JPH10501063A

JPH10501063A - 移植片受容の改良された評価

Info

Publication number: JPH10501063A
Application number: JP7530354A
Authority: JP
Inventors: ブエロー，ローランド
Original assignee: サングスタットメディカルコーポレイション
Priority date: 1994-05-24
Filing date: 1995-05-11
Publication date: 1998-01-27
Anticipated expiration: 2015-03-21
Also published as: WO1995032426A1; EP0763203A1; US5482841A; CA2188807A1; JP3022930B2; EP0763203A4

Abstract

(57)【要約】アロ抗原は細胞のソース、好ましくは血液細胞から弱界面活性剤で抽出され、潜在的な妨害性構成物により部分精製される。その後アロ抗原調製物はアロ抗原に特異的なレセプターの存在及び特異性を決定するためのアッセイにおいて用いられる。結合したレセプターの検出は ELISA又は他の適切なイムノアッセイにより決定される。

Description

【発明の詳細な説明】移植片受容の改良された評価導入技術分野本発明の分野は、アロ抗原特異的レセプターの検出である。背景多くの移植型の状況において、細胞ソースと細胞受容体とのアロタイプ、特に HLAタイプの間の差異についての心配がある。アロ抗原に対する抗体は、複合的な血液輸血、妊娠、又は事前移植片拒絶の間により誘導され得る。これらの抗体は低タイターであり得、検出するのが難しいが、潜在的な受容体の血液中におけるそれらの存在は、アロ抗原に適合する新しい移植片が拒絶されるであろうことを示唆する。外来HLA抗原に対する抗体の存在及び特異的性の測定は、それゆえ、移植患者を監視するのに臨床的に重要である。検出アッセイは、イニシャルブロードスクリーンとして抗原のパネルに対する反応性についてテストされ得（パネル反応性抗体、PRAテスティング）、又は単一のドナーに特異的であり得る（ドナー特異的クロスマッチ）。 HLA分類及び抗HLA抗体の検出のための標準的な技術は、抗体を含む血清が HLA 抗原発現性リンパ球、その後補足物とインキュベートされる微小リンパ毒性(mic rolymphotoxicity)である。いくつかの場合に、抗ヒト免疫グロブリンが死ぬ細胞を増加させるために加えられる。細胞毒性のレベルは、種々の染料を用いる死んだ細胞と生きている細胞とを識別することにより評価される。この方法は多くの不利な点を有する：それは、激しい労力、時間の浪費、細胞の単離を必要とすること、生きている細胞を必要とすること、HLAに非特異的であること、及び主観的評価を必要とすることである。フローサイトメトリーも用いられるが、大量の細胞及び広範囲の器械を必要とする。それゆえ、簡単に行うことができ、自動化することができ、先に記載されるような欠点のない、移植片受容体の予後のために重要である直ちに識別できる結果を供し、そして現存するテストからのデータに匹敵する代わりの技術を提供することが関心事である。関連文献関心の文献はDuquesnoy et al.（1990）Transplantation 50：427-37；Marti n et al.(1987)Transplantation 44：50-53；Grosse-Wilde et al.(1989)J.Imm unogenet. 16：149-55；Doxiadis and Grosse-Wilde(1989)Vox Sang 56：196-99 ；Davies et al.(1989)Transplantation 47：524-27；Stevenson et al.（1986 ）J.Immunol.Methods 86：187-90；Fauchet et al.（1989）Transplantation 30：114-129；Talbot et al.(1988)J.Immunol.Methods 112：279-83；Iwaki et al.（1988）Clin.Transplantation 2：81-84を含む。アロ抗体の分析の報告は、Fuller（1991）Clin Lab Med 11：551〜70；及びOl dfather et al.（1986）Transplantation 42: 267〜70に報告される。Terashit a（1989）Clin Transpl 391〜6は交差適合試験（crossmatch）におけるフローサイトメトリーの使用を議論している。 HLA分類の方法は先に記載されている。米国特許第 5,223,397号は、生物サンプルにおいて見い出された HLA分子の可溶形態との H LAクロスマッチを測定する方法を記載する。米国特許第 5,292,641号はアロ抗原又はアロ抗原特異的抗体の固体支持体における検出を記載している。