JPH10505741A - 高アルカリ性プロテアーゼ及びその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は新規の高アルカリ性プロテアーゼ、職業的或いは工業的領域及び家庭領域におけるその使用、並びにこのプロテアーゼを含む上記使用のための組成物に関するものである。本発明によるプロテアーゼにおいてはスブチリシン群、特に“スブチリシン３０９”型群からの或るプロテアーゼ前駆体から誘導される選択的三重突然変異体が重要である。

Description

【発明の詳細な説明】 高アルカリ性プロテアーゼ及びその使用 本発明は新規の高アルカリ性プロテアーゼ、職業的並びに工業的領域及び家庭 領域におけるその使用、並びに上記使用のためのこのプロテアーゼを含む組成物 に関するものである。 職業的並びに工業的用途並びに方法にプロテアーゼ含有組成物を使用すること は公知である。例えば職業的クリーニング屋においては例えば血液で汚れた病院 の洗濯物または肉処理業者の作業用上着の洗濯のためにずっと以前からプロテア ーゼが用いられている。皮革処理領域で、例えば皮革製造では現在実際に、脱毛 の予備段階であり、必要な皮溶解化をおこすアルカリ処理段階、いわゆる石灰ヅ ケ段階で、毛皮及び皮の脱毛は未だに一部疑問のある化学物質（例えば無機硫化 物など）の使用のもとで行われている。より最近でも酵素を強化した石灰ヅケ法 （脱毛処理）−特にトリプシン酵素又は真菌または細菌プロテアーゼの使用のも とで行い、一部にはカルボヒドロラーゼをも用いる−が提案されたことは確かだ が、この酵素脱毛法は小動物の毛皮にのみ適用され、したがって実際には限られ た規模でしか使用されなかった。それに対して大型家畜の皮では、先ず第一に一 部不完全な脱毛作用とコラーゲン銀膜の損傷、並びに皮物質の強すぎる分解のた めに、酵素的脱毛はこれまで行うことができなかった。化学物質による環境汚染 を減らすために、石灰ヅケにおいてアルカリ性プロテアーゼを１部用いて化学物 質（例えば硫化物）部分を減らすことも試みられた。化学物質部分（例えば硫化 物）は酵素の使用によって著しく減らすことができ、粒起面引張りの少ない非常 に良い平面収率を得ることができたことは確かだが、このようにして作られた皮 革は粒起がなく、ゆるい火炎（波状）構造や、大きい、一部はヌーバック状に起 毛した銀面を形成する傾向があった。現在すでにプロテアーゼは皮革製造（軟化 及び石灰ヅケ）領域に使用されているが、現状の技術ではこのプロテアーゼは高 ｐＨ値（ｐＨ１１ないし１３）では依然としてごくわずかな効果しかもたず、或 いは水を使う仕事場の一般的処理温度（２８ないし３０℃）では比較的低い活性 しか示さない。 家庭における使用（例えば家庭用洗剤）に比べて職業的並びに工業的方法にお ける一部ドラスチックな条件に基づいて、ここで用いるプロテアーゼには特に安 定性、環境受容性及び性能に関する高い要求がつきつけられている。高アルカリ 性ｐＨにおける良い安定性及び活性に加えて、これらのプロテアーゼは一方では 良い温度安定性を示し、一部より高温度の職業的／工業的方法においては比較的 低濃度でできるだけ長期間、その時々の使用目的に応じて良い結果をもたらし、 他方一定の用途（例えば皮革製造）のためには比較的低温（約３０℃）でも良い 活性を示さなければならない。その上、使用するアルカリ性プロテアーゼは、職 業的或いは工業的方法では一般的な化学物質及び内容物質（例えばテンシド、漂 白剤または殺菌剤、化学物質などの構成成分）に対してできるだけ非感受性でな ければならない。そこで、職業的或いは工業的用途に適した、例えば職業的繊維 製品クリーニング、職業的表面洗浄または皮革処理或いは皮革製造に適したその 他のアルカリ性プロテアーゼの必要性が依然として存在する。 そこで本発明の目的は、新しい、特に職業的或いは工業的方法における使用に 適し、その上家庭での使用にもできるだけ好都合な特性を示すアルカリ性プロテ アーゼを提供することである。 今や、これから述べる高活性を有するアルカリ性 Bacillus（バシラス）−プ ロテアーゼが種々の職業的並びに工業的方法に使用できることが判明した。した がって本発明の目的はアルカリ性プロテアーゼ或いはその使用であり、特に職業 的及び工業的処理のための、或いは家庭領域における組成物へのその使用である 。これはクレイムに記載され、以下により詳細に説明される。 したがって本発明は、最低９５％、より好適には最低９８％が図１に示すアミ ノ酸配列に相同である基礎的アミノ酸配列を示し、図１の位置４２／１１４／１ １５、またはその都度これと相同の３つの位置の三重突然変異により、該当する 位置にあるアミノ酸がアルギニンに交換することによって図１に示すアミノ酸配 列とは異なることを特徴とする高アルカリ性プロテアーゼに関するものである。 上記のアルカリ性 Bacillus −プロテアーゼは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド ゲル電気泳動法により分子量既知の標準蛋白質に対して測定したとき、分子量約 ２６，０００ないし２８，０００ｇ／ｍｏｌを有する。可溶性モデル基質を用い る分析試験において判明した最適ｐＨはｐＨ約１０．５であった；ここで最適ｐ Ｈとはこのプロテアーゼが最大蛋白質分解活性を示すｐＨ領域である。ｐＨ活性 はこの場合、元のプロテアーゼのそれよりも高い（図１による）；最適作用領域 はアルカリ性領域に広く広がり、ｐＨ１０．５ないし１１．５にある。上記の本 発明によるアルカリ性 Bacillus −プロテアーゼは良好なｐＨ−及び温度安定性 をも有する。技術的現状においてこれまでのプロテアーゼが到達し得ないｐＨ領 域で活性を有する非常に高アルカリ性のプロテアーゼであるということが特に重 要である。 ”図１に記載したアミノ酸配列に相同である”というのは、ここでは相当する アミノ酸配列が図１に記載したアミノ酸配列と構造的に類似していることを意味 する。相同性を評価するためには、図１のアミノ酸配列とそれに匹敵するアミノ 酸配列の互いに構造的に対応する断片を、それらアミノ酸配列間の最大構造的一 致があるように互いに合わせる；その際個々のアミノ酸の欠失または挿入によっ て起こる相違を考慮し、それに応じた配列断片のズレによって均す。