JPH0361436B2 - - Google Patents
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は発酵法によるプロトカテク酸の製造法
に関する。プロトカテク酸は食品用抗酸化剤の原
料として、又香料としての用途を有するバニリン
の原料、更には各種医薬品の原料として有用であ
る。従来プロトカテの酸を培地中に蓄積する菌と
してノイロスポラ属菌の変異株（バイオケミカル
ジヤーナル68、168、1958年）、コリネバクテリウ
ム属菌の変異株（特公昭45−39036）、ブレビバク
テリウム属菌の変異株（特開昭50−8952）等が報
告されている。 本発明者等は更に効率良くプロトカテク酸を発
酵生産する方法を開発することを目的として研究
を重ねた結果、ブレビバクテリウム属又はコリネ
バクテリウム属に属し、唯一の炭素源としてプロ
トカテク酸では生育できない変異株の中に多量の
プロトカテク酸を生成、蓄積する菌株が存在する
ことを見い出した。 本発明はこの知見に基づいて完成されたもので
ある。 本発明において、プロトカテク酸生産能を有す
る微生物はブレビバクテリウム属又はコリネバク
テリウム属等のコリネ型細菌に属し、プロトカテ
ク酸生産に必要な性質、例えばパラフルオロフエ
ニルアラニン、メタフルオロフエニルアラニン、
チロシンハイドロキサメート又は５−メチルトリ
プトフアン等の芳香族アミノ酸アナログ耐性もし
くはチロシン、フエニルアラニン、トリプトフア
ン等の芳香族アミノ酸の単独ないし、複合要求
性、更には芳香族アミノ酸生合成系の中間体であ
るシキミ酸やコリスミン酸等の要求性を有する微
生物である。 本発明において使用される変異株はブレビバク
テリウム属又はコリネバクテリウム属等のコリネ
型細菌に属し上記プロトカテク酸生産能を有する
性質を示し、かつ唯一の炭素源としてプロトカテ
ク酸で生育できない性質を有する変異株である。 本発明において用いられる微生物は、具体的に
は例えば ブレビバクテリウム・ ブレビバクテリウム・ ラクトフエルメンタム AJ 12106 FERM Ｐ−73
33 （mFPr、PCA分解活性欠失） ブレビバクテリウム・ ブレビバクテリウム・ ラクトフエルメンタム AJ 12107 FERM Ｐ−73
34 （PFPr、Try-、PCA分解活性欠失） コリネバクテリウム・ コリネバクテリウム・ アセトアシドフイラム AJ 12108 FERM Ｐ−73
35 （PFPr、PCA分解活性欠失） mFPr：メタフルオロフエニルアラニン
耐性 PCA分解活性欠失：プロトカテク酸分
解能欠失 Try-：Ｌ−チロシン要求性 pFPr：パラフルオロフエニルアラニン
耐性 これら本発明の変異株は、ブレビバクテリウム
属又はコリネバクテリウム属の微生物を親株とし
て、これに通常の変異誘導操作例えば紫外線、Ｘ
線照射あるいはＮ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−
ニトロソグアニジン（NTGと略す）、亜硝酸等の
化学薬剤処理を施し、変異処理した菌体を完全培
地を含む寒天平板上で培養し、唯一の炭素源とし
て各々グルコース又はプロトカテク酸を含む最少
寒天平板培地上にレプリカする。このようにして
唯一の炭素源としてグルコースでは生育できる
が、プロトカテク酸では生育できないコロニーを
分離することによつて得られる。又最少培地に含
む唯一の炭素源としてはプロトカテク酸の他に、
キナ酸又はシキミ酸であつても何らさしつかえな
い。 次に本発明で使用する変異株の変異誘導法を以
下の実験例にて示す。 実験例 １ ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
AJ12105（FERMP−7332）をイーストブイヨン
寒天斜面培地で培養し、生育した菌体を集めて1/
５０Ｍリン酸緩衝液（PH7.0）に懸濁し（108〜109
コ／mlの菌体を含む）、これにNTGを加え
（NTG濃度は1000μｇ／ml）、室温で30分間保持
した。このようにしてNTG処理した菌体を同リ
ン酸緩衝液で充分洗浄した後、完全寒天平板培地
上にコロニー数が200コ程度になるように菌液を
適当に希釈して塗布し、３〜４日間31.5℃で培養
した。 次に第１表に示す唯一の炭素源としてグルコー
ス又はプロトカテク酸を各々に含む最少寒天平板
培地上にレプリカし、プロトカテク酸培地で生育
せず、グルコースを唯一の炭素源とする最少寒天
培地上で生育するコロニーを分離した。このよう
にして得られた変異株の中にはすぐれたプロトカ
