JPH10504801A - 毒素アッセイ - Google Patents

毒素アッセイ

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JPH10504801A JP8500544A JP50054496A JPH10504801A JP H10504801 A JPH10504801 A JP H10504801A JP 8500544 A JP8500544 A JP 8500544A JP 50054496 A JP50054496 A JP 50054496A JP H10504801 A JPH10504801 A JP H10504801A
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Abstract

(57)【要約】 毒素による切断用の基質およびその基質を認識しないが毒素によるその基質の切断産物を認識および結合する抗体を用いる毒素アッセイ。この基質は、ボツリヌス毒素または破傷風毒素についてのアッセイである場合、神経細胞ペプチドであり得る。

Description

【発明の詳細な説明】 毒素アッセイ 本発明はペプチダーゼ活性を有する毒素、特にボツリヌス神経毒素および破傷 風毒素のアッセイに関する。本発明はまた、アッセイにおいて有用な抗体および アッセイにおいて有用な固相ペプチドに関する。 ボツリヌス神経毒素は、構造的に類似するが抗原的に異なるタンパク質神経毒 素ファミリーであり、末梢神経系において作用し、神経筋伝達をブロックする。 これらの神経毒はマイクログラムのオーダーのヒトの致死量できわめて強力であ り、希ではあるがしばしば致死の疾患、ボツリヌス中毒に進展する。ボツリヌス 神経毒についてのアッセイは現在、食品産業および薬品産業の両方において用い られている。食品産業はボツリヌス神経毒についてのアッセイを用いて新しい食 品パッケージの方法が適切であることを確認し、食品の安全性を保証する。ボツ リヌス毒素の臨床用途が増加するのに伴い、薬品産業は生産物処方および品質管 理の両方のためにこれらの毒素についての正確なアッセイを必要とする。 マウス致死テストを用いる食糧中ボツリヌス毒素についてのアッセイが知られ ている。過去10年にわたって、多くのイムノアッセイ法が多くの場合に適用され ているマウステストの代わりにすることを目的として開発されてきたが、このマ ウステストが長年にわたり産業標準であった。 そのようなアッセイの１つで、サンプル中に存在する毒素に結合する抗体が付 着したプレートまたはカラムヘテストサンプルを添加することにより操作が行わ れる。さらなる抗体は、代表的には、結合した毒素を検出するために用いられる 。これらの酵素連結イムノアッセイ(ELISA)は、１つのボツリヌス毒素タイプに 特異的であり、２時間未満で迅速に行われ得る利点を有する。しかし、ELISAは いくつかの欠点を有する： (a) 毒素の生物活性を測定しない、 (b) 活性毒素と不活性毒素との間の区別ができない、および (c) 抗原多様性のため、いくつかの毒素はこれらのアッセイにより検出さ れず、それゆえに偽陰性を与える。 ボツリヌス神経毒は、その軽サブユニット内に高特異性亜鉛-エンドペプチダ ーゼ活性を有することが最近示された。神経毒タイプによって、これらは神経伝 達物質の放出物に含まれる小タンパク質を神経細胞内で切断するように作用する 。ボツリヌスタイプAおよびE毒素はタンパク質SNAP-25を切断する。ボツリヌス タイプB、D、F、およびG、ならびに破傷風毒素は、小胞関連膜タンパク質(VAMP ；シナプトブレビン(synaptobrevin)ともいう)を切断する。ボツリヌスタイプC 毒素は、タンパク質シンタキシン(syntaxin)を切断する。 さらなる毒素アッセイの開発において、種々の手法がエンドペプチダーゼ活性 の評価を目的として工夫された。液体クロマトグラフィ手法が公知であり、これ らは、ペプチド生産物の分析およびそれに続く評価に基づく。これらの手法は時 間がかかり、高価であり、そして自動化には容易には適さない。分光光度法を用 いることも公知であり、これらには適切な発色ペプチド試薬の開発が必要である 。このような方法はエンドペプチダーゼについての連続的で正確なアッセイを提 供する。しかし、分光光度法は酵素の比較的純粋な調製物が必要であり、粗製の または粒状のサンプルでのエンドペプチダーゼ活性の評価には通常適切ではない 。 これらの努力にもかかわらず、現在、ボツリヌス神経毒の生物活性についての 唯一の便利なアッセイであること、そしてFDAが認可した唯一のアッセイである ことが、マウス致死テストを残している。このテストは多くの欠点を有する： (a) 高価であり、多くの実験動物を用いる、 (b) 特異的な抗血清を用いる毒素中和テストと並行して行なわないと非特 異的である、および (c) 大量の動物群を用いることなしではあまり正確ではない。 本発明は、新規の試薬を用いる、毒素に対する新規のアッセイ系を記載する。 このアッセイは、これらの毒素についての現在のインビトロアッセイの多くの欠 点を克服するまたは少なくとも軽減することを目的とする。 従って、本発明の最初の局面は次の工程を含む毒素アッセイを提供する： (a) テスト化合物を、(i)毒素に対する切断部位を有する基質、および(ii) 切断基質には結合するが非切断基質には結合しない抗体と、結合させる工程、お よび (b) 該切断基質に結合した抗体の存在についてテストする工程。 これは、このアッセイが活性毒素と不活性毒素とを区別し得る（不活性毒素は 低減した活性を有するかまたは活性を有さないため)という利点を有する。また 、同群の毒素間の抗原多様性はアッセイの操作にあまり影響しない。なぜなら測 定されるのは毒素活性(基質を切断する能力)であり、毒素の正確な抗原構造では ないためである。 