JPH104995A - ｄ−ビオチンの発酵による製造 - Google Patents
ｄ−ビオチンの発酵による製造Info
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- JPH104995A JPH104995A JP9073328A JP7332897A JPH104995A JP H104995 A JPH104995 A JP H104995A JP 9073328 A JP9073328 A JP 9073328A JP 7332897 A JP7332897 A JP 7332897A JP H104995 A JPH104995 A JP H104995A
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- C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
- C12P17/185—Heterocyclic compounds containing sulfur atoms as ring hetero atoms in the condensed system
- C12P17/186—Heterocyclic compounds containing sulfur atoms as ring hetero atoms in the condensed system containing a 2-oxo-thieno[3,4-d]imidazol nucleus, e.g. Biotin
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- Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 クルチア属に属する微生物を用いることによ
り、バチルス又はセラチア属に属する株を用いる既存の
方法により高い収量でｄ−ビオチンを生産させる。 【解決手段】 ビオチン代謝拮抗物質に耐性を有し、ｄ
−ビオチン生産能を有するクルチア属に属する微生物
を、好気的条件下、培地中で培養し、生成したｄ−ビオ
チンを発酵ブロスから分離することを特徴とするｄ−ビ
オチンの製造法。
り、バチルス又はセラチア属に属する株を用いる既存の
方法により高い収量でｄ−ビオチンを生産させる。 【解決手段】 ビオチン代謝拮抗物質に耐性を有し、ｄ
−ビオチン生産能を有するクルチア属に属する微生物
を、好気的条件下、培地中で培養し、生成したｄ−ビオ
チンを発酵ブロスから分離することを特徴とするｄ−ビ
オチンの製造法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、発酵によるｄ−ビ
オチンの製造法に関する。
オチンの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】ｄ−
ビオチンは、動物、植物および微生物の栄養に必須なビ
タミンの一つであり、医薬品および食品添加物として非
常に重要である。本発明は、発酵による高収量でのｄ−
ビオチンの製造を可能にする。
ビオチンは、動物、植物および微生物の栄養に必須なビ
タミンの一つであり、医薬品および食品添加物として非
常に重要である。本発明は、発酵による高収量でのｄ−
ビオチンの製造を可能にする。
【０００３】これまでｄ−ビオチンの発酵による生産に
関しては、数多くの研究がある。ビオチン代謝拮抗物質
に耐性を有するバチルス（Bacillus）株（特開昭５８−
１５２４９５）およびビオチン代謝拮抗物質に耐性を有
するセラチア(Serratia)株（特開平２−２７９８０）
は、それぞれ０. ６〜４. ０mg/lおよび４. ３〜２２mg
/lのｄ−ビオチンを生産する。しかし、ビオチン代謝拮
抗物質に耐性を有するクルチア（Kurthia)属に属する微
生物によるｄ−ビオチンの生産はこれまで報告されてい
ない。
関しては、数多くの研究がある。ビオチン代謝拮抗物質
に耐性を有するバチルス（Bacillus）株（特開昭５８−
１５２４９５）およびビオチン代謝拮抗物質に耐性を有
するセラチア(Serratia)株（特開平２−２７９８０）
は、それぞれ０. ６〜４. ０mg/lおよび４. ３〜２２mg
/lのｄ−ビオチンを生産する。しかし、ビオチン代謝拮
抗物質に耐性を有するクルチア（Kurthia)属に属する微
生物によるｄ−ビオチンの生産はこれまで報告されてい
ない。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は、大量のｄ−ビ
オチンを蓄積させることを可能とする。ビオチン代謝拮
抗物質、たとえばアシドマイシン（以下、ＡＣＭと略記
する）、５−（２−チエニル）−吉草酸（以下、ＴＶＡ
と略記する）、α−メチルデチオビオチン（以下、Ｍｅ
ＤＴＢと略記する）、２−メチルＡＣＭ、アミクレノマ
イシンおよびビスノルビオチノールおよびそれらの混合
物に耐性を有する、クルチア属に属する微生物が、培養
ブロス中に大量のｄ−ビオチンを蓄積することができ、
そこから良好な純度で蓄積したｄ−ビオチンを採取でき
ることが認められた。事実、本発明を用いることによ
り、バチルス又はセラチア属に属する株を用いる既存の
方法より約５ないし２００倍高い収量でｄ−ビオチンを
生産させることが可能である。このように本発明は、ビ
オチン代謝拮抗物質に耐性を有し、ｄ−ビオチン生産能
を有するクルチア属に属する微生物を、好気的条件下、
培地中で培養し、生成したｄ−ビオチンを発酵ブロスか
ら分離することからなるｄ−ビオチンの製造法を提供す
る。
オチンを蓄積させることを可能とする。ビオチン代謝拮
抗物質、たとえばアシドマイシン（以下、ＡＣＭと略記
する）、５−（２−チエニル）−吉草酸（以下、ＴＶＡ
と略記する）、α−メチルデチオビオチン（以下、Ｍｅ
ＤＴＢと略記する）、２−メチルＡＣＭ、アミクレノマ
イシンおよびビスノルビオチノールおよびそれらの混合
物に耐性を有する、クルチア属に属する微生物が、培養
ブロス中に大量のｄ−ビオチンを蓄積することができ、
そこから良好な純度で蓄積したｄ−ビオチンを採取でき
ることが認められた。事実、本発明を用いることによ
り、バチルス又はセラチア属に属する株を用いる既存の
方法より約５ないし２００倍高い収量でｄ−ビオチンを
生産させることが可能である。このように本発明は、ビ
オチン代謝拮抗物質に耐性を有し、ｄ−ビオチン生産能
を有するクルチア属に属する微生物を、好気的条件下、
培地中で培養し、生成したｄ−ビオチンを発酵ブロスか