免疫複合体を含む HLA抗原を検出するための固体基質に結合した補足蛋白質 Clqの使用は、米国特許第 5,270,169号に記載されている。発明の概要アロ抗原とアロ抗原特異的レセプターとの間の反応は、細胞ソースから柔界面活性剤で可溶化されたアロ抗原と生物サンプルを組み合わせることにより測定され、潜在的妨害性構成物の沈殿により部分精製される。アロ抗原サンプルは１又はいくつかの器官ドナーからのものであり得る。結合したレセプターの存在は、慣用的なイムノアッセイ法により測定される。特定の実施形態の記載アロ抗原は細胞ソース、好ましくは血液細胞から弱界面活性剤で抽出され、潜在的妨害構成物の沈殿により部分精製される。その後アロ抗原調製物は、アロ抗原特異的レセプターの生物サンプルと混合される。結合したレセプターは、ELIS A又は他の適切なイムノアッセイにより測定される。本発明は、アロ抗原と２つの生物サンプルの間の免疫反応の指示体であるアロ抗原特異的抗体との間の反応性を決定することに特に利用できる。アロ抗体のレベル及び特異性の正確な評価は、組織移植におけるドナーと受容体とを適合させるのに重要である。ドナー HLAのための特異的アロ抗体の存在は、移植片が拒絶されるであろうことを強く予測させる。本発明の実施形態は、周知の組織適合性抗原に対する抗体を同定し（交差試験(crossmatching)）、周知の特異性の抗体で組織適合性抗原を同定し（組織タイピング）、そしていくつかの異なる組織適合性抗原に対する一般的異質反応性を同定することに用いられる。特定のアロ抗体の検出は、血液中のバックグラウンド蛋白質及び他の生化学的高分子の一般的に高レベルの妨害により困難になる。特に、血液からの可溶性アロ抗原との HLA反応性の決定は、存在する高レベルの非特異的免疫グロブリンから生ずるバックグラウンドシグナルを克服しなければならない。本発明は、アロ抗原サンプル中の非特異的蛋白質の量を大きく削減する単純精製及び部分精製を利用する。アッセイ結果の正確さはバックグラウンドノイズの削減により改良される。アロ抗原は同じ種の他のメンバーにより抗原として検出され得る対立遺伝子の直接又は非直接産物である。このような対立遺伝子の産物はコードされたポリペプチドを含むが対立遺伝子にコードされた酵素により合成された特異的ポリサッカリド及び脂質も含む。本発明における特に関心の抗原は、ヒトにおいて HLAとして主要に含む組織適合性抗原及び小量の組織適合性抗原グループである。移植とはドナー組織が移植片受容体の体に結合されることを意味する。好ましい移植は細胞、組織及び器官の移植を含む。血液もしくは血液構成物の輸血、骨、皮膚、骨髄等の移植、並びに眼、膵臓、肝臓、腎臓、心臓、脳、腸、肺等の組織の移植が特に関心事である。最も関心があるのは、造血細胞、例えば骨髄、末梢血液における流動性造血幹細胞等の移植並びに腎臓の移植である。このような細胞又は組織は採集と移植との間に処理され得る。予備処理は、単離、又は特定の細胞型、組織構成物、化合物等の濃度を増加もしくは減少させるための分別の方法を含み得る。更に、ドナー組織又は細胞は、受容体に移す前の培養、分化、増殖、及び遺伝子操作のような試験管内処理を行うことができる。本明細書に用いる場合、移植片受容体は、一般的に同じ種の、他の個体（ドナー）からの組織又は細胞が移されている個体である。移植片受容体及びドナーは一般的に哺乳動物、好ましくはヒトである。受容体の成長の段階は、一般に胎児から大人、通常子供から大人の範囲であろう。ほとんどの場合、潜在的な移植片受容体は、アッセイされるべきアロ抗体を含む生物サンプルのソースとなろう。生物サンプルは一般的に、通常血漿又は血清の形態において得られる血液であろう。ほとんどの場合、血清は少くとも約１： 10、通常約１：100で１：1000以下で希釈されるであろう。いずれかの生理学的緩衝液、例えばPBS、通常の塩類溶液、HBSS，dPBS等が用いられ得る。希釈はバックグラウンドシグナルのレベルを削減するためにしばしば有用であるが、アロ抗体のタイターがしばしば低いため、そのレベルを超える実質的な希釈は通常行われないであろう。アロ抗原のソースは潜在的な組織ドナー又はサンプルの広範囲のパネルであり得る。ドナーは、胎児から大人までの発達のいずれかの段階であり得る。ドナー組織は、移植の間、組織が生きている死んだ個体からも抽出され得る。アロ抗原の細胞ソースは、血液、組織バイオプシーサンプル、特に腎臓、皮膚、肺、心臓、骨髄等；器官又は組織培養細胞；等を含む。その言葉は誘導体及びフラクションも含む。好ましいソースは、白血球の濃縮ソースである血液及び血液の軟膜（ buffy coat）フラクションであり、それゆえ HLAアロ抗原である。メンブラン結合アロ抗原は、弱界面活性剤、特に非イオン性又は双性イオン界面活性剤で細胞から抽出される。この界面活性剤は部分精製ステップにおいて用いられる沈殿剤と適合しなければならない、即ち界面活性剤はこの試薬の添加で沈殿しないであろう。