JPH10501426A - 酸化還元酵素の可逆的作用性阻害剤の定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、酵素基質を調製し、反応に含まれる酵素の酵素活性を測定し、得られた測定値から阻害剤の濃度を決定することを特徴とする、酸化還元酵素の可逆的作用性阻害剤の定量方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 酸化還元酵素の可逆的作用性阻害剤の定量方法 一般的に食品、医薬、及び化学産業において、データの収集は、物質の特徴づ け及び製法制御のために非常に重要である。同じことは、水、汚水、及び土壌（ ソイル）の監視、並びに環境技術にも適用できる。 これらのデータ及び制御される変数の決定のために一般に用いられる選択的方 法は、クロマトグラフィー法［例えば、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ ）、及びガスクロマトグラフィー（ＧＣ）］、湿式分折法（例えば、容積測定分 析法）、及び酵素法（これは、一般的にテストキットである）である。ＨＰＬＣ 法の不利な点は、データ及び試料処理物を得るのに長時間かかることである。ま た、消費物質のコストがかなり高く、最終的には機械に関する多大な出費が必要 になる。同じことがＧＣ法についても言える。湿式分折法も、分析データを得る のに長い時間がかかり、サンプルの処理にかなりの費用がかかり、しかも、多量 のサンプルが必要であるにもかかわらず、単に低い選択性しかない。テストキッ トを使用する場合にも、１回の分析時間は、非常に長い。市販のテストキットは 、少量の分析にのみ使用することができるということを述べることも必要であろ う。 これらの分析物は、例えば、いわゆる可逆的阻害剤である。これらには、例え ば、カルボン酸、アミノ酸及びその塩、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、 ｎ−メチル−アミノ酸、メトキシアセテート、ピロール−２−カルボン酸、チオ フェン−２−カルボン酸、フラン−２−カルボン酸などの物質が含まれる。 酸化還元酵素としては、例えば、サルコシンオキシダーゼ、モノアミノオキシ ダーゼ、Ｌ−ラクテート２−モノオキシゲナーゼ、及びＬ−アミノ酸オキシダー ゼを挙げることができる。 従って、本発明の目的は、非常に高価な機械を用いることなく、分析物の濃度 に関して信用することのできる結果を短時間で与える、前記のデータ及び制御さ れる変数を決定する分析的方法を提供することにある。 更に本発明の目的は、前記の分析方法を実施する測定装置を提供することにあ る。 第一の観点によれば、前記目的は、可逆的に作用する酵素反応阻害剤の定量方 法によって解決される。前記方法においては、酵素基質を供給し、阻害剤の存在 下で、酵素反応に含まれる酵素の酵素活性を決定し、この得られたデータから、 前記の可逆的に作用する阻害剤の濃度を計算する。 本発明の方法において、分析物は阻害剤である。本発明では、従来の分析系に おいて間違ったデータを導くことのある阻害剤を、データ決定変数としてここで は用いる。従って、測定における阻害剤の影響を、阻害剤の濃度の測定に用いる 。ここでは、酵素基質は、従来法のように、分析物ではなく、阻害剤と一緒に反 応混合物中に存在する必要のある競合的反応パートナーである。次に、酵素の触 媒反応によって形成又は消費された反応関与物を、従来法によって検出する。電 子化学的検出、電流滴定検出、光学的検出（例えば、光度測定検出）の可能性が ある。 以下、酵素サルコシンオキシダーゼ（ＳＯＤ）及び可能な基質としてサルコシ ンを用いた反応系により本発明を説明する。ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン、ｎ−メ チル−ＤＬ−アラニン、ｎ−メチル−ＤＬ−バリン、ｎ−エチル−グリシン、又 は複素環式アミンも、サルコシンオキシダーゼの基質として用いることができる 。 前記の反応を行なうのに、前記酵素を、溶液中に存在させておくか、あるいは 、固相に固定しておくことができる。