図１に含ま れるアミノ酸の配列の総数に対する、配列中で互いに一致するアミノ酸（“相同 位置”）の数を相同％とする。配列におけるズレは、アミノ酸の変化、挿入によ ってもアミノ酸の欠失によっても起こり得る。それに応じて、最低９５％が図１ に相同であるアルカリ性プロテアーゼを使用する場合、図１に関して記号をつけ たアミノ酸位置はその都度使用されるプロテアーゼのこれに相同の位置に関係づ けられることは当然である。図１に相同であるプロテアーゼのアミノ酸配列の欠 失または挿入は、アミノ酸位置の相対的ズレをおこし、互いに相同性のアミノ酸 配列の相同部分において、互いに相手の相当するアミノ酸位置の数字記号が一致 する必要はない、すなわちアミノ酸位置の個々の数字付けに関してその都度ごく わずかな数字のズレが生じ得る。 本発明の好適変形体において、図１に記載のアミノ酸配列と実質上同一の基礎 的アミノ酸配列を示し、図１の４２／１１４／１１５の位置の三重突然変異によ って、該当する位置にあるアミノ酸がアルギニンに交換したためにこれとは異な ることを特徴とする高アルカリ性プロテアーゼが生ずる。“実質上同一な”アミ ノ酸配列という概念は、ここでは、上記の三重突然変異Ｎ４２Ｒ／Ｎ１１４Ｒ／ Ｎ１１５Ｒ以外には、ほんの少しの、すなわち特に６個までのアミノ酸だけが図 １に記載したアミノ酸の配列と異なることができる（約９８％以上の相同）こと を意味する。そこで本発明による高アルカリ性プロテアーゼの基礎となるアミノ 酸配列は、“スブチリシン３０９”型と呼ばれる実質上このようなプロテアーゼ に相当する、なぜならば技術的現状において公知の“スブチリシン３０９”はそ のアミノ酸配列が図１に記載のアミノ酸配列と同一だからである。これとほとん ど同一の、位置８５を除いて図１のアミノ酸配列と一致するプロテアーゼが技術 的現状においては Bucillus nov ．ＰＢ９２菌株（欧州特許出願 ＥＰ２８３０ ７５参照）からのプロテアーゼとして記載されている。Bucillus ＰＢ９２から のプロテアーゼは、８５位に天然の変異でセリンの代わりにアスパラギンがある という点で図１に記載のアミノ酸配列とはほんのわずかに異なる、したがってこ れは“スブチリシン３０９”型プロテアーゼとみなされる。もう一つの“スブチ リシン３０９”に実質上同一のプロテアーゼ、５つの位置９７、９９、１０１、 １０２及び１５７を除いて図１に記載のアミノ酸配列と一致するプロテアーゼは 現状の技術では Bucillus lentus からのプロテアーゼ（ＷＯ９１／０２７９２ 及びＵＳ５３５２６０４参照）として記載される（“ＢＬＡＰ”）。Bucillus l entus からのプロテアーゼ“ＢＬＡＰ”は、次の５つの位置に天然の変異がある という点で図１に記載のアミノ酸配列とはわずかに異なる：９７Ｄ，９９Ｒ，１ ０１Ａ，１０２１及び１５７Ｓ。“ＢＬＡＰ”の１変異体はその他に６番目の天 然の変異−３位にセリンの代わりにスレオニンが存在する−によって異なる（こ れもＷＯ９１／０２７９２及びＵＳ５３５２６０４に記載されたアルカリ性プロ テアーゼである）。Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸、Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン、Ａ ＝Ａｌａ＝アラニン、Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン、Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン、Ｔ＝Ｔ ｈｒ＝スレオニンの意味である。“ＢＬＡＰ”及び突然変異Ｓ３Ｔをもつその変 異体は図１のアミノ酸配列に約９８％の相同性を示し、そのためここでは“スブ チリシン３０９”型プロテアーゼとみなされる。したがって本発明は好適には、 基礎的アミノ酸配列が図１に記載されたアミノ酸配列と一致するか、または８５ 位のみの、セリンの代わりにアスパラギンがあるという天然変異により、または 次の５つの位置のみの天然変異、９７Ｄ／９９Ｒ／１０１Ａ／１０２Ｉ／１５７ Ｓによって、または次の６つの位置のみの天然変異３Ｔ／９７Ｄ／９９Ｒ／１０ １Ａ／１０２Ｉ／１５７Ｓによって図１に記載のアミノ酸配列とは異なる、三重 突然変異Ｎ４２Ｒ／Ｎ１１４Ｒ／Ｎ１１５Ｒを有する高アルカリ性プロテアーゼ に関するものである。 本発明によるプロテアーゼの基礎であるアルカリ性 Bacillus −プロテアーゼ は、１９８９年７月２８日にＤＳＭ−Ｎｒ５４６６として預託された Bucillus 菌株から得ることができた（図１のアミノ酸配列をもつ）。それ以上の詳細、特 に分離法は、この菌株に関して欧州特許出願ＥＰ４１５２９６に記載されている 。本発明によるプロテアーゼ突然変異株からのプロテアーゼの８５位変異体も同 様に Bucillus nov．菌種ＰＢ９２の培養によって得られる（これらは欧州特許 申請ＥＰ２８３０７５或いはこれと関連のある米国特許ＵＳ５２１７８７８に記 載されている）。本発明によるプロテアーゼ突然変異体を基礎とするプロテアー ゼの、位置９７／９９／１０１／１０２／１５７−または位置３／９７／９９／ １０１／１０２／１５７変異体は同様に Bucillus lentus の培養によっても、 または Bucillus licheniformis の適切な形質転換後にも（ＷＯ９１／０２７９ ２或いはこれと関連のある米国特許ＵＳ５３５２６０４に記載されている）得ら れる。８５位変異体、並びに変異体“ＢＬＡＰ”は、図１に記載したアミノ酸配 列を有するプロテアーゼから上記位置のそれぞれの点突然変異の誘発によっても 作り出すことができる。上述の、本発明によるプロテアーゼ突然変異体を基礎と する“スブチリシン３０９”型のプロテアーゼから、“スブチリシン３０９”型 のプロテアーゼ前駆体のアミノ酸配列の複合−または逐次−点突然変異による三 重突然変異Ｎ４２Ｒ／Ｎ１１４Ｒ／Ｎ１１５Ｒをもつ本発明による高アルカリ性 プロテアーゼを公知の方法で生成することができる。