本発明の実施態様の利用において、テスト化合物に存在する毒素による基質の 切断は、アッセイ抗体に認識されて結合される生産物を生じ、この抗体は非切断 基質には結合しない。毒素は２つの生産物(１つは抗体に結合する)を生じるよう な単一の位置で基質を切断することが好ましい。 本発明の他の実施態様では、基質は毒素に対する切断部位を含むペプチドまた はタンパク質であり、基質の切断はN-およびC末端を有する新たなペプチドを生 じる。抗体はこれらの新たに形成されたペプチドの１つに結合する。本発明の特 定のアッセイは、ボツリヌス毒素または破傷風毒素のアッセイについてであり、 これらの毒素のうち１つの何らかの量がテスト化合物に存在するのかどうかを測 定する。この特定のアッセイにおいて、本発明の基質はボツリヌス毒素または破 傷風毒素のエンドペプチダーゼ活性により切断されるペプチドまたはタンパク質 である。このアッセイの利点は、該アッセイが活性毒素と非活性毒素とを区別す ることである。なぜなら、該アッセイは、サンプル中に存在するペプチダーゼ活 性を測定するためである。 本発明のアッセイのさらなる実施態様は次を含む： (i) VAMP、SNAP-25、シンタキシンおよびそれらのフラグメントから選択さ れるペプチドを含む固相と、テスト化合物とを結合させる工程、 (ii) 固相からテスト化合物を洗浄する工程、 (iii) 該固相と、毒素により切断されたペプチドに選択的に結合するのに 適合する抗体とを結合させる工程、および (iv) 該抗体と、切断されたペプチドとのコンジュゲートを検出する工程。 好ましくは、該抗体は配列番号1−7から選択されるペプチドに選択的に結合す るのに適合する。 本アッセイの他の実施態様は次を含む： (i) 固定化したペプチドを含むアッセイプレートにテスト溶液を添加する 工程であって、該ペプチドがVAMP、SNAP-25、シンタキシンおよびそれらのフラ グメントから選択される、工程、 (ii) 該アッセイプレートをインキュベートする工程、 (iii) 該プレートを緩衝液で洗浄する工程、 (iv) 抗体溶液を該プレートに加える工程であって、該溶液が、(1)そのC末 端が配列番号1、3、および5から選択されるペプチドならびに(2)そのN末端が配 列番号2、4、および6から選択されるペプチドから選択されるペプチドに選択的 に結合するのに適合する抗体を含む、工程、 (v) アッセイプレートをインキュベートする工程、 (vi) プレートを緩衝液で洗浄する工程、ならびに (vii) アッセイプレート上の抗体の存在を測定する工程。 (ii)および(v)の工程において、適切なインキュベートの期間は35-39℃で20分 から３時間である。 使用に際しては、抗体は酵素に結合され得、プレート上の抗体は、基質を加え 、そして検出可能な(例えば有色の)生産物への転換を観察することにより測定さ れ得る。 本発明のアッセイが調査中の化合物中の活性毒素を検出することは、すでに記 載した。いくつかの毒素、とりわけボツリヌス毒素は不活性構造でも存在し、そ れ自体はアッセイにより同定されない。本アッセイのさらなる実施態様は、不活 性毒素を活性毒素に転換するテスト化合物の前処理を含む。これは例えばトリプ シンのようなプロテアーゼにより達成される。 アッセイにおいては、固相に付着した基質を用いることがさらに好ましい。例 えば、アッセイの固相へ共有結合している(例えば、末端システイン残基を介し て共有結合されている)基質を用いることが好ましい。 このように本発明のアッセイ手法は代表的には、ボツリヌス神経毒素および破 傷風毒素のような多くの特定の毒素に適用し得る固相マイクロタイターベースの アッセイを示す。分光光度アッセイに比較して、本発明の手法は容易に自動化さ れ得、毒素エンドペプチダーゼの非常に粗製のまたは粒状の調製物にも適用し得 る。この手法はまた比較的高価ではなく、使用しやすい。 切断基質に結合した抗体の検出については、抗体がマーカー分子または酵素に 連結されることは随意である。一例では、マーカーは従来の、そして周知の技法 を用いて検出され得る西洋ワサビペルオキシダーゼである。 本発明の詳細な実施態様では、ボツリヌス毒素用の合成ペプチド基質(毒素の 標的である細胞内タンパク質の配列に由来する)を調製し、アッセイ系(次の手法 による)における固相エンドペプチダーゼ基質成分として用いる： 工程１−ボツリヌス毒素を含むテスト溶液を固相エンドペプチダーゼ基 質とインキュベートする。その結果、毒素タイプに依存する配列の特定のポイン トでのペプチドの切断を生じる(これは図１に例示する)。 工程２−抗ペプチド抗体試薬とインキュベートする。この抗体試薬は、 固相ペプチドの新たに切断されたNまたはC末端の１つに特異的であり、完全なペ プチドを認識しない。抗体試薬はペルオキシダーゼまたはアルカリホスファター ゼのような酵素マーカーに共有結合される。新たに切断されたペプチドのN末端 に対しておよびC末端に対してそれぞれ結合する２つの異なる抗体を存在させる ことがさらに随意である。 工程３−酵素マーカー用の基質とのインキュベーション、または一般に 入手可能な技法によるさらなる増幅。 この後者の実施態様のアッセイは２つの主要な成分を有することが見られる。 第一の成分は、アッセイされる毒素エンドペプチダーゼにより切断されたタン パク質またはペプチドを含み、あるいは該タンパク質またはペプチドから構成さ れる、エンドペプチダーゼ基質成分である。これは代表的には、アッセイの固相 成分へ取り込まれる。 エンドペプチダーゼ基質成分は、例えばエンドペプチダーゼのタンパク質標的 (例えば、シンタキシン、VAMP、またはSNAP-25)または毒素エンドペプチダーゼ により切断されるこれらのタンパク質のフラグメントであり得る。あるいは、こ のエンドペプチダーゼ基質成分は、他のタンパク質に連結した上記のものを含む 融合タンパク質であり得る。 固相は、エンドペプチダーゼ基質成分を固定化するために用いられ得るELISA プレート、ビーズ、ディップスティック、または他のマトリックスであり得る。 