. Los vehículos acuosos son, por ejemplo, agua, dado el caso mezclada con alcohol, soluciones salinas (NaCl), dextrosa Ringer's, etc. Como conservantes se pueden utilizar sustancias antimicrobianas, antioxidantes, agentes quelantes o gases inertes.

Los preparados según la invención también son adecuados para el tratamiento local cuando se eligen formas de administración que desarrollan su efecto en la zona hemorrágica. Éstos pueden ser sólidos o líquidos, preferentemente en forma de polvo, emplasto o compresa para heridas, pomadas, supositorios, cápsulas, en particular cápsulas resistentes a los jugos gástricos, pero también gotas o pulverizadores.

Los factores de la coagulación utilizados pueden ser tanto de origen plasmático como procedentes de proteínas elaborados mediante tecnología de ADN recombinante. En ambos casos es esencial que se encuentren en el preparado farmacéutico en forma purificada, en particular en una forma libre de fosfolípidos endógenos y exógenos.

Preferentemente, los preparados farmacéuticos según la invención se ponen a disposición en forma liofilizada, lo que implica ventajas en lo referente al transporte, almacenamiento y administración bien conocidas. Como solución reconstitutiva se puede utilizar una solución farmacéuticamente aceptable que, en caso dado, contiene ATIII o heparina. Gracias al alto grado de pureza de los componentes del preparado según la invención, éstos se pueden recomponer después de un breve tiempo de solución a temperatura ambiente, preferentemente menos de 5 minutos, en particular menos de 1 minuto, para obtener una solución transparente, por ejemplo, con como mínimo 10 U de protrombina/ml, pudiendo incluso alcanzarse concentraciones hasta 200 U de protrombina/ml de solución. En este contexto, una solución transparente se define mediante un valor máximo de extinción a 600 nm de 0,1 (para una solución de como mínimo un 5% en peso de contenido proteínico, con un espesor de capa de 1 cm), con respecto a la solución pura (solución tampón) como referencia. Como alternativa también se puede definir como transparente una solución con menos de 70 Light Scattering Units (LSU) (unidades de dispersión luminosa), determinado por medición en nefelómetro a 340 nm y con un espesor de capa de 1 cm.

Al contrario que los preparados conocidos hasta el momento para el tratamiento de alteraciones de la coagulación sanguínea, los preparados según la invención son extraordinariamente estables, es decir, se pueden dejar reposar durante un mayor tiempo antes de su administración. Por ejemplo, de acuerdo con la información de producto, la FEIBA® en su estado listo para la administración no se debe dejar reposar más de 1 hora. En cambio, los preparados según la invención en forma de solución lista para su uso no muestran ningún tipo de activación de coagulación o trombogenia durante un período de 3 o más horas a temperatura ambiente, por lo que los preparados según la invención también se pueden poner a disposición en forma de una solución de infusión que también se puede administrar a lo largo de varias horas. Por el mismo motivo, los preparados según la invención también se pueden administrar en forma de solución de infusión durante un período más largo. No obstante, se ha comprobado que en relación con los efectos secundarios tromboembólicos no se produce ninguna diferencia esencial entre una inyección de bolo y una infusión lenta con los preparados según la invención.

De acuerdo con una forma de realización preferente de la presente invención, los preparados farmacéuticos se presentan en dispositivos de administración adecuados, preferentemente como un liofilizado en jeringas, que permiten su reconstitución in situ con una solución farmacéuticamente aceptable. En el preparado combinado es recomendable un dispositivo de administración como el mostrado en la Figura 1, en el que los liofilizados, por ejemplo de protrombina y factor Xa, se guardan por separado y en caso necesario se pueden administrar mediante una jeringa de cámara doble después de su reconstitución in situ.

Los preparados farmacéuticos según la presente invención, en particular cuando se obtienen a partir de proteínas plasmáticas o cultivos celulares, pueden ser sometidos a uno o más tratamientos de inactivación viral o de reducción de la cantidad de virus, por ejemplo tratamientos químicos o físicoquímicos, tratamiento térmico y/o con detergentes según el documento EP 0 159 311, el documento EP 0 519 901 o el documento 0 674 531, o tratamientos físicos, como nanofiltración.

Los preparados según la invención permiten tratar de forma segura y sencilla las alteraciones de la coagulación sanguínea, tratamiento en el que se puede observar un efecto eficaz en muy poco tiempo.

Se ha comprobado que el inicio del efecto eficaz tiene lugar más rápidamente en la administración del complejo de factor II y factor Xa que en el caso de un preparado que contiene exclusivamente factor II.

Por consiguiente, para el tratamiento de una complicación hemorrágica en un paciente con hemofilia que desarrolla inhibidores resulta ventajoso tratar el episodio hemorrágico mediante la administración del complejo de factor II/Xa para cortar rápidamente la hemorragia y, con el fin de evitar hemorragias posteriores, continuando la terapia con dosis de mantenimiento de un preparado que contiene exclusivamente el factor II.

Además, la larga vida media de los preparados según la invención y la ausencia de efectos secundarios trombogénicos, o la falta de aparición de una reacción anafiláctica que conduzca a un reforzamiento de la inhibición, permiten tratar al paciente que presenta alteraciones de la coagulación sanguínea de una forma considerablemente mejor que con los procedimientos conocidos. Gracias a la alta concentración o dosis del preparado según la invención, el paciente puede recibir una cierta cantidad de principio activo, lo que reduce la necesidad de tratamientos frecuentes. En consecuencia, el paciente también puede permanecer sin tratamiento durante un período de varios días y, en caso dado, ser tratado ambulatoriamente administrándose él mismo una inyección, eventualmente subcutánea.

De acuerdo con otro aspecto, la presente invención se refiere a la utilización de factores de protrombinasa purificados, en particular de protrombina purificada y factor Xa purificado, para la producción de un preparado farmacéutico que establece concentraciones de protrombina supranormales en la sangre de un paciente, o para establecer concentraciones de protrombina normales en la sangre en aquellos estados que presentan niveles bajos de protrombina.

Se ha comprobado que, con los preparados según la invención, dichos niveles supranormales de factor II se pueden mantener incluso de forma permanente, es decir, durante períodos más largos, lo que se debe atribuir a que la protrombina como medicamento presenta una vida media muy alta para los factores de la coagulación sanguínea y, por otra parte, también se debe a la ausencia de efectos secundarios de los preparados según la invención, de modo que incluso es posible una administración subcutánea, por ejemplo mediante administración en depósito. Las concentraciones supranormales de protrombina en la sangre que se pueden lograr mediante la administración de protrombina purificada, y en caso dado factor Xa purificado u otros factores de protrombinasa, son de como mínimo un 150%, preferentemente incluso como mínimo un 200%, correspondientes a una actividad de como mínimo 1,5 U de protrombina/ml de sangre, preferentemente como mínimo 2,0 a 10 U/ml.

Por último, la invención también se refiere a la utilización de factores de protrombinasa purificados, en particular de protrombina purificada y factor Xa purificado, en la producción de un preparado farmacéutico para el tratamiento de estados donde se desarrolla una inhibición del factor VIII, la hemofilia A o B y la enfermedad von Willebrand. Se ha comprobado que los preparados según la invención permiten un tratamiento rápido, eficaz y exento de efectos secundarios en modelos animales con todas estas indicaciones.

Los preparados según la invención se ponen a disposición, preferentemente, en forma de solución con un pH fisiológico, que preferentemente no contiene ningún ión calcio libre. No obstante, también se puede utilizar un tampón ácido alejado, por ejemplo, del valor óptimo de actividad de factor Xa, en el intervalo de pH 4,5-6,5, preferentemente 5-6, con lo que se puede retener la activación de protrombina y, con ello, aumentar una vez más la estabilidad del preparado combinado. Se entiende que para producir los preparados según la invención listos para el uso se pueden utilizar todas las soluciones y aditivos farmacéuticos adecuados para los factores II, V, Va, X y Xa.

También se ha comprobado sorprendentemente que con los preparados según la invención también se pueden tratar de forma eficaz hemorragias agudas, aumentos de la tendencia a la hemorragia o un incremento del riesgo de hemorragia en caso de pacientes no hemofílicos. Además de las indicaciones ya mencionadas de las diferentes formas de hemofilia, es decir, hemofilia A y B y también hemofilia con desarrollo de inhibidores, los preparados según la invención también se pueden utilizar en caso de pacientes no hemofílicos. Entre los pacientes no hemofílicos se cuentan también aquellos que presentan alteraciones de la coagulación sanguínea debidas a inhibidores contra factores de la sangre que no son el factor VIII o el factor IX. También se puede tratar a pacientes que presentan una alteración en la formación de trombina debida a un fallo o defecto funcional de uno o más factores de la coagulación extrínseca o intrínseca, o en caso de formación de anticuerpos contra uno o más de estos factores, o por la ausencia del receptor celular para uno o más de estos factores. Después de la administración de un preparado según la invención se produce in vivo, en caso dado, un efecto promotor de la coagulación, lo que posibilita un tratamiento, a saber: una administración profiláctica o terapéutica.