テク酸生産性を示す菌株が数多く存在した。 この内生産能の最も高い菌株AJ12106を選ん
だ。同様の変異操作によりブレビバクテリウム・
ラクトフエルメンタムAJ3436（FERM−P1913）
を親株としてAJ12107を選んだ。 第１表 最少培地の組成成 分 含 量 グルコース 10ｇ／ 又はプロトカテク酸 ５ 〃 硫酸アンモニウム ５ 〃 尿 素 ２ 〃 KH2PO4 １ 〃 MgSO4・7H2O １ 〃 Fe++、Mn++イオン 各2ppm Biotin 50μｇ／ VB1・HCl 2000 〃 DL−メチオニン 400mg／ｇ Ｌ−Tyr 100 〃 PH7.0（KOH） 又同様の変異操作によりコリネバクテリウム・
アセトアシドフイラムATCC13870を親株として
同様な方法でAJ12108を誘導した。 次にこのようにして得た変異株についてグルコ
ース又はプルトカテク酸を唯一の炭素源とする最
少培地での生育の結果を第２表に示す。
に関する。プロトカテク酸は食品用抗酸化剤の原
料として、又香料としての用途を有するバニリン
の原料、更には各種医薬品の原料として有用であ
る。従来プロトカテの酸を培地中に蓄積する菌と
してノイロスポラ属菌の変異株（バイオケミカル
ジヤーナル68、168、1958年）、コリネバクテリウ
ム属菌の変異株（特公昭45−39036）、ブレビバク
テリウム属菌の変異株（特開昭50−8952）等が報
告されている。 本発明者等は更に効率良くプロトカテク酸を発
酵生産する方法を開発することを目的として研究
を重ねた結果、ブレビバクテリウム属又はコリネ
バクテリウム属に属し、唯一の炭素源としてプロ
トカテク酸では生育できない変異株の中に多量の
プロトカテク酸を生成、蓄積する菌株が存在する
ことを見い出した。 本発明はこの知見に基づいて完成されたもので
ある。 本発明において、プロトカテク酸生産能を有す
る微生物はブレビバクテリウム属又はコリネバク
テリウム属等のコリネ型細菌に属し、プロトカテ
ク酸生産に必要な性質、例えばパラフルオロフエ
ニルアラニン、メタフルオロフエニルアラニン、
チロシンハイドロキサメート又は５−メチルトリ
プトフアン等の芳香族アミノ酸アナログ耐性もし
くはチロシン、フエニルアラニン、トリプトフア
ン等の芳香族アミノ酸の単独ないし、複合要求
性、更には芳香族アミノ酸生合成系の中間体であ
るシキミ酸やコリスミン酸等の要求性を有する微
生物である。 本発明において使用される変異株はブレビバク
テリウム属又はコリネバクテリウム属等のコリネ
型細菌に属し上記プロトカテク酸生産能を有する
性質を示し、かつ唯一の炭素源としてプロトカテ
ク酸で生育できない性質を有する変異株である。 本発明において用いられる微生物は、具体的に
は例えば ブレビバクテリウム・ ブレビバクテリウム・ ラクトフエルメンタム AJ 12106 FERM Ｐ−73
33 （mFPr、PCA分解活性欠失） ブレビバクテリウム・ ブレビバクテリウム・ ラクトフエルメンタム AJ 12107 FERM Ｐ−73
34 （PFPr、Try-、PCA分解活性欠失） コリネバクテリウム・ コリネバクテリウム・ アセトアシドフイラム AJ 12108 FERM Ｐ−73
35 （PFPr、PCA分解活性欠失） mFPr：メタフルオロフエニルアラニン
耐性 PCA分解活性欠失：プロトカテク酸分
解能欠失 Try-：Ｌ−チロシン要求性 pFPr：パラフルオロフエニルアラニン
耐性 これら本発明の変異株は、ブレビバクテリウム
属又はコリネバクテリウム属の微生物を親株とし
て、これに通常の変異誘導操作例えば紫外線、Ｘ
線照射あるいはＮ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−
ニトロソグアニジン（NTGと略す）、亜硝酸等の
化学薬剤処理を施し、変異処理した菌体を完全培
地を含む寒天平板上で培養し、唯一の炭素源とし
て各々グルコース又はプロトカテク酸を含む最少
寒天平板培地上にレプリカする。このようにして
唯一の炭素源としてグルコースでは生育できる
が、プロトカテク酸では生育できないコロニーを
分離することによつて得られる。又最少培地に含
む唯一の炭素源としてはプロトカテク酸の他に、
キナ酸又はシキミ酸であつても何らさしつかえな
い。 次に本発明で使用する変異株の変異誘導法を以
下の実験例にて示す。 実験例 １ ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
AJ12105（FERMP−7332）をイーストブイヨン
寒天斜面培地で培養し、生育した菌体を集めて1/
