JPH07286194A - 営業用繊維洗浄法及びこの方法を実施するための組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 アルカリ性プロテアーゼを使用する営業用繊
維洗浄法及びこれを含有する組成物 【構成】 アルカリ性バチルス−プロテアーゼを営業用
繊維洗浄法に使用すること並びにこのプロテアーゼを含
有する営業用繊維洗浄用組成物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、アルカリ性プロテアー
ゼを営業用繊維洗浄法で使用すること並びにアルカリ性
プロテアーゼを含有するこの方法で使用される組成物に
関する。

【０００２】

【従来の技術】営業用洗濯で使用される繊維洗浄剤は、
一般に家事で使用される洗浄剤とは色々な面で相違して
いる。即ち、営業用洗濯では行程に分けてか又は連続的
に操業される非常に高い洗濯装入量を有する大量洗浄装
置を使用し、その際、異なる洗浄段階、例えば湿潤、予
備洗い、清澄洗浄及びすすぎで、異なる混合洗剤を繊維
の種類及び汚れの程度に応じて洗液中に添加する。水及
びエネルギーを合理的に使用するために、洗濯すべき繊
維の種類及び汚れに応じてその都度の洗浄行程に最適に
合わせることができる営業用繊維洗濯用の特別な部分既
製品の洗剤混合物の開発が必要とされている。

【０００３】プロテアーゼ含有洗剤組成物を営業用洗濯
で、例えば血液で汚染された病院の洗濯物又は精肉業務
の防護服を洗濯するために使用することは、既に以前か
ら公知である。家事洗剤と比較して営業用繊維洗浄法に
おける厳しい条件に基づき、その際に使用されるプロテ
アーゼに対しては高い要求がなされる。高アルカリ性ｐ
Ｈ値における良好な堅牢性及び活性の他に、プロテアー
ゼは、低い濃度でできるかぎり長い時間営業用繊維洗浄
法の高い温度でその都度の洗浄工程に関して良好な洗浄
結果を生じるように、高い温度安定性を有さねばならな
い。更に、使用されるアルカリ性プロテアーゼは、営業
用繊維洗浄法で常用の洗剤含有物質、例えば界面活性
剤、漂白剤又は消毒作用を有する成分に対して可能な限
り安定であるべきである。従って営業用繊維洗浄法に好
適なアルカリプロテアーゼが常に必要とされている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の課題
は、営業用繊維洗浄法で使用するために好適なアルカリ
性プロテアーゼを提供することであった。

【０００５】

【課題を解決するための手段】さて、高い洗浄作用を有
する下記のアルカリ性バチルス−プロテアーゼを営業用
繊維洗浄法で使用することができることを見出した。従
って本発明の目的は、アルカリ性プロテアーゼを営業用
繊維洗浄法用の組成物中に使用することであり、その
際、 ａ）バチルス−菌株ＤＳＭ６８４５及び／又は ｂ）図１に記載のアミノ酸配列とは少なくとも１個のア
ミノ酸交換Ｑ１２Ｒ、Ｎ４２Ｒ、Ｎ７４Ｒ、Ｎ１１４
Ｒ、Ｎ１１５Ｒ、Ｑ１３５Ｒ、Ｍ２１６Ｑ、Ｎ２３７
Ｐ、Ｔ２４９Ｒにより相違しているアミノ酸配列を有す
るバチルス−菌株ＤＳＭ５４６６からのアルカリ性バチ
ルス−プロテアーゼの群から選択したアルカリ性プロテ
アーゼ少なくとも１種類を使用する。

【０００６】前記アルカリ性バチルス−プロテアーゼ
は、公知分子量を有する対照蛋白質とは対照的に、ＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミド−ゲル電子泳動法により測定し
て、２６０００〜２８０００ｇ／モルの範囲の分子量を
有する。その最適ｐＨは８〜１３．０の範囲であり、そ
の際、最適ｐＨとはプロテアーゼが最大蛋白質分解活性
を有するようなｐＨ範囲である。前記アルカリ性バチル
ス−プロテアーゼは良好なｐＨ安定性も有する。

【０００７】１９９１年１２月１６日に番号ＤＳＭ６８
４５で寄託された、バチルス株からのアルカリ性バチル
ス プロテアーゼは、この菌株により培養上澄みから得
られる。

【０００８】図１に記載のアミノ酸配列とは前記位置で
相違しているアミノ酸配列を有する、１９８９年７月２
８日にＤＳＭ５４６６で寄託されたバチルス−菌株から
のアルカリ性バチルス−プロテアーゼは、自体公知の方
法で、例えば欧州特許（ＥＰ−Ａ）第４１５２９６号明
細書に記載されているようにアミノ酸配列の点突然変異
により得られる。

