JPH1045792A - リゾスフィンゴ脂質の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 リゾスフィンゴ脂質を効率よく製造するため
の方法、それに使用する、スフィンゴリピドセラミドデ
アシラーゼ生産能を有する微生物、該方法によるリゾス
フィンゴ脂質、あるいはそれよりのリゾスフィンゴ脂質
誘導体の製法を提供する。 【解決手段】 スフィンゴ脂質をスフィンゴリピドセラ
ミドデアシラーゼ生産能を有する微生物と接触反応さ
せ、リゾスフィンゴ脂質を採取するリゾスフィンゴ脂質
の製造方法。スフィンゴリピドセラミドデアシラーゼ生
産能を有する細菌。上記方法により得られるリゾスフィ
ンゴ脂質。それを処理するリゾスフィンゴ脂質誘導体の
製造方法。 【効果】 効率よく安価にリゾスフィンゴ脂質を大量調
製することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、医薬、糖質工学及
び細胞工学等に有用なリゾスフィンゴ脂質の製造方法、
並びに該製造方法により得られたリゾスフィンゴ脂質に
関する。

【０００２】

【従来の技術】スフィンゴ脂質はスフィンゴ糖脂質、ス
フィンゴリン脂質（スフィンゴホスホノリピドを含
む）、セラミド、を含む長鎖塩基スフィンゴイドを持つ
脂質の総称であり、スフィンゴイドのアミノ基に不均一
な鎖長の長鎖脂肪酸を酸アミド結合したセラミドを共通
構造としてもち、下等動物から高等動物にまで広く分布
している。これらスフィンゴ脂質は近年、細胞の増殖、
分化誘導、アポトーシス等のような生物活性において重
要な役割に関与していることが明らかにされつつある。
また、細胞表層の構成成分であることから化粧料等への
添加物としても使用されつつある。また、スフィンゴ脂
質のスフィンゴイドのアミノ基に酸アミド結合した脂肪
酸を欠くスフィンゴ脂質のＮ−脱アシル体はリゾスフィ
ンゴ脂質と呼ばれ、スフィンゴ脂質と同様な生物活性を
持つことが明らかにされつつある。更に、リゾスフィン
ゴ脂質はスフィンゴイドに遊離のアミノ基を持ってお
り、再アシル化によりリゾスフィンゴ脂質誘導体（スフ
ィンゴ脂質誘導体）を合成する際の出発原料として有用
である。例えば、均一な脂肪酸組成を持つスフィンゴ脂
質や、基のスフィンゴ脂質と脂肪酸鎖長の異なるスフィ
ンゴ脂質を再合成することができる。また、発色団や放
射性同位元素¹⁴Ｃ等で標識化されたスフィンゴ脂質を得
ることが可能である。更に、リゾスフィンゴ脂質の遊離
のアミノ基を利用して担体に固定化することも可能であ
る。従来、リゾスフィンゴ糖脂質の製造方法は化学的方
法、酵素を用いる方法、微生物を用いる方法が知られて
いる。化学的方法としては、ヒドラジン分解法やアルコ
ール系溶媒中でのアルカリ加水分解法が知られている。
しかし、これらの方法によると、シアル酸を含むスフィ
ンゴ糖脂質（ガングリオシド）の場合、シアル酸部分の
脱アシル化反応が同時に進行する。また、アミノ糖を含
むスフィンゴ糖脂質の場合Ｎ−アセチル基の脱離が起こ
り、デ−Ｎ−アセチルリゾ糖脂質が生じる。そのため、
脱アシル化後、脂質部分のアミノ基に保護基を選択的に
導入した後、シアル酸部分を再アシル化を行い、その
後、更に保護基を外す必要がある。また、これらの操作
では様々な副生成物が生成する。このように化学的方法
によるリゾ糖脂質の製造には多くの手間と技術的な熟練
を要する。