このような個々のアミノ酸 位置に関する点突然変異法は欧州特許申請ＥＰ４１５２９６に記載されており、 そこに記載の方法を本発明のプロテアーゼの作成のための三重突然変異生成にも 使用することができる。したがってこれに関する上述の特許出願、特にＥＰ４１ ５２９６（或いはこれに関連する米国特許ＵＳ５３５２６０３）の内容は引例に よりこの出願に明確に挿入される。 本発明の非常に好適な変異体において、基礎的アルカリ性 Bacillus −プロテ ーアゼの三重突然変異Ｎ４２Ｒ／Ｎ１１４Ｒ／Ｎ１１５Ｒを有する本発明による 高アルカリ性プロテアーゼは、図１と同一の基礎的アミノ酸配列を有する菌株Ｄ ＳＭ５４６６から誘導される。突然変異を簡単にあらわす場合、数字はアミノ酸 配列の位置に関係する（図１参照）。本来のアミノ酸が数字の前に置かれ、該当 する位置のアミノ酸配列の突然変異によって導入された新しいアミノ酸は数字の 後に置かれる。アミノ酸を示すために文字コードが選択される；ここではＮはア スパラギン（Ａｓｐ）を、Ｒはアルギニン（Ａｒｇ）をあらわす。相当するアミ ノ酸交換は、既述のように公知の方法でアミノ酸配列の点突然変異によって起こ り得る；この方法は例えばＥＰ４１５２９６に記載されている。 本発明による高アルカリ性 Bacillus −プロテアーゼ−突然変異体Ｎ４２Ｒ／ Ｎ１１４Ｒ／Ｎ１１５Ｒは、職業的或いは工業的使用に一般的な条件−高ｐＨ値 、高温、短い使用時間など−のもとで極めて良い活性を示す。また、本発明によ るプロテアーゼ突然変異体は職業的或いは工業的処理、例えば職業的繊維製品ク リーニングなど−に必要な処方成分に対して驚くべき高い安定性をも示す。本発 明による高アルカリ性 Bacillus −プロテアーゼ−突然変異体は、職業的或いは 工業的処理法、例えば職業的繊維製品クリーニング、あらゆる種類の職業的表面 洗浄、皮革処理、特に例えば皮革製造などに好適に使用することができる。職業 的繊維製品クリーニングにおける本発明によるプロテアーゼの職業的或いは工業 的使用は、例えば優先権同等のドイツ特許出願ＤＥ４４１１２２３に、より詳細 に述べられている；そこで本発明による高アルカリ性 Bacillus −プロテアーゼ −突然変異体は例えば職業的大規模回転ドラム式洗濯機または全自動または工程 ごとに作動する向流洗濯装置に使用できる。いわゆる多槽アルカリ液法、例えば 予備洗浄と洗浄からなる二槽法においては本発明によるアルカリ性 Bacillus − プロテアーゼを予備洗浄工程の助剤溶液に加えるのが特に好適である。予備洗浄 はその際、職業的繊維製品クリーニング法に一般的な条件下で、例えば３０ない し７０℃で公知の方法で、この洗濯に普通に用いられる洗剤成分と共に行われる 。ひどい蛋白質性汚れ、例えば病院から出る血液で汚れた洗濯物、例えば大規模 調理室または肉類処理業者の洗濯物の場合は、上記のプロテアーゼを必要によっ て は予備洗浄につながる予備的すすぎ洗いの段階において澄明な冷水、または還流 する温水、及びこの場合に一般的なこれ以外の洗剤内容物質と共に用いて良い結 果を得ることができる。さらに本発明によるアルカリ性 Bacillus −プロテアー ゼ突然変異体はその他の職業的繊維製品クリーニング法において、例えば或る一 定の繊維及び汚れの種類によって定まっている職業的繊維製品クリーニング法、 例えば病院からの布製品の消毒クリーニングの場合などにも好適に用いられる。 これに関するより詳細はＤＥ４４１１２２３に記載されている。 この発明の範囲内のその他の好都合な使用領域は職業的或いは工業的設備の（ 硬質）表面の洗浄領域である。特に食品−及び嗜好品工業の食肉処理場、大規模 調理場、グリル工場などに好適である。 製造及びその後の加工並びに輸送の際に食料と接触するあらゆる表面は一定の 時間間隔で清浄にしなければならない。種々の分野（例えば飲料−、缶詰−及び 砂糖工業、乳−、肉類−及び脂肪加工業など）では種々の汚れがつく。これらの 汚れを除去するために技術的現状において種々の洗浄剤の比較的大規模な品揃え がある。これらの洗浄剤は先ず第一に蛋白質、脂肪、及び炭水化物の汚れを除去 しなければならない。有機物の他に無機の汚れもつく。したがって洗浄剤は洗浄 工程で或る定まった機能を発揮する種々の成分の混合物からなる。それらは粉末 または液体として、稀にはペーストとして購入され、わずかな例外を除いて、使 用者が水で０．５ないし２重量％の濃度に希釈して使用しなければならない。酵 素としては、表面洗浄の領域では蛋白質−及び澱粉含有汚れを落とすための特に プロテアーゼ及びアミラーゼが特殊の洗浄剤に加えられる。表面洗浄のためには このような洗浄剤に本発明によるプロテアーゼ−三重突然変異体を使用すること をすすめる；特に、汚れた材料が腐食を受けやすいために比較的強い酸性または アルカリ性製品を使用できない場合や、例えば高濾過装置の膜の洗浄（逆行振と う性）のためにもすすめられる。 食品工業における表面洗浄のためのこのような特殊の洗浄剤の一般的内容物質 は、（これまでに既に述べた酵素の他に）特に、そのような洗浄剤の主要成分と して汚れの溶解のために役立つ汚れ可溶化成分、及び大抵はアルカリ性反応を示 す例えば水酸化ナトリウムまたは−カリウム、炭酸ナトリウムまたは−カリウム 、 オルトリン酸またはその他の有機酸のアルカリ塩類、並びに種々の二酸化ケイ素 ／アルカリオキシド比（ＳｉＯ2 ：Ｎａ2 Ｏ＝０．７−３．３）を有するナトリ ウム−及びカリウム水ガラスの種類である；その他の成分は界面活性物質、特に 脂肪性汚れを除去するための界面活性物質（陰イオン性テンシド、例えば脂肪ア ルコール硫酸塩、アルキルベンゾールスルフォネート、アルキルベンゾールスル フォネート並びに石鹸であり；その他に非イオン性脂肪アルコール−及びアルキ ルフェノールグリコールエーテル）；特にアルミニウム及びその合金などの軽金 属の場合には汚れ腐食を避けるための防腐剤、例えばアルカリ性領域では水ガラ ス及び酸性領域では酸及び材料に作用する多数の特異的阻止物質；消泡剤、例え ばパラフィン油及びシリコン、特に特殊のエトキシル化−及びプロポキシル化産 物がある。 硬質表面洗浄領域における本発明によるプロテアーゼ三重突然変異体の使用例 として、特殊な２分野で使われる２つの洗浄剤の組成を次に記載する： グリル洗浄剤： − １．