【０００９】特に有利な変法では、下記特性： （１）作用：蛋白質及びペプチドの分解； （２）最適ｐＨ：約ｐＨ値９．５〜１３．０で、 （３）ｐＨ−安定性：ｐＨ値９．５〜１１．０でプロテ
アーゼは完全に安定であり、その際、「完全に安定」と
は少なくとも９０％の残反応性のことである； （４）最適温度：約６４℃； （５）温度−安定性：プロテアーゼを温度３０℃で１５
分間恒温維持することによって、プロテアーゼの活性は
実質的に損なわれない；４０℃で１５分間後にプロテア
ーゼの反応性は少なくとも７５％であるを有する菌株Ｄ
ＳＭ６８４５からのアルカリ性バチルス−プロテアーゼ
を使用する。

【００１０】更に有利な１態様では、図１に記載のアミ
ノ酸配列とは少なくとも１個のアミノ酸交換Ｑ１２Ｒ、
Ｎ４２Ｒ、Ｎ１１４Ｒ、Ｎ１１５Ｒ、Ｑ１３５Ｒ、Ｍ２
１６Ｑ、Ｎ２３７Ｐ、Ｔ２４９Ｒ、有利にはアミノ酸配
列Ｎ４２Ｒ／Ｎ１１４Ｒ／Ｎ１１５Ｒ又はＮ４２Ｒ／Ｎ
１１４／Ｍ２１６Ｑにより相違しているアミノ酸配列を
有する菌株ＤＳＭ５４６６からのアルカリ性バチルス−
プロテアーゼを使用する。ここで、数字はアミノ酸配列
の位置を表わす。アミノ酸は、文字コードで表わされる
が、その際、元のアミノ酸は位置記載の前に記載し、導
入されたアミノ酸は位置記載の後に記載されている。こ
のアミノ酸交換は、自体公知の方法で、例えば欧州特許
（ＥＰ−Ａ）第４１５２９６号明細書に記載されている
ようにアミノ酸配列の点突然変異により得ることができ
る。

【００１１】前記アルカリ性バチルス−プロテアーゼ
は、営業用洗濯で常用の条件、例えば高いｐＨ値、短い
洗濯時間及び高い洗浄温度下で、非常に良好な洗浄効率
を示す。前記プロテアーゼは、営業用繊維洗浄法で常用
の洗剤成分に対して意外にも高い安定性も示す。本発明
により、前記アルカリ性バチルス−プロテアーゼは、有
利に営業用大容量ドラム洗濯機中又は完全に連続的にか
又は工程別に作業する逆流−洗濯装置中に使用すること
ができる。その際、特に有利にはアルカリ性バチルス−
プロテアーゼをいわゆる多アルカリ溶液法、例えば予備
洗い−及び澄明洗浄工程から成る二槽浴法で予備洗い工
程の洗液に添加する。その際、予備洗いは営業用繊維洗
浄法で常用の条件、例えば温度３０〜７０℃で自体公知
の方法で、一般にこの洗浄工程で使用される洗浄剤内容
物質を用いて実施される。強力な蛋白質含有汚染の際に
は、例えば病院、大食堂又は精肉場からのひどく血液で
汚れた洗濯物の場合には、前記プロテアーゼを、場合に
より予備洗い工程の前の予備すすぎ工程で澄んだ冷水又
は回収された温水及びその他のこの目的のために常用の
洗浄剤内容物と一緒に使用することができ、良好な結果
をもたらす。もちろん、本発明により前記アルカリ性バ
チルス−プロテアーゼを全てのその他の営業用繊維洗浄
法で、例えば特定の繊維−及び汚染種類に合わせた営業
用繊維洗浄法で、例えば病院部門からの繊維の消毒洗浄
で使用することもできる。

【００１２】更に本発明は、 ａ）バチルス−菌株ＤＳＭ６８４５及び／又は ｂ）図１に記載のアミノ酸配列とは少なくとも１個のア
ミノ酸交換Ｑ１２Ｒ、Ｎ４２Ｒ、Ｎ７４Ｒ、Ｎ１１４
Ｒ、Ｎ１１５Ｒ、Ｑ１３５Ｒ、Ｍ２１６Ｑ、Ｎ２３７
Ｐ、Ｔ２４９Ｒにより相違しているアミノ酸配列を有す
るバチルス−菌株ＤＳＭ５４６６からのアルカリ性バチ
ルス−プロテアーゼ少なくとも１種類を含有する、営業
用繊維洗浄法用の組成物に関する。