Por consiguiente, de acuerdo con otro aspecto, la presente invención se refiere a la utilización de como mínimo 2 factores de coagulación que forman parte de una protrombinasa o pro-protrombinasa y están libres de fosfolípidos, seleccionándose los factores de la coagulación de entre el grupo consistente en los factores II, V, Va, X y Xa, o a la utilización del preparado según la invención en la producción de un preparado farmacéutico para el tratamiento de hemorragias agudas, aumentos de la tendencia a la hemorragia o un incremento del riesgo de hemorragia en caso de pacientes no hemofílicos.

En particular se pueden tratar estados debidos a una alteración en el comportamiento de agregación de plaquetas o en trombopatías, por ejemplo deficiencias de almacenamiento, o estados condicionados por funciones deficientes o disfunciones de proteínas asociadas a las plaquetas, pero también estados hemorrágicos condicionados por deficiencias plaquetarias (trombocitopenia). Un efecto secundario de una terapia con anticoagulantes consiste en la trombocitopenia inducida por heparina, que también es una indicación para el preparado según la invención.

En consecuencia, de acuerdo con una forma de realización preferente, la presente invención se refiere a la utilización de como mínimo 2 factores de coagulación que forman parte de una protrombinasa o pro-protrombinasa y están libres de fosfolípidos, seleccionándose los factores de coagulación de entre el grupo consistente en los factores II, V, Va, X y Xa, en la producción de un preparado farmacéutico para el tratamiento de hemorragias debidas a una trombocitopenia, en particular para el tratamiento de trombocitopenias inducidas por heparina.

En este contexto resulta ventajoso que el preparado farmacéutico elaborado de acuerdo con la utilización según la invención presente en determinadas circunstancias una actividad hemostática primaria. El preparado farmacéutico producido se puede reforzar combinándolo con proteínas con actividad hemostática primaria. Para ello es adecuada sobre todo una proteína del factor von Willebrand o una fracción del factor von Willebrand con una actividad de unión de colágeno específica.

Otra indicación para el tratamiento de pacientes con alteraciones de la coagulación sanguínea consiste en evitar o tratar las hemorragias que aparecen en relación con la enfermedad de von Willebrand. Esta enfermedad con y sin la prevalencia de inhibidores de factores de la coagulación implica un aumento de la tendencia a la hemorragia o un riesgo de hemorragia, y en muchos casos conduce a hemorragias difícilmente controlables. Las hemorragias de este tipo se pueden detener rápidamente con ayuda del preparado según la invención.

Por consiguiente, de acuerdo con la invención se pone a disposición un sistema para el tratamiento de pacientes con alteraciones de la coagulación sanguínea, que incluye los siguientes componentes:

a): un preparado farmacéutico que contiene como mínimo 2 factores de coagulación que forman parte de una protrombinasa o pro-protrombinasa y están libres de fosfolípidos, seleccionándose los factores de coagulación entre el grupo formado por los factores II, V, Va, X y Xa, y

b): una proteína con actividad hemostática primaria, en particular vWF.

Según las circunstancias, las terapias con inhibidores de la coagulación o anticoagulantes sintéticos, semisintéticos o biológicos, o con inhibidores de la función trombocítica, pueden tener como efectos secundarios hemorragias difícilmente controlables. Estas sustancias actúan directa o indirectamente en el sistema de coagulación y pueden alterar de forma no deseable el proceso de coagulación natural. Por consiguiente existe una necesidad de antagonistas para estas sustancias. En el estado actual de la técnica se conoce la utilización de un complejo de protrombina o un preparado FEIBA® para el tratamiento de hemorragias provocadas por una terapia con anticoagulantes. Véase Irani M. S. y col., The American Journal of Cardiology, vol. 75, 15 de febrero de 1995, p. 422; Fareed J. y col., Haemostasis 1991, vol. 21 (supl. 1) p. 64-72; y Fareed J. y col., Seminars in Thrombosis and Hemostasis 1991, vol. 17, nº 2, p.137.

De acuerdo con otra forma de realización de la presente invención, los factores de coagulación arriba mencionados se utilizan en la producción de un preparado farmacéutico según la invención para el tratamiento de hemorragias en el marco de una terapia con anticoagulantes, en particular para la producción de un preparado farmacéutico como antídoto para un inhibidor de la coagulación o anticoagulante, o para un inhibidor de la función trombocítica. En este contexto es esencial evitar el riesgo de trombosis ligado a la presencia de fosfolípidos. Precisamente los pacientes sometidos a una terapia con anticoagulantes presentan un mayor riesgo de trombosis. Sin embargo, de acuerdo con la invención, se puede prescindir de la utilización de fosfolípidos, con lo que sorprendentemente el efecto antídoto se vuelve aún más específico.

La utilización según la invención se refiere sobre todo a la actividad antagonista de un inhibidor de la coagulación o anticoagulante que inhibe directa o indirectamente el factor Xa o la trombina. De acuerdo con la invención, preferentemente se antagoniza una sustancia seleccionada de entre el grupo consistente en APAP (clorhidrato-pentahidrato de ácido (2S)-2-[4-[[(3S)-1-acetimidil-3-pirrolidinil]oxi]fenil]-3-(7-amidino-2-naftil)propiónico), derivado benzamidina, hirudina, heparina, análogos de heparina, en particular pentasacáricos, complejo AT III-heparina, AT III, antistasina, "Tick-Anticoagulant Peptide" (péptido anticoagulante de garrapata), factores de coagulación inactivos, en particular factores de coagulación inhibidos "active site" (sitio activo), TFPI, ligandos competitivos con receptores de superficie de membrana de trombocitos, en particular anticuerpos contra GP IIb/IIIa y sus análogos producidos genética o sintéticamente, en particular péptidos, y también anticoagulantes orales. Entre los factores de coagulación inactivos se cuentan, principalmente, factores de coagulación sanguínea intrínseca o extrínseca derivados, mutados, fragmentados, inactivados o inhibidos química o físicamente, que pueden interaccionar de forma competitiva con el factor nativo.

La antagonización de un inhibidor de la función trombocítica está indicada sobre todo en el caso de la ticlopidina o el ácido acetilsalicílico.

Las hemorragias agudas son muy críticas sobre todo en el área del cerebro. Por ello existe la necesidad de impedir o tratar las hemorragias intracraneales, por ejemplo la hemorragia intraventricular (IVH). Principalmente los pacientes con una lesión de los vasos sanguíneos o con una alteración de la formación de trombina presentan un mayor riesgo de hemorragias intracraneales. El preparado según la invención también es especialmente adecuado para esta indicación, permitiendo sobre todo un mejor tratamiento de partos prematuros.

En el marco de la utilización según la invención, para cada una de las indicaciones arriba mencionadas se pone a disposición el sistema correspondiente que contiene como uno de sus componentes el preparado farmacéutico según la invención. También puede contener sustancias que refuerzan el efecto hemostático, por ejemplo una proteína con actividad hemostática primaria, en particular vWF. Evidentemente, un sistema para la terapia con anticoagulantes contiene además el anticoagulante correspondiente y el preparado farmacéutico según la invención como antídoto.

La invención se explica más detalladamente mediante los siguientes ejemplos y los dibujos correspondientes, sin estar por ello limitada a los mismos.

Descripción de los dibujos

Figura 1 y Figura 2: muestran posibles formas de administración de los preparados según la invención;

Figura 3: muestra el diagrama de flujo de una forma de realización del procedimiento de producción;

Figura 4: muestra la determinación del complejo de protrombinasa parcial;

Figura 5: muestra el análisis espectroscópico de un ejemplo de los preparados según la invención (A) en comparación con preparados patrón [complejo de protrombina activado (B), complejo de protrombina (C)];

Figura 6: muestra el efecto in vivo de un preparado de factor II en conejos con desarrollo de inhibidores del factor VIII;

Figura 7 y Figura 8: muestran el efecto in vivo de los preparados según la invención en el modelo factor von Willebrand/inhibidor del factor VIII.