ら分離することからなるｄ−ビオチンの製造法を提供す
る。
【０００５】培養ブロス中に蓄積したｄ−ビオチンの含
有量は、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillu
s plantarum)ＡＴＣＣ８０１４〔Proc. Soc. Exp. Bio
l. Med., 56, 95-98 (1944)〕を用いる比濁法〔J. Micr
obiological Methods, 6, 237-245 (1987) 〕により定
量することができる。
有量は、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillu
s plantarum)ＡＴＣＣ８０１４〔Proc. Soc. Exp. Bio
l. Med., 56, 95-98 (1944)〕を用いる比濁法〔J. Micr
obiological Methods, 6, 237-245 (1987) 〕により定
量することができる。
【０００６】本発明で用いることができる微生物は、ク
ルチア属〔Bergey's Manual of Systematic Bacteriolo
gy, 9th ed., vol.2, 1255 (1984）を参照〕に属し、前
述のようなビオチン代謝拮抗物質に耐性を有する、ｄ−
ビオチンを生産するすべての微生物を含む。上述の微生
物は、親株としてクルチア属に属する株を、変異原物
質、たとえばＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソ
グアニジン（以下、ＮＴＧと略記する）、エチルメタン
スルホン酸、アクリジンオレンジ、紫外線又はＸ線で処
理することにより効率良く得られる。
ルチア属〔Bergey's Manual of Systematic Bacteriolo
gy, 9th ed., vol.2, 1255 (1984）を参照〕に属し、前
述のようなビオチン代謝拮抗物質に耐性を有する、ｄ−
ビオチンを生産するすべての微生物を含む。上述の微生
物は、親株としてクルチア属に属する株を、変異原物
質、たとえばＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソ
グアニジン（以下、ＮＴＧと略記する）、エチルメタン
スルホン酸、アクリジンオレンジ、紫外線又はＸ線で処
理することにより効率良く得られる。
【０００７】本発明で用いられる微生物を調製するため
の親株としては、クルチア属に属するいかなる株も用い
ることができる。クルチア属に属する微生物は、自然界
から分離してもよく、又は微生物菌株保存機関から購入
してもよい。好ましくは本発明においては、クルチアＳ
Ｐ５３８−６（ＤＳＭ No.９４５４）を用いる。大量の
ｄ−ビオチン生産能を有する微生物は、クルチア属に属
し、上述したようなビオチン代謝拮抗物質に耐性を有す
る微生物を分離することにより得ることができる。たと
えば、大量のｄ−ビオチンを生産するクルチアＳＰ５３
８−６（ＤＳＭNo.９４５４）の変異株は、以下に述べ
るように分離した。
の親株としては、クルチア属に属するいかなる株も用い
ることができる。クルチア属に属する微生物は、自然界
から分離してもよく、又は微生物菌株保存機関から購入
してもよい。好ましくは本発明においては、クルチアＳ
Ｐ５３８−６（ＤＳＭ No.９４５４）を用いる。大量の
ｄ−ビオチン生産能を有する微生物は、クルチア属に属
し、上述したようなビオチン代謝拮抗物質に耐性を有す
る微生物を分離することにより得ることができる。たと
えば、大量のｄ−ビオチンを生産するクルチアＳＰ５３
８−６（ＤＳＭNo.９４５４）の変異株は、以下に述べ
るように分離した。
【０００８】（１）大量のｄ−ビオチン生産能を有する
ＡＣＭ耐性変異株の分離 液体培地で培養したクルチアＳＰ５３８−６（ＤＳＭ N
o.９４５４）の細胞を遠心分離により集め、生理食塩水
で洗浄し、懸濁した。突然変異誘発を以下に述べるよう
にAdelbergら〔Biochem. Biophys. Res. Comm., 18, 78
8, (1965) 〕の方法で行った。細胞を、１００mMトリス
塩酸緩衝液中、pH８. ０で、５０〜３００μg/mlのＮＴ
Ｇで振とうしながら処理した。処理後、その細胞を生理
食塩水で洗浄し、ふたたび懸濁した。その洗浄細胞を、
ＡＣＭ １００μg/mlを含む蒸留水１，０００mlにグリ
セリン２０ｇ、ビタミンを含まないカザミノ酸（ディフ
コ）５ｇ、Ｋ2 ＨＰＯ4 ２ｇ、ＫＨ2 ＰＯ4 １ｇ、Ｍｇ
ＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ
０．０１ｇ、ＭｎＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏ ０．０１ｇおよび
チアミン・塩酸塩１００μg を含む、ｄ−ビオチンを含
まない合成培地（以下、ＢＭと略記する）の寒天平板上
にまいた。培養後、生育した大きなコロニーを、ビオチ
ンの指示菌としてラクトバチルス・プランタラムＡＴＣ
Ｃ８０１４を含む定量平板上に植菌した。３７℃で培養
後、ｄ−ビオチン量に依存して生じる生育ハローの直径
を測定した。その結果、最も大きなハローを形成するコ
ロニーを得、クルチアＳＰ５３８−ＫＡ２６と命名し
た。
ＡＣＭ耐性変異株の分離 液体培地で培養したクルチアＳＰ５３８−６（ＤＳＭ N
o.９４５４）の細胞を遠心分離により集め、生理食塩水
で洗浄し、懸濁した。突然変異誘発を以下に述べるよう
にAdelbergら〔Biochem. Biophys. Res. Comm., 18, 78
8, (1965) 〕の方法で行った。細胞を、１００mMトリス
塩酸緩衝液中、pH８. ０で、５０〜３００μg/mlのＮＴ
Ｇで振とうしながら処理した。処理後、その細胞を生理
食塩水で洗浄し、ふたたび懸濁した。その洗浄細胞を、
ＡＣＭ １００μg/mlを含む蒸留水１，０００mlにグリ
セリン２０ｇ、ビタミンを含まないカザミノ酸（ディフ
コ）５ｇ、Ｋ2 ＨＰＯ4 ２ｇ、ＫＨ2 ＰＯ4 １ｇ、Ｍｇ
ＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ
０．０１ｇ、ＭｎＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏ ０．０１ｇおよび
チアミン・塩酸塩１００μg を含む、ｄ−ビオチンを含
まない合成培地（以下、ＢＭと略記する）の寒天平板上