固相成分はまた、ニトロセルロースメンブレンまたはウエスタンブロッティング 技法で用いられるような同等物であり得る。 第二の成分は抗体成分であり、これは毒素エンドペプチダーゼによるエンドペ プチダーゼ基質成分の切断後に得られた、新たに生じたN末端ペプチドまたは新 たに生じたC末端ペプチドのいずれかの配列を示す短ポリペプチド(代表的には、 6−8アミノ酸残基長)に対して惹起された抗体である。この抗体は、エンドペプ チダーゼ基質成分を認識しないが、代わりに切断されたペプチド生産物のみを認 識するという特性を有する。 この抗体は酵素、あるいは放射活性または蛍光マーカーに連結され得る。ある いは、この抗体は遊離のタンパク質およびアッセイ手法で用いられる二次抗体で あり得る。抗体はさらにメークアップ(make up)におけるポリクローナルまたは モノクローナル、抗体フラグメント、あるいは他のタンパク質に融合または連結 された抗体または抗体フラグメントであり得る。 本発明の第二の局面では、次の特性により特徴付けられた第一の局面のアッセ イで用られる抗体が提供される： (a) 抗体は毒素エンドペプチダーゼによる基質の切断生産物であるペプチ ドに結合する、および (b) 抗体は非切断基質には結合しない。 第二の局面の実施態様では、抗体は基質には結合せず、キャリア分子に共有結 合または他の方法で結合する。基質は、本発明の第一の局面に従って毒素により 切断可能であるペプチド、さらに好ましくは神経細胞ペプチドが好ましい。この ペプチドは好ましくは、シンタキシン、VAMP、およびSNAP-25から選択される。 ペプチド基質は、限られた数の切断生産物を生じるように限られた数の位置で 、そして好ましくは２ヶ所、またはより好ましくは１ヶ所の位置て毒素エンドペ プチダーゼにより切断されること、ならびにこの抗体はこれらの生産物の１つに 選択的に結合することがさらに好ましい。 本発明の好ましい実施態様では、抗体は次のペプチド配列の１つを認識する： さらに、好ましい抗体は、次の場合には、上記の配列1−7のうちの１つを認識 しない。つまり、その配列が完全な非切断ペプチドの一部であり、そしてその配 列が上記に示される遊離のNまたはC末端を含まない場合には、認識しない。 本発明の第二の局面に従い毒素アッセイに用いられる抗体は、例えば次の手法 により調製される： −毒素により切断され、切断生産物を生じるペプチドを同定する工程、 −動物、例えばウサギを該切断生産物で免疫する工程、 −その動物由来の切断生産物に対する抗体を単離する工程、および −抗体が該ペプチドに交差反応しないことをチェックする工程。 本発明の他の局面は、抗体(毒素アッセイに用いるための抗体)を得る方法であ り、該方法は、毒素により切断されて切断生産物となる高分子を同定する工程、 切断生産物の１つに対して動物を免疫する工程、上記切断生産物の１つに対して 結合する抗体を単離する工程、および抗体が該高分子と交差反応しないことをチ ェックする工程を包含する。この方法の実施態様は次を含む： (i) 毒素により切断される高分子を同定し、それにより少なくとも第一お よび第二の切断生産物を形成する工程、 (ii) 切断生産物の選択された１つで動物を免疫する工程、 (iii) 選択された切断生産物に結合する抗体を動物から単離する工程、お よび、 (iv) 該抗体が該高分子に結合しないことをチェックする工程。 この高分子は好ましくはペプチドまたはタンパク質である。このペプチドまた はタンパク質は２つのフラグメントに切断されることが特に好ましい。 この方法は、驚くべき有利な特性(特に、毒素についてのアッセイを行うため の)を有する抗体の産生を可能にする。重要な特性は短くなった切断生産物に対 する結合アフィニティであり、このことにより完全な非切断高分子に対するいか なる重要なアフィニティによっても汚染されることなくこの生産物に結合し得る 。 他の実施態様では、この方法は次を含む： (i) 毒素により切断され、それにより少なくとも第一のおよび第二の切断 生産物を形成するペプチドまたはタンパク質を同定する工程、 (ii) (1)第一の切断生産物の末端フラグメント、(2)第一の切断生産物の合 成フラグメント、(3)(1)のアナログ、および(4) (1)-(3)のいずれかに連結する キャリア分子、から選択される抗原で動物を免疫する工程、 (iii) 該第一の切断生産物に結合する抗体を該動物から単離する工程。 多くのキャリア分子は当該技術分野で公知であり、好ましいキャリアはキーホ ールリンペットヘモシアニン、ウシ血清アルブミン、およびオボアルブミンを含 む。 さらなる局面では、本発明は毒素アッセイの固相に付着したペプチド基質であ る毒素アッセイ成分を提供し、そのペプチド基質は毒素エンドペプチダーゼによ る切断の標的となる。好ましくは、このペプチドは完全なペプチドおよび次のも ののフラグメントから選択される： １． VAMP、 ２． SNAP-25、 ３． シンタキシン。 このアッセイで用いるための特に好ましい標的ペプチド配列は、下記に例示し た配列番号8-11から選択される。 本発明のさらに好ましいペプチドは、配列番号1−7から選択される配列を含む ペプチドである。 本アッセイの固相ペプチドは安定であり、そして便利で有効な毒素アッセイを 提供するテストキットに取り込むのに適切である。 本発明のアッセイはまた、本発明の第二の局面による抗体を含む固相を用いて 行われ得ることは当業者である読者により認識される。この手順で、このアッセ イは毒素を含み得るテスト化合物と毒素基質とを結合することにより行い得る。 次いでこの混合物は固相抗体と結合し、その後、固相抗体に結合した切断ペプチ ドの存在が検出される。本発明の実施態様では、抗体に結合した切断ペプチドは 放射標識ペプチドまたはさらなるペプチド特異的抗体を用いて検出される。従っ て、本発明の第四の局面は毒素アッセイで用いる固相抗体を提供し、該抗体は本 発明の第二の局面による結合特性を有する。 