Ejemplo 1 Producción de factor X y factor II a partir de una fracción de plasma inactivada en cuanto a virus mediante cromatografía de intercambio iónico

Se elaboró un preparado de factores de complejo de protrombina liofilizado que contenía los factores II, IX, X y proteína C y proteína S de acuerdo con el método de Brummelhuis, H.G.J., Preparation of the Prothrombincomplex. En: Methods of Plasma Protein Fractionation, Curling, J. M. ed., 117-128, Academic Press, New York, (1980), y se sometió a tratamiento térmico para la inactivación viral de acuerdo con el documento EP 159 311. El liofilizado (1.000 U de factor X/g, 1.200 U de factor II/g) se disolvió en agua destilada, de modo que contenía 50.000 U de factor X/l, y se ajustó a un pH 7,0. Después de añadir un 12% v/v de TWEEN 80, la mezcla se agitó durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación se diluyó 1:5 con un tampón tris-HCl 20 mM, pH 7,0, y la fracción de proteína de complejo de protrombina se adsorbió en fosfato de calcio [Ca_{3}(PO_{4})_{2}] en una concentración de 30 g Ca_{3}(PO_{4})_{2} por l de solución de complejo de protrombina mediante una hora de agitación a temperatura ambiente. A continuación, la fase sólida se separó por centrifugación, 20 minutos a 5.000 r.p.m., y el precipitado se lavó dos veces con tampón tris-HCl 20 mM, pH 7,0, que contenía un 10% de sulfato de amonio, mediante resuspensión y nueva centrifugación. Luego se llevó a cabo de igual manera un tercer lavado con tampón tris-HCl 20 mM, pH 7,0, que contenía NaCl 150 mM. La elución de la fracción de complejo de protrombina se realizó con una solución de fosfato de sodio 1 M, pH 7,0. Veinticinco ml de esta solución por g de fosfato de calcio se agitaron durante 1 hora a temperatura ambiente y a continuación el precipitado residual se separó por centrifugación tal como se describe más arriba. Acto seguido, el sobrenadante se precipitó con una disolución de sulfato de amonio, 366 g de sulfato de amonio por l, durante 15 horas a 4ºC con agitación. El precipitado, que contenía la fracción de complejo de protrombina, se separó por centrifugación tal como se describe más arriba. El precipitado se recogió en un tampón de citrato trisódico dihidratado 25 mM, que contenía NaCl 100 mM, clorhidrato de benzamidina 1 mM, pH 6,0, y se retamponó en una columna rellena de Sephadex® G-25, a 4ºC con un flujo lineal de 1 cm/min contra tampón de citrato trisódico dihidratado 25 mM, que contenía NaCl 100 mM, clorhidrato de benzamidina 1 mM, pH 6,0, para separar el sulfato de amonio. En este proceso se midió la absorción UV a 280 nm y la conductividad eléctrica en la corriente del eluato. Las fracciones que contenían proteína se reunieron y a continuación se sometieron a una cromatografía de intercambio iónico a través de DEAE-Sepharose FF®, firma Pharmacia. Las fracciones se colocaron en una columna (diámetro interior:altura de lecho de gel = 1:1,3) con un volumen de gel de 8,2 l, 0,55 g proteína/l de gel, con un flujo lineal de 0,36 cm/min. La cromatografía tuvo lugar a 22ºC. Antes de colocar las proteínas, la columna había sido equilibrada con un tampón de citrato trisódico dihidratado 25 mM, que contenía NaCl 100 mM, clorhidrato de benzamidina 1 mM, pH 6,0. La elución de las fracciones de proteína se llevó a cabo en varias etapas con un tampón 1 (citrato trisódico dihidratado 25 mM, clorhidrato de benzamidina 1 mM, NaCl 245 mM, pH 6,0), un tampón 2 (citrato trisódico dihidratado 25 mM, clorhidrato de benzamidina 1 mM, NaCl 270 mM, pH 6,0) y un tampón 3 (citrato trisódico dihidratado 25 mM, clorhidrato de benzamidina 1 mM, NaCl 400 mM, pH 6,0). La elución con el tampón 1 se llevó a cabo con 2,4 volúmenes de columna, separándose en el proceso la proteína inerte. La elución con el tampón 2 se llevó a cabo con 5,6 volúmenes de columna. En este caso se recogieron fracciones en las que se analizó el contenido de factor II, factor X, proteína C y factor IX. Las fracciones que contenían el factor X y estaban libres de factor II, IX y proteína C se reunieron. Mediante la elución con el tampón 3 (1,9 volúmenes de columna) se desorbió factor II, y de nuevo se recogieron fracciones en las que se analizó el contenido de factor X, factor IX y factor II. Las fracciones que contenían el factor II se reunieron. Tanto el agrupamiento que contenía el factor II como el agrupamiento que contenía el factor X pudieron someterse, en caso dado, a un tratamiento adicional para la inactivación de impurezas patógenas mediante adición de KSCN 1M e incubación a 22ºC durante
varias horas.

Ejemplo 2 Purificación de factor II mediante cromatografía de interacción hidrófoba (producto intermedio)

El agrupamiento de factor II obtenido en el Ejemplo 1 se ajustó a NaCl 1,8 M mediante la adición de cloruro de sodio y el valor pH se corrigió a 7,0. A continuación, esta solución se adsorbió mediante interacción hidrófoba en un gel, Phenylsepharose High Performance®, firma Pharmacia, uniéndose 3 g de proteína/l de gel. La fracción de proteína se adsorbió en una columna con una relación diámetro interior:altura de lecho de gel = 1:1,9, con un flujo lineal de 0,25 cm/min, y a continuación se liberó de proteína inerte mediante lavado con un tampón (tris-HCl 25 mM, NaCl 3 M, pH 7,4). El factor II de la columna se eluyó mediante elución por gradiente con 11,5 volúmenes de columna de NaCl 3 M - 0,9 M con recogida simultánea de fracciones. Se reunieron las fracciones que presentaban actividad de factor II pero que estaban libres de factor X y factor IX. A continuación, las fracciones de factor II reunidas se concentraron a una décima parte mediante ultrafiltración/diafiltración a través de una membrana de ultrafiltración con un "cut-off" de 30 kD y se retamponaron contra un tampón que contenía 4 g de citrato trisódico dihidratado/1,8 g de NaCl/l, pH 7,0. El preparado de factor II producido de este modo presentaba una actividad específica de 6,9 U/mg de proteína. La actividad de factor II se determinó con un método de una única etapa, basado en el tiempo de tromboplastina, utilizando un plasma deficiente en factor II contra el patrón de factor II internacional con la combinación de reactivos IMMUNO, Viena. Otros factores de la coagulación sólo eran detectables en trazas o no eran detectables en absoluto en los análisis de coagulación (factor VII < 0,00002 U/U de factor II, factor IX 0,0002 U/U de factor II, factor X 0,004 U/U de factor II, proteína C 0,003 U/U de factor II y factor VIII < 0,0002 U/U de factor II).

Ejemplo 3 Purificación de factor II mediante cromatografía de interacción hidrófoba y cromatografía con hidroxilapatita (producto intermedio)

Como procedimiento alternativo de producción de un factor II altamente purificado también se utilizó un procedimiento en el que, a partir de un preparado de factores de complejo de protrombina liofilizado (véase el Ejemplo 1), primero se separó el factor IX mediante cromatografía hidrófoba, a continuación se aisló el factor II y luego éste se sometió a alta purificación mediante cromatografía en hidroxilapatita.

El preparado de factores de complejo de protrombina se disolvió como en el Ejemplo 1 y se incubó con detergentes durante 1 h a temperatura ambiente. A continuación se aisló una fracción que contenía los factores II, IX y X mediante cromatografía de intercambio iónico en DEAE-Sepharose FF®, firma Pharmacia, como en el Ejemplo 1. A continuación se separó de ésta la fracción que contenía el factor IX mediante interacción con Butyl-Toyopearl®, firma Toso Haas. Acto seguido, el sobrenadante de adsorción se purificó en Phenyl-Sepharose High Performance®, firma Pharmacia, mediante otra cromatografía de interacción hidrófoba, con lo que se pudieron adsorber aproximadamente 4 g de proteína/l de gel. La fracción de proteína se adsorbió en una columna con una relación diámetro interior:altura de lecho de gel = 1:1,9, con un flujo lineal de 0,25 cm/min, y a continuación se separó la proteína inerte mediante lavado con tris-HCl 20 mM, NaCl 3 M, pH 7,4, y finalmente se aisló la fracción que contenía el factor II mediante elución, que al disminuir la conductividad se desorbió del gel a NaCl 1,9 M. A continuación, la fracción que contenía el factor II se adsorbió directamente en Ceramik-Hydroxylapatit®, firma Biorad. Esto se realizó en una columna con una relación diámetro interior:altura de lecho de gel = 1:4,8. La elución se llevó a cabo con un flujo lineal de 3 cm/min. El factor II se desorbió de la columna mediante elución con un gradiente salino. Las fracciones que contenían el factor II se reunieron y se concentraron mediante ultrafiltración/diafiltración a través de membranas de polisulfona con un "cut-off" de 30 kD, hasta que la concentración de factor II alcanzó un valor de 50 - 100 U/ml. El preparado de factor II así producido presentaba una actividad específica de como mínimo 7 U/mg de proteína. Otros factores de coagulación, en particular el factor IX y el factor VIII, ya sólo eran detectables en trazas o no eran detectables en absoluto, como en el preparado del Ejemplo 2. Mediante la elección de un tampón de diafiltración adecuado, el preparado de factor II se transformó con un tampón farmacéuticamente compatible (por ejemplo 4 g de citrato trisódico dihidratado/1,8 g de NaCl/l, pH 7,0).