５０Ｍリン酸緩衝液（PH7.0）に懸濁し（108〜109
コ／mlの菌体を含む）、これにNTGを加え
（NTG濃度は1000μｇ／ml）、室温で30分間保持
した。このようにしてNTG処理した菌体を同リ
ン酸緩衝液で充分洗浄した後、完全寒天平板培地
上にコロニー数が200コ程度になるように菌液を
適当に希釈して塗布し、３〜４日間31.5℃で培養
した。 次に第１表に示す唯一の炭素源としてグルコー
ス又はプロトカテク酸を各々に含む最少寒天平板
培地上にレプリカし、プロトカテク酸培地で生育
せず、グルコースを唯一の炭素源とする最少寒天
培地上で生育するコロニーを分離した。このよう
にして得られた変異株の中にはすぐれたプロトカ
テク酸生産性を示す菌株が数多く存在した。 この内生産能の最も高い菌株AJ12106を選ん
だ。同様の変異操作によりブレビバクテリウム・
ラクトフエルメンタムAJ3436（FERM−P1913）
を親株としてAJ12107を選んだ。 第１表 最少培地の組成成 分 含 量 グルコース 10ｇ／ 又はプロトカテク酸 ５ 〃 硫酸アンモニウム ５ 〃 尿 素 ２ 〃 KH2PO4 １ 〃 MgSO4・7H2O １ 〃 Fe++、Mn++イオン 各2ppm Biotin 50μｇ／ VB1・HCl 2000 〃 DL−メチオニン 400mg／ｇ Ｌ−Tyr 100 〃 PH7.0（KOH） 又同様の変異操作によりコリネバクテリウム・
アセトアシドフイラムATCC13870を親株として
同様な方法でAJ12108を誘導した。 次にこのようにして得た変異株についてグルコ
ース又はプルトカテク酸を唯一の炭素源とする最
少培地での生育の結果を第２表に示す。
【表】
実験方法は、各変異株の菌体を第１表の最少培
地で良く洗浄した後、小型試験官に入れた第２表
に示す所定量の炭素源を含む最少培地（４ml）に
一定量接種し、31.5℃で24時間振盪培養を行い、
培養液の560nｍに於ける吸光度を測定して生育
度を求めた。第２表にはその相対生育値を示し
た。 本発明で使用する培地は炭素源、窒素源、無機
塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン、
核酸等の有機微量栄養素を含有する通常の栄養培
地が使用される。炭素源としては使用する変異株
の利用可能なものであれば良く、例えばグルコー
ス、フラクトース、シユークロース、マルトー
ス、澱粉分解物糖蜜糖の糖類が使用され、その
他、エタノール、プロパノール等のアルコール
類、酢酸、クエン酸等の有機酸類、更に菌株によ
つてはノルマルパラフイン等も単独あるいは他の
炭素源と併用して使用される。 窒素源としては硫酸アンモニウム、塩化アンモ
ニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム
塩、硝酸塩、尿素、アンモニア、肉エキス等無機
あるいは有機の窒素源が使用される。有機微量栄
養素としてはアミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核
酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザ
ミノ酸、酵母エキス、蛋白分解物等が使用され、
生育にアミノ酸等を要求する栄養要求性変異株を
使用する場合には要求される栄養素を補添するこ
とが必要である。 培養は好気的条件で行うことが望ましく、培養
期間中培地のPHを５ないし９、温度を20℃ないし
40℃に制御しつつ１日ないし４日間振盪培養又は
通気撹拌培養することによりプロトカテク酸が多
量培養液中に蓄積される。培養液からプロトカテ
ク酸を採取する方法は公知の方法で従つて行えば
良く、培養液から菌体を分離除去した後、イオン
交換樹脂を用いる方法等により採取される。 以下、実施例にて説明する。 実施例 １ 下記第３表に示すプロトカテク酸生産用培地を
調製し、500ml容振盪フラスコに20ml宛分注し、
120℃で10分間加熱滅菌した。これに別途加熱殺
菌した炭酸カルシウム粉末1.0ｇを補添した。
地で良く洗浄した後、小型試験官に入れた第２表
に示す所定量の炭素源を含む最少培地（４ml）に
一定量接種し、31.5℃で24時間振盪培養を行い、
培養液の560nｍに於ける吸光度を測定して生育
度を求めた。第２表にはその相対生育値を示し
た。 本発明で使用する培地は炭素源、窒素源、無機
塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン、
核酸等の有機微量栄養素を含有する通常の栄養培