前記の反応系は、以下の反応式で表すこと ができる。 この系では、例えば、可逆的作用性阻害剤は、酢酸、プロピオン酸、及びそれ らの塩、並びにホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、ｎ−メチル−アミノ酸、 メトキシアセテート、ピロール−２−カルボン酸、チオフェン−２−カルボン酸 、及びフラン−２−カルボン酸である。これらの分析物を前記反応系に加えるこ と によって、酸素の消費及び過酸化水素の生成を減少させている。 前記反応系の長所は、その高い選択性にある。物質を干渉することによって生 じるマトリックス効果を、緩衝液組成、酵素濃度、及び基質の変動によって決定 することができる。更には、可逆的作用性阻害剤を前記反応系に加えることによ って、選択性に影響を与えることができる。通常極めて安定なサルコシンオキシ ダーゼの酵素活性の欠失は、基質濃度の増加によって補うことができる。阻害物 質が可逆的に作用しているので、酵素の再生は必要でない。中間行程を更に経る ことなく、酸素又は過酸化水素検出によって、直接、データの収集を行なう。 前記決定を行なうために必要な試薬は、いわゆるテストキットの中から集める ことができる。例えば、サルコシンオキシダーゼの基質、サルコシンオキシダー ゼ（例えば、固定状態で）、緩衝液（例えば、リン酸緩衝液）、及び安定剤（例 えば、ＥＤＴＡ）を含むことができるであろう。 本発明方法を実施するための可能な測定装置は、チューブを介して反応チャン バーに連絡された少なくとも２個のピストンポンプを含む。好ましくは、必要な 反応溶液を遮断、バイパス、又は供給することのできるバルブを、チューブの途 中に設ける。好ましくは、試料、緩衝液、及び必要により更に試薬用に、ピスト ンポンプを設ける。検出ユニットは、反応チャンバー自体か、あるいは、その後 のいずれかに配置することができる。原則として、使用する検出系の種類は重要 ではない。例えば、光度測定系により、あるいは、酸素の減少又は過酸化水素の 生成のそれぞれを測定することによって、検出を行なうことができる。酵素的反 応の場合には、酵素を、反応チャンバー内に固定するか、あるいは、同様に決定 するために同様にその中に入れることができる。チャンバー内での反応混合物の 撹拌は、マグネチックスターラー又は他の混合用装置によって実施することがで きる。反応チャンバーにアウトプットを連絡することができる。ピストンポンプ をモーターで駆動することが好ましい。ピストンポンプのピストン及びシリンダ ーは、プラスチック、金属、又はガラス製である。 測定を実施するために、同時に、あるいは、適当な時間で順に、ピストンポン プを操作し、それによって、反応チャンバーへの経路に沿った反応パートナーの 平行な流れ（ｆｌｏｗ）を起こす。反応チャンバー内で充分に混合した後に、測 定を行なう。この方法では、不連続又は連続した過程で行なうことができる。 以下、フローインジェクション分析（ｆｌｏｗ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ａｎａ ｌｙｓｉｓ）システム、撹拌容器（ｓｔｉｒｒｅｄ ｖｅｓｓｅｌ）システム、 及び平行フロー分析（ｐａｒａｌｌｅｌ ｆｌｏｗ ａｎａｌｙｓｉｓ）システ ムを用いた本発明に従って、本発明の方法を以下に記載した。フローインジェクション分析システム（ＦＩＡシステム） ＦＩＡシステムにおいては、注入された試料は、連続的な運動［分割された担 体フロー（ｃａｒｒｉｅｒ ｆｌｏｗ）又は輸送フローではなく］によって混合 及び反応ラインを経由して検出器まで輸送される。その間に、注入された試料領 域は広がり（分散）、担体フローの成分と反応する。化学変換の結果として、関 与する成分の濃度の変化により、検出器におけるシグナルが変化する。これは、 注入試料の所定の基質の濃度に関して特徴的である。 図１では、試料として分析物（酢酸）及び基質（サルコシン）を、作業緩衝液 からなる担体フロー中に注入する。混合及び反応ラインは、試料の分析物及び基 質と反応する固定化酵素サルコシンオキシダーゼを含む。酸素の減少、又は過酸 化水素の生成を、酸素又は過酸化水素電極により測定する。 