非イオン性アルキル化糖界面活性剤、例えばｎ−デシルβ−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ドデシル β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ドデシルβ−Ｄ−マルトシド、ｎ−ヘプチルβ −Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−オクチルα−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ノニルβ−Ｄ−グルコピラノシド等が HLA抗原の選択的抽出に有用である。好ましい界面活性剤はｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシドである。界面活性剤は少くとも１％、更に通常は約４％、そして10 ％以下、通常５％以下において用いられるであろう。界面活性剤の濃度は、上清サンプルのゲル電気泳動により種々であり得る細胞膜からのアロ抗原を可溶化するのに十分でなければならない。抽出されたアロ抗原、界面活性剤及び細胞を含む溶液は、大きな粒子、例えば細胞を除く点において遠心され、又はよりしばしば次のステップにおいて直接用いられ得る。沈殿剤がこの溶液に加えられ、その後該溶液は妨害するバックグラウンド構成物を凝集するのに十分な期間インキュベートされる。このようなバックグラウンド構成物は典型的には蛋白質、特に免疫グロブリン、メンブランフラグメント、及び他の大きな生物分子であろう。通常、インキュベーションは少くとも約５分間、より通常には少くとも約10分間、いくつかの場合には約１時間、通常３時間以下であろう。沈殿のために有用な試薬はポリエチレングリコール及び硫酸アンモニウムである。硫酸アンモニウムは、少くとも約30％、更に通常は約40％、そして約80％以下、通常は約50％以下の濃度において用いられる。沈殿剤の濃度は本発明に重要である。それは、免疫グロブリンのようなバックグラウンド構成物を沈殿させるのに十分でなければならないが、アロ抗原が沈殿するであろう高い濃度であってはならない。この手順は、アロ抗原対バックグラウンド蛋白質の相対濃度を分析するためのゲル電気泳動により種々であり得る。その後サンプルは遠心され、ペレットされた残物が捨てられる。残った上清はレセプターサンプルとのイムノアッセイにおいてアロ抗原のソースとして用いられる。アロ抗原特異的レセプターの濃度を測定することは、種々の特定のアッセイにより行われ得る。好ましい実施形態において、交差試験（crossmatch）又は PRA テスティングのための慣用的なイムノアッセイに類似した ELISAサンドイッチアッセイが用いられる。アロ抗原に特異的な捕獲剤を固相支持体に最初に付着させることによりサンドイッチアッセイが行われる。この捕獲剤はその表面の性質によりいずれかの慣用的手段によりその表面に結合される。結合の特定の様式は本発明の他の試薬及び全体の方法と適合する限り重要でない。捕獲剤が抗体である場合、それは共有的又は非共有的、好ましくは非共有的にプレートに結合され得る。特に有用な捕獲剤はアロ抗原に対する抗体である。全体又は完全な抗体のかわりに、抗体フラグメント例えばFab，F(ab′)₂、軽又は重鎖フラグメント等を用いることができる。アフィニティー精製されたポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を用いることが好ましい。CD４，CD８、及びＴ細胞レセプターのようなアロ抗原結合アフィニティーとの免疫分子は直接又はその誘導体を介してのいずれかにおいて有用な捕獲剤を供する。レクチンは、アロ抗原がサッカリドの存在により選択され得る場合に有用であり得る。本発明の好ましい実施形態において、捕獲剤は１以上の HLAアロ抗原に特異的な抗体である。このような抗体は、ポリクローナル又はモノクローナルであり得、一般に市販されるか又は当業者に周知である技術により直ちに作られる。クラスIIHLA分子を検出するために、抗体はα又はβ鎖のいずれかに特異的でありうる；クラスＩHLA のために、特異性は MHC遺伝子コード鎖、特にα３ドメイン又は関連したβ−２ミクログロブリン鎖に対してであり得る；又はいずれのクラスにおいても、特異性は両方の鎖の組合せにより発現されるコンホメーション的エピトープに対してであり得る。抗体は、 HLA分子のクラスを通して保存性があるエピトープに特異的、又は HLA分子のサブセットにより発現されるエピトープに特異的であり得る。クラス II分子のサブセットはDP，DQ及びDR遺伝子領域の産物を含み、クラスＩ分子のそれはＡ，Ｂ及びＣ領域の産物を含む。抗体は特定の対立遺伝子の定常領域又は多形領域の一部分に対してであり得る。不溶性支持体は、捕獲剤が結合され得、可溶性材料から直ちに分離され、そして他には方法全体に適合するいずれかの組成物であり得る。各々の支持体の表面は固体又は多孔質、並びにいずれかの慣用的形状のものであり得る。レセプターが結合する適切な不溶性支持体の例はビーズ、メンブラン及びマイクロタイタープレートを含む。