JPH10500687A

JPH10500687A - 抗菌性水中油エマルジョン

Info

Publication number: JPH10500687A
Application number: JP7530418A
Authority: JP
Inventors: ライト，ディー．クレイグ
Original assignee: ノババックスインコーポレイテッド
Priority date: 1994-05-20
Filing date: 1995-05-18
Publication date: 1998-01-20
Also published as: WO1995031966A1; JPH10500686A; AU687562B2; CA2190606A1; EP0765151A1; EP0760650B1; WO1995031956A1; DE69524953D1; BR9507669A; EP0765151A4; EP0760650A4; CN1158069C; AU2593695A; AU2593795A; CA2190604A1; DE69527624T2; EP0760650A1; DE69524953T2; BR9507742A; CN1156404A

Abstract

(57)【要約】グリセロールモノオレエート、グリセロールトリオレエートグリセロールモノラウレート及びグリセロールジラウレートよりなる群から選択する剤を主要乳化剤として含み、Ｃ₁₂〜Ｃ₁₆鎖を有するカチオン性ハロゲン含有化合物を陽性電荷生成剤として含む抗菌性水中油エマルジョンを開示する。このエマルジヨンは、更に、適宜、ステロール好ましくはフィトステロールを含むことができる。この発明で使用するのに好適なＣ₁₂〜Ｃ₁₆鎖を有するカチオン性ハロゲン含有化合物には、セチルピリジニウムクロリド、セチルピリジニウムブロミド、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、セチルジメチエチルアンモニウムブロミド及び塩化ベンザルコニウムが含まれる。この抗菌性エマルジョンを製薬調製物の形態で用いて、細菌、カビ及びウイルスを含む広範囲の病原体の生育を阻止することができる。

Description

【発明の詳細な説明】抗菌性水中油エマルジョン発明の背景本発明は、接触の際に感染性病原体を不活性化する抗菌性脂質含有水中油エマルジョンに関係する。水不混和性の液相を機械的撹拌例えば超分散機によって水相に混合させるならば、その結果生成する水中油分散の安定性は、最も頻繁に、乳化剤の添加を必要とし、その分子は、油滴の表面上に吸着されて、２つの隣接する液滴の間の直接の接触を阻止する一種の連続性の膜を形成するということが知られている。これらの油滴は、更に、有機媒質例えばステロールに可溶性の物質を含むことができる。水相中に分散した別々の油滴に加えて、水中油エマルジョンは、他の脂質構造、例えば、小脂質小胞（即ち、しばしば、水相の層により互いに分離された幾つかの実質的に同心状の脂質二重層からなる脂質球）、ミセル（例えば、極性のヘッド基が外向きに水相に面し、非極性のテイルが水相から離れて内向きに引っ込むように配列した５０〜２００分子の小クラスター状の両親媒性分子）、又はラメラ相（各粒子が、水の薄いフィルムにより分離された平行なグリセロールエステル二重層からなる脂質分散）をも含むことができる。これらの脂質構造は、非極性残基（即ち、長い炭化水素鎖）を水から駆逐する疎水性の力の結果として形成される。病原性の細菌、ウイルス又はカビの侵入口は、主に、皮膚及び粘膜並びに上下の気道である。如何なる感染においても、最初のステップは、皮膚又は粘膜上への付着又はコロニー形成であり、それに続く感染性病原体の侵入及び播種である。従って、本発明の目的は、接触の際に膜構造の崩壊により感染性病原体を不活性化する抗菌性エマルジョンを提供することである。発明の要約本発明は、接触の際に感染性病原体を不活性化するための安定な抗菌性水中油エマルジョンを提供する。このエマルジョンは、正に帯電した脂質含有の油性「不連続相」の液滴を水性「連続相」中に分散して含む。この油性不連続相は、感染性病原体を、それらの膜構造を崩壊することにより不活性化すると考えられる。このエマルジョンは、広いスペクトルの細菌、ウイルス及び酵母に対する殺菌剤活性を有する。本発明の抗菌性エマルジョンは、主として、水性連続相例えば水中に分散された油性不連続相の正に帯電した液滴からなる。この不連続相は、グリセロールモノオレエート（ＧＭＯ）、グリセロールトリオレエート（ＧＴＯ）、グリセロールモノラウレート（ＧＭＯ）及びグリセロールジラウレートよりなる群から選択するグリセロールエステル及びカチオン性ハロゲン含有化合物（好ましくは、陽性電荷生成剤としてＣ₁₂〜Ｃ₁₆鎖を有するもの）を含む。これらの液滴は、更に、コレステロール又はフィトステロール等のステロールを含むことができる。