【０００３】一方、スフィンゴ糖脂質からリゾ体を生成
する酵素を用いる方法がこれまで知られている。しかし
ながら、ノカルディア（Nocardia) 属放線菌の生産する
ガングリオシドセラミダーゼを用いる方法（特開昭６４
−６０３７９号公報）は、酵素の基質特異性のため中性
糖脂質のリゾ体を得ることはできない。また、ロドコッ
カス（Rhodococcus)属放線菌の生産する酵素又は菌体処
理物を用いる方法（特開平６−７８７８２号公報）で
は、酸性糖脂質（ガングリオシド）のリゾ体を得ること
はできない。また、更にシュードモナス（Pseudomonas)
属細菌の生産するスフィンゴリピドセラミドデアシラー
ゼを用いる方法（特開平８−８４５８７号公報）は、各
種スフィンゴ脂質に幅広く作用する。しかし、これらの
酵素を用いるいずれの方法においても、リゾ体の収率は
最高でも７２．５％であり、効率が悪いものであった。
微生物又はその抽出物を用いる方法として、グリコスフ
ィンゴリピドセラミドデアシラーゼを生産する能力を有
するストレプトミセス（Streptomyces) 属放線菌を用い
る方法（特開平７−１０７９８８号公報）では、培地中
にスフィンゴ糖脂質を添加しリゾ体に変換する方法が知
られている。しかしこの方法においても効率が悪く、ま
た基質特異性によりガングリオシドＧＭ３及び中性糖脂
質であるラクトシルセラミド、グルコシルセラミド、ガ
ラクトシルセラミドには作用せず、これらの糖脂質のリ
ゾ体を得ることはできない。一方、スフィンゴリン脂質
であるスフィンゴミエリンのリゾ体を得る方法として
は、化学的方法と酵素的方法が知られており、化学的方
法としてアルコール系溶媒中での塩酸加水分解による方
法が一般に知られている。しかしこの方法によると天然
型のＤ−エリスロ（D-erythro)（２Ｓ，３Ｒ）だけでは
なくＬ−スレオ（L-threo)（２Ｓ，３Ｓ）の立体異性体
が生じてしまい、これらを分離することは非常に困難で
あった。また、特開平８−８４５８７号公報にシュード
モナス属細菌の生産するスフィンゴリピドセラミドデア
シラーゼによって、スフィンゴミエリンから異性体を生
成することなく加水分解しリゾスフィンゴミエリンを得
る方法が記載されている。しかしこの酵素を用いた方法
ではスフィンゴミエリンを分解するためには精製酵素を
用いる必要があった。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】上述したように、従来
の化学的あるいは酵素的にリゾスフィンゴ脂質を製造す
る方法及び微生物を用いるリゾスフィンゴ脂質の製造方
法は、望ましくない副産物ができたり、多くの手間と技
術的な熟練を要し、また基質が限定されたりするもので
あり、効率の悪いものであった。したがって本発明の目
的は、副生成物を生ずることなく幅広いリゾスフィンゴ
脂質を効率よく製造するための方法を提供することにあ
る。本発明の他の目的は、本発明の製造方法に使用す
る、スフィンゴリピドセラミドデアシラーゼ生産能を有
する微生物を提供することにある。本発明の他の目的
は、上記製造方法により得られたリゾスフィンゴ脂質及
びリゾスフィンゴ脂質誘導体を提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明は、スフィンゴ脂質をスフィンゴリピ
ドセラミドデアシラーゼ生産能を有する微生物と接触反
応させ、リゾスフィンゴ脂質を採取することを特徴とす
るリゾスフィンゴ脂質の製造方法に関する。本発明の第
２の発明は、スフィンゴリピドセラミドデアシラーゼ生
産能を有するシュードモナス属細菌、又はシェワネラ
（Shewanella) 属細菌に関する。本発明の第３の発明
は、本発明の第１の発明の製造方法により得られるリゾ
スフィンゴ脂質に関する。本発明の第４の発明は、上記
第３の発明のリゾスフィンゴ脂質を処理することを特徴
とするリゾスフィンゴ脂質誘導体の製造方法に関する。

【０００６】本発明者らはリゾスフィンゴ脂質の大量調
製法について検討を行った結果、スフィンゴリピドセラ
ミドデアシラーゼを生産する細菌をスフィンゴ脂質と共
に培養すればそのリゾ体が得られることを見出した。な
お、スフィンゴリピドセラミドデアシラーゼ生産菌とし
てスフィンゴ脂質の内スフィンゴ糖脂質の一部にのみ作
用する酵素を生産する放線菌はこれまで知られてきた
が、スフィンゴ脂質に幅広く作用する酵素を生産する細
菌としてはシュードモナス エスピー．ＴＫ−４（Pseu
domonas sp. TK-4) のみであった。そこで、本発明者ら
は新たに海洋環境からスフィンゴ脂質を炭素源とする合
成培地中でスフィンゴ脂質をリゾスフィンゴ脂質に変換
する能力を有する細菌を単離し、これらの細菌をスフィ
ンゴ脂質と共に培養すれば、効率的にしかも特定のスフ
ィンゴ脂質に限定されることなく幅広いスフィンゴ脂質
に対してそのリゾ体が得られることを見出し本発明を完
成するに至った。