０重量％ Walocel ＨＴ ３００００ＰＦＶ − ０．５重量％ Sequinon ４０ Ｎａ３２ − ２５重量％ 苛性カリ液（５０重量％） − ４重量％ Rewoteric ＡＭ ＶＳＦ − ３重量％ プロテアーゼ−三重突然変異体 （活性 ３００，０００ＤＵ／ｍｌ、±５％） − ６６．５重量％水 高圧活性洗浄剤： − ５重量％ 脂肪族アルコールエーテル硫酸塩（２８重量％） − １０重量％ Sequinon ４０ Ｎａ３２ − １０重量％ 苛性ソーダ液（５０重量％） − ２重量％ クメン硫酸ナトリウム（４０重量％） − ３重量％ プロテアーゼ−三重突然変異体 （活性 ３００，０００ＤＵ／ｍｌ、±５％） − ７０重量％ 水 本発明による高アルカリ性プロテアーゼ突然変異体のもう一つの好都合な使用 領域は皮革処理領域、特に皮革製造領域である。本発明によるプロテアーゼ突然 変異体はその際特に皮または皮からの脱毛工程に使用される；その際それは好適 には軟化及び／または石灰ヅケ段階に使用される。 本発明によるプロテアーゼ突然変異体は皮革製造の際に使用するために特に適 している。皮革製造は特に次の製造段階を含む ａ）塩類、汚れ及び廐肥を取り除くための汚れ分離 ｂ）皮をふやかし、水溶性蛋白質を溶出するための軟化； ｃ）脱毛、皮可溶化及びその後の膨潤のための石灰ヅケ（生皮）；“生皮”と はこのとき生じた毛のない可溶性になった皮を意味する； ｄ）上皮−及び皮残渣を除去し、ｐＨ値を下げるための脱灰及び酵解； ｅ）生皮を酸性部分（Sauerstellen）に浸す； ｆ）クロムなめし、すなわちクロム−或いはアルミニウム−またはジルコン塩 によるミネラルなめし。 上述の諸段階に続いて普通は中和、場合によっては後なめし、染色及び油脂塗 布、並びに皮の乾燥及び商品にするための仕上げが行われる。乾燥及び仕上げ以 外では上記の作業はいわゆる水作業場で行われる。この場合容器としてウインス 染色機、樽、及びコンクリートミキサー−または洗浄機原理による機械を用いる 。酵素は上述の浸酸（Pickel）までの（浸酸を含む）作業工程に加えられる。そ の際なめし化学工程、及びｐＨ３ないし１２領域における蛋白分解酵素の使用に おいて、個々の処理段階で異なる酵素を必要とすることは当然である、なぜなら ば各酵素は特異的ｐＨ活性領域をもっているからである。種々の活性ｐＨ領域を もつ酵素類を混合して皮革製造のために提供することによって、皮革製造のため の酵素産物のｐＨ依存性活性バンド巾を著しく広げることができる。本発明によ るプロテアーゼ突然変異体を皮革製造時に−場合によっては軟化段階の他に−特 に脱毛（石灰ヅケ）段階に加えるのが好適である。本発明による突然変異体はこ の際、毛髪固定の原因となる蛋白質の溶解という点から見てｐＨ１２というｐＨ 値まで、特に技術的脱毛には一般的な比較的低い温度（約２８ないし３０℃）で も最適活性を保証するという傑出した特性を有する。その上脱毛活性は、本発明 に よるプロテアーゼ三重突然変異体の高いｐＨ安定性によっても高められる。本発 明によるプロテアーゼ三重突然変異体の使用のもとで処理した毛皮及び皮からは 毛は非常に容易に除去され、高い総剥離度（約９９％以上）が得られる。作業モ デル実験の１例で示されるように、シェーバーで毛を除去することは困難でない 。本発明によるプロテアーゼ三重突然変異体を用いると、実際に即した方法で大 型家畜の皮からも完全に、傷をつけずに酵素的に脱毛することができる。さらに 本発明によるプロテアーゼ三重突然変異体を石灰ヅケに使用すると、環境的に好 ましくない化学物質（例えば硫化物）を大幅に削減することができる。 本発明はさらに職業的及び／または工業的使用のための非常に一般的な組成物 にも関係する；それら組成物は前述の本発明による高アルカリ性プロテアーゼ及 びその時々の使用のために一般的なその他の処方成分を含む。このような本発明 による組成物は例えば職業的及び／または工業的表面洗浄領域における次のよう な典型的成分を含む：アルカリ（例えばＮａＯＨ、ＫＯＨ）、陰イオン性及び非 イオン性テンシド、錯化剤、過酸化漂白剤、プロピレングリコールなどの有機溶 媒、リン酸塩などのビルダー。レザー製造領域では典型的組成物は処方成分とし て硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、おがくずなどの成分を含むことが多い。 この際粉末状成分と顆粒との混合物からなる固形産物が重要である。 職業的及び／または工業的使用における本発明による高アルカリ性 Bacillus −プロテアーゼ突然変異体の上述の利点の他に、本発明によるプロテアーゼ突然 変異体は、本発明によるプロテアーゼ突然変異体をその他の技術的現状における 一般的な“スブチリシン３０９”型プロテアーゼ（これは三重突然変異Ｎ４２Ｒ ／Ｎ１１４Ｒ／Ｎ１１５Ｒを示さない）と組み合わせた家庭の洗剤及び洗浄剤組 成物においても驚くべき長所を有する。本発明による高アルカリ性プロテアーゼ 突然変異体は、家庭で一般的に用いられるこれらのプロテアーゼ、特に“スブチ リシン３０９”型のプロテアーゼと混合すると、家庭用洗剤の保存後の残留洗浄 能力にプラスの影響を与える。本発明による高アルカリ性プロテアーゼの併用に よって、特に一般的家庭用洗剤或いは家庭用洗浄剤プロテアーゼの、一般的洗剤 −或いは洗浄剤処方成分の存在下における貯蔵安定性は顕著に高まる。技術的現 状において一般的なプロテアーゼを含む組成物は、認め得る活性損失を超える、 より大きい洗濯能力低下を示す一方、本発明によるプロテアーゼ三重突然変異体 Ｎ４２Ｒ／Ｎ１１４Ｒ／Ｎ１１５Ｒを使用する場合には販売時の一般的貯蔵期間 及び出荷時間にわたって一般的家庭用洗剤の条件（ｐＨ＝９．５ないし１０．５ 、洗濯温度特に３０ないし６０℃）でにおいて適切な洗濯効果があらわれる。そ れは技術的現状において従来公知のプロテアーゼのみを含む組成物の洗濯効果を 凌ぐものである。 本発明はしたがって家庭用洗剤−及び家庭用洗浄剤組成物にも関係する。それ らは本発明による高アルカリ性プロテアーゼ突然変異体をその他の、三重突然変 異Ｎ４２Ｒ／Ｎ１１４Ｒ／Ｎ１１５Ｒを示さない“スブチリシン３０９”型のプ ロテアーゼと組み合わせて含む。