これらの液滴は、細菌、ウイルス又はカビの膜に含まれる負に帯電した蛋白質に結合し、それにより、膜構造が崩壊して病原体を死滅させるようである。本発明の抗菌性エマルジョンは、例えば、飲み込み、吸入し又は皮膚に塗布したときに、無毒で安全である。この結果は、Ｃ₁₂〜Ｃ₁₆鎖を有する多くのカチオン性ハロゲン含有化合物が単独で投与するならば非常に毒性であるので予想外のことである。例えば、この発明の好適なカチオン性ハロゲン含有化合物であるセチルピリジニウムクロリド（ＣＰＣ）は、上気道、粘膜及び皮膚の組織の重大な炎症及び損傷を引き起こす。しかしながら、この発明のエマルジョンの形態で投与するならば、かかる悪影響を生じることはない。更に、この発明のエマルジョンは、加熱し又は有意のレベルの酸及び塩基にさらしたときに安定である。油性不連続相の正電荷は、Ｃ₁₂〜Ｃ₁₆鎖を有するカチオン性ハロゲン含有化合物により与えられる。好適具体例において、Ｃ₁₂〜Ｃ₁₆鎖を有するカチオン性ハロゲン含有化合物は、セチルピリジニウムクロリド（ＣＰＣ）、セチルピリジニウムブロミド（ＣＰＢ）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）及びセチルジメチエチルアンモニウムブロミド（ＣＤＥＡＢ）よりなる群から選択する。他の使用し得るＣ₁₂〜Ｃ₁₆鎖を有するカチオン性ハロゲン含有化合物には、例えば、セチルトリメチルアンモニウムクロリド、セチルベンジルジメチルアンモニウムクロリド、セチルトリブチルホスホニウムブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド及びテトラデシルトリメチルアンモニウムブロミドが含まれる。この油性不連続相は、更に、コレステロール、コレステロール誘導体、ヒドロコーチゾン、フィトステロール及びこれらの混合物よりなる群から選択する少なくとも１種のステロールを含むことができる。用語「コレステロール誘導体」は、ここで用いる場合、コレステロールの硫酸塩及びリン酸塩誘導体を含むが、これらに限定されない。好適ステロールは、フィトステロール例えば大豆ステロールを含む。本発明の抗菌性水中油エマルジョンの形成において有用な油には、広いスペクトルの水不混和性物質例えば大豆油、アボカド油、スクアレン油、胡麻油、オリーブ油、キャノラ油、トウモロコシ油、菜種油、紅花油、ヒマワリ油、魚油、香油、水不溶性ビタミン及びこれらの混合物が含まれる。この発明の好適具体例において、油は、香りのついた油例えばペパーミント油である。この発明の他の具体例において、エマルジョンの少なくとも一部分は、単ラメラ、多重ラメラ及び少ラメラ脂質小胞、ミセル及び及びラメラ相を含む（但し、これらに限定されない）脂質構造の形態であってよい。本発明の抗菌性エマルジョンを、例えば製薬調製物（例えば、クリーム、溶液及び懸濁液）において用いて、細菌、ウイルス及びカビを含む広範囲の感染性病原体の生育を阻止することができる。従って、本発明は又、この発明の抗菌性エマルジョン及び製薬上許容し得るキャリアーで作られた製薬投与に適した抗菌性調製物をも提供する。この調製物は、皮膚表面領域、粘膜又は口内表面に、例えばクリーム、ゲル、スプレー、口内洗浄剤又は脱臭剤として局所的に塗布して、 Propionibacteriumu acnes、Neisseria gonorrhea、Strepto-coccus及びStaphyl ococcus epidermidis等の細菌の感染を治療し又は予防することができる。或は、この調製物を、例えば経口投与又は静脈投与により内部に投与することができる。かかる調製物の全身投与を用いて、例えば、病原性微生物例えばHelicobact er pylori 等の細菌及びウイルス、特にエンベロープを有するウイルスを不活性化することができる。この発明の好適具体例において、この調製物を、個人に、経口投与してＨＩＶによる感染を治療する。従って、本発明は、更に、この発明の抗菌性エマルジョンの局所的又は全身投与による感染性病原体の生育を阻止するための方法を提供する。発明の詳細な説明本発明は、水性連続相中に分散した油性不連続相の正に帯電した液滴でできた安定な抗菌性水中油エマルジョンに関係する。用語「抗菌性」は、ここで用いる場合、感染性病原体を不活性化する能力を有することを意味する。用語「不活性化する」は、ここで用いる場合、生物を殺し又はその成育を阻止することを含むが、限定はしない。用語「感染性病原体」は、ここで用いる場合、カビ、ウイルス、細菌及び寄生虫を含むが、これらに限定されない。本発明の抗菌性エマルジョンは、広範囲の感染性病原体を不活性化する。不活性化は、油性不連続相の成分による病原体の膜構造の崩壊により達成されるようである。用語「エマルジョン」は、ここで用いる場合、古典的な水中油分散又は液滴並びに、水不混和性の油性相を水相と混合したときに、非極性残基（例えば、長い炭化水素鎖）を水から駆逐し、極性ヘッド基を水に向ける疎水性の力の結果として形成し得る他の脂質構造を含む。