地が使用される。炭素源としては使用する変異株
の利用可能なものであれば良く、例えばグルコー
ス、フラクトース、シユークロース、マルトー
ス、澱粉分解物糖蜜糖の糖類が使用され、その
他、エタノール、プロパノール等のアルコール
類、酢酸、クエン酸等の有機酸類、更に菌株によ
つてはノルマルパラフイン等も単独あるいは他の
炭素源と併用して使用される。 窒素源としては硫酸アンモニウム、塩化アンモ
ニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム
塩、硝酸塩、尿素、アンモニア、肉エキス等無機
あるいは有機の窒素源が使用される。有機微量栄
養素としてはアミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核
酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザ
ミノ酸、酵母エキス、蛋白分解物等が使用され、
生育にアミノ酸等を要求する栄養要求性変異株を
使用する場合には要求される栄養素を補添するこ
とが必要である。 培養は好気的条件で行うことが望ましく、培養
期間中培地のPHを５ないし９、温度を20℃ないし
40℃に制御しつつ１日ないし４日間振盪培養又は
通気撹拌培養することによりプロトカテク酸が多
量培養液中に蓄積される。培養液からプロトカテ
ク酸を採取する方法は公知の方法で従つて行えば
良く、培養液から菌体を分離除去した後、イオン
交換樹脂を用いる方法等により採取される。 以下、実施例にて説明する。 実施例 １ 下記第３表に示すプロトカテク酸生産用培地を
調製し、500ml容振盪フラスコに20ml宛分注し、
120℃で10分間加熱滅菌した。これに別途加熱殺
菌した炭酸カルシウム粉末1.0ｇを補添した。
【表】
この培地に第４表に示すプロトカテク酸生産菌
を１白金耳接種し、30℃で72時間振盪培養した。
培養液中のプロトカテク酸生成量を測定し、その
結果を第４表に示した。
を１白金耳接種し、30℃で72時間振盪培養した。
培養液中のプロトカテク酸生成量を測定し、その
結果を第４表に示した。
【表】
Claims (1)
- １ ブレビバクテリウム属又はコリネバクテリウ
ム属に属し、唯一の炭素源としてプロトカテク酸
では生育できずかつプロトカテク酸生産能を有す
る変異株を培養してプロトカテク酸を培地中に生
成、蓄積せしめこれを採取することを特徴とする
発酵法によるプロトカテク酸の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20726683A JPS6098989A (ja) | 1983-11-04 | 1983-11-04 | 発酵法によるプロトカテク酸の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20726683A JPS6098989A (ja) | 1983-11-04 | 1983-11-04 | 発酵法によるプロトカテク酸の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6098989A JPS6098989A (ja) | 1985-06-01 |
| JPH0361436B2 true JPH0361436B2 (ja) | 1991-09-19 |
Family
ID=16536942
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20726683A Granted JPS6098989A (ja) | 1983-11-04 | 1983-11-04 | 発酵法によるプロトカテク酸の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6098989A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP6322576B2 (ja) * | 2012-07-03 | 2018-05-09 | 花王株式会社 | 有用微生物および目的物質の製造方法 |
-
1983
- 1983-11-04 JP JP20726683A patent/JPS6098989A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6098989A (ja) | 1985-06-01 |
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