これらはガラス、プラスチック（例えばポリスチレン）、ポリサッカリド、ナイロン又はニトロセルロースから典型的に作られる。マイクロタイタープレートは、少量の試薬及びサンプルを用いて大量のアッセイを同時に行うことができるので特に便利である。分離が磁気により行われる場合、支持体は好ましくはプラスチックにより覆われた常磁性構成物を含む。アロ抗原サンプルを加える前に、不溶性支持体上の非特異的結合部位、即ち捕獲剤により占有されていないところは一般にブロックされる。好ましいブロッキング剤はウシ血清アルブミン、カゼイン、及びゼラチン等のような非妨害性蛋白質を含む。あるいは、Tween，NP40、及び TX100等のような妨害しない濃度におけるいくつかの界面活性剤が用いられ得る。その後可溶化アロ抗原を含むサンプル上清は、支持体結合捕獲剤を含む別々にアッセイ可能な支持体（例えばマイクロタイタープレートの分離したウェル）に加えられる。HLA交差試験の例において、予期された組織ドナーからのアロ抗原サンプルは特異的捕獲剤を通して固相支持体に結合し、予期された組織受容体からの血清が特定の抗体の存在についてアッセイされる。他の例において、一連の異なるドナーサンプルは、別々のサンプルアリコートにおいて用いられ、その後このアリコートは各々の HLA特異的抗体の存在について平行にアッセイされる。一般的に希釈等された約 0.001〜１mlの可溶化アロ抗原が十分であり、通常約 0.01mlが十分である。好ましくは、各々の上清は、平均値が得られうるようにマルチプルウェルに加えられるであろう。インキュベーション時間は、アロ抗原分子が捕獲剤に結合するのに十分であるべきである。一般に、0.1〜３時間が十分であり、通常１時間で十分である。インキュベーションの後、不溶性支持体は、結合していない構成物が一般に洗浄される。一般に、適切なpH、一般に７〜８における希釈非イオン性界面活性媒体が洗浄媒体として用いられる。サンプル中に存在する非特異的結合蛋白質を全体にわたり洗浄するのに十分な量において、１〜６回の洗浄が行われ得る。洗浄後、アロ抗原特異的レセプターを含む生物サンプルが適用される。本明細書において用いられるサンプルは、血液、脳脊髄液、涙、唾液、リンパ及び透析液等のような生物流体；器官又は組織培養由来流体；並びに生理学的組織から抽出された流体を含む。またこの言葉にはこのような流体の誘導体及びフラクションも含まれる。血漿又は血清のような血液又はその誘導体(以後“血液”)のような生理学的サンプルが好ましい。このようなサンプルは一般に特定のレセプターの濃度が低い複合混合物であろう。関心の特定のレセプターは抗体である。アイソタイプIgG及ぴIgMは血中において見い出され、IgAは分泌された流体、例えば唾液等において検出され得る。免疫応答を指示し得る他のレセプターはＴ細胞レセプターである。特に関心のものは移植又は予期された移植患者において見い出されるアロ抗体である。生物サンプルの量、組成及び濃度は捕獲剤に予め結合したアロ抗原への測定可能な結合を供する。量は、0.1μｌ〜１mlが十分であり、通常約１μｌで十分である。インキュベーション時間はレセプターが利用できる結合したアロ抗原分子に結合するのに十分であるべきである。一般に、約0.1〜３時間で十分であり、通常１時間で十分である。レセプターがアロ抗原に結合した後、不溶性支持体は、先の洗浄のために本質的に記載されるように、非特異的に結合した蛋白質がないように一般的に再び洗浄される。結合したアロ抗原特異的レセプターの存在は、標識試薬、特に抗ヒト抗体、例えば抗血清で検出される。レセプター結合の直接的測定を許容する標識の例は、³Ｈ又は¹²⁵Ｉのような放射能標識、発蛍光体、染料、ビーズ、化学発光体、及びコロイド粒子等を含む。結合の間接的測定を許容する標識の例は、その基質が有色又は蛍光産物を供し得る酵素を含む。好ましい実施形態において、標識試薬は抗体、好ましくは適切な基質の添加の後に検出可能な産物シグナルを供することができる共有結合した酵素で標識された抗体である。接合体において用いるための適切な酵素の例は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、及びマレートデヒドロゲナーゼ等を含む。市販されていない場合、このような抗体−酵素接合体は当業者に周知である技術により直ちに作られる。非特異的結合材料が除かれた後、結合した接合体により産生されたシグナルは、慣用の手段により検出される。酵素接合体を用いる場合、検出可能な産物が形成されるように適切な酵素基質が提供される。更に詳しくは、ペルオキシダーゼが選択された酵素接合体である場合、好ましい基質の組合せはH₂O₂であり、適切な反応条件下で有色の産物を産生するｏ−フェニレンジアミンである。先に記載されるもののような他の酵素接合体のための適切な基質は当業者に周知である。種々の有用な接合体又はその産物を検出するための適切な反応条件及び手段も当業者に周知である。基質ｏ−フェニレンジアミンの産物のために、例えば490〜4 95nmにおける光吸収が分光光度計で便利に測定される。