これらの他の脂質構造には、単ラメラ、少ラメラ及び多重ラメラ脂質小胞、ミセル及びラメラ又は六角形相が含まれるが、これらに限定はされない。これらの他の脂質構造は又、グリセロールモノオレエート（ＧＭＯ）、グリセロールトリオレエート（ＧＴＯ）、グリセロールモノラウレート（ＧＭＬ）及びグリセロールジラウレート（ＧＤＬ）よりなる群から選択するグリセロールエステル（主要乳化剤）及びドダシル〜ヘキサデシルカチオン性ハロゲン含有化合物（正電荷生成剤）をも含む。これらの他の脂質構造は又、更に、少なくとも１種のステロール（好ましくは、フィトステロール）を含むことができる。この発明の好適具体例においては、ＧＭＯを主要乳化剤として用いる。用語「主要乳化剤」は、ここで用いる場合、油性不連続相に含まれる何れの単一の乳化剤よりも大きい重量比を占める乳化剤をいう。本発明の抗菌性水中油エマルジョンは、当業者に周知の古典的エマルジョン形成技術を用いて形成することができる。簡単にいえば、脂質−油相を比較的高い剪断力下で水相と混合して直径約１ミクロンの油滴を含む水中油エマルジョンを得る。一層詳細には、正に帯電した脂質含有油性不連続相を、（ａ）油キャリアー；（ｂ）ＧＭＯ、ＧＴＯ、ＧＭＬ又はＧＤＬよりなる群から選択するグリセロールエステル；及び（ｃ）Ｃ₁₂〜Ｃ₁₆鎖を有するカチオン性ハロゲン含有化合物を、任意の他の適合性のグリセロールエステル又は乳化剤（例えば、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ６０）及び脂質−油相に取込むべき任意のステロール又は他の親油性物質と共にブレンドすることにより形成する。一度脂質−油相が形成されたならば、それを加熱して水相（例えば、水、塩溶液又は他の脂質を水和することのできる水溶液）と、約１：４〜１：２にわたる脂質−油相対水相の容積対容積基準（好ましくは、約１：３）にてブレンドする。これらの脂質−油相及び水相を、例えばフレンチプレス、Ｎｏｖａｍｉｘ（商標）、脂質小胞メーカー（ニュージャージー、Buena在、IGI Inc.）、シリンジミキサー等の高剪断混合力を生成し得る任意の器具を用いてブレンドすることができ、或は、米国特許第４，８９５，４５２号及び４，９１１，９２８号に記載された２つのシリンジを用いて手作業によりブレンドすることができる（これらの教示は、本明細書中に参考として援用する）。本発明の抗菌性水中油エマルジョンは、熱、酸又は塩基の存在下で安定であるという利点を与える。例えば、下記の実施例７に示すように、この発明のエマルジョンは、煮沸し又は１Ｎ硝酸若しくは１Ｎ水酸化ナトリウムにさらしたときに有意に変化したり分解したりしない。この安定性は、これらのエマルジョンを製薬投与に適したものにし、内部投与にさえ適したものにする。本発明の抗菌性水中油エマルジョンを用いて、接触の際に様々な感染性病原体を不活性化することができる。下記の実施例に記載したように、本発明により不活性化される微生物には、広範囲の細菌、カビ及びウイルスが含まれる。一層詳細には、口内又は口腔咽頭領域にコロニーを形成する細菌例えばStreptococcus pneumoniae、Ａ群ベータ溶血性Streptococcus、Haemophilus influenzae及びNei sseria meningitidisの不活性化には、今回開示するエマルジョンをスプレー又は口内洗浄剤として局所適用することができる。胃腸領域にコロニーを形成する細菌例えば Helicobacter pyloriには、これらのエマルジョンを、例えば、丸薬又は液体として、経口投与することができる。腟内にコロニーを形成する細菌及びカビ例えばNeisseria gonorrhoeae、Gardnerella vaginalis、Ｂ群Streptococcus及びCan dida albicansには、これらのエマルジョンを、クリーム、ゲル又は坐薬として局所適用することができる。今回開示するエマルジョンは又、クリーム又はゲルとして皮膚科適用に用いて、Propionibacterium acnes、Staphylococcus aureus 、Staphylococcus epidermidis及びＢ群Streptococcusの次の感染を不活性化し又は阻止することもできる。この発明の好適具体例において、本発明の抗菌性エマルジョンを用いて、グラム陽性細菌による感染を阻止することができる。本発明の抗菌性水中油エマルジョンを用いて、様々なウイルス、特にエンベロープを有するウイルスを接触に際して不活性化することもできる。