Ejemplo 4 Obtención de factor Xa (producto intermedio)

La fracción de factor X producida como se describe en el Ejemplo 1 se procesó a continuación tal como se describe en el documento DE 43 25 872 para obtener factor Xab, y el preparado de factor Xa altamente purificado así obtenido se liofilizó en presencia de 1 g/100 ml de albúmina humana. Este preparado estaba libre de otros factores de coagulación; el factor Xa obtenido presentaba una actividad específica de 120 U/mg de proteína antes de la adición de la
albúmina.

Ejemplo 5 Liofilización de factor II (producto intermedio)

El preparado que contenía factor II altamente purificado descrito en el Ejemplo 3 se liofilizó sin adición de estabilizadores, manteniéndose después de la liofilización más de un 80% de su actividad inicial.

Ejemplo 6 Coliofilización de factor II y factor Xa

Un preparado de factor II producido según el Ejemplo 3 se introdujo, a una concentración de 100 U/ml, hasta 20 ml, en un frasco de 50 ml y se sometió a congelación ultrarrápida a -80ºC. A continuación, sobre la solución de factor II congelada se dosificaron 30 \mul de una solución de un factor Xa altamente purificado que había sido producida según el documento DE 43 25 852 y presentaba una concentración de 500 U/ml. Mediante la congelación inmediata del pequeño volumen se evitó que la fase de factor II y la fase de factor Xa se mezclaran. A continuación se liofilizó. Para preparar la solución de infusión, el liofilizado se reconstituyó con 20 ml de agua destilada, se mezcló e inmediatamente se preparó para la administración.

Ejemplo 7 Formulación farmacéutica de factor II, factor Xa y antitrombina III y/o complejo de antitrombina III-heparina

El factor II altamente purificado, combinado con el factor Xa y antitrombina III o complejo de antitrombina III-heparina, se diluyó en un tampón que contenía 4 g de citrato de trisodio dihidratado/l y 8 g de NaCl/l, pH 7,0, hasta la concentración de empleo. Estas soluciones se liofilizaron, manteniéndose una actividad de como mínimo un 80% de los componentes correspondientes.

Ejemplo 8 Determinación de la protrombinasa parcial

La formación de un complejo de factor II y factor Xa en la "protrombinasa parcial" se demostró mediante el siguiente experimento:

57 U del factor II del Ejemplo 3 y 1,2 U del factor Xa del Ejemplo 4 se disolvieron en tampón tris-HCl 20 mM, que contenía NaCl 150 mM, pH 7,4, y se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente para formar el complejo. A continuación se cromatografió una parte alícuota de la solución mediante cromatografía de filtración en gel a través de Superose 12 (HR10/30) (Pharmacia) con un flujo de 0,25 ml/min. El volumen de aplicación fue de 200 \mul. El paso por la columna se midió mediante espectrofotometría UV a 280 nm y se recogió en fracciones de 0,5 ml. A continuación se midió cuantitativamente el factor Xa de las fracciones, que había sido determinado con el método descrito en el documento DE 43 25 872 en un ensayo fotométrico con sustrato cromógeno. También se determinó la actividad del factor II en las fracciones individuales como en el Ejemplo 2. El resultado se muestra en la Figura 4. El factor Xa [Figura 4: (-\blacksquare-) act. Xa (FII/Xa)] y el factor II [Figura 4: (-\medbullet-) act. II x 10 (FII/Xa)] se eluyeron junto con la fracción de proteína [Figura 4: ____A280 nm (FII/Xa)]. Después se aplicó sólo el factor Xa en la columna bajo las mismas condiciones, se determinó el perfil de elución tras el paso por el gel midiendo la absorción UV a 280 nm [Figura 4:\cdot\cdot\cdot\cdot\cdot\cdot\cdot\cdot\cdot\cdot A280 nm (FXa)] y se determinó la actividad de factor Xa [Figura 4: (-\ding{115}-) act. Xa x 10 (FXa)] en las fracciones. El pico de proteína correspondiente al factor Xa era claramente inferior al factor Xa en el complejo con factor II. Mediante reducción del tiempo de retención del factor Xa en el complejo en la columna y relacionando con ello el desplazamiento a una masa molar aparentemente superior, se pudo demostrar la formación de complejo de factor II y factor Xa (protrombinasa parcial).

Ejemplo 9 Formulación del preparado en un sistema de jeringa de cámara doble

Para simplificar la utilización del sistema de varios componentes, como por ejemplo mezclas de factor II y factor Xa, o factor II, factor Xa y antitrombina III, como dispositivo de administración se puede utilizar un cuerpo de jeringa doble de cámara doble, tal como se describe en AT 382 783. En caso contrario, para utilizar clínicamente sistemas de varios componentes liofilizados habría que reconstituir cada uno de ellos y mezclarlos entre sí en una proporción definida antes de poder administrárselos al paciente. La carga de los liofilizados correspondientes en un sistema de jeringa de cámara doble permite una dosificación exacta de una actividad predeterminada del preparado para el tratamiento de la hemofilia que desarrolla inhibidores, por ejemplo en unidades FEIBA convencionales que se pueden determinar de acuerdo con AT 350 726. Utilización un sistema de este tipo, la mezcla activa se prepara in situ durante la inyección. En una forma de realización, en cada uno de los dos cuerpos de jeringa de cámara doble se encuentra un liofilizado de los principios activos, factor II y factor Xa, respectivamente, que al adicionar el disolvente, agua destilada, se disuelven inmediatamente a causa de la gran solubilidad de las proteínas altamente purificadas y, acto seguido, al continuar apretando el émbolo de la jeringa, después de mezclarse en la cabeza de mezcla se administran por infusión al paciente (véase la Figura 1).

Gracias a la alta estabilidad del factor II en solución, ésta también es adecuada como disolvente para el factor Xa en la forma de administración de una jeringa de cámara doble. Una solución de factor II altamente purificado, producido por ejemplo según el Ejemplo 2, en un tampón citrato fisiológicamente compatible (4 g de citrato trisódico dihidratado/l, 8 g de NaCl/l, pH 7,0) en una concentración de 100 U de factor II/ml se mezcla con antitrombina III, Immuno Wien (1 mU de antitrombina III/U de factor II). Esta solución se utiliza en una jeringa de cámara doble (véase la Figura 2) como disolvente para el polvo liofilizado de un factor Xa altamente purificado.

Ejemplo 10 Estabilidad del factor II altamente purificado

El factor II se purificó tal como se describe en el Ejemplo 2 y se almacenó en forma de solución con una concentración de 60 U/ml en un tampón que contenía 4 g/l de citrato trisódico dihidratado, 8 g/l de NaCl, pH 7,0, a 5ºC, a 22ºC, a 37ºC y a 50ºC. En el caso de temperaturas de almacenamiento de 5ºC y 22ºC se tomaron muestras cada 24 h. En el caso del almacenamiento a 37ºC y a 50ºC, las tomas de muestras a lo largo de 24 h se realizaron en los tiempos 1 h, 2 h, 4 h, 8 h y 24 h. En cada una de las muestras se determinó actividad de factor II.

En el caso del almacenamiento a 5ºC, 86 días después del comienzo del almacenamiento todavía se pudo detectar más de un 80% de la actividad inicial. A 22ºC se detectó más de un 80% de la actividad inicial a lo largo de 14 días. A 37ºC se pudo detectar un 95% de la actividad inicial 24 h después del comienzo del almacenamiento. Incluso a 50ºC se detectó un 94% de la actividad original 8 h después de ser almacenados.

Ejemplo 11 Autoactivación y estabilidad de los preparados según la invención

Se analizaron en un ensayo in vitro las propiedades protrombóticas de los preparados según el Ejemplo 5 (factor II) y del Ejemplo 6 (complejo de factor II/Xa), en particular referentes al sistema de coagulación extrínseco, y se compararon con dos concentrados de complejo de protrombina comerciales. Antes de su utilización en el ensayo, la heparina presente en el concentrado de complejo de protrombina se neutralizó con sulfato de protamina según la concentración, para mostrar componentes trombogénicos que quedarían enmascarados por la heparina.

La carga a analizar consistía en 250 \mul de Thrombotest® (Nycomed Pharma AS, Oslo, Noruega), un preparado que contenía tromboplastina de cerebro bovino y plasma bovino adsorbido, que se preincubó durante 3 min a 37ºC. A continuación se añadieron 50 \mul de una muestra y se determinó el tiempo de coagulación con un coagulómetro de bola (KC4, Amelung). Las tromboplastinas bovinas se consideran especialmente sensibles a factores de coagulación activados. Igualmente, el sistema de ensayo puede proporcionar información sobre la trombogenia in vitro de los preparados analizados. En esta carga de ensayo se utilizó plasma normal humano no diluido como control. Éste muestra un tiempo de coagulación de 74 segundos. Los dos preparados según la invención analizados, utilizados sin diluir, mostraron tiempos de coagulación de más de 100 segundos, correspondiendo su concentración a una concentración de utilización posible de 30 U de factor II/ml. Un concentrado de complejo de protrombina comercial, también disuelto en la concentración de utilización y diluido a 30 U/ml tuvo que ser diluido adicionalmente con tampón 1:32 para alcanzar el tiempo de coagulación del plasma normal (74 segundos). Otro concentrado de complejo de protrombina activado comercial tuvo que ser diluido con tampón hasta 1:216 para alcanzar el tiempo de coagulación de un plasma normal de 74 segundos. A continuación, los preparados según la invención disueltos se almacenaron hasta 4 h a temperatura ambiente y una vez a la hora se tomaron muestras y se determinó de nuevo el tiempo de coagulación con Thrombotest®. En este proceso no se produjo ningún cambio, es decir, después de 4 h las muestras utilizadas sin diluir seguían presentando tiempos de coagulación de más de 100 segundos. De estos ensayos se desprende que los preparados según la invención presentan un potencial trombogénico claramente inferior al de los concentrados de complejo de protrombina comerciales.