【０００７】

【発明の実施の形態】以下、本発明について具体的に説
明する。本明細書において、スフィンゴ脂質とは、スフ
ィンゴ糖脂質、スフィンゴリン脂質、セラミド、を含む
長鎖塩基スフィンゴイドを有する天然物あるいは合成物
の単体、あるいはそれらの混合物等が挙げられる。ま
た、本明細書において、リゾスフィンゴ脂質とは、スフ
ィンゴイドのアミノ基に酸アミド結合した脂肪酸を欠く
スフィンゴ脂質のＮ−脱アシル体を示す。更に、本明細
書において、スフィンゴリピドセラミドデアシラーゼと
は、スフィンゴ脂質のスフィンゴイド塩基のアミド結合
に作用し、リゾスフィンゴ脂質と脂肪酸に加水分解する
酵素、すなわち、スフィンゴ脂質のスフィンゴイドと脂
肪酸との酸アミド結合を特異的に加水分解する酵素を示
す。例えば、スフィンゴ糖脂質（ガングリオシド、中性
糖脂質）、スフィンゴリン脂質（スフィンゴミエリン）
を含むスフィンゴ脂質に幅広く作用する酵素としてシュ
ードモナス属に属する微生物の生産するスフィンゴリピ
ドセラミドデアシラーゼ〔ＳＣＤａｓｅ、ジャーナル
オブ バイオロジカル ケミストリー（Journal of Bio
logical Chemistry)、第２７０巻、第２４３７０〜２４
３７４頁（１９９５）、特開平８−８４５８７号公
報〕、が挙げられるが、これらに限定されるものではな
い。本明細書において、スフィンゴリピドセラミドデア
シラーゼ生産能を有する微生物とは、スフィンゴリピド
セラミドデアシラーゼ生産能を有するシュードモナス属
細菌及びシェワネラ属細菌が挙げられるが、これらに限
定されるものではなく、スフィンゴリピドセラミドデア
シラーゼの生産能を有する菌株であればいかなる微生物
でもよく、またそれらの微生物の変異株でもよい。この
場合、産生されるスフィンゴリピドセラミドデアシラー
ゼはスフィンゴ脂質に幅広く作用するものが好ましい。
このような微生物の単離方法としては、例えば、土壌や
海藻、海水、海砂、海泥、海産生物の消化管内容物など
のサンプルを、スフィンゴ脂質を唯一の炭素源とする合
成培地に加え、２５℃で３〜４日培養する。その後培養
上清中の基質の分解をＴＬＣで確認し、スフィンゴリピ
ドセラミドデアシラーゼ活性のあるものを同培地に植え
継ぎ、これを数回繰り返した後、平面培地で各コロニー
を単離することにより得ることができる。また、スフィ
ンゴリピドセラミドデアシラーゼをコードする遺伝子を
適当なベクターに連結し、該ベクターを導入した微生
物、更に、スフィンゴリピドセラミドデアシラーゼをコ
ードする遺伝子が欠失、付加、挿入若しくは置換された
遺伝子を適当なベクターに導入し、該ベクターを導入し
た微生物も本明細書で言うスフィンゴリピドセラミドデ
アシラーゼ生産能を有する微生物に含まれる。

【０００８】本発明のリゾスフィンゴ脂質の製造に用い
る菌株の具体例としては、シュードモナス属細菌、例え
ばシュードモナス エスピー．ＴＫ−４（Pseudomonas
sp.TK-4) あるいはシェワネラ属細菌、例えばシェワネ
ラ アルガ ＮＳ−５８９（Shewanella alga NS-589)
が挙げられる。シュードモナス エスピー．ＴＫ−４
（Pseudomonas sp. TK-4) はＧ−１８２と表示され、通
商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ
ＢＰ−５０９６として寄託されている。