にまいた。培養後、生育した大きなコロニーを、ビオチ
ンの指示菌としてラクトバチルス・プランタラムＡＴＣ
Ｃ８０１４を含む定量平板上に植菌した。３７℃で培養
後、ｄ−ビオチン量に依存して生じる生育ハローの直径
を測定した。その結果、最も大きなハローを形成するコ
ロニーを得、クルチアＳＰ５３８−ＫＡ２６と命名し
た。
【０００９】（２）大量のｄ−ビオチン生産能を有する
ＡＣＭおよびＴＶＡ耐性変異株の分離 クルチアＳＰ５３８−ＫＡ２６を培養し、その細胞を
（１）で述べたのと同様の方法でＮＴＧで処理した。処
理した細胞を、ＡＣＭ２００μg/mlおよびＴＶＡ２００
μg/mlを含む蒸留水１，０００mlにグリセリン２０ｇ、
（ＮＨ4)2 ＳＯ4３ｇ、Ｋ2 ＨＰＯ4 ２ｇ、ＫＨ2 ＰＯ4
１ｇ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ4
・７Ｈ2 Ｏ ０．０１ｇ、ＭｎＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏ ０．
０１ｇおよびチアミン・塩酸塩１００μg を含む、ｄ−
ビオチンを含まない合成培地（以下、ＭＭと略記する）
で培養し、２〜３日ごとにＡＣＭ２００μg/mlおよびＴ
ＶＡ２００μg/mlを含む新しい培地で連続的に数回植え
継いだ。その結果、得られる集積物を希釈し、ＡＣＭ２
００μg/mlおよびＴＶＡ２００μg/mlを含むＭＭ寒天平
板上にまいた。培養後、生育した大きなコロニーを、
（１）で述べたのと同様の方法で、ラクトバチルス・プ
ランタラムＡＴＣＣ８０１４を含む定量平板上に植菌し
た。培養後、生育ハローの直径を測定した。その結果、
最も大きなハローを形成するコロニーを得、クルチアＳ
Ｐ５３８−１７Ｈ４と命名した。
ＡＣＭおよびＴＶＡ耐性変異株の分離 クルチアＳＰ５３８−ＫＡ２６を培養し、その細胞を
（１）で述べたのと同様の方法でＮＴＧで処理した。処
理した細胞を、ＡＣＭ２００μg/mlおよびＴＶＡ２００
μg/mlを含む蒸留水１，０００mlにグリセリン２０ｇ、
（ＮＨ4)2 ＳＯ4３ｇ、Ｋ2 ＨＰＯ4 ２ｇ、ＫＨ2 ＰＯ4
１ｇ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ4
・７Ｈ2 Ｏ ０．０１ｇ、ＭｎＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏ ０．
０１ｇおよびチアミン・塩酸塩１００μg を含む、ｄ−
ビオチンを含まない合成培地（以下、ＭＭと略記する）
で培養し、２〜３日ごとにＡＣＭ２００μg/mlおよびＴ
ＶＡ２００μg/mlを含む新しい培地で連続的に数回植え
継いだ。その結果、得られる集積物を希釈し、ＡＣＭ２
００μg/mlおよびＴＶＡ２００μg/mlを含むＭＭ寒天平
板上にまいた。培養後、生育した大きなコロニーを、
（１）で述べたのと同様の方法で、ラクトバチルス・プ
ランタラムＡＴＣＣ８０１４を含む定量平板上に植菌し
た。培養後、生育ハローの直径を測定した。その結果、
最も大きなハローを形成するコロニーを得、クルチアＳ
Ｐ５３８−１７Ｈ４と命名した。
【００１０】（３）大量のｄ−ビオチン生産能を有する
ＡＣＭ、ＴＶＡおよびＭｅＤＴＢ耐性変異株の分離 クルチアＳＰ５３８−１７Ｈ４を培養し、その細胞を
（１）で述べたのと同様の方法でＮＴＧで処理した。処
理した細胞を、ＡＣＭ １００μg/mlを含むＢＭ寒天平
板上にまいた。培養後、プレート中でｄ−デチオビオチ
ン０. ５μg/mlおよびＭｅＤＴＢ８０μg/mlを含む生産
培地の寒天ブロック上にコロニーを植菌した。培養後、
寒天ブロックに紫外線を照射し、それらの寒天ブロック
をラクトバチルス・プランタラムＡＴＣＣ８０１４を含
む定量平板上に移した。培養後、生育ハローの直径を測
定した。その結果、最も大きなハローを形成するコロニ
ーを得、クルチアＳＰ５３８−５１Ｆ９と命名した。
ＡＣＭ、ＴＶＡおよびＭｅＤＴＢ耐性変異株の分離 クルチアＳＰ５３８−１７Ｈ４を培養し、その細胞を
（１）で述べたのと同様の方法でＮＴＧで処理した。処
理した細胞を、ＡＣＭ １００μg/mlを含むＢＭ寒天平
板上にまいた。培養後、プレート中でｄ−デチオビオチ
ン０. ５μg/mlおよびＭｅＤＴＢ８０μg/mlを含む生産
培地の寒天ブロック上にコロニーを植菌した。培養後、
寒天ブロックに紫外線を照射し、それらの寒天ブロック
をラクトバチルス・プランタラムＡＴＣＣ８０１４を含
む定量平板上に移した。培養後、生育ハローの直径を測
定した。その結果、最も大きなハローを形成するコロニ
ーを得、クルチアＳＰ５３８−５１Ｆ９と命名した。
【００１１】更に、前のパラグラフで述べたのと同様の
方法でＭｅＤＴＢ １５０μg/mlに耐性な変異株をスク
リーニングした。その実験から、クルチアＳＰ５３８−
５１Ｆ９より更に大きなハローを形成するコロニーを
得、クルチアＳＰ５３８−２Ａ１３と命名した。
方法でＭｅＤＴＢ １５０μg/mlに耐性な変異株をスク
リーニングした。その実験から、クルチアＳＰ５３８−
５１Ｆ９より更に大きなハローを形成するコロニーを
得、クルチアＳＰ５３８−２Ａ１３と命名した。
【００１２】本発明の製造法は、同化可能な炭素源、消
化しやすい窒素源、無機塩、および微生物の生育に必要
な他の栄養素を含む培地で微生物を培養することにより
適宜実施する。炭素源としては、たとえばグルコース、
フラクトース、デンプン、乳糖、マルトース、ガラクト
ース、スクロース、デキストリン、グリセリン又はキビ
ゼリーなどが用いられ、好ましくはグリセリン又はグル
コースが用いられる。窒素源としては、たとえばペプト
ン、大豆粉、コーンスチープリカー（corn steep liquo
r)、肉エキス、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、
尿素又はそれらの混合物が用いられ、好ましくはペプト
ンが用いられる。更に、その他の微量元素としてカルシ
ウム、マグネシウム、亜鉛、マンガン、コバルトおよび
鉄の硫酸塩、塩酸塩あるいはリン酸塩などが用いられ
る。特に好ましい無機塩は、リン酸一カリウム、硫酸マ
グネシウム、硫酸第一鉄および硫酸マンガンである。ま
た、必要に応じて動物油、植物油、鉱油などの一般的な
栄養因子もしくは消泡剤を加えてもよい。培養に用いる
培地のpHは、好都合には約５. ０ないし９. ０、好まし
くは約６. ５ないし７. ５である。培養温度は、適当に
は約１０ないし４０℃、好ましくは約２６ないし３０℃
である。培養時間は、約１ないし１０日、好ましくは約