例えば、今回開示するエマルジョンを、口腔咽頭、口内、腟内、皮膚又は内部適用に用いて、 Herpesviridae（例えば、単純ヘルペスウイルス１型及び２型、エプスタイン− バールウイルス、サイトメガロウイルス、水痘ウイルス及びヒトヘルペスウイルス６型）、Togaviridae（例えば、風疹ウイルス）、Flaviviridae（例えば、黄熱病ウイルス）、Coronaviridae（例えば、コロナウイルス）、 Rhabdoviridae（例えば、狂犬病ウイルス）、Filoviridae（例えば、マールブルク病ウイルス）、Paramyxoviridae（例えば、麻疹ウイルス）、Orthomyxovirida e（例えば、インフルエンザウイルス）、Bunyaviridae（例えば、カリフォルニア嗜眠性脳炎ウイルス）、Arenaviridae（例えば、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス）、Retroviridae（例えば、ＨＩＶ−１）及びHepadnavirida（例えば、Ｂ型肝炎）を含むウイルスの次の感染を不活性化し又は阻止することができる。この発明のエマルジョンを用いて、イン・ビトロでウイルスを不活性化して、例えば、汚染した血液製剤を殺菌することができる。この発明の好適具体例において、これらの水中油エマルジョンを用いてＨＩＶを不活性化する。本発明は又、本発明の抗菌性エマルジョン及び製薬上許容し得るキャリアーからなる製薬投与に適した抗菌性調製物をも提供する。用語「製薬上許容し得る」は、ここで用いる場合、製薬投与に用いることについて生理学的に適合性の任意のキャリアーをいう。製薬的に活性な物質用にかかる媒質及び剤を使用することは、当業者に周知である。慣用の媒質又は剤が本発明のエマルジョンと適合性でない場合を除いて、製薬調製物におけるそれらの使用を企図する。本発明は、更に、感染性病原体の生育を、本発明の抗菌性エマルジョン（好ましくは、製薬調製物形態）の局所的又は全身的投与により阻止する方法を提供する。用語「局所的」は、ここで用いる場合、粘膜、口内表面、皮膚、内耳表面、又は任意の身体の穴例えば腟又は直腸の表面への適用を含む。用語「全身的」は、ここで用いる場合、経口及び静脈投与を含む（但し、これらに限定はしない）任意の形態の内部投与を含む。下記の実施例は、この発明の有効性を説明する。実施例実施例１ − ＧＭＯ及びＧＭＳ水中油エマルジョンの調製この実施例では、主要乳化剤としてＧＭＯ又はＧＭＳの何れかを有する正及び負に帯電した脂質含有水中油エマルジョンのシリーズを形成した。選択したエマルジョンは又、純度、ｐＨ及び油滴の寸法に関して特性決定をもした。表１は、主要乳化剤としてグリセロールモノオレエート（ＧＭＯ）又はグリセロールモノステアレート（ＧＭＳ）を有し、陽性電荷生成剤としてのセチルピリジニウムクロリド（ＣＰＣ）、セチルピリジニウムブロミド（ＣＰＢ）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）若しくはジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＤＡＢ）又は陰性電荷生成剤としてのオレイン酸を有する幾つかの帯電したＧＭＯ及びＧＭＳ水中油エマルジョンの脂質−油相を形成するのに用いた各化学成分の量を示している。上記の表１に示した帯電したエマルジョンを調製するために、約１２〜２１重量％のＧＭＯ又はＧＭＳ、０．８〜０．９重量％のカチオン性ハロゲン含有化合物（又は０．７重量％のオレイン酸）、６７〜８０重量％のキャリアー油例えば大豆油、３〜５重量％ツイーン６０（ポリオキシエチレン２０ソルビタンモノステアレート）及び３〜６重量％の大豆ステロールを含む脂質−油相を約１時間８６℃に加熱した。次いで、この脂質−油相を、６５℃の水を含む水相と、米国特許第４，８９５，４５２号に記載されたような５ｍｌシリンジを用いて、１３部の脂質−油対３７部の水（容積対容積）にてブレンドした。表２は、表１に示したエマルジョンのｐＨを示す。循環水浴を備えたCoulter LS 130レーザーサイジング機にて測定したこれらのエマルジョンの脂質−油滴のサイズをも示す。実施例２ − １０ＮＧＭＯ水中油エマルジョンの調製この実施例では、主要乳化剤としてのＧＭＯ及び実施例１と比較して１０倍高濃度（１０Ｎ）の陽性電荷生成剤としてのハロゲン含有化合物（セチルピリジニウムクロリド（ＣＰＣ）、セチルピリジニウムブロミド（ＣＰＢ）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、セチルジメチエチルアンモニウムブロミド（ＣＤＥＡＢ）及び塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ））を有する正に帯電した一連の水中油エマルジョンを調製した。表３は、これらの正に帯電した１０ＮＧＭＯエマルジョンの脂質−油相を形成するために用いた各化学成分の量を示している。上記の表３に示した１０Ｎエマルジョンを調製するために、約１９重量％のＧＭＯ、６２重量％のキャリアー油（例えば、大豆油）、４．７重量％のツイーン６０（ポリオキシエチレン２０ソルビタンモノステアレート）、５．４重量％の大豆ステロール及び７．４〜８．４重量％のカチオン性デタージェントを含む脂質−油相を、約１時間、８６℃に加熱した。