【０００９】またシェワネラ アルガ ＮＳ−５８９
（Shewanella alga NS-589) は、本発明者らが福岡県和
白干潟の土壌より新たに検索して得た菌株で、その菌学
的性質は以下の通りである。 （１）形態 桿菌 （２）グラム染色性 − （３）胞子 − （４）運動性 ＋ （５）鞭毛 極短毛 （６）酸素に対する態度 好気性 （７）オキシダーゼ ＋ （８）カタラーゼ ＋ （９）Ｏ−Ｆテスト Ｏ （１０）集落の色調 黄色系 （１１）Ｎａ⁺ の要求性 ＋ （１２）塩類要求性 ＋ ０％ＮａＣｌ培地での生育 − １％ＮａＣｌ培地での生育 ＋ 海水培地での生育 ＋ （１３）ＤＮＡの分解 ＋ （１４）アルギニンジヒドロラーゼ − （１５）オルニチンデカルボキシラーゼ ＋ （１６）リジンデカルボキシラーゼ − （１７）硫化水素の生成 ＋ （１８）６％ＮａＣｌ存在下での生育 ＋ （１９）生育温度 ４℃での生育 − ３７℃での生育 ＋ ４２℃での生育 ＋ （２０）ＳＳ寒天培地での生育 ＋ （２１）酸の生成 Ｄ−リボース ＋ マルトース − Ｌ−アラビノース − （２２）ＧＣ含量 ５３％ （２３）キノン系 Ｑ−８，Ｑ−７，ＭＫ−７，ＭＭＫ−７

【００１０】以上のような菌学的性質を有する菌株につ
いて、バージーズ マニュアル システマティック バ
クテリオロジー（Bergey's Manual of Systematic Bact
eriology) 、第１巻、ウィリアムズ アンド ウィルキ
ンス カンパニー（Williams& Wilkins Company) 、１
９８４年発行の分類法、システム アンド アプライド
マイクロバイオロジー（System and Applied Microbi
ology)、第６巻、第１７１頁（１９８５）及びインター
ナショナル ジャーナル オブ システマティック バ
クテリオロジー（International Journal of Systemati
c Bacteriology) 、第４２巻、第６２８頁（１９９２）
に基づいて同定を行ったところ、本菌株はシェワネラ
アルガ（Shewanella alga)に属する細菌であると同定さ
れる。本菌株は Shewanella alga NS-589 と命名、表示
され、工業技術院生命工学工業技術研究所に、ＦＭＲＭ
Ｐ−１５７００として寄託されている。

【００１１】本菌株によって生産されるスフィンゴリピ
ドセラミドデアシラーゼの酵素化学的及び理化学的性質
は次の通りである。 （１）作用 スフィンゴ脂質中の分子内セラミドに作用して、スフィ
ンゴシン塩基と脂肪酸とに加水分解し、リゾ糖脂質と脂
肪酸を生成する。 （２）基質特異性 ＧＭ１、ＧＭ２、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、シアロシルパラ
グロボシド等の酸性糖脂質、ラクトシルセラミド、Ｇｂ
４、Ｇｂ５等の中性糖脂質、スルファチド等の硫糖脂
質、スフィンゴリン脂質であるスフィンゴミエリンに作
用しそれぞれに対するリゾスフィンゴ脂質と脂肪酸を生
成する。 （３）至適ｐＨ及び温度安定性 本酵素の至適ｐＨは７〜８で、ｐＨ５〜８．５の間で比
較的高い活性を示す〔図１：図１中、縦軸は相対活性
（％）、横軸はｐＨを表す。また白四角印が酢酸緩衝
液、白ひし形印がＭＯＰＳ、白丸印がグリシン緩衝液を
示す〕。また、本酵素を種々の温度で１５分間保温した
場合、本酵素は５０℃以上ではほぼ失活しており、比較
的低い温度域（４０℃以下）で安定である〔図２：図２
中、縦軸は残存活性（％）、横軸は温度（℃）を示
す〕。