従って本発明のアッセイ手法は、種々の特性を包含する： (i)ポリペプチド配列(例えばXXXXN)に対する抗体の産生。このポリペプチド 配列は、アミノ酸Nが遊離である場合にのみ認識され、同じ配列が長いペプチド( 例えば、XXXXNXXXX)を構成する場合は認識されない。長いペプチドに反応性を示 さない適切な抗体が惹起され得ることは驚くべきことである。 (ii) 毒素エンドペプチダーゼについての迅速な固相アッセイにおける、そ のような抗体の特性の利用。ボツリヌスまたは破傷風神経毒素アッセイの例では 、生産物はこれらの毒素の亜鉛-エンドペプチダーゼ活性を利用する。 (iii) 固相アッセイ成分として、神経細胞ペプチドのような毒素標的分子 を用いるアッセイ。 (iv) 固相アッセイ成分として(i)に記載された抗体を用いるアッセイ。 本発明の特性は、切断ペプチドを検出するために用いる抗体が非切断ペプチド に結合しないことである；明らかに、このような結合は擬陽性を生じ、アッセイ の正確さをそこなうためである。抗体が完全なペプチドと交差反応しないことを 決定する便利な手段は、２つのプレートを用いて抗体をスクリーニングすること である。第一のプレートは固相に付着した完全なペプチドを含む。第二のプレー トは固相に付着した切断ペプチドを含み、切断ペプチドの遊離末端は、例えば配 列番号1−7またはアッセイ抗体により認識される他の配列である。 スクリーニング中の抗体を両方のプレートに添加し、一定期間インキュベート し、次いでプレートを洗浄し、続いて結合抗体の存在についてテストする。適切 な抗体(すなわち交差反応しない抗体)は、第二プレート上に大きなシグナルを生 じ(これは、結合抗体の存在を示す)、第一プレート上に弱いシグナルを生じる( 好ましくは実質的にシグナルを生じない)。 多くの潜在アッセイ抗体がテストされる場合には、切断ペプチドについて、完 全なペプチドよりも高い選択性をもって抗体が選択されるように、シグナル(第 二プレートの結果)とノイズ(第一プレートの結果)との比率を比較することが直 接的である。本発明の実施態様では、この比率は少なくとも10:1であり、好まし くは少なくとも20:1、そしてより好ましくは少なくとも50:1である。特に好まし い比率は100:1またはそれより高く、これは完全なペプチドに対するアフィニテ ィより少なくとも２オーダー程度大きい切断ペプチドに対するアフィニティを反 映する。 本発明は、毒素(例えばボツリヌス神経毒、破傷風毒素)の生物活性を従来のEL ISA系の感度に比較し得る感度で測定するアッセイを提供する点で有利である。 発明者は、アッセイがボツリヌスAおよびB毒素の場合には、１mlあたり１ngより 少ない毒素を検出し得ることを観察した。多くの作業者に、毒素の正確な定量が 危険評価における使用に非常にのぞまれている。また偽陰性は、アッセイが毒素 エンドペプチダーゼ活性の直接測定であるため、起こらないようである。発明者 の観察によれば、血清および他のサンプルにおけるアッセイのノイズレベルが従 来のイムノアッセイ系において得られ得るノイズレベルより有意に低い。発明者 は現在まで、ボツリヌスB毒素についてのアッセイで偽陰性または擬陽性を有さ ず、そしてノイズレベルは血清を含む毒素サンプルにおいて、従来のELISAで得 られ得るノイズレベルより低かった。さらに、ペプチド固相アッセイ成分は非常 に長い保存期間において安定である。 記載された本発明のアッセイおよびアッセイ成分は毒素に対して特に高感度で あり、毒素について、ELISAに比較し得る感度および改善された感度を有すると 発明者により見い出された。本発明のさらなる利点は、さらなる特異的抗体がア ッセイでの使用のために同定された場合、より高感度になる可能性を有すること である。この状況をELISAのそれと比較すると、これは毒素に対する抗体のアフ ィニティに依存する。高アフィニティ抗体を単離する広範な仕事により、このア フィニティはすでに至適であるため、ELISAの感度においてはほとんど増加は期 待されない。 次に続く図によって例示された本発明の多くの実施例がある： 図１は、ボツリヌス毒素アッセイの模式図を示す； 図２−４は、実施例１のボツリヌス毒素アッセイを用いて達成した結果を示 す； 図５−６は、実施例１のボツリヌス毒素アッセイがさらに改良され、シグナ ル増幅および実施例２に記載された毒素活性化手法によりさらに好感度になる結 果を示す； ならびに 図７は、実施例４のボツリヌス毒素アッセイを用いて達成された結果を示す 。 実施例１． ボツリヌスタイプB神経毒(BoNT/B)についてのアッセイ。 ボツリヌスタイプBアッセイ用に、VAMPイソ体-1の配列を示すペプチド、60-94 残基(配列番号９、C-末端システイン残基付)を用いた： マイクロタイターアッセイプレートを次のように調製した：上記のペプチドを 、1mM EDTAを含有する0.05M リン酸ナトリウム緩衝液、pH6.5中10μgml-1の最終 濃度に希釈し、Sulphydryl Binding Plate(Coster)に加えた(100μ/ウェル)。１ 時間、室温でインキュベートした後、ペプチド溶液を除去し、そしてプレートを ３回リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)pH7.4で洗浄した(洗浄のこの段階では界面活 性剤は使用しない)。次いでプレートのあらゆる残存結合部位を0.1% Tween 20お よび5%ウシ胎児血清を含有するPBS緩衝液の添加(100μl/ウェル)によりブロック した。次いで、プレートを１時間37℃で連続して振盪しながらインキュベートし 、その後ブロッキング溶液を除去した。 