次いで、この脂質−油相を、６５℃ の水を含む水相と、５ｍｌシリンジ機械（米国特許第４，８９５，４５２号に記載されたもので、その教示を参考として本明細書中に援用する）を用いて、容積対容積で１３部の脂質−油対３７部の水にてブレンドした。実施例３ − ＧＭＯ及びＧＭＳ水中油エマルジョンのStaphylococcus aureus ８型に対する殺菌剤活性この実施例においては、表１に示したＧＭＯ及びＧＭＳエマルジョンの各々の殺菌活性を比較した。この目的のために、これらの各エマルジョンのStaphyloco ccus aureus８型を殺す能力を下記のように試験した：細菌を液体培地（Trypticase大豆ブロス又はSchaedlerブロス）に接種して３７℃で１〜７時間インキュベートした。次いで、波長６５０ｎｍでの光学密度及び定量的培養を各ブロス培養について行なった。次いで、各細菌ブロス１ｍｌを、１ｍｌのエマルジョン又は水（対照用）と、１０又は３０分間混合した。次いで、各混合物について、二連で、定量的培養を行なった。細菌を含むプレートを３７℃で１８時間インキュベートしてから計数した。次いで、殺菌された細菌のパーセンテージを、下記の方程式により測定した。殺菌％＝（Ａ−Ｂ）／Ａ×１００Ａ＝接種した細菌の総数Ｂ＝エマルジョンと混合した後に計数された総数表４には、２×１０⁷の細菌と１０又は３０分間インキュベートした後に各エマルジョン又は水により殺菌されたStaphylococcus aur eus ８型のパーセンテージを列記してある。表４から、正に帯電したグリセロールモノオレエート（ＧＭＯ）エマルジョンは、Staphylococcus aureus ８型を不活性化するが、正に帯電したグリセロールモノステアレート（ＧＭＳ／ＣＰＣ）エマルジョンは不活性化し得ないということがわかる。更に、クロリド又はブロミドを含むＣ₁₂〜Ｃ₁₆鎖を有するカチオン性化合物（即ち、ＣＰＣ、ＣＰＢ又はＣＴＡＢ）のみが有意の殺菌活性と関連し、ジオクタデシルカチオン性化合物（ＤＤＤＡＢ）又はオレイン酸（陰性電荷を有する）は関連しなかった。従って、この細菌Staphylococcus aureus の不活性化は、Ｃ₁₂〜Ｃ₁₆鎖を有するクロリド又はブロミド含有のカチオン性化合物を含むＧＭＯエマルジョンを用いれば、一層効果的である。この発明のエマルジョン中の電荷生成剤の濃度を変えることの影響を測定するために、種々の濃度のＣＰＣを含むＧＭＯエマルジョンも、Staphylococcus aureus ８型に対する殺菌剤活性について試験した。表５は、ＧＭＯエマルジョンを１０⁷の細菌と１０又は３０分間インキュベートした後の殺菌されたStaphylococcus aureus８型のパーセンテージを示している。表５は、Staphylococcus aureus ８型細菌がＧＭＯ／ＣＰＣエマルジョン（エマルジョン１ｍｌ当り０．２３ｍｇより高濃度のＣＰＣ）の殺菌活性に感受性であることを示している。実施例４ − ＧＭＯ水中油エマルジョンの細菌及び酵母に対する殺菌活性この実施例では、実施例１で形成し表１に示したＧＭＯ／ＣＰＣエマルジョンの種々の細菌及び酵母を殺す能力を試験した。上記の実施例３に記載したアッセイを用いて、ＧＭＯ／ＣＰＣエマルジョンの幾らかの細菌及びカビに対する殺菌剤活性を測定した（但し、下記の点は変更した）。酵母を、Sabouraudブロスに接種して３０℃で６時間インキュベートし、ＧＭＯ／ＣＰＣエマルジョンを１０又は３０分間混合してプレートし、３７℃で１８時間インキュベートしてから計数した。 P．acnesをSchaedlerブロスにて２４時間嫌気的に生育させ、エマルジョンを１０又は３０分間混合し、５％ヒツジ血液を含むTrypticase大豆寒天プレート上にプレートして、７２時間嫌気的にインキュベートしてから計数した。 G．vaginalisを５％ヒツジ血液を含むTrypticase大豆寒天プレート上にプレートして、３７℃で７２時間５％ＣＯ₂中でインキュベートした。コロニーをプレートから綿棒でふき取って、Schaedlerブロスに、０．５ McFarland標準の密度で接種した。次いで、このブロス／細菌混合物をエマルジョンと共に１０又は３０分間インキュベートし、それから、５％ヒツジ血液を含むTrypticase大豆寒天プレート上にプレートした。プレートを、３７℃で７２時間、５％ＣＯ₂中でインキュベートしてからコロニーを計数した。表６には、ＧＭＯ／ＣＰＣエマルジョンを１０⁵〜１０⁸の細菌と１０又は３０分間インキュベートした後に殺菌されたグラム陽性細菌のパーセンテージを列記してある。