サンプルは標準値を与えるために陽性及び陰性対照と共にかけられるであろう。陰性対照は、同じ手順により調製されて検出される固体基質を有するであろうが、アロ抗原又はレセプター被検体を欠如するであろう。陰性対照は経験的に決定され得る予め決定されたカットオフ値より低くなければならない。陽性対照は、結合したアロ抗原に結合するであろう試薬を用いて行われるであろう。HLAクラスＩ抗原に対する抗体の存在を検出するための便利な陽性対照は、全ての HLAクラスＩ蛋白質で見い出される不変鎖であるヒトβ₂−ミクログロブリンと反応する周知の量の抗体を結合したアロ抗原に添加することにより供される。抗体は検出を許容する標識に直接接合され得、又は第２抗体、特にテストサンプルにおいて用いられる標識された検出試薬と組み合わせて用いられ得る。陽性参照は存在する周知の量の対立遺伝子のために予想されるてあろうものを基礎とした予め決定された範囲内であるはずである。アッセイにおいて用いられるカットオフ値は大量のサンプルからデータを収集して微小リンパ球細胞毒性の目的のアッセイと慣用的アッセイとの間の一致を最適化するカットオフ値を計算することにより経験的に決定されるであろう。本発明での適用が見い出され得る装置は、捕獲剤が結合している多孔質基材を有するものである。基材を支持するのは、サンプル及び洗浄物を含む種々の流体を吸収するであろう吸収層である。望ましくは、吸収層と多孔質層は多孔質層を通しての流れの速度及び方向に関する複数のオリフィスを有するフローコントロールフィルムにより分離される。この装置の更なる記載については、1992年９月 15日に発行された米国特許第 5,147,780号を参照のこと。この装置及び同等の装置は、異なるソースからの、又は同じソースからの異なる濃度におけるもののいずれかの複数のサンプルの同時の測定を許容する。これにより同時に複数の測定を行うことができる。あるいは、マイクロタイタープレートは、そのウェルの底がろ過を許容するため多孔質である場合に用いられ得る。用いられる特定の装置は測定されるべきサンプルの数、及び利用できる装置等によるであろう。以下の実施例は実例の手段により、限定の手段でなく提供される。実験実施例Ｉ交差 ELISA プレート及び試薬の調製 Nunc Maxisorbプレートを抗 HLAクラスＩモノクローナル抗体（抗アルフ(anti -alph3)）でコートした。コーティング溶液は0.1Ｍ酢酸ナトリウム中10μｇ／ml のF(ab)′₂−TP25である。各々のウェルを100μｌのコーティング溶液でコートして98％以上の相対湿度、25℃、６±0.5時間、インキュベートした。インキュベーションの後、コーティング溶液を吸引して、ウェルを300μｌ／ウェルで50mMリン酸緩衝液で一回洗浄した。その後、ウェルを相対湿度98％以上、25℃、18±４時間、300μｌ／ウェルでPRAブロック溶液(SangStat Medical Corp)でブロッキングした。インキュベーションのおわりにブロッキング溶液を吸引してプレートを30 0μｌ／ウェルで50mMリン酸緩衝液で一回洗浄した。その後プレートを10分間、3 00μｌ／ウェルにおいて４％スクロース溶液でコートした。スクロース溶液を全てのウェルから吸引した。プレートを25℃で７分間、ドライングトンネルにおいて乾燥した。プレートを乾燥剤と共に袋に入れて後の使用のために４℃で保存した。ドナー血液調製物スタンフォード血液センターからの各々約20mlの20のランダムなドナーからの新鮮な血液をこの研究のために集めた。この血液は抗凝血物質 ACDを含んでいる。各々のドナー血液を以下の通り処理した：全体の血液−ドナー血液の必要な量を測定してポリプロピレンチューブ内に入れた。PBS中20％のｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシド（OG）の保存溶液をこの血液に加えて２％重量／容量の最終濃度とした。ドナー血液及びOGを十分に混合して室温で10分間インキュベートした。その後飽和硫酸アンモニウム(SAS) を血液及びOG混合物に加えて40％硫酸アンモニウム重量／容量の最終濃度とした。ドナー血液、OG及び SASをボルテキシングにより十分によく混合して室温で10 分間インキュベートした。その後、この混合物を５分間、マイクロフュージで15 ,000ｇで遠心した。この上清を回収して透明なポリプロピレンチューブに移し、３〜５分間再び遠心した。この上清を50mMリン酸緩衝液、0.01％チメロサールpH 7.4で直ちに１：４に希釈した。軟膜（buffy coat）−ドナー血液をベックマンTJ−６セントリフュージにおいて10分間、４℃で1,500rpmで回転した。血漿での軟膜を注意深く集収してポリプロピレンチューブ内に入れた。いくつかの赤血球を軟膜と共に取り出し得る。軟膜の必要な量を測定して、その上清を緩衝液中１：３に希釈した以外は全体の血液での方法と全く同様にOG及び SASで処理した。受容者血清調製物（PRA−STAT及びリンパ球毒性により）０〜100％の周知の％PRA値の13の受容体血清をこの研究のために選択した。