Clostridium botulinum タイプB神経毒のアッセイ：毒素溶液を10mMジチオト レイトール(または、毒素のエンドペプチダーゼ活性に対して還元状態を提供す るための同等の試薬)を含むアッセイ緩衝液(例えば、10μM ZnCl2および1%ウシ 胎児血清を含有する0.05M Hepes緩衝液、pH7.4)で希釈し、ペプチドコートマイ クロタイタープレートに加えた(100μl/ウェル)。次いでプレートを１時間37℃ で連続して振盪しながらインキュベートする。図１に記載のようにBoNT/Bがペプ チドを切断するこの期間の後、プレートを、３回、0.1% Tween 20を含有するPBS で洗浄した。 次いで、新たに切断されたペプチドに特異的な抗体を加えた。アッセイのこの 実施例では、抗体は以下のVAMP(配列番号１、C-末端システイン付)の切断配列に 特異的である： 抗体(0.1% Tween 20および5% ウシ胎児血清を含むPBS緩衝液で希釈)を加え(1 00μl/ウェル)、１時間37℃で連続して振盪しながらインキュベートする。次い で、 プレートを、３回、0.1% Tween 20を含有するPBSで洗浄した。 抗体がペルオキシダーゼに結合される場合、適切なペルオキシダーゼ基質がこ の段階で加えられ、発色し、アッセイの結果を提供する。 別の方法では抗体は遊離型であり、この場合市販の二次抗体の添加が必要であ る。例えば、抗ペプチド抗体がモルモットにおいて惹起される場合、二次抗体は 抗モルモットペルオキシダーゼコンジュゲートである。二次抗体コンジュゲート (0.1% Tween 20および5%ウシ胎児血清を含有するPBS緩衝液で希釈した)を添加し (100μl/ウェル)、１時間37℃で連続して振盪しながらインキュベートする。二 次抗体を洗い流した後(0.1% Tween 20を含有するPBSで、３回)、適切なペルオキ シダーゼ基質がこの段階で添加され得、発色され得、アッセイの結果を提供し得 る。 図２は、上記の２つの抗体検出系を用いるBoNT/Bの代表的なアッセイの結果を 例示する。データは、アッセイにおける２つの異なるVAMPペプチドの固相ペプチ ドとしての使用を例示する。BoNT/Bの切断部位付近のこれらのペプチドの配列は ２つのヒトVAMPのイソ体を示す。 データは、バックグラウンドをこえる0.3吸光単位の任意のカットオフ点で、 これらのアッセイにおけるBoNT/Bの検出感度が、固相としてVAMP-1ペプチドを用 いて約1ng/ml、固相としてVAMP-2ペプチドを用いて5ng/mlであったことを示す。 図３は、BoNT/Bについてのアッセイ系の特性を例示する。(1)BoNT/F、(2)破傷 風毒素、および(3)BoNT/BプラスEDTAについて、ゼロ吸光度を記録した。これら のデータは、BoNT/Bを検出するために設計されたアッセイが、密接に関連するボ ツリヌスタイプFおよび破傷風毒素の存在下で擬陽性の結果を与えないことを示 す。このデータはまた、EDTA(これは金属イオンキレート剤である)の存在下でBo NT/Bで行ったアッセイにおいてシグナルが得られなかったことを示す。後者の結 果は、アッセイが、BoNT/Bの亜鉛-メタロプロテアーゼ活性に依存することを例 示する。 図４は、単一の抗体(すなわち、抗ペプチド抗体を直接ペルオキシダーゼに結 合させる)および２重抗体(すなわち、遊離の抗ペプチド抗体を抗種ペルオキシダ ーゼコンジュゲートと結合させて用いる)検出系の両方を用いる、BoNT/Bによる 固相ペプチド切断のアッセイ動力学を例示する。BoNT/Bの濃度を、100ng/mlに固 定して、アッセイシグナルを種々の時間で測定した。データは、２重抗体アッセ イ系がより迅速て好感度な、BoNT/Bによる固相ペプチド切断を測定する手段を提 供することを示す。 実施例２． ボツリヌス神経毒についてのアッセイの増幅および増強 実施例１に記載のようなボツリヌス毒素についてのアッセイを、より高感度を 提供するために、さらに増強し得る多くの方法がある： (a) ELASTTM(Dupont)系のような市販の増幅系を用いるアッセイシグナ ルの更なる増幅。 (b) アッセイ前の神経毒の限定されるトリプシン処理。全てのボツリ ヌス神経毒は、細菌において一本鎖ポリペプチドとして産生され、これは次いで 活性な２本鎖型の毒素を与える特異的な細菌プロテアーゼにより続いて活性化さ れる。いくつかの場合では、特にボツリヌス神経毒タイプBおよびEの場合、毒素 は十分には活性化されず、そして不活性神経毒を100%まで含み得る。これらの不 活性な１本鎖型の毒素は、毒素のエンドペプチダーゼ活性を弱く発現するかまた は全く発現しない。ボツリヌス神経毒の限定されるトリプシン処理は、１本鎖毒 素型を２本鎖の活性毒素型に転換する。従って、１本鎖毒素の一部を含むボツリ ヌス神経毒タイプでは、トリプシン処理の結果、神経毒のエンドペプチダーゼ活 性および特異的毒性における両方の増加を生じる。 図５は、ELAST系のような増幅系が、実施例１に記載のような代表的なアッセ イに適用される場合、BoNT/Bについてのアッセイの感度における増加を例示する 。このデータは、バックグラウンドを超える0.3吸光単位の任意のカットオフ点 で の非増幅アッセイにおけるBoNT/Bの検出感度が、約1ng/mlであり、一方増幅アッ セイ系における感度は0.1ng/mlに近い感度を与え、ほぼ10倍高かったことを示す 。 この結果は、本発明のアッセイが、改良された感度を提供するために市販の増 幅系と組み合わせて容易に用いられ得ることを示す。 図６は、神経毒アッセイの感度におけるBoNT/Bの限定されるトリプシン処理の 効果を例示する。BoNT/Bサンプル(1mg/ml)をトリプシン(2.5μg/mlの終濃度)で 、30分間、37℃で処理し、反応を5〜10モル過剰のトリプシンインヒビターを用 いて停止させた。図６は、増幅型および非増幅型のアッセイの両方について(図 を参照のこと)、トリプシン処理の効果が、BoNT/Bについてのアッセイ系の感度 を増加したことを示す。 BoNT/Bについてのアッセイのための別の戦略は、固相ペプチド基質と切断配列 に対する特異的抗体との異なる組合せを用いて行われる。