【００１２】本発明のリゾスフィンゴ脂質の製造方法に
おいては、例えば上述した菌株を栄養培地中で培養した
後、培地にスフィンゴ脂質を加えるか、あるいはあらか
じめスフィンゴ脂質を加えた栄養培地中で培養する方法
が用いられる。培地としては本菌株が生育し、スフィン
ゴリピドセラミドデアシラーゼが生産され、培地中に存
在するスフィンゴ脂質から効率よくリゾスフィンゴ脂質
が生成するようなものであればよく、特に限定されるも
のではない。かかる培地において炭素源としては、例え
ばスフィンゴ糖脂質であるガングリオシド、中性糖脂
質、硫糖脂質等あるいはスフィンゴリン脂質であるスフ
ィンゴミエリンあるいはこれらの混合物が利用でき窒素
源としては例えば塩化アンモニウム、ポリペプトン、酵
母エキス等が適当である。その他にリン酸塩、カリウム
塩、マグネシウム塩、亜鉛塩などの無機質及び金属塩類
や界面活性剤等を加えても良い。これらの成分は菌株に
合せて適時選択される。本菌株を培養するに当り、スフ
ィンゴリピドセラミドデアシラーゼの生産量、リゾスフ
ィンゴ脂質の生成量は培養条件により大きく変動する
が、一般的に培養温度は２０〜３５℃、培地のｐＨ６〜
８が良く、１日〜７日の通気かくはん培養で本発明のリ
ゾスフィンゴ脂質が生産される。本発明者らは、上記培
養に当り、β−シクロデキストリンのメチル化物を共存
させると、目的物の生成量を増大させることができるこ
とを見出した。メチル化の位置、個数に制限はないが、
中でも２，６−Ｏ−ジメチル−β−シクロデキストリン
は好適なものである。培養終了後、目的のリゾスフィン
ゴ脂質を含む培養液から遠心分離、ろ過等によって菌体
等の不溶性成分を除去し、得られた培養上清から通常用
いられる方法でタンパク質や塩類を除去する。このため
には、例えば培養上清を逆相カラム等に負荷してタンパ
ク質を除去し、同時に脱塩を行う方法が効果的である。
脱塩した培養上清から通常用いられる方法、例えば逆相
クロマトグラフィーやシリカゲルカラムの順相クロマト
グラフィーあるいはイオン交換クロマトグラフィーによ
ってリゾスフィンゴ脂質を精製することができる。精製
したリゾスフィンゴ脂質の構造の確認は、薄層クロマト
グラフィーや液体クロマトグラフィー、質量分析、核磁
気共鳴スペクトルなどの分析法によって行うことができ
る。このようにしてスフィンゴ脂質を本発明に用いる微
生物と共に培養することにより、スフィンゴ脂質から目
的のリゾスフィンゴ脂質に変換することができる。

【００１３】既述の本発明の第４の発明に従って、リゾ
スフィンゴ脂質を処理してリゾスフィンゴ脂質誘導体を
製造する方法について以下説明する。処理の１例として
は再アシル化があり、アシル化は、アミノ基の酸アミド
化の常法に従って化学的方法又は酵素的方法によって行
うことができる。化学的方法では、標識を有し、又は有
しない脂肪族カルボン酸又はその反応性誘導体を用いて
反応を行えばよい。本発明において使用可能な脂肪族カ
ルボン酸の例には、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸はもちろ
んのこと、それら脂肪酸の炭化水素鎖が、ハロゲン、置
換若しくは非置換のアミノ基、オキソ基、水酸基等の官
能性基で置換されている酸、あるいは当該炭化水素鎖中
に酸素、硫黄、アミノ基を有する酸等の脂肪族性をもつ
カルボン酸がすべて含まれる。他方酵素的方法として
は、公知のリパーゼを用いる方法等があるが、特に有用
な方法としては、スフィンゴ脂質のスフィンゴイドと脂
肪酸との酸アミド結合を特異的に加水分解する酵素、又
は該酵素の生産能を有する微生物を用いる方法がある。
酵素の例にはスフィンゴリピドセラミドデアシラーゼが
ある。

【００１４】処理の他の例としては、リゾスフィンゴ脂
質を用いてスフィンゴイドのアミノ基を標識する方法が
ある。標識化方法としては、標識する部分に、発色団を
形成する物質、蛍光物質、ビオチン、放射性同位元素等
を導入すればよい。

【００１５】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に
示すが、本発明は実施例に限定されるものではあい。