２ないし７日、最も好ましくは約２ないし４日（４８な
いし９６時間）である。通常、培養において通気、撹拌
により好ましい結果が得られる。
化しやすい窒素源、無機塩、および微生物の生育に必要
な他の栄養素を含む培地で微生物を培養することにより
適宜実施する。炭素源としては、たとえばグルコース、
フラクトース、デンプン、乳糖、マルトース、ガラクト
ース、スクロース、デキストリン、グリセリン又はキビ
ゼリーなどが用いられ、好ましくはグリセリン又はグル
コースが用いられる。窒素源としては、たとえばペプト
ン、大豆粉、コーンスチープリカー（corn steep liquo
r)、肉エキス、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、
尿素又はそれらの混合物が用いられ、好ましくはペプト
ンが用いられる。更に、その他の微量元素としてカルシ
ウム、マグネシウム、亜鉛、マンガン、コバルトおよび
鉄の硫酸塩、塩酸塩あるいはリン酸塩などが用いられ
る。特に好ましい無機塩は、リン酸一カリウム、硫酸マ
グネシウム、硫酸第一鉄および硫酸マンガンである。ま
た、必要に応じて動物油、植物油、鉱油などの一般的な
栄養因子もしくは消泡剤を加えてもよい。培養に用いる
培地のpHは、好都合には約５. ０ないし９. ０、好まし
くは約６. ５ないし７. ５である。培養温度は、適当に
は約１０ないし４０℃、好ましくは約２６ないし３０℃
である。培養時間は、約１ないし１０日、好ましくは約
２ないし７日、最も好ましくは約２ないし４日（４８な
いし９６時間）である。通常、培養において通気、撹拌
により好ましい結果が得られる。
【００１３】本発明の製造法において、好ましくは、微
生物の培養は、同化可能な炭素源、消化しやすい窒素
源、無機塩、および微生物の成育に必要な他の栄養素を
含む培地中、約５．０ないし９．０のpH、約１０ないし
４０℃の温度で、好気的条件下で、約１ないし１０日間
行う。より好ましくは、微生物の培養は、炭素源として
グリセリン又はグルコース、窒素源としてペプトン、そ
してリン酸一カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄
および硫酸マンガンなどの無機塩少量を含む培地中、約
６．５ないし７．５のpH、約２６ないし３０℃の温度
で、好気的条件下で、約４８ないし９６時間行う。
生物の培養は、同化可能な炭素源、消化しやすい窒素
源、無機塩、および微生物の成育に必要な他の栄養素を
含む培地中、約５．０ないし９．０のpH、約１０ないし
４０℃の温度で、好気的条件下で、約１ないし１０日間
行う。より好ましくは、微生物の培養は、炭素源として
グリセリン又はグルコース、窒素源としてペプトン、そ
してリン酸一カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄
および硫酸マンガンなどの無機塩少量を含む培地中、約
６．５ないし７．５のpH、約２６ないし３０℃の温度
で、好気的条件下で、約４８ないし９６時間行う。
【００１４】培養後、生産されたｄ−ビオチンは、培養
ブロスから分離され、精製される。通常、培養ブロスか
ら生成物の抽出に用いる方法は、ｄ−ビオチンの各種の
性質を利用して行われる。したがって、たとえば菌体を
培養ブロスから除き、その濾液中の所望な物質を活性炭
に吸着させ、溶出後、更にイオン交換樹脂で精製する。
あるいは、直接、培養濾液をイオン交換樹脂に適用し、
溶出後、所望な生成物をアルコールと水の混液から再結
晶化する。
ブロスから分離され、精製される。通常、培養ブロスか
ら生成物の抽出に用いる方法は、ｄ−ビオチンの各種の
性質を利用して行われる。したがって、たとえば菌体を
培養ブロスから除き、その濾液中の所望な物質を活性炭
に吸着させ、溶出後、更にイオン交換樹脂で精製する。
あるいは、直接、培養濾液をイオン交換樹脂に適用し、
溶出後、所望な生成物をアルコールと水の混液から再結
晶化する。
【００１５】本発明で用いられる微生物は、ＡＣＭ、Ｔ
ＶＡ、ＭｅＤＴＢ、２−メチルＡＣＭ、アミクレノマイ
シンおよびビスノルビオチノール又はそれらの混合物に
耐性な、ｄ−ビオチン生産能を有するクルチア属に属す
るすべての菌株を含む。クルチア属の菌株の中で、特に
好ましい株はクルチアＳＰ５３８−ＫＡ２６、クルチア
ＳＰ５３８−１７Ｈ４、クルチアＳＰ５３８−５１Ｆ９
およびクルチアＳＰ５３８−２Ａ１３であり、それらの
菌は１９９６年３月２６日にドイツ、ブラウンシュバイ
クのＤＳＭ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen
und Zellkulturen GmbH)に、それぞれＤＳＭ No.１０６
０９、ＤＳＭ No.１０６０８、ＤＳＭ No.１０６１０お
よびＤＳＭ No.１０６０７として寄託されており、これ
ら自体が本発明に包含される。
ＶＡ、ＭｅＤＴＢ、２−メチルＡＣＭ、アミクレノマイ
シンおよびビスノルビオチノール又はそれらの混合物に
耐性な、ｄ−ビオチン生産能を有するクルチア属に属す
るすべての菌株を含む。クルチア属の菌株の中で、特に
好ましい株はクルチアＳＰ５３８−ＫＡ２６、クルチア
ＳＰ５３８−１７Ｈ４、クルチアＳＰ５３８−５１Ｆ９
およびクルチアＳＰ５３８−２Ａ１３であり、それらの
菌は１９９６年３月２６日にドイツ、ブラウンシュバイ
クのＤＳＭ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen
und Zellkulturen GmbH)に、それぞれＤＳＭ No.１０６
０９、ＤＳＭ No.１０６０８、ＤＳＭ No.１０６１０お
よびＤＳＭ No.１０６０７として寄託されており、これ
ら自体が本発明に包含される。
【００１６】
【実施例】以下、本発明について実施例を示して更に詳
細な説明を行うが、本発明は、特定の実施例に限定され
るものではないと理解される。
細な説明を行うが、本発明は、特定の実施例に限定され
るものではないと理解される。
【００１７】実施例１ １％ブイヨン（極東製薬）を含む寒天培地（以下、ＮＢ
と略記する）に生育したクルチアＳＰ５３８−６（ＤＳ
Ｍ No.９４５４）の一白金耳の細胞を、ＮＢ培地５０ml
を含む５００ml容フラスコに植菌し、２８℃で回転振と
う（１８０rpm)を行った。１３. ５時間培養後、培養ブ
ロス中の細胞を７, ５００rpm で１０分間遠心分離する
ことにより集め、滅菌生理食塩水で２回洗浄し、滅菌水
２０mlに懸濁した。１００mMトリス塩酸緩衝液（pH８.