本発明による好適家庭用洗剤−及び家庭用洗浄 剤組成物は、本発明による高アルカリ性プロテアーゼ突然変異体を、アミノ酸配 列の９５％、より好適には９８％が図１のアミノ酸配列と相同であるその他のプ ロテアーゼと組み合わせて含み、その際ここで言うその他のプロテアーゼは三重 突然変異Ｎ４２Ｒ／Ｎ１１４Ｒ／Ｎ１１５Ｒを示さない。基礎的アミノ酸配列が 図１に示すアミノ酸配列と実質的に一致する本発明による高アルカリプロテアー ゼを含む家庭用洗剤−及び洗浄剤組成物が特に好適である。この際基礎的アミノ 酸配列が図１に示すアミノ酸配列と一致するか、または８５位のみにセリンの代 わりにアスパラギンがあるという天然変異によって図１に示すアミノ酸配列とは 異なる、このような本発明による突然変異Ｎ４２Ｒ／Ｎ１１４Ｒ／Ｎ１１５Ｒを 有する高アルカリ性プロテアーゼがすぐれている。 好適には本発明による使用及び組成物には、５０，０００ないし１，０００， ０００ＤＵ／ｇ酵素試料という活性を示す本発明によるアルカリ性 Bacillus − プロテアーゼ- 試料を用いるべきである。ここで“ＤＵ”とは酵素的活性 Delft Units である；ここで蛋白分解活性１０００ＤＵは、２％（Ｗ／Ｗ）酵素溶液 １ｍｌ量でカゼイン分解後、吸光度差（１ｃｍ光路；２７５ｎｍ；ブランク検体 に対して測定）０．４０００を与える活性である。本発明によるアルカリ性 Bac illus-プロテアーゼ−試料はその際職業的或いは工業的方法に一般的な処方にお いて単独で、または所望の場合には他の職業的或いは工業的分野でまたは家庭用 に使用されるプロテアーゼまたはその他の一般的酵素、例えばアミラーゼ、リパ ーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、ヌクレアーゼ、酸化還元酵素などと組み合わ せて使用することができる。本発明による処方の上記 Bacillus-プロテアーゼ部 分は総調製物の乾燥物質に対して好適には０．１ないし５重量％、特に０．２な いし２重量％である。 本発明による組成物は種々の使用分野において公知の方法で粉末状、例えば顆 粒状、Prills、またはペレットの形で、場合によっては表面コーティングをほど こして製造することができる。本発明による上記の Bacillus −プロテアーゼ突 然変異体は良い安定性をもつため、液体処方にも使用することができる。 職業的或いは工業的方法に一般的な条件−高アルカリ性ｐＨ値、例えば１１以 上のｐＨ値、場合によっては７０℃までの高温−のもとでは本発明による高アル カリ性 Bacillus-プロテアーゼ突然変異体は驚くべきすぐれた特性を示す。一般 的家庭での使用に比較して職業的或いは工業的使用では大ていは比較的短い使用 時間だけしか自由に使えないだけに、これはますます有利である。高温安定性の 他に本発明による高アルカリ性 Bacillus −プロテアーゼ突然変異体は職業的或 いは工業的組成物または家庭用にも必要な内容物質の存在下で特に高い酵素安定 性を示す。職業的或いは工業的分野または家庭領域で使われる漂白剤、例えば病 院用の職業的殺菌性洗剤に、或いは一般に家庭用洗剤にも使われるような漂白剤 に対して、本発明による高アルカリ性 Bacillus −プロテアーゼ突然変異体は驚 くほど安定している。 図の説明： 図１： Bacillus alcalophilus ＨＡ１（ＤＳＭ ５４６６）からのアルカリ性プロテア ーゼのアミノ酸配列の配列プロトコル（配列番号ＮＯ１） 図２： 突然変異をおこしていない元のプロテアーゼとプロテアーゼ突然変異体とのＴ＝ ５０℃における最適ｐＨの比較 図３： プロテアーゼ突然変異体と突然変異をおこしていない元のプロテアーゼとのｐＨ ＝１１における最適温度の比較 図４： 標準洗剤中のプロテアーゼ突然変異体と突然変異をおこしていない最初のプロテ アーゼとの貯蔵安定性の比較（閉鎖ボール箱） 図５：ｐＨ＝１１．４及びＴ＝１５〜６０℃におけるプロテアーゼ突然変異体と 突然変異をおこしていない元のプロテアーゼとの洗浄能力の比較 Bacillus alcalophilus ＨＡ１（ＤＳＭ ５４６６）からのアルカリ性プロテ アーゼの図１に示したアミノ酸配列を、相当するヌクレオチド配列の研究を介し て配列決定した結果がＥＰ４１５２９６の例１ないし４に記載されている。Baci llus alcalophilus と記される菌株ＨＡ１は１９８９年７月２８日にドイツ微生 物コレクション（ＤＳＭ）にＤＳＭ５４６６の番号で預託された（宛名：ＤＳＭ −ドイツ微生物コレクション及び細胞培養会社、Mascheroder Weg 1b、D-38124 Braunschweig、ドイツ）。 実施例 次の例は本発明を説明するものであるが、その範囲を制限するものではない。 実施例１： アミノ酸配列の突然変異によって変異したアルカリ性プロテアーゼの作成 アミノ酸交換Ｎ４２Ｒ、Ｎ１１４Ｒ及びＮ１１５Ｒによって、Bacillus alcal ophilus ＨＡ１（ＤＳＭ ５４６６）からのアルカリ性プロテアーゼの図１に記 載したアミノ酸配列とは異なるアルカリ性プロテアーゼを、公知の方法により、 相当するプロテアーゼ遺伝子のＤＮＡ部分配列の選択的（gerichtet）突然変異 誘発によって作成した。その際図１に記載のアミノ酸配列の相当する位置を数字 で表示し、公知の文字コード中の位置数字の前に元のアミノ酸を配置し、誘導さ れたアミノ酸を位置数字の後に配置する。個々の突然変異について選択的突然変 異誘発法がＥＰ４１５２９６の例５ないし１８に詳細に記載されている。その他 に個々の突然変異誘発の実施法についてはＥＰ５０３３４６の例も参照される。 原則的にこの方法は次に示す公知の処理段階を含んでいた： 天然単離菌 Bacillus alcalophilus ＨＡ１（ＤＳＭ ５４６６）からサイト ウらの方法（１９６３、Biochem.Biophys.Acta ７２巻、６１９−６２９ページ ）によって染色体ＤＮＡを分離し、制限酵素Ｓａｕ３Ａで部分的に加水分解した 。 制限酵素切断片を電気泳動によって分離し、３から８キロベースまでの大きさを もつ断片を分離した。分離し、おおざっぱに選択した Bacillus alcalophilus ＨＡ１のＤＮＡ−断片を in vitro で公知のプラスミドｐＵＢ１１０のベクター ＤＮＡと公知の方法で新たに組み合わせた。