【００１６】実施例１ シュードモナス エスピー．Ｔ
Ｋ−４によるリゾＧＭ１の製造 ガングリオシドＧＭ１（ヤトロン社製）を３０ｍｇ及び
２，６−Ｏ−ジメチル−β−シクロデキストリン０．１
％を含むＰＹ培地（ポリペプトン０．５％、酵母エキス
０．１％、塩化ナトリウム０．２％、ｐＨ７．２）を滅
菌後、牛脳粗ガングリオシド０．１％含む斜面培地〔牛
脳粗ガングリオシドはメソッズ インエンザイモロジー
（Methods in Enzymology)、第１４巻、第６６０〜６６
４頁（１９６９）の記載の方法にて調製〕で一晩培養し
ておいた菌体を接種し、２５℃で３日間振とう培養を行
った。得られた培養液から遠心分離により菌体を除き、
培養上清を得た。この培養上清を薄層クロマトグラフィ
ーにより分析した結果、すべてのガングリオシドＧＭ１
はリゾＧＭ１に変換されていた。この培養上清をＳｅｐ
−ＰａｋＣ１８カラム（ウォーターズ社製）に添加し、
水で非吸着画分を洗浄後、カラム体積と同量のメタノー
ルを流し、クロロホルム／メタノール＝１：２（ｖ／
ｖ）で溶出しリゾＧＭ１を得た。次に、得られたリゾＧ
Ｍ１を乾固し、クロロホルム／メタノール／水＝６０：
３０：５（ｖ／ｖ）に溶解した。更にＡｑｕａｓｉｌ
ＳＳ−１２５１カラム（４．６×２５０ｍｍ、センシュ
ー科学社製）を用いて高速液体クロマトグラフィーにか
け、クロロホルム／メタノール／水＝６０：３０：５
（ｖ／ｖ）１．５ｍｌ／ｍｉｎで溶出し、リゾＧＭ１を
精製した。これらの操作により精製リゾＧＭ１を１８ｍ
ｇ得ることができた。

【００１７】実施例２ シュードモナス エスピー．Ｔ
Ｋ−４による各種スフィンゴ糖脂質のリゾ体への変換 オートクレーブ滅菌した２，６−Ｏ−ジメチル−β−シ
クロデキストリン０．１％を含むＰＹ培地（ポリペプト
ン０．５％、酵母エキス０．１％、塩化ナトリウム０．
２％、ｐＨ７．２）に、フィルター滅菌した各種スフィ
ンゴ糖脂質水溶液のうちＧＭ１、ＧＭ３（ヤトロン社
製）、ＧＤ１ａ（ヤトロン社製）、ＧＤ１ｂ（ヤトロン
社製）、ＧＤ３（ヤトロン社製）、ＧＴ１ｂ（バイオカ
ーブ社製）を０．５ｍｇ／ｍｌ、Ｇｂ４（ヤトロン社
製）を０．１ｍｇ／ｍｌになるようにそれぞれを添加し
た培地に、牛脳粗ガングリオシド０．１％を含む斜面培
地で一晩培養しておいた菌体を接種し、２５℃、３日間
振とう培養を行った。得られた培養液から遠心分離によ
り菌体を除き、培養上清を得た。この培養上清を薄層ク
ロマトグラフィーにより分析した。その結果を表１に示
す。

【００１８】

【表１】 表 １ ──────────────────────────── ガングリオシド 分解率（％） ──────────────────────────── ＧＭ１ １００ ＧＭ３ １００ ＧＤ１ａ １００ ＧＤ１ｂ １００ ＧＤ３ １００ ＧＴ１ｂ １００ Ｇｂ４ ５６ ────────────────────────────

【００１９】実施例３ シェワネラ アルガ ＮＳ−５
８９によるスフィンゴシルホスホリルコリン（リゾスフ
ィンゴミエリン）の製造 合成培地（リン酸水素二カリウム０．０５％、塩化アン
モニウム０．０５％、スフィンゴミエリン０．１％、タ
ウロデオキシコール酸ナトリウム０．１％、塩化ナトリ
ウム２％、２，６−Ｏ−ジメチル−β−シクロデキスト
リン０．１％、ｐＨ７．４）２００ｍｌにシェワネラ
アルガ ＮＳ−５８９を植菌し、３０℃で２日間振とう
培養を行った。得られた培養液から遠心分離により菌体
を除き、培養上清を得た。この培養上清を薄層クロマト
グラフィーにより分析した結果、スフィンゴミエリンの
８０％がスフィンゴシルホスホリルコリンに変換されて
いた。この培養上清をＣ₁₈逆相ラカム〔Preparative Ｃ
₁₈１２５Ａ（ミリポア社製）充てん量３０ｇ、カラム直
径３０ｍｍ、オープンカラム〕に添加し、水３００ｍｌ
で脱塩、洗浄した後、メタノール３００ｍｌ、クロロホ
ルム／メタノール＝１：１（ｖ／ｖ）３００ｍｌで溶出
した。この時、スフィンゴシルホスホリルコリンはメタ
ノール画分に溶出された。次に、スフィンゴシルホスホ
リルコリン画分の溶媒をロータリーエバポレーターによ
り除去した後、シリカゲル６０カラム（メルク社製）に
添加し、クロロホルム／メタノール／水＝５：４：１
（ｖ／ｖ）で分画した。更に得られたスフィンゴシルホ
スホリルコリン画分の溶媒をロータリーエバポレーター
により除去した後、凍結乾燥することにより精製スフィ
ンゴシルホスホリルコリン４７．６ｍｇを得ることがで
きた。この精製スフィンゴシルホスホリルコリンを薄層
クロマトグラフィーにより展開しクマシーブリリアント
ブルーで染色した結果、単一のバンドが得られた。また
スタフィココッカス アウレウス（Staphylococcus aur
eus)由来スフィンゴミエリナーゼ（シグマ社製）によっ
て消化した後、薄層クロマトグラフィーにより解析した
結果スフィンゴシンが遊離されることが確認された。更
にＦＡＢ−マススペクトル分析した結果、（Ｍ⁺ Ｈ）⁺
の４６５、及び（（Ｍ⁺ Ｎａ）⁺ の４８７のイオンピー
クが確認された。以上の結果より本方法によって高純度
のスフィンゴシルホスホリルコリンを得ることができる
ことが明らかとなった。