Ejemplo 12 Comportamiento de disolución del preparado

En primer lugar se produjo y liofilizó un preparado que contenía factor II altamente purificado como se describe en el Ejemplo 5. El liofilizado estaba ajustado de tal modo que la actividad por volumen después de la reconstitución con agua destilada era de 50 U/ml. Ésta era una concentración de utilización típica. No obstante, gracias a la alta pureza del preparado, también se pudieron lograr concentraciones volumétricas de 100 y más unidades de factor II por ml. Se determinó el tiempo de disolución, definido como el tiempo transcurrido desde la adición del disolvente (agua destilada) hasta la disolución completa del polvo. En comparación con ello, los liofilizados de dos preparados comerciales (complejo de protrombina y complejo de protrombina activado) se reconstituyeron, en cada caso, a las concentraciones de utilización mediante adición de agua destilada según las indicaciones del fabricante, y también se determinó el tiempo de disolución. La siguiente tabla muestra el tiempo de disolución de los preparados
analizados:

	Preparado según el Ejemplo 5	APCC^{1}	PCC^{2}
Tiempo de disolución (s)	< 30	240	300
^{1}APCC = Concentrado de complejo de protrombina activado
^{2}PCC = Concentrado de complejo de protrombina.

Una vez llevada a cabo la disolución de los preparados correspondientes se midió en cada caso un espectro UV/VIS entre 280 y 750 nm contra un tampón citrato-sal común. Los espectros se muestran en las Figuras 5a, b y c (a: preparado según el Ejemplo 5, b: complejo de protrombina activado, c: complejo de protrombina). La comparación de los espectros mostraba que el preparado según el Ejemplo 5 presentaba una absorción de la luz en la región visible hasta 700 nm claramente inferior a la de los preparados comparativos. Por consiguiente, el preparado según el Ejemplo 5 se caracterizaba por una extraordinaria solubilidad y en estado disuelto se encontraba en forma de una solución transparente incolora, como es característico en los preparados farmacéuticos mejorados.

Ejemplo 13 Efecto del preparado en el plasma con inhibidores del factor VIII

Un plasma con inhibidores de factor VIII de alta concentración (55 BU/ml) se sometió a enfriamiento previo en un baño helado y se incubó a 37ºC durante 1 minuto con reactivo PTT (IMMUNO, Viena) y la muestra a ensayar, ambos también sometidos a enfriamiento previo en baño helado, en una proporción de 1 + 1 + 1. A continuación se añadió 1 parte de una solución de CaCl_{2} 0,05 M y se determinó el tiempo de coagulación de la carga de ensayo con un coagulómetro de bola de la firma Amelung, modelo KC-4. Los preparados a ensayar se diluyeron adicionalmente en una proporción 1:10 en un tampón que contenía 7 g de CaCl/l y 6 g de citrato trisódico dihidratado/l y se utilizaron en el ensayo a esta concentración. Bajo estas condiciones se ensayó un factor II altamente purificado, solo o en combinación con factor Xa altamente purificado, en combinación con antitrombina III y heparina. La siguiente tabla muestra los tiempos de coagulación.

Sustancias de ensayo (concentración)	Tiempo de coagulación (segundos)
Factor II	Factor Xa	Antitrombina III	Heparina
10 U/ml	-	-	-	147
10 U/ml	0,1 U/ml	-	-	63
10 U/ml	0,1 U/ml	1 U/ml	-	55
10 U/ml	0,1 U/ml	1 U/ml	6 U/ml	49

Como control se determinó el tiempo de coagulación de la carga de ensayo con tampón cloruro sódico-citrato trisódico puro. Dicho tiempo de coagulación fue de 148 segundos. En consecuencia, el tiempo de coagulación del plasma con inhibidores sólo se pudo reducir claramente mediante la adición de factor II/Xa con o sin antitrombina III o heparina. Midiendo un preparado patrón FEIBA (FEIBA STIM 4, Immuno), que representa el preparado convencional para el tratamiento de pacientes con desarrollo de inhibidores del factor VIII, en diferentes concentraciones en la misma carga de ensayo se pudo determinar que la actividad FEIB del preparado, que contenía 10 U/ml de factor II y 0,1 U de factor Xa/ml, corresponde a aproximadamente 35 U de FEIBA/ml.

Ejemplo 14 Efecto in vivo en caso de hemofilia con desarrollo de inhibidores del factor VIII (ensayo comparativo)

Para ensayar la eficacia in vivo del preparado según la invención se utilizó un modelo de conejo con hemofilia con desarrollo de inhibidores del factor VIII. Unos conejos de Nueva Zelanda blancos, con un peso de aproximadamente 2 kg, se narcotizaron. Una vez iniciada la narcosis se preparó la vena femoral derecha en cada caso y se estableció un acceso venoso permanente. A través de éste se realizó una infusión de 0,5 ml/kg de peso corporal de un plasma humano con inhibidores del factor VIII (1.500 BU/ml) a lo largo de 10 minutos. Treinta minutos después de finalizar la infusión se determinó la característica hemorrágica utilizando un método modificado de Giles y col., Blood 60: 727-730 (1982). Para ello se rasuró el pelo alrededor de una uña de la pata trasera del conejo con el fin de evitar que la sangre que saliera durante la hemorragia posterior fuera absorbida por el pelo. La piel de la uña se lesionó con un cortaúñas. Inmediatamente después se dispusieron filtros debajo de tal modo que la sangre pudiera gotear directamente sobre los filtros sin ser absorbida por éstos por capilaridad, para evitar que se destruyeran los coágulos en formación. Las unidades de filtro se cambiaron cada 2 minutos y la sangre saliente se recogió en fracciones. La recogida de sangre continuó durante 30 minutos y después, si la hemorragia no se había detenido, se obliteró la herida. Para cuantificar la característica hemorrágica, los filtros se extrajeron, en cada caso, con una disolución de hidróxido amónico al 0,04% durante 5 h, con lo que se lisaron los eritrocitos recogidos con la sangre en el filtro. La hemoglobina se extrajo mediante 10 minutos de tratamiento de ultrasonidos y se determinó cuantitativamente por fotometría a 416 nm contra una curva patrón. Ésta se estableció disponiendo con una pipeta entre 10 \mul y 1 ml de sangre de conejo sobre los filtros, extrayéndolos como se describe más arriba y determinando la hemoglobina por fotometría a 416 nm. La característica hemorrágica del corte en la uña se determinó trazando un gráfico de la cantidad de sangre por fracción de 2 minutos en función del tiempo. Para la evaluación se calculó la pérdida de sangre acumulada trazando un gráfico del volumen de las fracciones de sangre individuales en función del tiempo. Como criterio relevante para la hemorragia se empleó el aumento de la hemorragia acumulada entre 10 y 20 minutos. Este valor era independiente de la cantidad de sangre inicial, que variaba de un conejo a otro en función del corte en la uña. El aumento de la característica hemorrágica en intervalos de observación de 10 a 20 minutos servía como medida de la intensidad de la hemorragia. Un aumento igual a cero significaba que la hemorragia se había detenido. Un aumento > 0 con un coeficiente de correlación > 0,8 indicaba una hemorragia constante. Los conejos sanos presentaban, bajo las condiciones de ensayo, una intensidad de hemorragia < 2 \mul de sangre/min. Los conejos con inhibidores del factor VIII presentaban una intensidad de hemorragia de aproximadamente 50 \mul de sangre/min (véase la Figura 6). Los conejos con inhibidores del factor VIII que habían sido tratados con un preparado de factor II según el Ejemplo 3 en una dosis de 75 U/kg de peso corporal en forma de una infusión a lo largo de 30 minutos, presentaban de promedio (n = 6) una intensidad de hemorragia de 9,3 \mul/min y, en consecuencia, una reducción significativa con respecto a los animales con inhibidores
no tratados.