得られた、in vitro で新たに組み 合わせたＤＮＡを菌株 Bacillus subtilis ＢＤ２２４（捍菌遺伝子保存センタ ー １Ａ４６）のプロトプラストを S.Shang 及び N.Cohen が記載した方法（ １９７９、Mol.Gen.Genet.１６８巻、１１１−１１５ページ）によって形質転換 した。形質転換体をプレート上でネオマイシンで選択した。マニアティス（Mani atis）らの教本にしたがって（マニアティスら＝T.Maniatis、E.F.Fritsch、J.S ambrook、分子クローニング（Molecular Cloning ）、実験室マニュアル、Cold Spring Harbor Laboratory、１９８２）１クローンからプラスミド−ＤＮＡを分 離した。このプラスミドに含まれる B.alcalophilus-ＤＮＡの断片は４．１キロ ベースの大きさを有し、Bacillus alcalophilus ＨＡ１（ＤＳＭ ５４６６）か らの高アルカリ性プロテアーゼのための完全なＤＮＡ配列を含む（ＥＰ４１５２ ９６の例１及び２参照）。 Bacillus alcalophilus ＨＡ１（ＤＳＭ ５４６６）からの高アルカリ性プロ テアーゼの完全なＤＮＡ配列を含むプラスミドをＡｖａＩで切断した。残ってい る端部を公知の方法で（マニアティスら、１１４ページ）ＤＮＡ二本鎖に補填し た。それに続いてこのＤＮＡをＸｂａＩで制限後、Ｎ−末端１．６１８ＢＰ含有 断片を分離し、公知の方法でベクターｐＢＳにおいてクローン化した。生成した ベクターは図１に描かれるアミノ酸配列の遺伝暗号をもつＤＮＡのＮ−末端部を 含む（ＥＰ４１５２９６、例５参照）。 同様な方法で、６５８ＢＰを含み、相当するプロテアーゼのＣ−末端部の遺伝 暗号をもつＤＮＡ断片を含むベクターを作った。このためには完全なＤＮＡ配列 を含むプラスミドを制限酵素ＸｂａＩ及びＡｓｐ７１８で切断し、既知ベクター ｐＢＳの相当する切断箇所においてクローン化した（ＥＰ４１５２９６、例７参 照）。 Ｃ−末端部またはＮ−末端部を含むＤＮＡ部分配列においてクンケル（Kunkel ,T.A.）（１９８５、Proc.Natl.Acad.Sci.USA ８２巻、４８８−４９２ページ ） が記載した“プライマー伸長”法で選択的突然変異を実施した。このためには先 ず第一に、相当するベクターを公知の方法でそれらのウラシル化一本鎖同族体に 転換した；このとき両ベクターの１つで形質転換した E.Coli（大腸菌）ＣＪ２ ３６細菌−これには付加的にヘルパー−ファージＭ１３ Ｋ０７（Bio-Rad 研究 所、リッチモンド、カリフォルニア）を感染された−を培養した。細菌 E.Coli ＣＪ２３６は公知のウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ欠乏突然変異体であり、これ はベクターの複製の際にチミジンの代わりにヌクレオチド ウラシルをそのベク ターのＤＮＡ配列にはめ込む。ウラシル化ベクターは公知の方法で in vitro 選 択的突然変異誘発反応のために好都合に使用される、なぜならば反応終了後、突 然変異ＤＮＡ鎖の生成のための基質（マトリックス）として役立ったウラシル含 有ＤＮＡ一本鎖はウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ処理によって除去できるからで ある。上記ヘルパー−ファージの添加は生成ウラシル化一本鎖ベクター−ＤＮＡ のための鞘蛋白質（Hullproteine）の合成に必要であった。覆われた（Umhullte ）ウラシル化一本鎖ベクターＤＮＡは形質転換された寄生微生物 E.Coli ＣＪ２ ３６から誘導され、その後培養培地から分離された。 Ｃ−末端部あるいはＮ−末端部の、分離されたウラシル化ＤＮＡ一本鎖ベクタ ーを合成オリゴヌクレオチドとハイブリダイズした；これらは突然変異部位をも ち、同時にその後突然変異によって完全なＤＮＡ−二本鎖に補完するためのプラ イマーとして役立つ。ここで使用する合成オリゴヌクレオチド類は公知の方法で ビューケイジ（Beaucage,S.L．）及びカルターズ（Caruthers,M.H.）（１９８１ ，Tetrahedron Letters 22，１８５９−１８６２）の方法によって作成した。第 二のＤＮＡ鎖の合成は公知の方法でＴ４−ＤＮＡ−ポリメラーゼを用い、その後 Ｔ４−ＤＮＡ−リガーゼによる結合によって行った（クンケルら、１９８７、Me thods in Enzymol．１５４巻、３６７−３８２ページ）。生成した二本鎖ベクタ ー−ＤＮＡを E.Coli ＭＣ１０６１において形質転換し、突然変異をおこしたベ クターを、合成オリゴヌクレオチドで挿入、或いは除去された相当する単一の制 限酵素識別箇所の検査によって確認した。 プロテアーゼＤＮＡのＮ−末端部分かＣ−末端部分かどちらかに例えば２つの 突然変異を作るために、第１の突然変異誘発後、第２の突然変異を導入するため のまた別の合成オリゴヌクレオチドを同様に使用してこの方法を繰り返した。 プロテアーゼ−ＤＮＡ配列のＣ−末端部、或いはＮ−末端部に突然変異を有す る発現ベクターを作成した；その場合選択的突然変異誘発によって得られたＤＮ Ａ配列を制限酵素で切断し、そのＤＮＡ配列の相当する別の末端部分並びに発現 に必要なすべての要素を含むベクターＤＮＡと連結した。得られたベクターは相 当する突然変異プロテアーゼの発現のために適した読み枠（Leseraster）をもっ た完全な発現ベクターでった。この種の発現ベクターの作成はＥＰ４１５２９６ の例１６に詳細に記載した方法と同様にして行われた。次の三重突然変異のため に、発現ベクターＤＳＭ５４６６Ｍｕｔ．Ｎ４２Ｒ／Ｎ１１４Ｒ／Ｎ１１５Ｒも 同様に作成した。 三重突然変異をもった高アルカリ性プロテアーゼを作成するために、B.subtil is ＢＤ２２４を公知の方法で上記の発現ベクターで形質転換し、培養した。形 質転換し、培養した菌株の培養上澄液から公知の方法で三重突然変異−高アルカ リ性プロテアーゼを分離した。突然変異プロテアーゼの分離法はＥＰ４１５２９ ６例１６及び１８に詳細に記載されており、ここではそれと同様に処理した。 