０）中、ＮＴＧ５０〜３００μg/mlおよび１×１０7 個
／mlの細胞を含む反応混合物５mlを含む試験管を、２８
℃で３０分間、往復振とう（２８５rpm)した。その細胞
を滅菌生理食塩水５mlで２回洗浄し、生理食塩水５mlに
懸濁した。その細胞懸濁液を１０-1〜１０-7まで滅菌生
理食塩水で連続的に希釈し、ＡＣＭ １００μg/mlを含
むＢＭ寒天上にまいた。２８℃で３日間培養後、生育し
たそれぞれのコロニーのｄ−ビオチン生産性を、以下に
述べるラクトバチルス・プランタラムＡＴＣＣ８０１４
を含む寒天平板法で定量した。７５０のコロニーを、ラ
クトバチルス・プランタラムＡＴＣＣ８０１４を含む定
量平板上に楊枝を用いて移した。３７℃で一晩培養後、
ｄ−ビオチン量に依存する生育ハローの直径を測定し
た。その結果、最も大きなハローを形成するクルチアＳ
Ｐ５３８−ＫＡ２６（ＤＳＭ No.１０６０９）を得た。
と略記する）に生育したクルチアＳＰ５３８−６（ＤＳ
Ｍ No.９４５４）の一白金耳の細胞を、ＮＢ培地５０ml
を含む５００ml容フラスコに植菌し、２８℃で回転振と
う（１８０rpm)を行った。１３. ５時間培養後、培養ブ
ロス中の細胞を７, ５００rpm で１０分間遠心分離する
ことにより集め、滅菌生理食塩水で２回洗浄し、滅菌水
２０mlに懸濁した。１００mMトリス塩酸緩衝液（pH８.
０）中、ＮＴＧ５０〜３００μg/mlおよび１×１０7 個
／mlの細胞を含む反応混合物５mlを含む試験管を、２８
℃で３０分間、往復振とう（２８５rpm)した。その細胞
を滅菌生理食塩水５mlで２回洗浄し、生理食塩水５mlに
懸濁した。その細胞懸濁液を１０-1〜１０-7まで滅菌生
理食塩水で連続的に希釈し、ＡＣＭ １００μg/mlを含
むＢＭ寒天上にまいた。２８℃で３日間培養後、生育し
たそれぞれのコロニーのｄ−ビオチン生産性を、以下に
述べるラクトバチルス・プランタラムＡＴＣＣ８０１４
を含む寒天平板法で定量した。７５０のコロニーを、ラ
クトバチルス・プランタラムＡＴＣＣ８０１４を含む定
量平板上に楊枝を用いて移した。３７℃で一晩培養後、
ｄ−ビオチン量に依存する生育ハローの直径を測定し
た。その結果、最も大きなハローを形成するクルチアＳ
Ｐ５３８−ＫＡ２６（ＤＳＭ No.１０６０９）を得た。
【００１８】ＡＣＭ １００μg/mlを含むＢＭ寒天上に
生育するクルチアＳＰ５３８−ＫＡ２６の一白金耳の細
胞を、グリセリン２％、プロテオース・ペプトン（日本
製薬）４％、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．１％、ＭｇＳＯ4 ・７
Ｈ2 Ｏ ０．０５％、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．００
１％、ＭｎＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏ ０．００１％からなる生
産培地５mlを含む試験管に植菌後、その試験管を往復振
とう機（２８５rpm)にて２８℃で振とうした。３日間培
養後、培養ブロス上澄中のｄ−ビオチン含量を、以下に
述べるラクトバチルス・プランタラムＡＴＣＣ８０１４
を用いる比濁法で定量した。上澄およびｄ−ビオチンの
標準溶液（０〜１０mg/l）を蒸留水で順次１. ２５×１
０-3まで希釈した。希釈溶液５０μl および蒸留水５ml
をこの順に試験管に加えた。１２０℃で１０分間オート
クレーブ滅菌後、ラクトバチルス・プランタラムＡＴＣ
Ｃ８０１４を含むｄ−ビオチン定量用培地（日水）５ml
を試験管に加え、３７℃で試験管を垂直に立てて培養し
た。２１時間培養後、菌体の増殖を、０. ２N 塩酸５ml
を加えて停止し、その後６６０nmで試料の濁度を測定し
た。試料中のｄ−ビオチン量は、試料の濁度を、ラクト
バチルス・プランタラムＡＴＣＣ８０１４の標準生育曲
線と比較して計算した。その結果、３日目の培養ブロス
上澄中には１リットルあたり３. ９mgのｄ−ビオチンが
含まれていた。クルチアＳＰ５３８−ＫＡ２６（ＤＳＭ
No.１０６０９）は、親株のクルチアＳＰ５３８−６
（ＤＳＭ No.９４５４）の約３, ９００倍のｄ−ビオチ
ンを生産していた。
生育するクルチアＳＰ５３８−ＫＡ２６の一白金耳の細
胞を、グリセリン２％、プロテオース・ペプトン（日本
製薬）４％、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．１％、ＭｇＳＯ4 ・７
Ｈ2 Ｏ ０．０５％、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．００
１％、ＭｎＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏ ０．００１％からなる生
産培地５mlを含む試験管に植菌後、その試験管を往復振
とう機（２８５rpm)にて２８℃で振とうした。３日間培
養後、培養ブロス上澄中のｄ−ビオチン含量を、以下に
述べるラクトバチルス・プランタラムＡＴＣＣ８０１４
を用いる比濁法で定量した。上澄およびｄ−ビオチンの
標準溶液（０〜１０mg/l）を蒸留水で順次１. ２５×１
０-3まで希釈した。希釈溶液５０μl および蒸留水５ml
をこの順に試験管に加えた。１２０℃で１０分間オート
クレーブ滅菌後、ラクトバチルス・プランタラムＡＴＣ
Ｃ８０１４を含むｄ−ビオチン定量用培地（日水）５ml
を試験管に加え、３７℃で試験管を垂直に立てて培養し
た。２１時間培養後、菌体の増殖を、０. ２N 塩酸５ml
を加えて停止し、その後６６０nmで試料の濁度を測定し
た。試料中のｄ−ビオチン量は、試料の濁度を、ラクト
バチルス・プランタラムＡＴＣＣ８０１４の標準生育曲
線と比較して計算した。その結果、３日目の培養ブロス
上澄中には１リットルあたり３. ９mgのｄ−ビオチンが
含まれていた。クルチアＳＰ５３８−ＫＡ２６（ＤＳＭ
No.１０６０９）は、親株のクルチアＳＰ５３８−６
（ＤＳＭ No.９４５４）の約３, ９００倍のｄ−ビオチ
ンを生産していた。