典型的な測定シグナルを図２に再現する。ピーク高Ｈ又は面Ｓは、試料の濃度 に比例している。 ピーク高から検定する場合には、種々の分析物濃度の試料を注入し、それらの 分析物濃度に応じて得られたピーク高をチャートに明示する（図３）。同様の方 法で分析物濃度が未知の試料を注入し、検定曲線を用いてピーク高から決定する ことができる。 酵素と反応媒質との分離の結果として、触媒活性を未だに有する固定化酵素を システム中に保持する一方、永続的に、新しい抽出物（ｅｄｕｃｔ）を添加し、 生成物を除去する。 図４では、基質を緩衝溶液に添加し、分析物を注入することによって検定を行 なう。図５に示すような検定曲線を使用することによって、未知の試料の分析を 再び行なうことができる。 図６は、混合ユニットを経由する基質及び分析物の自動供給を示す。 図７に、基質の異なる阻害強度（生物工学の媒質においてしばしば生じる）を 示す。前記のような媒質に関して、０．１ｍｏｌ／ｌの最大濃度を選択する。ア セテートでかなり強く測定系が阻害されるにもかかわらず、その他の基質ではほ とんど阻害されないことを理解することは容易である。 図８は、異なるサルコシンオキシダーゼ活性の２種類の曲線を示す。基質濃度 を上げながら、１８Ｕ及び１００Ｕのサルコシンオキシダーゼを使用した。 前記曲線が、測定スケールの直線性における違いを示すことを、知ることがで きる。１８Ｕのサルコシンオキシダーゼ活性では、直線の測定スケールが、低い 選択性の２ｇ／ｌまで広がっているのに対して、１００Ｕの活性を用いた場合に は、直線の測定スケールは、高い選択性の０．５ｇ／ｌサルコシンまで容認され ている。 分析物としてアセテートを用いる検量曲線、及びそれらの相当する種々の酵素 活性を図９に示す。１００Ｕのサルコシンオキシダーゼ活性に関する基質濃度は 、０．５ｇ／ｌサルコシンであるのに対して、より低いサルコシンオキシダーゼ 活性では、ほとんど同じピーク高に達するために、２ｇ／ｌサルコシンを用いる 必要がある。前記測定によって以下のことが示される。すなわち、酵素活性の起 こりうる減少を、基質濃度を上げることにより補うことができ、従って、ダイア グラムの過程を維持することができる。それに関する憶測は、図８に示す直線ス ケールの範囲内にある両方の酵素活性における基質濃度を選択することである。 図１０は、アセテート濃度に関連する、サルコシンオキシダーゼ活性（１００ Ｕ）の阻害に対する４つの種々のサルコシン濃度の影響を示す。０．２５ｇ／ｌ 又は０．５ｇ／ｌサルコシンのそれぞれでは、相当の阻害が起きているのに対し て、特に０．０２ｍｏｌ／ｌまでの低いアセテート濃度では、高い選択性が得ら れることが明白である。一方、１ｇ／ｌ又は２ｇ／ｌサルコシン濃度では、アセ テート濃度の広い直線スケールをカバーしているにもかかわらず、わずかな阻害 が観察されるだけである。 これらの測定によって以下のことが示される。すなわち、適当な基質濃度を選 択することによって、阻害量を変動させることができ、その結果、測定上の特定 の問題に対して容易に調整することができる柔軟な測定系が得られる。撹拌容器システム ＦＩＡシステムに対して、撹拌容器システムは不連続過程である。測定を行な うために、必要なすべての反応パートナーを撹拌容器システムの反応チャンバー 中に入れ、適当な検出器で反応過程を所定の時間モニターする。その後、全反応 混合物を除去し、続いて、新しい測定を実施することができる。 図１１の撹拌容器システムの反応混合物は、試料、基質、緩衝溶液、及び酵素 を含む。ここでは、試料及び酵素は順番に入れ、試料それ自体は、種々の濃度の 分析物（例えば、酢酸）を含有する。酸素の減少、又は過酸化水素の生成を、酸 素又は過酸化水素感受性電極により所定の時間測定する。シグナルの初期勾配（ ｇｒａｄｉｅｎｔ）から、測定の結果を計算する。 初期勾配を経る検量の間に、種々の分折物濃度の試料を添加し、関連する初期 傾斜（ｉｎｃｌｉｎｅ）をチャート中に、分析物濃度に依存して、明示する（図 １２、図１３、及び図１４を参照のこと）。未知の分析物濃度を含有する試料を 、同様にして、反応混合物に添加し、検量曲線と比較する初期傾斜を用いること によって決定する。 