Ejemplo 15 Efecto in vivo en caso de inhibidor de factor von Willebrand/factor VIII

Análogamente al Ejemplo 14 se estableció un modelo de inhibidor de factor von Willebrand/factor VIII infundiendo en conejos antiplasma anti-factor von Willebrand/factor VIII de cabra, que había sido obtenido por inmunización de cabras con un preparado factor VIII/factor von Willebrand purificado, en dosis de 1 ml/kg de peso corporal. Los animales sometidos a este tratamiento previo mostraban un aumento de la tendencia a la hemorragia (véase la Figura 7). La característica hemorrágica en estos animales se midió mediante cortes en las uña e infusión simultánea de la sustancia de ensayo y 30 minutos después de finalizar la infusión de la sustancia de ensayo. Mediante la administración de factor II en forma de un bolo de 2,5 ml en una dosis de 75 U/kg, la intensidad de la hemorragia, inicialmente incrementada, se pudo reducir de 77 \mul/min a 31 \mul/min (1^{er} corte de uña) o a 12 \mul/min (2º corte de uña). Mediante la combinación de factor II (75 U/kg) con un factor Xab (preparado según el Ejemplo 4) en una dosis de 0,55 U/kg en forma de un bolo con un volumen de inyección de 2,5 ml, la tendencia a la hemorragia se pudo reducir del valor inicial a 18 \mul/min en el 1^{er} corte de uña y a 5 \mul/min en el 2º corte de uña. De este modo, el comportamiento hemorrágico anormalmente incrementado de los animales con inhibidores se normalizó al nivel de los animales sanos control (4 \mul/min).

También se examinó en el mismo modelo la combinación de factor II (75 U/kg), factor Xa (0,55 U/kg) y antitrombina III, Immuno Wien (75 mU/kg). En el 1^{er} corte de uña se pudo lograr una reducción a 35 \mul/min y en el 2º corte de uña una reducción a 7 \mul/min (véase la Figura 8). La adición de antitrombina III debía evitar la generación de trombina a partir de protrombina mediante la enzima factor Xa en la solución administrada.

Ejemplo 16 Trombogenia del preparado según la invención

Los componentes individuales del preparado según la invención y mezclas de ellos se examinaron en cuanto a su actividad trombogénica en sangre venosa estasiada de conejos utilizando el método descrito por Wessler, J. Appl. Phys. 14: 943-946 (1959).

Los conejos se narcotizaron con pentobarbital. Después se descubrió la vena yugular de los animales y se le realizaron ligaduras sueltas a una distancia de 1 - 2 cm. Las sustancias a ensayar se inyectaron en la vena de la oreja opuesta a la vena yugular descubierta de los animales. La inyección duró 15 segundos. Después de un tiempo de espera de 10 - 15 segundos se estranguló el tramo de vena. Diez minutos después se extrajo el trozo de vena y se cortó en una placa petri en tampón citrato, y los trombos obtenidos se evaluaron mediante una escala del 0 al 4 (véase
la Tabla).

Grado de trombosis	Evaluación
Ningún trombo formado	0
Algunos trombos pequeños	0,5 - 1
Algunos trombos de tamaño mediano y muchos trombos pequeños	2
Muchos trombos de tamaño mediano	3
Algunos trombos grandes	3,5
Un trombos coherente	4

Las sustancias se examinaron en seis animales en cada caso, cada uno de los cuales recibió 75 U de factor II/kg, 0,55 U de factor Xa/kg y 75 mU de antitrombina III/kg, individualmente o combinados. La siguiente tabla muestra el valor medio de la calificación Wessler de los seis animales examinados en cada caso. Como control se utilizó tampón de citrato puro, que también se empleó como tampón de dilución.

\newpage

Sustancia de ensayo
Factor II	Factor Xa	Antitrombina III	Calificación Wessler
+	-	-	0,17
-	+	-	0,17
-	-	+	0,08
+	+	-	0,25
+	-	+	0,08
-	+	+	0,17
+	+	+	0,17
-	-	-	0,2
(Tampón)	(Tampón)	(Tampón)

Se comprobó que ninguno de los componentes utilizados, ni individualmente ni combinados, presentaba actividad trombogénica en el conejo.

Ejemplo 17 Efecto del preparado según la invención en función de la forma de administración

Se analizó la eficacia de un preparado que contenía factor II y factor Xa según el Ejemplo 6, en cada caso, en 6 conejos con hemofilia con desarrollo de inhibidores del factor VIII inducido (véase Ejemplo 14). La dosis analizada era tal como se describe en el Ejemplo 15. Como control, los animales fueron sometidos a una infusión con tampón puro.

En el primer ensayo se llevó a cabo una infusión de las sustancias de ensayo a lo largo de 30 minutos, correspondientes a aproximadamente 15 min/kg de peso corporal, mediante una bomba de infusión automática con una velocidad de infusión de 1 ml/min. En el segundo ensayo se administró a los animales la misma dosis, pero en forma de un bolo en un plazo de 30 segundos en un pequeño volumen de inyección de 2,5 ml/kg de peso corporal. Como en el Ejemplo 14, después se midió la intensidad de la hemorragia durante la administración de la sustancia y después de finalizar ésta. Se comprobó que tanto en el caso de una infusión lenta con un gran volumen de infusión como en el caso de la inyección rápida de una pequeña dosis volumétrica, pero con dosis idénticas con respecto al peso corporal, la intensidad de la hemorragia prolongada patológicamente de 67 \mul/min se pudo normalizar a aproximadamente 5 \mul/min, lo que correspondía al comportamiento hemorrágico de los animales comparativos sanos. Mediante la administración de tampón, igualmente con las dos modalidades de infusión, no se detectó ninguna variación de la intensidad de la hemorragia. A pesar de la inyección rápida en forma de bolo, no se observó ninguna reacción de incompatibilidad en el caso de la inyección ni en el caso de la infusión lenta. Para preparados comerciales con una indicación comparable, preparados de complejo de protrombina (activados), se recomiendan velocidades de infusión < 0,05 ml/min por kg de peso corporal para evitar efectos secundarios tromboembólicos. Como demostró el ensayo, el preparado según la invención, gracias a su alta pureza, se pudo administrar sin efectos secundarios a una velocidad de 5 ml/min por kg de peso corporal, es decir, a una velocidad de inyección 100 veces
mayor.

Ejemplo 18 Efecto de la protrombinasa parcial en ratas con deficiencia plaquetaria

Como modelo de trombocitopatía se utilizan ratas Fawn-Hooded, según se describe en T.B. Tschopp y M.B. Zucker (Hereditary Defect in Platelet Function in Rats, Blood 1972; 40: 217-226). Esta cepa de ratas, que fue caracterizada adicionalmente por S.L. Raymon y W.J. Dodds (Characterization of the Fawn-Hooded Rats as a Model for Hemostatic Studies, Thrombos Diathes haemorrh. 1975; 33: 361-369), se caracteriza por un tiempo de hemorragia anormalmente alto y una escasa agregación plaquetaria, mientras que el tiempo de protrombina, el tiempo de tromboplastina parcial, el nivel de factor VIII y fibrinógeno en el plasma y la cantidad de plaquetas se encuentran en el mismo rango que en las ratas sanas. La trombopatía sufrida por la rata Fawn-Hooded está relacionada con una liberación reducida de ATP y ADP inducida por trombina y también con una liberación reducida de serotonina, por lo que se caracteriza como deficiencia "storage-pool" (deficiencia de depósito de almacenamiento), reflejo de la deficiencia "storage-pool" en humanos.

Las ratas Fawn-Hooded se narcotizan con cetamina-xilazina (100 mg/kg + 5 mg/kg) i.m. En una vena yugular se introduce un catéter a través del cual se introducen por infusión las sustancias a ensayar. A continuación se determina el tiempo de hemorragia, para lo cual se utilizan agujas desechables R Simplate (Organon, Technica). A una distancia de aproximadamente 1,5 cm de la base de la cola se practica primero un corte longitudinal en la parte dorsal y después otro en la parte ventral, y se mide el tiempo de hemorragia en cada caso. El valor medio de las dos medidas individuales se considera el tiempo de hemorragia. Después se administra la sustancia de ensayo (tampón, factor II según el Ejemplo 2, factor Xa según el Ejemplo 4 y protrombinasa parcial según el Ejemplo 6); 30 minutos después se determina de nuevo el tiempo de hemorragia. Como control se utilizan ratas Sprague-Dawley (Charles River) sanas.

El análisis se lleva a cabo en grupos de 10 animales cada uno y el complejo de la protrombinasa parcial se administra en 2 dosis, 75 U/kg de peso corporal de protrombina y 0,55 U/kg de peso corporal de factor Xa, y también 150 U/kg de peso corporal de protrombina y 1,1 U/kg de peso corporal de factor Xa. Como control se administran los componentes individuales y el tampón. La siguiente tabla muestra los tiempos de hemorragia medios medidos en los grupos de ensayo por separado. Las ratas sanas presentan, bajo las mismas condiciones de ensayo, un tiempo de hemorragia de 168 \pm 5 segundos, mientras que las ratas con una trombopatía presentan un mayor tiempo de hemorragia de 335 \pm 10 segundos. Este tiempo de hemorragia anormalmente alto se puede reducir a aproximadamente 270 segundos mediante la administración de la protrombinasa parcial.