【００１９】実施例２ 実施例１で述べたのと同様の方法で、クルチアＳＰ５３
８−ＫＡ２６（ＤＳＭNo.１０６０９）の細胞をＮＴＧ
で処理し、ＡＣＭおよびＴＶＡに耐性な細胞を以下に述
べるように集積した。ＮＴＧ処理後、洗浄した細胞を、
ＡＣＭ １００μg/mlを含むＢＭ培地５mlを含む試験管
に植菌し、その試験管を往復振とう機（２８５rpm)にて
２８℃で振とうした。一晩培養後、その培養ブロスを、
ＡＣＭ２００μg/mlおよびＴＶＡ２００μg/mlを含むＭ
Ｍ５mlを含む試験管に、６００nmでの濁度が約０. ０３
になるよう植菌した。その試験管を２８℃で振とうし、
培養物が混濁するまで生育させた。この集積を２又は３
日ごとにＡＣＭ２００μg/mlおよびＴＶＡ２００μg/ml
を含む新しいＭＭ培地を含む試験管でくり返した。３回
くり返した後、培養物を生理食塩水で希釈し、同じ培地
の寒天上にまいた。２８℃で３〜４日間培養後、６５０
のコロニーについてｄ−ビオチン生産性を、ラクトバチ
ルス・プランタラムＡＴＣＣ８０１４を含む定量平板上
で定量した。その結果、最も大きなハローを生産するク
ルチアＳＰ５３８−１７Ｈ４（ＤＳＭNo.１０６０８）
を得た。
８−ＫＡ２６（ＤＳＭNo.１０６０９）の細胞をＮＴＧ
で処理し、ＡＣＭおよびＴＶＡに耐性な細胞を以下に述
べるように集積した。ＮＴＧ処理後、洗浄した細胞を、
ＡＣＭ １００μg/mlを含むＢＭ培地５mlを含む試験管
に植菌し、その試験管を往復振とう機（２８５rpm)にて
２８℃で振とうした。一晩培養後、その培養ブロスを、
ＡＣＭ２００μg/mlおよびＴＶＡ２００μg/mlを含むＭ
Ｍ５mlを含む試験管に、６００nmでの濁度が約０. ０３
になるよう植菌した。その試験管を２８℃で振とうし、
培養物が混濁するまで生育させた。この集積を２又は３
日ごとにＡＣＭ２００μg/mlおよびＴＶＡ２００μg/ml
を含む新しいＭＭ培地を含む試験管でくり返した。３回
くり返した後、培養物を生理食塩水で希釈し、同じ培地
の寒天上にまいた。２８℃で３〜４日間培養後、６５０
のコロニーについてｄ−ビオチン生産性を、ラクトバチ
ルス・プランタラムＡＴＣＣ８０１４を含む定量平板上
で定量した。その結果、最も大きなハローを生産するク
ルチアＳＰ５３８−１７Ｈ４（ＤＳＭNo.１０６０８）
を得た。
【００２０】ＡＣＭ １００μg/mlを含むＢＭ寒天上に
生育するクルチアＳＰ５３８−１７Ｈ４（ＤＳＭ No.１
０６０８）の一白金耳の細胞を、ＡＣＭ５００μg/mlを
含むＢＭ培地５mlを含む試験管に植菌し、その試験管を
２８℃で振とうした。一晩培養後、培養ブロス１mlを、
グリセリン４％、プロテオース・ペプトン４. ５％、Ｋ
Ｈ2 ＰＯ4 ０．１％、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．０
５％、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．０５％、ＭｎＳＯ4
・５Ｈ2 Ｏ ０．００１％および消泡剤ＣＡ−１１５
（日本油脂）１滴からなる生産培地５０mlを含むフラス
コに移し、そのフラスコを２８℃で振とうした。７２時
間培養後、培養ブロス上澄中のｄ−ビオチン含量を、ラ
クトバチルス・プランタラムＡＴＣＣ８０１４を用いる
比濁法で定量した。その結果、上澄中には１リットルあ
たり２６. ３mgのｄ−ビオチンが含まれていた。クルチ
アＳＰ５３８−１７Ｈ４（ＤＳＭ No.１０６０８）は、
親株のクルチアＳＰ５３８−ＫＡ２６（ＤＳＭ No.１０
６０９）の約６. ７倍のｄ−ビオチンを生産していた。
生育するクルチアＳＰ５３８−１７Ｈ４（ＤＳＭ No.１
０６０８）の一白金耳の細胞を、ＡＣＭ５００μg/mlを
含むＢＭ培地５mlを含む試験管に植菌し、その試験管を
２８℃で振とうした。一晩培養後、培養ブロス１mlを、
グリセリン４％、プロテオース・ペプトン４. ５％、Ｋ
Ｈ2 ＰＯ4 ０．１％、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．０
５％、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．０５％、ＭｎＳＯ4
・５Ｈ2 Ｏ ０．００１％および消泡剤ＣＡ−１１５
（日本油脂）１滴からなる生産培地５０mlを含むフラス
コに移し、そのフラスコを２８℃で振とうした。７２時
間培養後、培養ブロス上澄中のｄ−ビオチン含量を、ラ
クトバチルス・プランタラムＡＴＣＣ８０１４を用いる
比濁法で定量した。その結果、上澄中には１リットルあ
たり２６. ３mgのｄ−ビオチンが含まれていた。クルチ
アＳＰ５３８−１７Ｈ４（ＤＳＭ No.１０６０８）は、
親株のクルチアＳＰ５３８−ＫＡ２６（ＤＳＭ No.１０
６０９）の約６. ７倍のｄ−ビオチンを生産していた。
【００２１】実施例３ クルチアＳＰ５３８−１７Ｈ４（ＤＳＭ No.１０６０
８）の培養ブロスからｄ−ビオチンを採取した。それぞ
れの精製過程でのｄ−ビオチン濃度は、ラクトバチルス
・プランタラムＡＴＣＣ８０１４を用いる比濁法で追跡
した。ラクトバチルス・プランタラムＡＴＣＣ８０１４
に対してｄ−ビオチン活性２５. ７mg/lを有する７２時
間培養ブロス１リットルを、７, ５００rpm で１０分
間、遠心分離した。その上澄を、活性炭（和光純藥）３
８０mlを充填した３. ６×４２cmのカラムに通した。そ
のカラムを脱イオン水５００mlで洗浄後、５０％エタノ
ール４７４mlと２５％アンモニア２６mlを含むエタノー
ル／アンモニア溶液５００mlで展開した。ラクトバチル
ス・プランタラムＡＴＣＣ８０１４に対してｄ−ビオチ
ン活性８２. １mg/lを有する溶出液３００mlを減圧下、
５０mlまで濃縮した。その濃縮物を、ダウエックス（Do
wex)１×４（ギ酸型、１００−２００メッシュ、Dow Ch
emical Co. Ltd., U.S.A.)１９０mlを充填したカラム
（２. ６×３８cm）に通した後、そのカラムを０. ０５
M ギ酸２００mlで洗浄した。その後カラムを、０. １M