図１３に、酸素及び過酸化水素の同時検出によるプロピオネートの測定に関す る検量曲線を示す。 図１５に、それぞれの分析物濃度に依存する、相対的初期傾斜を示す。アセテ ート及びプロピオネートでは同様の曲線が得られるのに対して、アセトアルデヒ ドではサルコシンオキシダーゼの阻害量がより低く、ホルムアルデヒドでは実質 的により高いことが明らかである。これらの分析物のもっとも高い選択性は、よ り低い濃度領域で見出すことができる。 図１６に、サルコシンオキシダーゼの活性における阻害剤、例えば、アセテー ト、プロピオネート、アセトアルデヒド、及びホルムアルデヒドの効果を示す。 ０．１ｇ／ｌサルコシンでのアセテート及びプロピオネートは、１．０ｇ／ｌサ ルコシンに比較して、サルコシンオキシダーゼを実質的により強く阻害する。一 方、アセトアルデヒド及びホルムアルデヒドによる阻害は、基質濃度によりほん のわずか影響を受ける。撹拌容器システムを用いたこれらの測定によっても、基 質濃度の変動が、阻害量と、従って、反応系の選択性とに影響を与えることがで きることを示す。平行フロー分析システム（ＰＦＡシステム） 図１７に、ピストンポンプ３個を含む本発明の測定装置を示す。前記ポンプは 、分析物又はいくつかの可能な検量溶液（Ｓｔ）のおそらく１個を含む試料、緩 衝溶液、及び基質をそれぞれ送り出す。前記ピストンポンプは、チューブを介し て反応チャンバーに連絡され、それぞれバルブを備える。前記反応チャンバーは 、固定化サルコシンオキシダーゼを含む。検出器として酸素又は過酸化水素電極 を使用し、これは反応チャンバーの内部に固定される。 ３個のピストンポンプのタイミング制御は、基質及び緩衝溶液と一緒に混合す るプローブを、反応チャンバー内の容器に移すことによって、行なう。酸素の増 加及び過酸化水素の減少のそれぞれを、時間依存性の値として測定する。撹拌容 器システムと同様に、シグナルの初期勾配から測定結果が得られる。 初期傾斜から検量するために、種々の分析物濃度の試料を添加し、分析物濃度 に依存する適当な初期勾配を、チャートに明示する。前記と同じ方法で、分折物 濃度が未知の試料を測定チャンバー内に入れ、そこで決定した。 ＰＦＡシステムによれば、緩衝溶液、基質、及び試料の混合割合の変更は、装 置における変更を伴わずに、適当なピストンポンプの吸引容量及び流速を単に変 更するだけで可能である。特に、このことは、種々のマトリックスの試料の決定 に関して必要である。また、試料を予め調整するために、試料の外部希釈を行な う必要がない。

【手続補正書】 【提出日】１９９７年３月３日 【補正内容】 第１４〜１７図を削除する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．酸化還元酵素の基質を添加し、反応に関与している前記酵素の酵素活性を阻 害剤の存在下で測定し、得られたデータから阻害剤の濃度を決定する、酸化還元 酵素の可逆的作用性阻害剤の定量方法。 ２．前記基質としてサルコシンを使用し、サルコシンオキシダーゼの酵素活性を 測定する、請求項１に記載の方法。 ３．前記酵素を固定化した状態で使用する、請求項１又は２に記載の方法。 ４．測定の選択性を高めるために、基質濃度、酵素濃度、緩衝液濃度、緩衝液組 成、及び基質の性質、及び／又は流速及び緩衝液温度を変動させる、請求項１〜 ３の方法。 ５．反応系に種々の種類及び濃度の可逆的作用性阻害剤を添加することによって 、測定の選択性を高める、請求項１〜４に記載の方法。 ６．基質濃度を上げることにより酵素活性の長時間の損失を補う、請求項１〜５ に記載の方法。 ７．少なくとも２個のピストンポンプが、供給チューブを介して、酵素を含む反 応領域に連絡され、検出器を反応領域内又はその後に設ける、請求項１〜６に記 載の方法を実施する測定装置。 ８．前記供給チューブにおいて、ピストンポンプと反応領域との間にバルブを設 ける、請求項７に記載の測定装置。 ９．光学的に、又は電流滴定により、酸素又は過酸化水素の検出を行なう、請求 項７又は８に記載の測定装置。 １０．酸化還元酵素、前記還元酵素の基質、緩衝液、及び必要により安定剤を含 む酸化還元酵素の可逆的作用性阻害剤の定量用のテストキット