これらの列記した細菌は、一般に、次のように分類することができる：（ａ）Staphylococcus aureus（８型）、Staphylococcus aureus（５型）Stap hylo-coccus epidermidis（９７７株）、Ｂ群Streptococcus（莢膜型III）、Ａ群Streptococcus（ベータ溶血性）及びPropionibacterium acneusが含まれる、皮膚上にコロニーを形成するもの；（ｂ）Ａ群Streptococcus（ベータ溶血）、S treptococcus pneumoniae（５型）及びStreptococcus mutansが含まれる、口腔咽頭にコロニーを形成するもの；（ｃ）Gardnerella vaginalis及びＢ群Strepto coccus（莢膜型III）が含まれる、腟にコロニーを形成し又は感染するもの。表６は、ヒトの重大な臨床的感染症を引き起こすすべてのグラム陽性細菌がＧＭＯ／ＣＰＣエマルジョンの殺菌作用に対して鋭敏に感受性であることを示している。表７は、ＧＭＯ／ＣＰＣエマルジョンを１０⁵〜１０⁸の細菌と１０又は３０分間インキュベートした後に殺菌されたグラム陰性細菌のパーセンテージをしめしている。この表には、口腔咽頭にコロニーを形成するグラム陰性細菌、例えば、Haemophilus influenzae （莢膜型ｂ）及びNeisseria meningitidis b型；胃腸管にコロニーを形成するもの、例えば、Helicobacter pylori；及び腟にコロニーを形成するもの、例えば、Neisseria gonorrhoeaeが含まれている。表７は、３０分間のインキュベーションにおいては、Flavobacterium meningo septicumを除いて、試験したすべてのグラム陰性細菌の接種物の少なくとも８５％の不活性化があるを示している。莢膜を有するｂ型Haemophilus influenzae、b 型Neisseria meningitidis、Neisseria gonorrhoeae及びHelicobacter pylori細菌（他のグラム陰性細菌と比較して粗いＬＰＳ型を有する）は、ＧＭＯ／ＣＰＣエマルジョンの殺菌剤活性に対して鋭敏に感受性である。表８は、ＧＭＯ／ＣＰＣエマルジョンを１０⁵の酵母と１０又は３０分間インキュベートした後に殺菌された２つのCandida種のパーセンテージを示している。表８は、１０〜３０分間だけのＧＭＯ／ＣＰＣエマルジョンとのインキュベーションの後にCandida albicans種の有意の不活性化が起きることを示している。実施例５ − ＩＯＮＧＭＯエマルジョンの殺菌剤活性この実施例では、実施例２で形成し、表３に示した正に帯電した１０ＮＧＭＯエマルジョンを、２種類のグラム陽性細菌Staphylococcus aureus ８型及びSt aphylococcus epidermidis、並びに２種類のグラム陰性細菌E．coli及びHelicob acter pyloriに対する殺菌剤活性について下記のように試験した：凍結乾燥された細菌培養物に、Schaedlerブロス０．５ｍＬを加え、そのバイアルの全内容物を５％ヒツジ血液を含む寒天プレート（ＴＳＡII）に接種した。次いで、培養物を、Campy GasPAKを有する嫌気性ジャー内で、３７℃で７２時間培養した。７２時間のＴＳＡIIプレートからのコロニーを、次いで、０．５McFa rland標準が達成されるまでSchaedlerブロス中に接種した。次いで、この細菌培養の１ｍｌのアリコートを１ｍｌの水中油エマルジョンと１０分間混合した。次いで、定量的培養を、各混合物にて二連で行ない且つ、元のブロス培養にて定量的培養を行なった。細菌を含むプレートを、Campy GasPAK を有する嫌気性ジャー内で、３７℃で７２時間インキュベートし、次いで、計数した。殺菌された細菌のパーセンテージを、下記の方程式により決定した（その結果を表９に示す）：殺菌％＝（Ａ−Ｂ）／Ａ×１００Ａ＝接種した細菌の総数Ｂ＝エマルジョン又はリポソームと混合した後に計数された数表９には、表３の１０ＮＧＭＯ／ＣＰＣエマルジョンと１０⁶〜１０⁷の細菌とを１０分間インキュベートした後に殺菌された各細菌のパーセンテージを列記してある。表９は、１０ＮＧＭＯ／ＣＰＣエマルジョン（最大で１：８０の稀釈）を用いて試験した各細菌（高稀釈（即ち、１：４０及び１：８０）の大腸菌を除く）の９６％以上が不活性化されたことを示している。１：１０の稀釈では、各細菌の９９．９９〜１００％が不活性化された。実施例６ − ＧＭＯ水中油エマルジョン及びフソジェニック脂質小胞のＨＩＶに対する殺ウイルス剤活性この実施例においては、実施例１で形成したＧＭＯ／ＣＰＣエマルジョン及び下記のようにして調製したフソジェニック脂質小胞のＨＩＶに対する殺ウイルス剤活性を試験した。フソジェニック脂質小胞を調製するために、９４．５グラムのポリオキシエチレン（ＰＯＥ）２ステアリルエーテル（Brij72）、０．７８グラムのオレイン酸、３６グラムのコレステロールを溶融するまで加熱して液体脂質相を形成した。次いで、脂質相の一部（０．５３ｍｌ）を０．４７ｍｌのスクアレンと混合して１．０ｍｌの脂質−油相を形成した。これを、４．０ｍｌのＰＢＳを含む水相と、米国特許第４，９１１，９２８号に記載のようにして、剪断混合条件下でブレンドして脂質小胞を形成した。