ギ酸２５０mlを初発の緩衝液として展開し、０. １M ギ
酸と０. ３５M ギ酸のそれぞれ２５０mlで直線的濃度勾
配溶出を行った。ラクトバチルス・プランタラムＡＴＣ
Ｃ８０１４に対してｄ−ビオチン活性１４４. ８mg/lを
有する溶出液１６０mlを減圧下で濃縮して、白色粉末１
７. ６mgを得た。その白色粉末を、エタノール−水混液
から結晶化して、２３２℃の融点を有する白色針状物質
１５. １mgを得た。その試料の融点、薄層クロマトグラ
フ上でのＲｆ値（溶媒系：酢酸エチル／メタノール＝１
０／１、Kieselgel 60 F254 ，E. Merck）、赤外線吸収
スペクトル、ＮＭＲスペクトルは、ｄ−ビオチン標品
（Sigma Co, Ltd.,U.S.A.）のそれらと一致していた。
８）の培養ブロスからｄ−ビオチンを採取した。それぞ
れの精製過程でのｄ−ビオチン濃度は、ラクトバチルス
・プランタラムＡＴＣＣ８０１４を用いる比濁法で追跡
した。ラクトバチルス・プランタラムＡＴＣＣ８０１４
に対してｄ−ビオチン活性２５. ７mg/lを有する７２時
間培養ブロス１リットルを、７, ５００rpm で１０分
間、遠心分離した。その上澄を、活性炭（和光純藥）３
８０mlを充填した３. ６×４２cmのカラムに通した。そ
のカラムを脱イオン水５００mlで洗浄後、５０％エタノ
ール４７４mlと２５％アンモニア２６mlを含むエタノー
ル／アンモニア溶液５００mlで展開した。ラクトバチル
ス・プランタラムＡＴＣＣ８０１４に対してｄ−ビオチ
ン活性８２. １mg/lを有する溶出液３００mlを減圧下、
５０mlまで濃縮した。その濃縮物を、ダウエックス（Do
wex)１×４（ギ酸型、１００−２００メッシュ、Dow Ch
emical Co. Ltd., U.S.A.)１９０mlを充填したカラム
（２. ６×３８cm）に通した後、そのカラムを０. ０５
M ギ酸２００mlで洗浄した。その後カラムを、０. １M
ギ酸２５０mlを初発の緩衝液として展開し、０. １M ギ
酸と０. ３５M ギ酸のそれぞれ２５０mlで直線的濃度勾
配溶出を行った。ラクトバチルス・プランタラムＡＴＣ
Ｃ８０１４に対してｄ−ビオチン活性１４４. ８mg/lを
有する溶出液１６０mlを減圧下で濃縮して、白色粉末１
７. ６mgを得た。その白色粉末を、エタノール−水混液
から結晶化して、２３２℃の融点を有する白色針状物質
１５. １mgを得た。その試料の融点、薄層クロマトグラ
フ上でのＲｆ値（溶媒系：酢酸エチル／メタノール＝１
０／１、Kieselgel 60 F254 ，E. Merck）、赤外線吸収
スペクトル、ＮＭＲスペクトルは、ｄ−ビオチン標品
（Sigma Co, Ltd.,U.S.A.）のそれらと一致していた。
【００２２】実施例４ 実施例１で述べたのと同様の方法で、クルチアＳＰ５３
８−１７Ｈ４（ＤＳＭNo.１０６０８）の細胞をＮＴＧ
で処理した後、ＭｅＤＴＢに耐性な変異株を以下に述べ
る方法でスクリーニングした。処理した細胞を、ＡＣＭ
１００μg/mlを含むＢＭ培地中で２８℃で一晩培養し
た後、その培養物を滅菌生理食塩水で１０-1〜１０-7ま
で連続的に希釈し、ＡＣＭ８０μg/mlを含むＢＭ寒天上
にまいた。２８℃で２〜３日培養後、プレート中でｄ−
デチオビオチン０．５μg/mlおよびＭｅＤＴＢ８０μg/
mlを補給した、グリセリン２％、プロテオース・ペプト
ン２％、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．１％、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2
Ｏ ０．０５％、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．０５％、
ＭｎＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏ ０．００１％および寒天１. ５
％を含む生産培地の寒天ブロック上に１９，５００のコ
ロニーを植菌した。２８℃で２日培養後、寒天ブロック
に紫外線を２時間照射し、ラクトバチルス・プランタラ
ムＡＴＣＣ８０１４を含む定量平板上に移した。定量平
板を３７℃で１９時間培養し、ハローの直径を測定し
た。その結果、最も大きなハローを形成するクルチアＳ
Ｐ５３８−５１Ｆ９（ＤＳＭ No.１０６１０）を得た。
８−１７Ｈ４（ＤＳＭNo.１０６０８）の細胞をＮＴＧ
で処理した後、ＭｅＤＴＢに耐性な変異株を以下に述べ
る方法でスクリーニングした。処理した細胞を、ＡＣＭ
１００μg/mlを含むＢＭ培地中で２８℃で一晩培養し
た後、その培養物を滅菌生理食塩水で１０-1〜１０-7ま
で連続的に希釈し、ＡＣＭ８０μg/mlを含むＢＭ寒天上
にまいた。２８℃で２〜３日培養後、プレート中でｄ−
デチオビオチン０．５μg/mlおよびＭｅＤＴＢ８０μg/
mlを補給した、グリセリン２％、プロテオース・ペプト
ン２％、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．１％、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2
Ｏ ０．０５％、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．０５％、
ＭｎＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏ ０．００１％および寒天１. ５
％を含む生産培地の寒天ブロック上に１９，５００のコ
ロニーを植菌した。２８℃で２日培養後、寒天ブロック
に紫外線を２時間照射し、ラクトバチルス・プランタラ
ムＡＴＣＣ８０１４を含む定量平板上に移した。定量平
板を３７℃で１９時間培養し、ハローの直径を測定し
た。その結果、最も大きなハローを形成するクルチアＳ
Ｐ５３８−５１Ｆ９（ＤＳＭ No.１０６１０）を得た。
【００２３】ＡＣＭ １００μg/mlを含むＢＭ寒天上に
生育するクルチアＳＰ５３８−５１Ｆ９（ＤＳＭ No.１