本アッセイのこの局面 では、固相VAMPペプチドはN-末端システイン残基(配列番号９、N-末端システイ ン付)により付着される： 本発明のこの実施態様における切断配列に対する特異的抗体は、以下の切断さ れたVAMPに対して惹起される： 実施例３． 破傷風毒素についてのアッセイ 破傷風毒素はタンパク質VAMPをBoNT/Bのそれと同じ部位で切断する。しかし２ つの毒素のエンドペプチダーゼ活性の特異性は、切断に必要な最小限のペプチド 基質サイズにおいて異なる。BoNT/Bは、至適な切断のために30〜35残基長のペプ チド基質を必要とするが、破傷風毒素については、50残基長を超えるペプチド基 質が必要である。 従って、破傷風毒素切断アッセイは、固相ペプチドがヒトVAMP-１、イソ体-1 、33〜94残基(配列番号８)のペプチドであること以外は、BoNT/Bについての方法 と 同一の方法で行われる。BoNT/Bについて記載された本発明の実施例は、破傷風毒 素に対して、等しく適用可能である。 実施例４． ボツリヌスタイプA毒素(BoNT/A)についてのアッセイ ボツリヌスタイプA神経毒アッセイについて、マイクロタイタープレートを、 タンパク質SNAP-25(アミノ酸137〜206)から得られた配列を示す以下のペプチド でコートする(10μl/ml)。 毒素テスト溶液を、10μM ZnCl2を含有する0.05M HEPES pH7.2で緩衝化し、次 いで10mM 2-メルカプトエタノールを加え、そしてプレートを37℃で１時間イン キュベートする。 次いで、洗浄後、プレートを西洋ワサビペルオキシダーゼに結合された抗ペプ チド抗体とインキュベートする。抗体は、以下のSNAP-25の切断配列のいずれか に特異的である： インキュベーション後、過剰のペプチドを洗浄により取り除き、次いでペルオ キシダーゼ基質を加えて発色させる。 図７は、BoNT/Aについての代表的なアッセイの結果を示す。このアッセイ系で は、固相ペプチドは上記のSNAP-25(137〜206)であり、SNAP-25の切断配列に特異 的な抗血清と組み合わせて用いた： アッセイプロトコルは、実施例１でBoNT/Bについて記載されたようである。ア ッセイは約1ng/mlの濃度でBoNT/Aを検出した(バックグラウンドをこえる0.3単位 の任意の吸光度カットオフ点を用いる)。 実施例１に記載された増幅系はまた、BoNT/Aについてのアッセイにも適用され 得る。 実施例５． ボツリヌスタイプE毒素のアッセイ ボツリヌスタイプE神経毒アッセイについて、マイクロタイタープレートを、 タンパク質SNAP-25(アミノ酸137〜206)から得られた配列を示す以下のペプチド でコートする(10μg/ml)。 次いで、10μM ZnCl2および10mM 2-メルカプトエタノールを含有する0.05M HE PES pH7.2で緩衝化した毒素テスト溶液を加え、そしてプレートを37℃で１時間 インキュベートした。 次いで洗浄後、プレートを西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させた抗ペプチ ド抗体とインキュベートする。抗体は以下のSNAP-25の切断配列のいずれかに特 異的である： インキュベーション後、過剰のペプチドを洗浄により取り除き、次いでペルオ キシダーゼ基質を加えて発色させる。 実施例６． マイクロタイタープレートおよび他のアッセイ固相の調製および使 用 マイクロタイタープレートまたはディプスティックを、多くの異なる方法によ り調製する： (a) マイクロタイタープレートを、リン酸緩衝化生理食塩水pH7.4(または水)中 10または20μg/mlの濃度で、「エンドペプチダーゼペプチド基質」でコートし(1 00μ1/ウェル)、４℃で一晩インキュベートする。 (b) 「エンドペプチダーゼペプチド基質」を、１方の端でシステイン残基を有 するように生成させる。システイン残基が付加されるペプチドの端は、アッセイ に用いる抗体の特異性により決定される。特異的抗体により認識されるペプチド 切断生産物(アッセイの過程の間形成される)はまた、その遠位の末端にシステイ ン残基を含まなければならない。「エンドペプチダーゼペプチド基質」を、最終 濃度10μgml-1に、1mM EDTAを含有する0.05M リン酸ナトリウム緩衝液pH6.5中で 希釈し、そしてSulphydryl Binding Plate(Costar)に加える(100μl/ウェル)。 １時間、室温でのインキュベーション後、ペプチド溶液を取り除き、プレートを リン酸緩衝化生理食塩水pH7.4で３回洗浄する(洗浄のこの段階では界面活性剤は 用いない)。 (c) 「エンドペプチダーゼペプチド基質」のシステイン含有誘導体(上記)を、 キャリアタンパク質(例えば、マレイミド活性化BSA)に連結させる。キャリアタ ンパク質は市販されている(Pierce Warriner,U.K.)。次いで上記(a)に記載のマ イクロタイタープレートに結合させる。 (d) 「エンドペプチダーゼペプチド基質」をニトロセルロースメンブレンのよ うな別の固相に結合させ、そしてこの手法は標準ウエスタンブロッティング技法 において規定された手法と同様に用いられる。切断アッセイはいくつかの様式で 行われ得る： (i) ペプチド基質をニトロセルロースメンブレン上で切断する。 (ii) ペプチドは溶液中のボツリヌス毒素により切断され、次いで生産 物はニトロセルロースメンブレンに結合する。 (iii) ボツリヌス/破傷風毒素標的タンパク質を、毒素により細胞内( またはインビボで)で切断し得、細胞抽出物をSDSゲル電気泳動により分離し、次 いで切断ペプチド生産物を、ウエスタンブロッティングによりニトロセルロース に転写させる。 