【００２０】実施例４ シェワネラ アルガ ＮＳ−５
８９によるスフィンゴシルホスホリルコリン（リゾスフ
ィンゴミエリン）の製造における培地組成の検討 ＰＹ培地（ポリペプトン０．５％、酵母エキス０．１
％、塩化ナトリウム１％、スフィンゴミエリン０．１
％、タウロデオキシコール酸ナトリウム０．１％、ｐＨ
７．２）、合成培地（リン酸水素二カリウム０．０５
％、塩化アンモニウム０．０５％、スフィンゴミエリン
０．１％、タウロデオキシコール酸ナトリウム０．１
％、ｐＨ７．４）において塩化ナトリウム濃度を０、
０．５、１、２、３％に調製した培地、合成培地に酵母
エキス０．０５％を加え、塩化ナトリウム濃度を０、
０．５、１、２、３％に調製した培地、１％塩化ナトリ
ウムを含む合成培地に０．１％グルコースを加えた培地
を用意し、更にそれぞれについて２，６−Ｏ−ジメチル
−β−シクロデキストリン０．１％を加えた系、及び加
えない系を用意した。それぞれにシェワネラ アルガ
ＮＳ−５８９を植菌し、２５℃で３日間振とう培養した
後、得られた培養上清を薄層クロマトグラフィーにより
展開し、スフィンゴシルホスホリルコリンの生成を分析
した。スフィンゴシルホスホリルコリンはクマシーブリ
リアントブルーで染色後、ＴＬＣクロマトスキャナーＣ
Ｓ９０００（島津製作所社製）を用い波長６００ｎｍで
のデンシトグラムより定量した。この結果を図３に示
す。すなわち図３は、スフィンゴシルホスホリルコリン
の生成量を６００ｎｍにおけるピーク面積で示したもの
であり、縦軸はピーク面積、横軸はＮａＣｌ濃度（％）
を示す。図３からも分かるようにＰＹ培地、及び塩化ナ
トリウムを含まない培地では全くスフィンゴシルホスホ
リルコリンを生成しないこと、塩化ナトリウム２％、
２，６−Ｏ−ジメチル−β−シクロデキストリン０．１
％を含む合成培地で最も生成量が多いことが明らかとな
った。

【００２１】実施例５ シェワネラ アルガ ＮＳ−５
８９によるスフィンゴシルホスホリルコリン（リゾスフ
ィンゴミエリン）の製造における培養温度の検討 合成培地（リン酸水素二カリウム０．０５％、塩化アン
モニウム０．０５％、スフィンゴミエリン０．１％、タ
ウロデオキシコール酸ナトリウム０．１％、塩化ナトリ
ウム２％、２，６−Ｏ−ジメチル−β−シクロデキスト
リン０．１％、ｐＨ７．４）を用い、２５℃、３０℃、
３７℃の各温度で３日間培養した後、ＴＬＣクロマトス
キャナーＣＳ９０００（島津製作所社製）を用い波長６
００ｎｍでのデンシトグラムより定量した。この結果を
図４に示す。すなわち図４は、スフィンゴシルホスホリ
ルコリンの生成量を６００ｎｍにおけるピーク面積で示
したものであり、縦軸はピーク面積、横軸は温度（℃）
を示す。図４から分かるように、スフィンゴシルホスホ
リルコリンの製造は、３０℃が最も適することが明らか
となった。