各々の受容体血清を PRA 1×Specimen Dil uent(SangStat Medical Corp)中に１：101 に希釈した。接合体ヤギ抗ヒト IgG−Fcの西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)接合体を PRA 1×Spe cimen Diluent中で１：8,000に希釈した。基質 Substrate Buffer中３mg／mlにおいて使用前15分以内にOPD（ｏ−フェニレンジアミン）溶液を調製した。アッセイプロトコル： OG／SAS処理した全体の血液又は軟膜からの希釈したドナー上清を各々のテストウェル及びドナーのみのウェルに 100μｌ／ウェルでピペットで分注した。50 mMリン酸緩衝液、0.01％チメロサールpH 7.4を各々の受容体のみのウエルに 100 μｌ／ウェルで加えた。このプレートをプラスチックシーラーで覆って１時間37 ℃でインキュベートした。このプレートを吸引して PRA洗浄緩衝液で各々の回 325μｌ／ウェルで３回洗浄した。希釈した受容体血清をテスト及び受容体のみのウェルの両方に１ 00μｌ／ウェルにピペットで分注した。このプレートを１時間37℃でインキュベートした。このプレートを吸引して PRA洗浄緩衝液で各々の回 325μｌ／ウェルで３回洗浄した。希釈したヤギ抗ヒトIgG Fc−HRP 接合体を全てのウェルにピペットで分注した。このプレートを室温で１時間、インキュベートした。このプレートを吸引して PRA洗浄緩衝液で各々の回 325μｌ／ウェルで３回洗浄した。 OPD基質溶液を全てのウェルにピペットで分注した。このプレートを室温で７分間インキュベートした。停止溶液を100μｌ／ウェルで全てのウェルに加えた。このプレートを 492nm及び 600nm標準波長の波長においてマイクロプレートリーダーで読み取った。アッセイ結果の解釈各々のドナー及び受容体の対のために、交差比率を次の通り計算した：比率＝テストウェルのO.D.／（ドナーのみ＋受容体のみのウェルのO.D.）各々のO.D.は重複するウェルの平均値である。各々のクロスマッチ比率をカットオフ値と比較した。交差比率がカットオフ値以上であれば、受容体血清はドナーにおける HLA抗原に対する IgG抗体を含んでいた。これは陽性結果であった。交差比率がカットオフ値未満であれば、受容体血清はドナーにおける HLA抗原に対する IgG抗体について陰性であった。微小リンパ球毒性(microlymphocytoxicity)と結果を比較するために、次の等式を用いた：真陽性（TP）は微小リンパ球毒性及び ELISAの両方により陽性であるサンプルである。真陰性（TN）は微小リンパ球毒性及び ELISAの両方により陰性であるサンプルである。偽陽性（FP）は微小リンパ球毒性により陰性で ELISAにより陽性であるサンプルである。偽陰性（FN）は微小リンパ球毒性により陽性で ELISAにより陰性であるサンプルである。リンパ球毒性アッセイ末梢血液リンパ球(PBL)をFicoll-Hypaque技術により新鮮なドナー血液から単離した。PBLの濃度をml当り 2.0〜2.5 百万細胞に調節した。テラサキトレー上において、（未処理及び DTT処理した）受容体血清１μｌ及びドナーPBL１μｌを室温で45分間インキュベートした。その後５μｌのウサギ補体を全てのウェルに加えて室温で90分間インキュベートした。最後に10μｌのStain Fixを全てのウェルに加えた。細胞溶解を位相差顕微鏡下で評価した。陽性反応を陰性対照を超える25％細胞溶解として定義した。同種交差（autocrossmatch）はアッセイにおいて常に含まれている。結果交差 ELISAとリンパ球毒性との間の比較 20のドナー及び13の受容体からの全部で 260交差サンプルをテストした。交差 ELISAの結果をリンパ球毒性アッセイと比較した。交差 ELISAにおける 2.2のカットオフ値においてドナーの全体の血液調製物を用いて表１に示される値が得られた。交差ELISAとリンパ球毒性結果との間の一致度は84.6％、特異性86.6％、そして感度81.0％であった。交差 ELISAにおける 2.5のカットオフ値においてドナーの軟膜調製物を用いて表２に示される値が得られた。 ELISAとリンパ球毒性結果との間の一致度は91.1％であり、特異性89.0％、そして感度89.0％であった。それゆえ我々は、本方法が HLA交差及び PRAを測定するための単純で正確な診断アッセイを供すると結論づけた。この結果はリンパ球毒性アッセイに匹敵するが、アッセイが行われ得る速度、容易さ及び自動化において利点を供する。バックグラウンドシグナルのレベルは単純なアッセイシステムに比べて削減される。本方法は HLA反応体を測定するための容易な方法を提供することは先の結果からの証拠である。この方法は迅速かつ容易に行われ、直ちに利用できる試薬を必要とし、多数のサンプルで行うことができ、極めて効果的な様式において多数の対立遺伝子を測定することができる。本明細書において言及される全ての出版物及び特許出願は各々の個々の出版物又は特許出願が引用により組み込まれるように詳しくかつ個々に示されるように引用により本明細書に組み込まれる。先の発明は理解の明快さの目的のため実例及び実施例の手段によりいくらか詳しく記載されているが、特定の変化及び改良が添付の請求の範囲の要旨又は範囲から離れることなくなされ得ることは本発明の技術の範囲において当業者に直ちに明らかになるであろう。