Bacillus alcalophilus Ｈａ１（ＤＳＭ５４６６）を基礎とするアミノ酸配列 の三重突然変異によって変異したアルカリ性プロテアーゼを例２ないし４に記載 する実験に使用した。 本発明による三重突然変異体の職業的繊維製品クリーニング業における使用及 び長所は、平行した、ここでは優先権に基づくドイツ特許出願ＤＥ４４１１２２ ３の例に詳細に記載されており、したがってここではそれを参照するように指示 するにとどめる。 本発明によるプロテアーゼ突然変異体のその他の特性は実施例５に記載する。 実施例２： 本発明によるプロテアーゼ三重突然変異体の脱毛特性の測定 予備洗浄： 牛皮を０．１％マーリパル（Marlipal）０１３／９３９を含む２倍量（牛皮に 対して）の水で約２８−３０℃で洗う。その後牛皮を約２０×６０ｃｍの片に切 断し、−２０℃で貯蔵する。貯蔵した片から約２０×７ｃｍの試験片を切り取り 、 水を切り、ペーパータオルでふき取って乾かす。その試験片を０．５％ソーダを 含む溶液中で１２０分間、そして０．１％ソーダを含む溶液中で１５分間振とう する。重量増加を記録する。 Ａ．予備洗浄した皮の膨潤（水分取り込み） インキュベーション溶液：０．５％炭酸ナトリウム、０．１％（皮に対し）マ ーリパル（Marlipal）、２倍量の水（皮に対し） インキュベーション時間：１２０分間 インキュベーション温度：２８℃ 酵素：オプティマーゼＬ６６０ Ｂ．脱毛 インキュベーション溶液：７．１ｇ／ｌ Ｃａ（ＯＨ）２（牛皮の２００％） インキュベーション時間：２４時間 インキュベーション温度：３０℃ 混合：インキュベーション開始時に Linitest −機械で２時間持続的に、及び 終わりに３．５時間持続的に混合する ｐＨ値：最初１２．４８ 最後：１２．４５ コメント：処理段階Ａの後、試験片は白く、ぶよぶよしている、 処理段階Ｂの後、試験片は“ゴム状に硬化した” 実施例３： 試験片の出所：雌牛、背中部分 予備洗浄： 皮を０．１％マーリパル ０１３／９３９を含む２倍量（皮に対して）の水で 約２８−３０℃で洗う。その後その皮を２０×６０ｃｍの片に切断し、−２０℃ で貯蔵する。貯蔵片から約２０×７ｃｍの試験片を切り取る。この水を切り、ペ ーパータオルでふき取って乾かした。試験片を０．５％ソーダを含む溶液中で１ ２０分間、そして０．１％ソーダを含む溶液中で１５分間振とうする。重量増加 を記録する。 次に記載する条件で３試験を行った。 Ａ．予備洗浄した皮の膨潤（水分取り込み） インキュベーション溶液：０．５％炭酸ナトリウム、０．１％マーリパル（皮 に対し）、２倍量の水（皮に対し） インキュベーション時間：１２０分間 インキュベーション温度：２８℃ 酵素：オプティマーゼＬ６６０ Ｂ．脱毛 インキュベーション溶液：７．１ｇ／ｌ Ｃａ（ＯＨ）２（皮の２００％） インキュベーション時間：２４時間 インキュベーション温度：３０℃ 混合：インキュベーション開始時に Linitest −機械で２時間持続的に、終わ りに３．５時間持続的に混合。 試験１の結果： 使用プロテアーゼ：活性３０００００ＤＵ／ｍｌ（±５％）を有する突然変異 体Ｎ４２Ｒ／Ｎ１１４Ｒ／Ｎ１１５Ｒ コメント：毛は長さが一様に剥離したが、約１−３ｍｍの刈り残りが残った。 試験２の結果 使用プロテアーゼ：活性３０００００ＤＵ／ｍｌ（±５％）を有する突然変異 体Ｎ４２Ｒ／Ｎ１１４Ｒ／Ｎ１１５Ｒ 試験３の結果 使用プロテアーゼ：活性３０００００ＤＵ／ｍｌ（±５％）を有する突然変異 体Ｎ４２Ｒ／Ｎ１１４Ｒ／Ｎ１１５Ｒ 実施例４： Ａ．軟化 牛皮（重量）：１８８６．２５［ｇ］（実施例２及び３に記載したように予備 洗浄） 体部分： 腹部 添加物：水： ３７７２．５０［ｇ］ Ｎａ2ＣＯ3：９.４３［ｇ］ テンシド：１．８９［ｇ］マーリパル 酵素： ０．３０４６［ｇ］オプティマーゼＬ６６０ ｅｎｔｐｒｉｃｈｔ：９９５８２［ＡＡＤＵ／ｋｇ牛皮］ 反応４時間後の重量：２０３９．５［ｇ］ 重量増加： ８．１［重量％］ 反応４時間後のｐＨ値：１０．２１ Ｂ．脱毛 水： ３０５９．２５［ｇ］ Ｃａ（ＯＨ）２ ２０．４０［ｇ］ 酵素： ６．９３５２［ｇ］のプロテアーゼ突然変異体、活性＝ １５００００ＤＵ／ｍｌ（±５％） ｅｎｔｓｐｒｉｃｔ：５３９８７８［ＡＡＤＵ／ｋｇ牛皮］ １７.２５時間インキュベーション後のｐＨ値：１２.７５ 脱毛の光学的判定： 毛は非常に容易に除去され、ドラムから試験片を取り出したとき毛はすでに開口 縁と接触して除去された。２、３箇所に約２ｃｍ2 づつ残っていたがシェーバー で簡単に刈り取られた。 実施例５： 次に本発明による三重突然変異体の重要な特性をいくつか述べる。 ａ）本発明による三重突然変異体の活性とｐＨ値との関係を、突然変異をおこし ていない元のプロテアーゼと比較して次の条件下で測定した：基質＝アセチルカ ゼイン、Ｔ＝５０℃、変換時間＝１０分、リン酸−硼酸−緩衝液。検出されたｐ Ｈ依存性相対的活性を％で（ｐＨ＝８．５のときの活性を１００％とする）図２ にあらわす。本発明による三重突然変異体はｐＨ＝１０〜１２という比較的高い ｐＨ値では本来のプロテアーゼに比べて顕著に高い活性を示す。 ｂ）本発明による三重突然変異体の活性と温度との関係を突然変異をおこしてい ない元のプロテアーゼと比較して次の条件下で測定した：基質＝アセチルカゼイ ン、ｐＨ＝１１。検出された温度依存性相対的活性を％で（ｐＨ＝８．５のとき の活性を１００％とする）図３に示す。本発明による三重突然変異体は選択した 高ｐＨ値で、４５ないし５８℃の温度範囲では元のプロテアーゼに比較して顕著 に改善された活性を示す。 ｃ）本発明による三重突然変異体の貯蔵期間による貯蔵安定性と、突然変異をお こしていない元のプロテアーゼの貯蔵安定性（貯蔵寿命）とを、標準的完全洗剤 中で次の条件下で比較した：Ｔ＝３０℃、６０％相対湿度（ｒ．ｈ．＝相対湿度 ）、閉鎖ボール箱中。貯蔵後に検出された残留活性（％）（元の活性＝１００％ に対して）は、本発明による三重突然変異体が元のプロテアーゼに対して顕著に 高い 残留活性を示し、したがって改善された安定性を示した。結果は図４に明らかに される。 