TABLA

Tiempo de hemorragia (seg)	Factor II (U/kg)
Valor medio de 10 animales	0	75	150
	0	335 \pm 10	296 \pm 13^{ns}	307 \pm 11^{ns}
FXa (U/kg)	0,55	n.d.	273 \pm 13*	n.d.
	1,1	320 \pm 13^{ns}	n.d.	268 \pm 11***

Los datos se indican como valores medios \pm desviación estándar. Los valores medios de los grupos se compararon según el test T de Student.

n.d.: No determinado.

ns: Diferencia no significativa con respecto al grupo de control (0 U/kg FII y 0 U/kg FXa)

*: Diferencia significativa con respecto al grupo de control (0 U/kg FII y 0 U/kg FXa) con p \geq 95%.

***: Diferencia significativa con respecto al grupo de control (0 U/kg FII y 0 U/kg FXa) con p \geq 99,9%.

Ejemplo 19 Efecto de la protrombinasa parcial en perros con deficiencia de factor von Willebrand

Un perro con deficiencia congénita de factor von Willebrand con un nivel de actividad de factor von Willebrand y un nivel antigénico en plasma no mensurables y con una concentración de factor VIII en plasma reducida un 50% se trata con una protrombinasa parcial a una dosis de 100 U/kg de peso corporal. Para ello, el perro se narcotiza y a continuación se administra la protrombinasa parcial producida según el Ejemplo 6 en forma de un bolo y por vía intravenosa. Inmediatamente después de la administración de la sustancia de ensayo y también 15 minutos, 30 minutos, 1 h, 2 h, 3 h, 24 h y 48 h después de la infusión se toman muestras de sangre, a partir de éstas de produce plasma y se determina la concentración de protrombina, trombina y factor VIII en las muestras de plasma.

Antes de la administración de la protrombinasa parcial y también 3 y 24 h después de la inyección se determina la característica hemorrágica en piel de la uña. Para ello se aplica una modificación del método de A.R. Giles, S. Tinlin y R. Greenwood, A Canine Model of Hemophilic (Factor VIII:C Deficiency) Bleeding, Blood 1982; 60. El pelo alrededor de la uña se rasura con el fin de evitar que la sangre que salga durante la hemorragia posterior sea absorbida por éste. La piel de uña se lesiona con un cortauñas. Inmediatamente después se colocan filtros (Pipetman P5000-Schutzfilter, Gilson) debajo de la herida de tal modo que la sangre pueda gotear directamente sobre ellos sin ser absorbida por éstos por capilaridad, para evitar que se destruyan los coágulos en formación. Las unidades de filtro se cambian cada 2 minutos y la sangre saliente se recoge en fracciones. La recogida de sangre continúa durante 30 minutos. Después, si la hemorragia no se ha detenido, se oblitera la herida. Se pueden utilizar uñas diferentes de un mismo animal.

La calificación de la característica hemorrágica se realiza por extracción de la sangre recogida en fracciones sobre los filtros, en cada caso, con 5 ml de una disolución de hidróxido amónico al 0,04% a lo largo de 5 horas. En este proceso se lisan los eritrocitos recogidos en el filtro con sangre. La hemoglobina se extrae con 10 minutos de tratamiento ultrasónico (Sonorex RK 100, Bandelin electronic, Berlín) y se determina cuantitativamente por fotometría a 416 nm contra una curva patrón. La curva patrón se puede determinar colocando con una pipeta volúmenes de sangre de perro, entre 10 \mul y 1 ml, sobre los filtros, extrayéndolos tal como se describe más arriba y determinando la hemoglobina por fotometría a 416 nm. De igual forma se pueden establecer curvas patrón lineales que posibilitan una conversión directa de la concentración de hemoglobina a cantidad de sangre por filtro. La característica hemorrágica del corte en la uña se determina trazando un gráfico de la cantidad de sangre por fracción de 2 minutos en función del tiempo. Para la evaluación de la característica hemorrágica se calcula la pérdida de sangre acumulada trazando un gráfico de las fracciones de sangre individuales aditivamente en función del tiempo. Como criterio relevante de hemorragia se emplea el aumento de la hemorragia acumulada entre 10 y 20 minutos. Este valor es independiente de la cantidad de sangre inicial, que puede variar debido a las técnicas de corte de uña difícilmente normalizables. El aumento de la característica hemorrágica en el intervalo de observación de 10 - 20 minutos sirve como medida de la intensidad de la hemorragia y se indica en ml de sangre/min. Un aumento igual a cero, correspondiente a 0 ml/min, significa que la hemorragia se ha detenido; un aumento mayor de cero con un coeficiente de correlación > 0,8 significa una hemorragia constante. Los perros normales examinados bajo estas condiciones no muestran ninguna hemorragia en el período de observación, es decir, la hemorragia ya se ha detenido previamente (intensidad de hemorragia:
0,0 ml/min).

Antes de la administración de la protrombinasa parcial, la intensidad de hemorragia era de 1,05 ml/min. Después de 3 h se había reducido a 0,35 ml/min e incluso después de 24 h seguía en 0,47 ml/min.

El nivel de factor VIII en plasma se mantuvo constante durante todo el período de observación. El antígeno de factor von Willebrand permaneció por debajo del límite de determinación. Antes de la administración de la sustancia, el nivel de protrombina estaba en 0,7 U/ml; después de la inyección de la protrombinasa parcial aumentó a 2,4 U/ml y con una vida media de aproximadamente 24 h fue eliminada de la circulación. Una hora después de la administración de la sustancia de ensayo se pudo determinar una generación significativa de trombina con un sustrato cromógeno para trombina Th1 (Immuno). El perro toleró la inyección de protrombinasa parcial sin efectos
secundarios.

Ejemplo 20 Efecto de la protrombinasa parcial y factor von Willebrand en perros con deficiencia de factor von Willebrand

Análogamente al Ejemplo 19, el perro fue tratado con una protrombinasa parcial, con una dosificación de 100 U/kg de peso corporal, y un factor von Willebrand purificado con una dosificación de 60 U de RCoF/kg de peso corporal. Mediante la administración de esta combinación, después de 24 h se normalizó por completo el comportamiento hemorrágico anormalmente incrementado del perro con deficiencias en factor von Willebrand, siendo comparables los parámetros de plasma en cuanto a protrombina y trombina a los del Ejemplo 19. Además se produjo un aumento del factor VIII endógeno a aproximadamente un 200% del valor inicial, que se mantuvo constante durante un período de más de 48 h y a continuación retrocedió al valor inicial a lo largo de un período de aproximadamente 120 h. El factor von Willebrand se eliminó con una vida media de 20 h. Ya se sabía por la literatura (L. Drouet, J. Roussi, M. Bonneau, G. A. Pignaud, P. L. Turecek, F. Dorner, U. Schlokat, F.G. Falkner, B. Fischer, A. Mitterer y H.P. Schwarz, The effect of recombinant human von Willebrand Factor in pigs with severe von Willebrand Disease. Blood 1995; 86: 612a-AbsNo2435, (abs)) que la sola administración de factor von Willebrand únicamente conduce a una normalización parcial del comportamiento hemorrágico.

Ejemplo 21 Efecto de la protrombinasa parcial como antagonista de anticoagulantes peptídicos

Una protrombinasa parcial en una composición de 57 U de factor II y 1,2 U de factor Xa se disolvió en tampón tris-HCl 20 mM, que contenía 150 mM NaCl, pH 7,4, y se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente para formar el complejo. A continuación se tomó una parte alícuota de 50 \mul y se incubó con 50 \mul de un tampón de tris-imidazol, pH 8,4, durante 90 segundos a 37ºC. Acto seguido se mezcló con 100 \mul de una solución del sustrato cromógeno, hidroacetato de metoxicarbonil-D-ciclohexil-alanil-glicil-L-arginina-p-nitroanilida, de modo que la concentración del sustrato cromógeno era de 1 mmol/l. A continuación, se determinó fotométricamente a 405 nm la cinética de la disociación del sustrato cromógeno, durante 3 minutos a 37ºC. El sustrato cromógeno, hidrolizado tanto por la trombina como por el factor Xa, presentaba, durante la incubación con protrombinasa parcial, un \DeltaOD/min de 0,084. Como comparación, en este ensayo se utilizó factor Xa en la misma concentración pero sin protrombina, y se observó una tasa de conversión del sustrato cromógeno de 0,064 \DeltaOD/min. A la protrombinasa parcial se le añadió hirudina recombinante (Rhein-Biotech) en una concentración de 0,0025 U/ml y se examinó igualmente la tasa de conversión del sustrato cromógeno. Se comprobó que después de terminar la conversión del sustrato de factor Xa puro (0,064 \DeltaOD/min) no se podía medir ninguna conversión adicional de sustrato, lo que era atribuible a una neutralización completa de la hirudina.