【手続補正書】特許法第１８４条の７第１項【提出日】１９９５年９月６日【補正内容】請求の範囲１．生物学的サンプルにおいて HLA抗原に特異的な少くとも１つのレセプター被検体の存在を検出するための方法であって、該方法が、 HLA抗原の少くとも１つの細胞のソースを非イオン性又は両性イオン性界面活性剤で処理して可溶化された HLA抗原を含む溶液を供するステップと、前記可溶化 HLA抗原を含む溶液を沈殿剤と組み合わせることにより、前記溶液から妨害性バックグラウンド構成物を沈殿除去するステップと、前記 HLA抗原を固相支持体に結合させるステップと、前記生物学的サンプルを前記固相支持体に加えるステップと、カットオフ値と比較した検出可能なシグナルの手段により前記支持体上に存在する前記 HLA抗原に対する前記少くとも１つのレセプターの存在を検出するステップと、を含み、前記検出可能なシグナルと前記カットオフ値との間のシグナルにおける差異が前記レセプターの存在を示すことを特徴とする方法。２．前記界面活性剤が非イオン性アルキル化糖界面活性剤であることを特徴とする請求項１に記載の方法。３．前記非イオン性アルキル化糖界面活性剤がｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシドであることを特徴とする請求項２に記載の方法。４．前記沈殿剤が硫酸アンモニウムであり、前記妨害性バックグラウンド構成物を沈殿除去するステップが、前記妨害性バックグラウンド構成物を凝集させるのに十分な時間、前記溶液をインキュベートするステップと、前記溶液を遠心分離するステップと、上清を単離するステップと、を更に含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。５．前記レセプターがアロ抗体であり、前記生物学的サンプルが血液であり、前記検出するステップが、非特異的に結合した蛋白質が実質的にないように前記固相支持体を洗浄するステップと、前記アロ抗体に結合することができる標識試薬を加えるステップと、前記支持体に結合した前記標識試薬の存在を検出するステップと、を含むことを特徴とする請求項４に記載の方法。６．前記標識試薬が酵素標識された抗ヒト抗体であることを特徴とする請求項５に記載の方法。７．前記標識試薬がフルオロクロム標識抗ヒト抗体であることを特徴とする請求項５に記載の方法。８．前記 HLA抗原の少くとも１つの細胞のソースが血液及び血液の軟膜フラクションからなる群から選択されることを特徴とする請求項４に記載の方法。９．前記 HLA抗原の少くとも１つの細胞のソースが HLAアロタイプのパネルを供することを特徴とする請求項８に記載の方法。 10．前記 HLA抗原の細胞のソースが移植のための予期された組織ドナーであり、前記生物学的サンプルが予期された組織受容体からの血液であることを特徴とする請求項８に記載の方法。 11．予期された組織受容体からの血液サンプルにおいて少くとも１つの HLA抗原に特異的なアロ抗体の存在又は欠如を検出することにより HLA交差適合試験(cross-match)を行うための方法であって、前記アロ抗体の欠如が HLA交差適合を示し、前記方法が、予期されたドナーから得られた、血液及び血液の軟膜フラクションからなる群から選択される HLA抗原の細胞のソースをｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシドで処理して HLA抗原を含む溶液を供するステップと、硫酸アンモニウムを前記溶液に加えるステップと、妨害性バックグラウンド構成物を凝集させるのに十分な時間、前記溶液をインキュベートするステップと、前記溶液を遠心分離するステップと、前記遠心した溶液から上清を単離するステップと、前記上清中に存在する前記 HLA抗原を固相支持体に結合させるステップと、前記血液サンプルを前記固相支持体に加えるステップと、非特異的に結合した蛋白質が実質的にないように前記固相支持体を洗浄するステップと、前記アロ抗体に結合することができる標識試薬を加えるステップと、カットオフ値と比較した検出可能なシグナルの手段により前記指示体に結合した前記標識試薬の存在を検出するステップと、を含み、前記検出可能なシグナルと前記カットオフ値との間のシグナルにおける差異が前記アロ抗体の存在を示すことを特徴とする方法。 12．生物学的サンプルにおいて HLA抗原に特異的な少くとも１つのレセプター被検体の存在を検出するために方法において用いるためのキットであって、該キットが、 HLA抗原の関心のサブセットの保存性領域に特異的に結合することができる捕獲剤で被覆された固相支持体と、ｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシドと、ポリエチレングリコール及び硫酸アンモニウムの群から選択される沈殿剤と、ヒト抗体に特異的に結合する標識試薬と、を含むことを特徴とするキット。 13．前記捕獲剤が HLAクラスＩ重鎖のα３ドメインに対する抗体であることを特徴とする請求項12に記載のキット。