【００２２】実施例６ シェワネラ アルガ ＮＳ−５
８９によるスフィンゴシルホスホリルコリン（リゾスフ
ィンゴミエリン）の製造における界面活性剤の検討 合成培地（リン酸水素二カリウム０．０５％、塩化アン
モニウム０．０５％、スフィンゴミエリン０．１％、タ
ウロデオキシコール酸ナトリウム０．１％、塩化ナトリ
ウム２％、２，６−Ｏ−ジメチル−β−シクロデキスト
リン０．１％、ｐＨ７．４）を用い、各種濃度で界面活
性剤を添加し、３０℃で３日間培養した後、ＴＬＣクロ
マトスキャナーＣＳ９０００（島津製作所社製）を用い
波長６００ｎｍでのデンシトグラムより定量した。この
結果を図５に示す。界面活性剤はタウロデオキシコール
酸ナトリウム（ＴＤＣ）、コール酸ナトリウム（コール
酸Ｎａ）、トリトンＸ−１００（Triton X-100) を用
い、各々０．０５％、０．１％、０．２％を培地に添加
した。図５中、縦軸はピーク面積、横軸は界面活性剤の
添加量（％）を示す。図５からも分かるようにタウロデ
オキシコール酸ナトリウムが最も適することが明らかと
なった。

【００２３】

【発明の効果】本発明の製造方法により、効率よく安価
にリゾスフィンゴ脂質を大量調製することが可能となっ
た。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のシェワネラ属細菌の産生するスフィン
ゴリピドセラミドデアシラーゼの至適ｐＨを示す図であ
る。

【図２】本発明のシェワネラ属細菌の産生するスフィン
ゴリピドセラミドデアシラーゼの温度安定性を示す図で
ある。

【図３】本発明のシェワネラ属細菌によるスフィンゴシ
ルホスホリルコリンの製造における培地組成の検討を示
す図である。

【図４】本発明のシェワネラ属細菌によるスフィンゴシ
ルホスホリルコリンの製造における培養温度の検討を示
す図である。

【図５】本発明のシェワネラ属細菌によるスフィンゴシ
ルホスホリルコリンの製造における界面活性剤添加の検
討を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/80 Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｎ 9/80 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 19/26 Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｐ 19/26 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 加藤 郁之進 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 スフィンゴ脂質をスフィンゴリピドセラ
   ミドデアシラーゼ生産能を有する微生物と接触反応さ
   せ、リゾスフィンゴ脂質を採取することを特徴とするリ
   ゾスフィンゴ脂質の製造方法。
2. 【請求項２】 請求項１記載の製造方法において、当該
   接触反応時に、β−シクロデキストリンのメチル化物を
   共存させることを特徴とする請求項１記載の製造方法。
3. 【請求項３】 該微生物が細菌である請求項１又は２記
   載の製造方法。
4. 【請求項４】 該細菌がシュードモナス（Pseudomonas)
   属細菌又はシェワネラ（Shewanella) 属細菌である請求
   項３記載の製造方法。
5. 【請求項５】 スフィンゴリピドセラミドデアシラーゼ
   生産能を有するシュードモナス（Pseudomonas)属細菌。
6. 【請求項６】 シュードモナス属細菌がシュードモナス
   エスピー．（Pseudomonas sp.)ＴＫ−４である請求項
   ５記載の細菌。
7. 【請求項７】 スフィンゴリピドセラミドデアシラーゼ
   生産能を有するシェワネラ（Shewanella) 属細菌。
8. 【請求項８】 シェワネラ属細菌がシェワネラ アルガ
   （Shewanella alga)ＮＳ−５８９である請求項７記載の
   細菌。
9. 【請求項９】 請求項１〜４のいずれか１項に記載の製
   造方法により得られるリゾスフィンゴ脂質。
10. 【請求項１０】 請求項９記載のリゾスフィンゴ脂質を
    処理することを特徴とするリゾスフィンゴ脂質誘導体の
    製造方法。
11. 【請求項１１】 請求項９記載のリゾスフィンゴ脂質を
    用いて再アシル化することを特徴とする請求項１０記載
    のリゾスフィンゴ脂質誘導体の製造方法。
12. 【請求項１２】 請求項９記載のリゾスフィンゴ脂質を
    用いてスフィンゴイドのアミノ基を標識することを特徴
    とする請求項１０記載のリゾスフィンゴ脂質誘導体の製
    造方法。