次いでプレートを0.1% Tween 20を含有するリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で洗 浄し、次いてPBS中5%のウシ胎児血清溶液(またはPBS中1%BSAあるいはPBS中粉ミ ルクのような他のブロッキングカクテル)でブロックする(ポリスチレンへのタン パク質のさらなる結合をさけるため)。 この状態のプレートは数ヶ月(または数年)凍結保存するのに適している。 アッセイを行うために、毒素のテスト溶液を、10μM ZnCl2および20mM 2-ジチ オトレイトールを含む0.25M Hepes pH7.4緩衝液で緩衝化し(毒素溶液：緩衝液の 割合が4:1)、次いでマイクロタイタープレートに加え、37℃で１時間インキュベ ートする。次いで毒素テスト溶液をPBS/tweenで洗浄し、次いで抗体-ペルオキシ ダーゼコンジュゲートを加える。(抗体は切断生産物の１つの開放末端に特異的 であり、そしてそのバッチに依存してあらかじめ決定された希釈物で加える)。 １時間、37℃でのインキュベーション後、抗体ペルオキシダーゼコンジュゲート をプレートからPBS/tweemで洗い流し、次いでペルオキシダーゼ基質を加えて発 色させる。 実施例７． 特異的抗体産生の方法 抗体が惹起されるペプチドを、問題の反対側の端にシステイン残基を有するよ うに合成する。実施例１では、合成された２つのペプチドは以下の通りである。 次いでペプチドを、キャリアタンパク質(例えば、キーホールリンペットヘモ シアニンまたはウシ血清アルブミン)に、システイン残基を介して連結させる。 これは、供給者により詳細に説明されるように、マレイミド活性化キャリアタン パク質(Pierce Warriner,U.K.から市販されている)とペプチドを混合することに より達成される。 次いでコンジュゲートペプチドをアジュバント(例えば、フロイントアジュバ ント)の存在下で動物(例えば、モルモットまたはウサギ)に注入する。１つの免 疫スケジュールは、0、4、および8週の時点で50μgのペプチドタンパク質を動物 に与えることである；次いで10週後、動物を採血する。 血清中の抗体は血清由来のIgGを精製するための公表された方法のいずれかに より精製される。抗ペプチド特異的抗体は、必要に応じて、クロマトグラフィー 媒体上に固定化した免疫ペプチドを用いたアフィニティークロマトグラフィーに よりさらに精製される(Pierce Warriner，U.K.から市販されているキットおよび 方法)。 所望の結合特徴を有する抗体を、実施例６に記載のように評価する。アッセイ は、毒素の不在下では発色せず、１μg/mlの所望の毒素の存在下で強く発色すべ きである。 実施例８． アッセイの定量 アッセイは毒素標準を組み込むことにより定量的に作製される。種々の濃度の 毒素により産生された発色をマイクロタイタープレート読みとり装置により測定 し、そして未知のサンプルにおける毒素濃度が評価され得る標準曲線を作成する 。 従って、本発明は、新規のおよび有効な毒素アッセイを提供し、アッセイにお いて使用する新規の試薬を提供する。アッセイは、現存するアッセイ(例えばマ ウス致死テストを用いるアッセイ)に比べて高価ではなく、産業適用に適してい る。アッセイおよびその試薬のさらなる利点は上記に示した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ // Ｃ１２Ｑ 1/37 Ｃ１２Ｑ 1/37 (72)発明者 ハリス， バッサム イギリス国 エスピー２ ７ビーティー ウィルトシャー，サリスバリー， エイボ ン テラス ３ (72)発明者 ジェイムズ， ベンジャミン アーサー フレデリック イギリス国 エスピー５ ３ティーイー ウィルトシャー，サリスバリー， アルダ ーバリー， プライオリー クローズ 22 (72)発明者 クイン， コンラド パドライグ イギリス国 エスピー１ ３キューエス ウィルトシャー，サリスバリー， セント フランシス ロード 36

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １． ボツリヌス毒素または破傷風毒素についてのアッセイであって以下の工程 ： (a) テスト化合物を、基質および抗体と結合させる工程、ここで、該 基質は該毒素に対する切断部位を有し、毒素により切断される場合に生産物を形 成し、ここで該抗体は該生産物には結合するが、該基質には結合しない、工程； および、 (b) 該生産物に結合する抗体の存在をテストする工程、ここで該生産 物は固相アッセイ成分に付着する、工程、 を包含する、アッセイ。 ２． 前記毒素が、ボツリヌス毒素である、請求項１に記載のアッセイ。 ３． 請求項１〜２のいずれかに記載のアッセイであって、前記基質が前記毒素 により切断され、N-およびC-末端を有する新規のペプチドを生じるペプチドまた はタンパク質である、アッセイ。 ４． 請求項３に記載のアッセイであって、前記ペプチド基質が該アッセイの固 相成分に付着する、アッセイ。 ５． 以下のアッセイ成分(a)および(b)を利用する、請求項１〜４のいずれかに 記載のアッセイであって： (a) 固相に連結されたペプチド、ここで該ペプチドは切断生産物を生 じるために前記毒素により切断され得、 (b) 該切断生産物には結合するが該ペプチドには結合しない抗体、 そしてここで該アッセイは以下の工程： (i) 該毒素を含み得るまたは該毒素から構成され得るテスト化合物を 、アッセイ混合物を形成するために該固相ペプチドと結合させる工程、 (ii) 該アッセイ混合物を該抗体と連続してまたは同時に結合させる工 程、および (iii) 該抗体と該切断生産物との間に任意のコンジュゲートが形成さ れているかどうかを連続してまたは同時に決定する工程、 を包含する、アッセイ。 ６． 請求項５に記載のアッセイであって、ここで前記工程(i)が亜鉛化合物の存 在下で行われる、アッセイ。 ７． 請求項６に記載のアッセイであって、ここで前記ペプチドはVAMP、SNAP-25 およびシンタキシンから選択される完全なペプチドまたはそのフラグメントから 選択される、アッセイ。 ８． 請求項７に記載のアッセイであって、以下の工程： (i) 前記テスト化合物をVAMP、SNAP-25、シンタキシン、およびそのフ ラグメントから選択されるペプチドを含有する固相と結合させる工程、 (ii) 該固相から該テスト化合物を洗浄する工程、 (iii) 該固相と、毒素により切断されたペプチドと選択的に結合する ように適合された抗体とを結合させる工程、 (iv) 該抗体と切断されたペプチドとのコンジュゲートを検出する工程 、 を包含する、アッセイ。 ９． 請求項１〜８のいずれかに記載のアッセイであって、ここで前記抗体が、 配列番号1〜7から選択されるペプチドに選択的に結合するように適合される、ア ッセイ。 １０． 請求項７に記載のアッセイであって、以下の工程： (i)固定化ペプチドを含有するアッセイプレートにテスト溶液を加える 工程であって、該ペプチドはVAMP、SNAP-25、シンタキシンおよびそれらのフラ グメントから選択される、工程、 (ii) 該アッセイプレートをインキュベートする工程、 (iii) 該プレートを緩衝液で洗浄する工程、 (iv) 抗体溶液を該プレートに加える工程であって、該溶液は、(1) C- 末端が配列番号1、3、および5から選択されるペプチド、ならびに(2) N-末端が 配列番号2、4、および6から選択されるペプチド、から選択されるペプチドに選 択的に結合するように適合される抗体を含有する、工程、 (v) 該アッセイプレートをインキュベートする工程、 (vi) 該プレートを緩衝液で洗浄する工程、 (vii) 該アッセイプレート上の抗体の存在を測定する工程、 を包含する、アッセイ。 １１． 請求項１０に記載のアッセイであって、ここで前記抗体は酵素に連結さ れ、そして前記プレート上の抗体の存在が、酵素基質を加えることおよび該基質 の検出可能な生産物への転換を測定することにより測定される、アッセイ。 １２． 請求項１１に記載のアッセイであって、前記検出可能な生産物が発色し 、そして選択された波長での吸光度により測定される、アッセイ。 １３． 前記テスト化合物中に存在する不活性毒素を活性毒素に転換する工程を 包含する、請求項１〜１２のいずれかに記載のアッセイ。 １４． プロテアーゼを前記テスト化合物に加える工程を包含する、請求項１３ に記載のアッセイ。 １５． 前記一次抗体に特異的なおよび酵素に連結されたさらなる抗体を用いて 抗体-ペプチドコンジュゲートを検出する工程を包含する、請求項１〜１４のい ずれかに記載のアッセイ。 １６． 抗体を得る方法であって、該抗体はボツリヌス毒素または破傷風毒素に ついてのアッセイにおいて使用され、該方法は、該毒素により切断生産物へ切断 される高分子を同定する工程、該切断生産物の１つに対して動物を免疫する工程 、該切断生産物の１つに結合する抗体を単離する工程、ならびに該高分子と交差 反応しない抗体を回収する工程を包含する、方法。 １７． 請求項１６に記載の抗体を得る方法であって、該方法は、以下の工程： (i) 該毒素により切断され、それにより少なくとも第一および第二の 切断生産物を形成する、高分子を同定する工程、 (ii) 選択された該切断生産物の１つで動物を免疫する工程、 (iii) 該選択された切断生産物に結合する抗体を該動物から単離する 工程、ならびに、 (iv) 該高分子に結合しない該抗体をチェックする工程、 を包含する、方法。 １８． 請求項１７に記載の方法であって、前記高分子がVAMP、SNAP-25、および シンタキシンから選択される、方法。 １９． 以下の工程を包含する請求項１７に記載の抗体を得る方法であって、以 下の工程： (i) (1)配列番号1〜6；および(2)(1)に連結したキャリア分子から選択 される抗原で動物を免疫する工程、ならびに、 (ii) 該抗原に結合する抗体を動物から単離する工程、 を包含する、方法。 ２０． キーホールリンペットヘモシアニン、ウシ血清アルブミン、およびオボ アルブミンから選択されるキャリアタンパク質に連結された抗原で動物を免疫す る工程を包含する、請求項１９に記載の方法。 ２１． VAMP、SNAP-25、およびシンタキシンから選択されるペプチドには結合し ないが、これらのペプチドの１つの前記毒素による切断生産物に結合することを 特徴とする、請求項１〜１５のいずれかに記載のアッセイにおいて使用するため の抗体。 ２２． 配列番号1〜7から選択されるペプチドに結合するように適合される、請 求項２１に記載の抗体。 ２３． 以下の式の抗原に結合するように適合される、請求項２２に記載の抗体 であって： P-Q-X ここで、Xは配列番号1〜7から選択されるペプチドであり、P-Qに一端で共有結合 される、ならびにここで、P-Qは、Pがキャリアタンパク質であり、Qがアミノ酸 またはペプチドXをキャリアPに付着するように適合されるアミノ酸配列であるキ ャリアである、抗体。 ２４． 固相に固定化された完全なペプチドならびにVAMP、SNAP-25、およびシン タキシンのフラグメントから選択されるペプチドを含有する毒素アッセイの成分 。 ２５． 請求項２４に記載のアッセイ成分であって、前記固相がアッセイプレー ト、アッセイウェル、ニトロセルロースメンブレン、ビーズ、ディップスティッ ク、および溶出カラムの成分から選択される、アッセイ成分。 ２６． 毒素アッセイキットであって、(1)請求項２４〜２５のいずれかに記載の アッセイ成分、(2)(a)酵素に連結されるかまたは酵素を含む請求項２１〜２３の いずれかに記載の抗体、あるいは(b)請求項２１〜２３のいずれかに記載の一次 抗体、および該一次抗体に結合するように適合され、そして酵素に連結されるか または酵素を含む二次抗体、ならびに(3)該酵素の基質、を含む、毒素アッセイ キット。
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