Claims

【特許請求の範囲】１．生物学的サンプルにおいて HLA抗原に特異的な少くとも１つのレセプター被検体の存在を検出するための方法であって、該方法が、 HLA抗原の細胞のソースを非イオン性又は両性イオン性界面活性剤で処理して可溶化された HLA抗原を含む溶液を供するステップと、前記溶液から妨害性バックグラウンド構成物を沈殿除去するステップと、前記 HLA抗原を固相支持体に結合させるステップと、前記生物学的サンプルを前記固相支持体に加えるステップと、カットオフ値と比較した検出可能なシグナルの手段により前記支持体上に存在する前記 HLA抗原に対する前記少くとも１つのレセプターの存在を検出するステップと、を含み、前記カットオフ値と比較した前記試料からのシグナルにおける差異が前記レセプターの存在を示すことを特徴とする方法。２．前記界面活性剤が非イオン性アルキル化糖界面活性剤であることを特徴とする請求項１に記載の方法。３．前記非イオン性アルキル化糖界面活性剤がｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシドであることを特徴とする請求項２に記載の方法。４．前記妨害性バックグラウンド構成物を沈殿除去するステップが、硫酸アンモニウムを前記溶液に加えるステップと、前記妨害性バックグラウンド構成物を凝集させるのに十分な時間、前記溶液をインキュベートするステップと、前記溶液を遠心分離するステップと、上清を単離するステップと、を含むことを特徴とする請求項３に記載の方法。５．前記レセプターがアロ抗体であり、前記生物学的サンプルが血液であり、前記検出するステップが、非特異的に結合した蛋白質が実質的にないように前記固相支持体を洗浄するステップと、前記アロ抗体に結合することができる標識試薬を加えるステップと、前記支持体に結合した前記標識試薬の存在を検出するステップと、を含むことを特徴とする請求項４に記載の方法。６．前記標識試薬が酵素標識された抗ヒト抗体であることを特徴とする請求項５に記載の方法。７．前記標識試薬がフルオロクロム標識抗ヒト抗体であることを特徴とする請求項５に記載の方法。８．前記 HLA抗原の少くとも１つの細胞のソースが血液及び血液の軟膜フラクションからなる群から選択されることを特徴とする請求項４に記載の方法。９．前記 HLA抗原の細胞のソースが HLAアロタイプのパネルを供することを特徴とする請求項８に記載の方法。 10．前記 HLA抗原の細胞のソースが移植のための予期された組織ドナーであり、前記生物学的サンプルが予期された組織受容体からの血液であることを特徴とする請求項８に記載の方法。 11．予期された組織受容体からの血液サンプルにおいて少くとも１つの HLA抗原に特異的なアロ抗体の存在を検出することにより HLA交差適合試験(cross-mat ch)を行うための方法であって、該方法が、予期された組織ドナーから得られた、血液及び血液の軟膜フラクションからなる群から選択される HLA抗原の細胞のソースをｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシドで処理して HLA抗原を含む溶液を供するステップと、硫酸アンモニウムを前記溶液に加えるステップと、妨害性バックグラウンド構成物を凝集させるのに十分な時間、前記溶液をインキュベートするステップと、前記溶液を遠心分離するステップと、前記遠心した溶液から上清を単離するステップと、前記 HLA抗原を固相支持体に結合させるステップと、前記血液サンプルを前記固相支持体に加えるステップと、非特異的に結合した蛋白質が実質的にないように前記固相支持体を洗浄するステップと、前記アロ抗体に結合することができる標識試薬を加えるステップと、カットオフ値と比較した検出可能なシグナルの手段により前記指示体に結合した前記標識試薬の存在を検出するステップと、を含み、前記カットオフ値と比較した前記試料からのシグナルにおける差異が前記レセプターの存在を示すことを特徴とする方法。 12．請求項１に記載の方法において用いるためのキットであって、該キットが、 HLA抗原に特異的に結合することができるレセプターで被覆された固相支持体と、ｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシドと、ヒト抗体に特異的に結合する標識試薬と、を含むことを特徴とするキット。 13．前記 HLA抗原に結合することができるレセプターが HLAクラスＩ重鎖のα ３ドメインに対する抗体であることを特徴とする請求項12に記載のキット。