「剪断混合条件」は、ここで用いる場合、１ｍｍのオリフィスを通る５〜５０ｍ／秒の相対的流速に等しい剪断を意味する。体積対体積に基づいて、この混合物は、４部の稀釈液を１部の脂質−油混合物に対して含み、脂質１１．７％対油８．３％対稀釈液８０％であった。ＧＭＯ／ＣＰＣエマルジョン及びBrij72フソジェニック脂質小胞を、ＨＩＶに対する殺ウイルス剤活性について、下記のようにアッセイした：１０％ＰＢＳ及び５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含む２０ｍｌのＲＰＭＩ培地中に２０×１０⁶Ｃ８１６６細胞（ＨＴＬＶ−１でトランスフォームされたＴ細胞株）を含む細胞懸濁液を調製し、０．４ｍｌのアリコートに分割した。次いで、一連のウイルス稀釈物（１０^-2〜１０^-6）を、先ず、１００マイクロリットルのＨＩＶ_Mn（１０００×ペレット化ウイルス）を、１００マイクロリットルの滅菌水又は１００マイクロリットルのＧＭＯ／ＣＰＣエマルジョンの何れかと、３０分間、室温で、ニューテーター上で混合することにより作成した。次いで、１．８ｍｌの組織培養培地を各調製物に加えて１０^-1の稀釈物を生成した。次いで、１０^-1稀釈物１５０マイクロリットルを取って１．３５ｍｌのＲＰＭＩ培地にて更に５回順次稀釈することにより、１０^-2〜１０^-6の一連の１０倍稀釈を行なった。次いで、各稀釈物の２つの０．４ｍｌのアリコートを上記のように調製したＣ８１６６細胞のアリコートに加えた。これらの試料を、３７℃で、２、６又は２４時間インキュベートし、リン酸緩衝塩溶液で３回洗って新鮮な培地に再懸濁し、各稀釈物を４つの複製ウェルにプレートした。細胞を週２回供給した。７及び１４日目に、細胞を、細胞変性効果について観察し、上清を採集してウイルス増殖の指標としてｐ２４のレベルを測定した。次いで、組織培養感染量（ＴＣＩＤ−５０(ｌｏｇ₁₀)）の計算を、測定されたｐ２４のレベルに基づいて行なった。その結果は、下記の通りである：ＧＭＯ／ＣＰＣエマルジョンと２時間インキュベートした試料については、７日目のＴＣＩＤ−５０において、４．５ｌｏｇのウイルス減少があり（水と比較）、１４日目のＴＣＩＤでは、４．２５ｌｏｇのウイルス減少であった。ＧＭＯ／ＣＰＣエマルジョンと６時間インキュベートした試料については、７日目のＴＣＩＤ−５０において、４．５ｌｏｇのウイルス減少があり（水と比較）、１４日目のＴＣＩＤでは、５ｌｏｇのウイルス減少であった（水と比較）。ＧＭＯ／ＣＰＣエマルジョンと２４時間インキュベートした試料については、水と比較して、７及び１４日目のＴＣＩＤ−５０において、４．０ｌｏｇのウイルス減少があり（水と比較）、リン酸緩衝塩溶液と比較した場合には、７及び１４日目のＴＣＩＤ−５０において、それぞれ、３．７５及び４．２５ｌｏｇのウイルス減少があり、ＰＯＥ２ステアリルエーテルを含むフソジェニックノバソームと比較した場合には、７及び１４日目のＴＣＩＤ−５０において、それぞれ、４．０及び４．５ｌｏｇのウイルス減少があった。全体的に見て、この実施例は、ＧＭＯ／ＣＰＣエマルジョンが、Ｃ８１６６組織培養アッセイにおいて、ＨＩＶ−１_Mnの感染性を４．０〜５．０ｌｏｇ不活性化させることを示している。これらの実験は、任意のエンベロープを有するウイルスを用いて行なうことができるが、ウイルス例えばＨＩＶ−１_Mnを不活性化するためにこれらの物質が有効であることを示している。実施例７ − ＧＭＯ中油エマルジョンの安定性この実施例では、実施例１で形成したＧＭＯ／ＣＰＣエマルジョンを、熱、酸及び塩基の存在下での安定性について試験した。表１０は、１時間煮沸することのＧＭＯ／ＣＰＣエマルジョンの分解又は凝集に対する影響、等容積の１Ｎ硝酸とＧＭＯ／ＣＰＣエマルジョンを２時間混合することの、ＧＭＯ／ＣＰＣエマルジョンの分解又は凝集に対する影響、及び等容積の１Ｎ水酸化ナトリウムとＧＭＯ／ＣＰＣエマルジョンを２時間混合することの、ＧＭＯ／ＣＰＣエマルジョンの分解又は凝集に対する影響を示している。表１０は、（ａ）１時間煮沸することは、このエマルジョンの分解又はサイズを有意に変えないこと、（ｂ）１Ｎ硝酸に２時間さらすことは、ＣＭＯ／ＣＰＣエマルジョンのサイズ又は凝集プロフィルを有意に変えないこと、及び（ｃ）１Ｎ水酸化ナトリウムに２時間さらすことは、このエマルジョンの崩壊又は凝集を引き起こすことなくこのエマルジョンの平均サイズの２０％の減少を引き起こすことを示している。上記の実施例１〜７より、本発明の抗菌性水中油エマルジョンは、カチオン性ハロゲン含有化合物例えばＣＰＣが非常に低濃度であっても、広範囲のウイルス、細菌及び酵母に対して有意の殺菌剤活性を有することは明らかである。更に、この発明のエマルジョンは、熱、酸及び塩基の存在下で安定であり、このことは、それらを局所、経口又は全身の何れかの製薬投与に非常に適したものにしている。当業者は、常例的実験を用いて、ここに説明した発明の特定の実施例に対する多くの同等物を認めるであろうし、或は確認することができるであろう。