０６１０）の一白金耳の細胞を、ＡＣＭ５００μg/mlを
含むＢＭ培地５mlを含む試験管中、２８℃で培養した。
一晩培養後、その細胞を遠心分離により集め、１０％グ
リセリン溶液に懸濁した。その細胞懸濁液１mlを、グリ
セリン６％、プロテオース・ペプトン５. ５％、ＫＨ2
ＰＯ4 ０. １％、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０. ０５
％、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０. ０５％、ＭｎＳＯ4 ・
５Ｈ2 Ｏ ０. ００１％および消泡剤ＣＡ−１１５ １
滴を含む生産培地５０ml（以下、ＦＭ１と略記する）を
含むフラスコに植菌し、そのフラスコを２８℃で培養し
た。７２時間培養後、培養ブロス上澄中のｄ−ビオチン
含量を、ラクトバチルス・プランタラムＡＴＣＣ８０１
４を用いる比濁法で定量した。その結果、上澄中には１
リットルあたり４１. ５mgのｄ−ビオチンが含まれてい
た。クルチアＳＰ５３８−５１Ｆ９（ＤＳＭ No.１０６
１０）は、親株のクルチアＳＰ５３８−１７Ｈ４（ＤＳ
Ｍ No.１０６０８）の約１. ６倍のｄ−ビオチンを生産
していた。
生育するクルチアＳＰ５３８−５１Ｆ９（ＤＳＭ No.１
０６１０）の一白金耳の細胞を、ＡＣＭ５００μg/mlを
含むＢＭ培地５mlを含む試験管中、２８℃で培養した。
一晩培養後、その細胞を遠心分離により集め、１０％グ
リセリン溶液に懸濁した。その細胞懸濁液１mlを、グリ
セリン６％、プロテオース・ペプトン５. ５％、ＫＨ2
ＰＯ4 ０. １％、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０. ０５
％、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０. ０５％、ＭｎＳＯ4 ・
５Ｈ2 Ｏ ０. ００１％および消泡剤ＣＡ−１１５ １
滴を含む生産培地５０ml（以下、ＦＭ１と略記する）を
含むフラスコに植菌し、そのフラスコを２８℃で培養し
た。７２時間培養後、培養ブロス上澄中のｄ−ビオチン
含量を、ラクトバチルス・プランタラムＡＴＣＣ８０１
４を用いる比濁法で定量した。その結果、上澄中には１
リットルあたり４１. ５mgのｄ−ビオチンが含まれてい
た。クルチアＳＰ５３８−５１Ｆ９（ＤＳＭ No.１０６
１０）は、親株のクルチアＳＰ５３８−１７Ｈ４（ＤＳ
Ｍ No.１０６０８）の約１. ６倍のｄ−ビオチンを生産
していた。
【００２４】実施例５ ＭｅＤＴＢに対してより耐性な変異株を、クルチアＳＰ
５３８−５１Ｆ９（ＤＳＭ No.１０６１０）から誘導し
た。実施例１で述べたのと同様の方法で、クルチアＳＰ
５３８−５１Ｆ９（ＤＳＭ No.１０６１０）の細胞をＮ
ＴＧで処理した後、ＭｅＤＴＢ １５０μg/mlに耐性な
変異株を、寒天ブロック中のＭｅＤＴＢ濃度以外は実施
例４で述べたのと同様の方法でスクリーニングした。そ
の結果、最も大きなハローを形成するクルチアＳＰ５３
８−２Ａ１３（ＤＳＭ No.１０６０７）を得た。
５３８−５１Ｆ９（ＤＳＭ No.１０６１０）から誘導し
た。実施例１で述べたのと同様の方法で、クルチアＳＰ
５３８−５１Ｆ９（ＤＳＭ No.１０６１０）の細胞をＮ
ＴＧで処理した後、ＭｅＤＴＢ １５０μg/mlに耐性な
変異株を、寒天ブロック中のＭｅＤＴＢ濃度以外は実施
例４で述べたのと同様の方法でスクリーニングした。そ
の結果、最も大きなハローを形成するクルチアＳＰ５３
８−２Ａ１３（ＤＳＭ No.１０６０７）を得た。
【００２５】実施例４で述べたのと同様の方法で、クル
チアＳＰ５３８−２Ａ１３（ＤＳＭNo.１０６０７）
を、ＦＭ１培地５０mlを含むフラスコで２８℃で培養し
た。２４時間培養後、グリセリン４０％およびプロテオ
ース・ペプトン２０％を含む滅菌培地５mlを供給し、培
養を続けた。１２０時間培養後、培養ブロス上澄中のｄ
−ビオチン含量を、ラクトバチルス・プランタラムＡＴ
ＣＣ８０１４を用いる比濁法で定量した。その結果、上
澄には１リットルあたり１２６mgのｄ−ビオチンが含ま
れていた。クルチアＳＰ５３８−２Ａ１３（ＤＳＭ No.
１０６０７）は、親株のクルチアＳＰ５３８−５１Ｆ９
（ＤＳＭ No.１０６１０）の約３倍のｄ−ビオチンを生
産していた。
チアＳＰ５３８−２Ａ１３（ＤＳＭNo.１０６０７）
を、ＦＭ１培地５０mlを含むフラスコで２８℃で培養し
た。２４時間培養後、グリセリン４０％およびプロテオ
ース・ペプトン２０％を含む滅菌培地５mlを供給し、培
養を続けた。１２０時間培養後、培養ブロス上澄中のｄ
−ビオチン含量を、ラクトバチルス・プランタラムＡＴ
ＣＣ８０１４を用いる比濁法で定量した。その結果、上
澄には１リットルあたり１２６mgのｄ−ビオチンが含ま
れていた。クルチアＳＰ５３８−２Ａ１３（ＤＳＭ No.
１０６０７）は、親株のクルチアＳＰ５３８−５１Ｆ９
（ＤＳＭ No.１０６１０）の約３倍のｄ−ビオチンを生
産していた。
【００２６】下記の表−１には、これまでに得られた変
異株のｄ−ビオチン生産性を要約した。
異株のｄ−ビオチン生産性を要約した。
【００２７】
【表１】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 田副 正明 神奈川県横浜市磯子区洋光台５−14−22
Claims (2)
- 【請求項１】 ビオチン代謝拮抗物質に耐性を有し、ｄ
−ビオチン生産能を有するクルチア属に属する微生物
を、好気的条件下、培地中で培養し、生成したｄ−ビオ
チンを発酵ブロスから分離することを特徴とするｄ−ビ
オチンの製造法。 - 【請求項２】 クルチアＳＰ５３８−ＫＡ２６（ＤＳＭ
No.１０６０９）、クルチアＳＰ５３８−１７Ｈ４（Ｄ
ＳＭ No.１０６０８）、クルチアＳＰ５３８−５１Ｆ９
（ＤＳＭ No.１０６１０）およびクルチアＳＰ５３８−
２Ａ１３（ＤＳＭ No.１０６０７）。
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