Además del inhibidor de trombina efectivo y específico, la hirudina, también se añadió después una concentración de 50 \mug/ml de inhibidor de factor Xa selectivo, péptido anticoagulante de garrapata recombinante, un equivalente recombinante del inhibidor de serina-proteasa de Ornithodoros moubata, cuyo efecto anticoagulante in vivo había sido descrito por G.P. Vlasuk, D. Ramjit, T. Fujita y col. en Comparison of the In Vivo Anticoagulant Properties of Standard Heparin and the Highly Selective Factor Xa Inhibitors Antistasin and Tick Anticoagulant Peptide (TAP) in a Rabbit Model of Venous Thrombosis. Thrombos Haemostas 1991; 65: 25W-262. Treinta minutos después de la adición del péptido anticoagulante de garrapata recombinante ya no se pudo medir ninguna actividad enzimática con el sustrato cromógeno. El ensayo muestra que la protrombinasa parcial es un antagonista eficaz de los anticoagulantes peptídicos, hirudina y péptido anticoagulante de garrapata.

Claims

1. Preparado farmacéutico de factores de la coagulación para el tratamiento de alteraciones de la coagulación sanguínea, que contiene como mínimo 2 factores de coagulación individuales altamente purificados que forman parte de una protrombinasa o pro-protrombinasa y están libres de fosfolípidos, seleccionándose los factores de la coagulación de entre el grupo consistente en factores II, V, Va, X y Xa.

2. Preparado según la reivindicación 1, caracterizado porque como mínimo uno de los factores está activado.

3. Preparado según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque consiste esencialmente en los factores II y V o Va.

4. Preparado según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque consiste esencialmente en los factores X y V o Va.

5. Preparado según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque consiste esencialmente en los factores II y X o Xa, en caso dado en combinación con factor V o Va.

6. Preparado según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque los factores de la coagulación se encuentran en forma de un complejo.

7. Preparado según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque contiene iones magnesio.

8. Preparado según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque no contiene ningún ión calcio libre.

9. Preparado según la reivindicación 8, caracterizado porque contiene quelante para la formación de complejos de iones calcio libres.

10. Preparado según una de las reivindicaciones 1, 2 y 5 a 9, caracterizado porque contiene protrombina y factor Xa purificado como componentes activos y está libre de fosfolípidos.

11. Preparado según la reivindicación 10, caracterizado porque esencialmente consiste en protrombina y factor Xa.

12. Preparado según la reivindicación 10 u 11, caracterizado porque con una dosis de como mínimo 150 U de protrombina/kg se está libre de efectos secundarios tromboembólicos, expresado mediante calificación en el modelo de trombosis Wessler de como máximo 3 puntos.

13. Preparado según la reivindicación 10 a 12, caracterizado porque contiene protrombina con una actividad específica de como mínimo 5 U/mg de proteína.

14. Preparado según una de las reivindicaciones 10 a 13, caracterizado porque contiene factor Xa con una actividad específica de como mínimo 100 U/mg de proteína.

15. Preparado según una de las reivindicaciones 10 a 14, caracterizado porque contiene el factor Xa preponderantemente en forma de factor Xa\beta.

16. Preparado según una de las reivindicaciones 10 a 15, caracterizado porque la protrombina y el factor Xa se encuentran en forma de un complejo.

17. Preparado según una de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque además contiene antitrombina III en cantidades estabilizadoras, dado el caso junto con heparina.

18. Preparado según una de las reivindicaciones 10 a 17, caracterizado porque contiene menos de 0,1 U de factor VIII:C o factor VIII:Ag/U de protrombina.

19. Preparado según una de las reivindicaciones 10 a 18, caracterizado porque contiene menos de 0,1 U de factor IX/U de protrombina.

20. Preparado según una de las reivindicaciones 10 a 19, caracterizado porque contiene menos de 0,1 U de factor X/U de protrombina.

21. Preparado según una de las reivindicaciones 10 a 20, caracterizado porque contiene menos de 0,01 mg de fosfolípidos/U de protrombina.

22. Preparado según una de las reivindicaciones 10 a 21 en una forma de administración, con una concentración que posibilita una dosis de como mínimo 50 U de protrombina por kg de peso corporal y en caso dado permite la administración en forma de inyección de bolo.

23. Preparado según la reivindicación 22 en una forma de administración que incluye una dosis de 50 a 500 U de protrombina por kg de peso corporal.

24. Preparado según una de las reivindicaciones 1 a 23, caracterizado porque los factores de coagulación se producen mediante técnicas de ADN recombinante.

25. Preparado según una de las reivindicaciones 1 a 24, caracterizado porque se encuentra en forma de un liofilizado que preferentemente se puede reconstituir en una solución ópticamente transparente.

26. Preparado según una de las reivindicaciones 1 a 25, caracterizado porque se encuentra en un dispositivo de administración adecuado, preferentemente como un liofilizado en una jeringa, que permite una reconstitución in situ con una solución farmacéuticamente aceptable.

27. Preparado según una de las reivindicaciones 1 a 26, caracterizado porque está inactivado en cuanto a virus o donde ha sido reducida la cantidad de virus.

28. Complejo consistente en protrombina, factor Xa y en caso dado factor V o Va.

29. Complejo consistente en protrombina y factor V o Va.

30. Complejo consistente en factor X y V o Va.

31. Preparado que contiene un complejo según una de las reivindicaciones 28 a 30 y además iones calcio.

32. Preparado diagnóstico según la reivindicación 31, caracterizado porque además contiene trombina y en caso dado fosfolípidos, para uso diagnóstico.

33. Utilización de factores de protrombinasa purificados, en particular de protrombina purificada y factor Xa purificado, para la producción de un preparado farmacéutico según una de las reivindicaciones 1 a 27 para establecer concentraciones supranormales de protrombina en la sangre de un paciente.

34. Utilización según la reivindicación 33, siendo la concentración supranormal de como mínimo 1,5 U de protrombina por ml de sangre, preferentemente de como mínimo 2 U/ml.

35. Utilización de factores de protrombinasa purificados, en particular de protrombina purificada y factor Xa purificado, para la producción de un preparado farmacéutico según una de las reivindicaciones 1 a 27 para el tratamiento de estados de desarrollo de inhibidores del factor VIII, hemofilia A o B y enfermedad de von Willebrand.

36. Utilización de como mínimo 2 factores de coagulación, que forman parte de una protrombinasa o pro-protrombinasa, en la producción de un preparado farmacéutico según una de las reivindicaciones 1 a 27 para el tratamiento de hemorragias agudas, de un aumento de la tendencia a la hemorragia o de un incremento del riesgo de hemorragia en caso de pacientes no hemofílicos.

37. Utilización según la reivindicación 36 en la producción de un preparado farmacéutico para el tratamiento de hemorragias debidas a trombopatías.

38. Utilización según la reivindicación 36 ó 37 en la producción de un preparado farmacéutico para el tratamiento de una trombocitopenia inducida por heparina.

39. Utilización según una de las reivindicaciones 36 a 38, caracterizada porque el preparado farmacéutico presenta una actividad hemostática primaria.

40. Preparado farmacéutico según una de las reivindicaciones 1 a 27 para el tratamiento de pacientes con alteraciones de la coagulación sanguínea, que además contiene una proteína con actividad hemostática primaria, en particular vWF.

41. Sistema para el tratamiento de pacientes con alteraciones de la coagulación sanguínea, que incluye los siguientes componentes:

a) un preparado farmacéutico según una de las reivindicaciones 1 a 27 y

b) una proteína con actividad hemostática primaria, en particular vWF.

42. Utilización según una de las reivindicaciones 36 a 38 en la producción de un preparado farmacéutico para el tratamiento de hemorragias en el marco de una terapia con anticoagulantes.

43. Utilización según la reivindicación 42 para producir un preparado farmacéutico como antídoto para un inhibidor de la coagulación o para un anticoagulante o para un inhibidor de la función trombocítica.

44. Utilización según la reivindicación 43, caracterizada porque el inhibidor de la coagulación o el anticoagulante se selecciona de entre el grupo consistente en APAP, derivados benzamida, hirudina, heparina, análogos de heparina, en particular pentasacáridos, complejo AT III-heparina, AT III, antistasina, "Tick-Anticoagulant Peptide" (péptido anticoagulante de garrapata), factores de coagulación inactivos, en particular factores de coagulación inhibidos "active site" (sitio activo), TFPI, ligandos competitivos por receptores de superficie de membrana de trombocitos, en particular anticuerpos contra GP IIb/IIIa y sus análogos producidos genética o sintéticamente, en particular péptidos, y también anticoagulantes orales.

45. Utilización según la reivindicación 43, caracterizada porque el inhibidor de la función trombocítica es ticlopidina o ácido acetilsalicílico.

46. Sistema para tratar con anticoagulantes a pacientes, que incluye los siguientes componentes:

a): un inhibidor de la coagulación o anticoagulante o un inhibidor de la función trombocítica, y

b): un preparado farmacéutico según una de las reivindicaciones 1 a 32.

47. Utilización según la reivindicación 36 para producir un preparado farmacéutico para el tratamiento de hemorragias intracraneales, en particular en caso de alteraciones de formación de trombina.

48. Utilización según la reivindicación 47 para el tratamiento de partos prematuros.