かかる同等物は、後述の請求の範囲に含まれることを意図するものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 31/57 ＡＤＢ 9454−4ＣＡ６１Ｋ 31/57 ＡＤＢ 31/575 ＡＤＹ 9454−4Ｃ 31/575 ＡＤＹ (31)優先権主張番号０８／３２９，７３０ (32)優先日 1994年10月26日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．油性不連続相の正に帯電した液滴を連続水相中に分散して含有する抗菌性水中油エマルジョンであって、該エマルジョンは：ａ．油、ｂ．主要脂質としてのグリセロールモノオレエート、及びｃ．セチルビリジニウムクロリド、セチルピリジニウムブロミド、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、セチルトリメチルアンモニウムクロリド、セチルジメチルエチルアンモニウムブロミド、セチルベンジルジメチルアンモニウムクロリド、セチルトリブチルホスホニウムブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド及びテトラデシルトリメチルアンモニウムブロミドよりなる群から選択する、Ｃ₁₂〜Ｃ₁₆鎖を有するカチオン性ハロゲン含有化合物を含む、上記の抗菌性エマルジョン。２．油を、大豆油、スクアレン油、胡麻油、オリーブ油、キャノラ油、トウモロコソ油、菜種油、紅花油、ヒマワリ油、魚油、アボカド油、水不溶性ビタミン、及びこれらの混合物よりなる群から選択する、請求項１に記載の抗菌性エマルジョン。３．エマルジョンが、コレステロール、コレステロール誘導体、ヒドロコーチゾン、フィトステロール及びこれらの混合物よりなる群から選択する少なくとも１種のステロールを更に含む、請求項１に記載の抗菌性エマルジョン。４．エマルジョンの少なくとも一部が、単ラメラ、多重ラメラ及び少ラメラ脂質小胞、ミセル並びにラメラ相よりなる群から選択する正に帯電した脂質構造の形態である、請求項１に記載の抗菌性エマルジョン。５．請求項１に記載の抗菌性エマルジョン及び製薬上許容し得るキャリアーを含む、製薬投与に適した抗菌性調製物。６．油性不連続相の正に帯電した液滴を連続水相中に分散して含有する抗菌性水中油エマルジョンであって、該エマルジョンは：ａ．大豆油、スクアレン油、スクアラン油、胡麻油、オリーブ油、キャノラ油、トウモロコシ油、菜種油、紅花油、ヒマワリ油、魚油、アボカド油、香油、水不溶性ビタミン、及びこれらの混合物よりなる群から選択する油、ｂ．グリセロールモノオレエート、及びｃ．セチルピリジニウムクロリドを含む、上記の抗菌性エマルジョン。７．請求項６に記載の抗菌性エマルジョン及び製薬上許容し得るキャリアーを含む、製薬投与に適した抗菌性調製物。８．感染性病原体の生育を阻止する方法であって、該方法は、抗菌性水中油エマルジョンの局所適用のステップを含み、該抗菌性エマルジョンは、連続水相中に分散された油性不連続相の正に帯電した液滴の形態であり、このエマルジョンは：ａ．油、ｂ．主要脂質としてのグリセロールモノオレエート、及びｃ．セチルビリジニウムクロリド、セチルピリジニウムブロミド、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、セチルトリメチルアンモニウムクロリド、セチルジメチルエチルアンモニウムブロミド、セチルベンジルジメチルアンモニウムクロリド、セチルトリブチルホスホニウムブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド及びテトラデシルトリメチルアンモニウムブロミドよりなる群から選択する、Ｃ₁₂〜Ｃ₁₆鎖を有するカチオン性ハロゲン含有化合物を含む、上記の方法。９．油を、大豆油、スクアレン油、胡麻油、オリーブ油、キャノラ油、トウモロコシ油、菜種油、紅花油、ヒマワリ油、魚油、アボカド油、香油、水不溶性ビタミン、及びこれらの混合物よりなる群から選択する、請求項８に記載の方法。１０．感染性病原体を、イン・ビトロで、不活性化する方法であって、該方法は、その病原体を抗菌性水中油エマルジョンと接触させるステップを含み、このエマルジョンは、連続水相中に分散された油性不連続相の正に帯電した液滴の形態であり、このエマルジョンは：ａ．大豆油、スクアラン油、胡麻油、オリーブ油、キャノラ油、トウモロコシ油、菜種油、紅花油、ヒマワリ油、魚油、ペトロラタム、アボカド油、トリグリセリド油脂、香油、水不溶性ビタミン、及びこれらの混合物よりなる群から選択する油、ｂ．主要脂質としてのグリセロールモノオレエート、及びｃ．セチルビリジニウムクロリド、セチルピリジニウムブロミド、及びセチルトリメチルアンモニウムブロミドを含む、上記の方法。１１．病原体がウイルスである、請求項１０に記載の方法。１２．ウイルスがＨＩＶである、請求項１１に記載の方法。