ｄ）本発明による三重突然変異体の良い洗浄効果（表面浄化）を証明するために 、元のプロテアーゼに対する洗浄能率を種々の酵素濃度で次の条件下で測定した ；標準洗剤ベース；ｐＨ＝１１．４（６ｇ／ｌ）；試験組織＝ＥＭＰＡ１１７、 Ｔ＝６０℃。検出された結果（デルタ反射率）と使用酵素量（ｍｇ／ｌ）との関 係を図５に示す；これは高ｐＨ及び高温では本発明によるプロテアーゼがすぐれ ていることを示している。 ｅ）本発明による三重突然変異体と技術的現状による洗剤プロテアーゼとの組み 合わせが好ましいことを証明するために（ここでは元のプロテアーゼは“スブチ リシン３０９”型である）次に示す２つの実験を行い、以下に示すような結果を 得た。 実験１ 本発明による三重突然変異体と突然変異をおこさない元のプロテアーゼ（その 時に応じてコーティングしてある）の家庭用一般的完全洗剤中における貯蔵前及 び貯蔵後の相対的洗浄能力の比較。活性に関して等しい量で２試験組織から得た 平均洗浄能力を問題にしている。 実験２ 粉末洗剤中で３０℃、６０％ｒ．ｈ．で貯蔵した本発明による三重突然変異体 或いは元のプロテアーゼの残留活性及び残留洗浄能力（ｒ．ｈ．＝相対湿度）； 洗浄前のｐＨ値＝１０．２ 試験組織；血液／乳／墨（ＥＭＰＡ１１７） ％ｄＲ：試験組織（酵素含有洗剤）の反射率と無酵素基剤で洗浄した試験組織の 反射率との差 酵素量：等しい活性を示す量 Ａ＝残留活性［％］、元のプロテアーゼ Ｂ＝洗浄活性［％ｄＲ］、元のプロテアーゼ Ｃ＝残留活性［％］、三重突然変異体 Ｄ＝洗浄能力［％ｄＲ］、三重突然変異体 定義 オプティマーゼＬ６６０＝B.licheniformis からのアルカリプロテアーゼ マーリパル＝ポリエチレングリコール−イソトリデシル−エーテル ワロセル＝２−ヒドロキシエチル−セルロースエーテル セキノン＝［［ビス（２−ビス（ホスフォノメチル）アミノ）−エチル］アミノ ］メチル］−フォスフォン酸、ナトリウム塩 レウォテリック＝イミダゾリンを基礎とする両性電解質 ＡＡＤＵ＝自動分析器 Delf Units ＥＭＰＡ１１７＝血液／乳／墨で汚れた試験組織ポリエステル／木綿（スイス連 邦共和国材料試験機関、スイス）

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:07） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，Ｃ Ｎ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＲ，ＬＴ ，ＬＶ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ， ＳＩ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ (72)発明者 コニエツニ−ヤンダ，ゲルハルト ドイツ連邦共和国 ディー−30982 パテ ンゼン シェーンベルゲル ストラーセ 23 (72)発明者 ヘルマン，フーベルト ドイツ連邦共和国 ディー−31582 ニエ ンブルグ （ヴェステル） セレルストラ ーセ 116エイ (72)発明者 ベルネル，カステン ドイツ連邦共和国 ディー−31319 ゼー ンデ ドルフストラーセ ９

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．最低９５％、より好適には最低９８％が図１に記載したアミノ酸配列との相 同を示し、図１の位置４２／１１４／１１５、またはこれに相同の３つの位置の 三重突然変異により、該当する位置にあるアミノ酸がアルギニンに交換すること によって図１に記載のアミノ酸配列とは異なる基礎的アミノ酸配列を特徴とする 高アルカリ性プロテアーゼ。 ２．図１に記載のアミノ酸配列と実質的に同一の基礎的アミノ酸配列を示し、図 １の位置４２／１１４／１１５の三重突然変異により、該当する位置にあるアミ ノ酸がアルギニンに交換することによって図１に記載のアミノ酸配列とは異なる ことを特徴とする請求の範囲第１項記載の高アルカリ性プロテアーゼ。 ３．基礎的アミノ酸配列が図１に示すアミノ酸配列と同一であるかまたは位置８ ５のみの、セリンの代わりにアスパラギンがあるという天然変異によって、また は次の位置のみの天然変異、９７Ｄ／９９Ｒ／１０１Ａ／１０２Ｉ／１５７Ｓ、 または３Ｔ／９７Ｄ／９９Ｒ／１０１Ａ／１０２Ｉ／１５７Ｓによって図１に示 すアミノ酸配列と異なることを特徴とする請求の範囲第２項記載の高アルカリ性 プロテアーゼ。 ４．請求の範囲第１項ないし第３項のいずれかの項記載の高アルカリ性プロテア ーゼの職業的または工業的用途における使用。 ５．請求の範囲第１項ないし第３項のいずれかの項記載の高アルカリ性プロテア ーゼの職業的または工業的設備、特に食肉会社、食品−及び嗜好品工業、大規模 調理場、グリル工場における、表面洗浄のための請求の範囲第４項による使用。 ６．皮革製造、特に毛皮または皮からの脱毛処理に請求の範囲第１項ないし第３ 項のいずれかの項記載の高アルカリ性プロテアーゼの請求の範囲第５項による使 用。 ７．請求の範囲第１項ないし第３項のいずれかの項記載の高アルカリ性プロテア ーゼ及びその時々の使用のために一般的なその他の処方成分を含む職業用及び／ または工業用に使用するための組成物。 ８．請求の範囲第１項ないし第３項のいずれかの項記載の高アルカリ性プロテア ーゼを三重突然変異Ｎ４２Ｒ／Ｎ１１４Ｒ／Ｎ１１５Ｒを示さないもう一つの“ スブチリシン３０９”型プロテアーゼと組み合わせて成る家庭用洗剤−及び家庭 用洗浄剤組成物。 ９．請求の範囲第１項ないし第３項のいずれかの項記載の高アルカリ性プロテア ーゼをアミノ酸配列の９５％、より好適には９８％が図１に記載のアミノ酸配列 との相同を示すもう一つのプロテアーゼと組み合わせて成り、その際後者のプロ テアーゼは三重突然変異Ｎ４２Ｒ／Ｎ１１４Ｒ／Ｎ１１５Ｒを示さない請求の範 囲第８項記載の家庭用洗剤−及び家庭用洗浄剤組成物。 10．請求の範囲第３項記載の高アルカリ性プロテアーゼを、アミノ酸配列が図１ 記載のアミノ酸配列と同一であるか、または８５位置のみの、セリンの代わりに アスパラギンがあるという天然変異によって後者とは異なるもう一つのプロテア ーゼと組み合わせて成る請求の範囲第９項記載の家庭用洗剤−及び家庭用洗浄剤 組成物。