【００１３】有利には、本発明による組成物は、既に前
記した特性により特徴付けられる、バチルス−菌株ＤＳ
Ｍ６８４５からのアルカリ性バチルス−プロテアーゼを
含有する。

【００１４】同じく有利な１態様では、本発明による組
成物は、図１に記載のアミノ酸配列とは少なくとも１個
のアミノ酸交換Ｑ１２Ｒ、Ｎ４２Ｒ、Ｎ７４Ｒ、Ｎ１１
４Ｒ、Ｎ１１５Ｒ、Ｑ１３５Ｒ、Ｍ２１６Ｑ、Ｎ２３７
Ｐ、Ｔ２４９Ｒ、特にミノ酸交換Ｎ４２Ｒ／Ｎ１１４Ｒ
／Ｎ１１５Ｒ又はＮ４２Ｒ／Ｎ１１４Ｒ／Ｍ２１６Ｑに
より相違しているアミノ酸配列を有する菌株ＤＳＭ５４
６６からのアルカリ性バチルス−プロテアーゼを含有す
る。

【００１５】有利には、本発明による組成物では、酵素
製剤１ｇ当り５００００〜１００００００ＤＵの酵素活
性を有するようなアルカリ性バチルス−プロテアーゼを
使用する。その際、“ＤＵ”とは、デルフト（Ｄｅｌｆ
ｔ）単位の酵素活性であり、その際、１０００ＤＵは、
２％（Ｗ／Ｗ）酵素溶液１ｍｌの容量でカゼインの分解
により吸光度差（光路１ｃｍ；２７５ｎｍ；盲検試料試
験に関して測定）０．４０００を生じる蛋白質分解活性
に相応する。その際、前記アルカリ性バチルス−プロテ
アーゼは、営業用繊維洗浄法で常用の組成物で単独でか
又は所望により相互に混合して、場合によりその他の営
業用部門で常用の洗浄剤プロテアーゼ又はその他の自体
常用の洗浄剤酵素、例えばアミラーゼ、リパーゼ、ペク
チナーゼ、ヌクリアーゼ、オキシドレダクターゼ等と混
合して使用することができる。全組成物の乾燥物質に関
して、前記バチルス−プロテアーゼは、本発明による洗
浄剤組成物中で有利には０．１〜５重量％、特に０．２
〜２．０重量％である。

【００１６】本発明による組成物は、営業用繊維洗浄法
で常用の単独洗剤、単独洗剤並びに予備洗い剤及び予備
すすぎ剤の形で存在することができる。その際、洗剤の
タイプに応じて、当業者に自体常用の洗浄剤内容物、例
えば界面活性剤、漂白剤、ビルダー物質（骨格物質）、
洗浄助剤化学薬品、光学増白剤並びにその他の常用の成
分、例えばソーダ、メタ珪酸塩、オルト珪酸塩又は三燐
酸ナトリウムを自体常用の量で含有することができる。
考えられる洗剤内容物質には、更に例えば補強剤、酵素
安定化剤、汚れキャリアー及び／又は相容化剤、錯化剤
及びキレート形成剤、石鹸泡調整剤及び添加物、例えば
腐蝕防止剤、帯電防止剤、芳香剤、殺菌剤、漂白剤活性
剤、過酸漂白剤及び灰色防止剤が挙げられる。

【００１７】有利には、本発明による洗浄剤組成物は、
営業用繊維洗浄法で温度範囲３０〜７０℃でいわゆる多
アルカリ法、例えば予備洗浄−及び澄明洗浄工程から成
る二槽浴法で使用される予備洗浄剤である。前記アルカ
リ性バチルス−プロテアーゼの他に、本発明による予備
洗い洗浄剤は、この目的のために営業用部門で常用の内
容物質、例えば、非イオン界面活性剤、燐酸塩、炭酸
塩、珪酸塩、場合により過硼酸塩及び／又は漂白活性
剤、灰色化防止剤、ポリカルボキシレート、光学増白剤
並びに場合によりその他の緩衝剤及び助剤を含有するこ
とができる。付加的に前記アルカリ性バチルス−プロテ
アーゼを前記量で添加した、市販の洗浄剤組成物を使用
することもできる。その際、所望により、この市販の組
成物は酸素系の漂白剤を含有することもできる。この種
の市販の営業分野用の洗浄剤組成物の例は、テン−カラ
ー（ＴＥＮ−ＣＯＬＯＲ：登録商標）又はテナックス
コンク（ＴＥＮＡＸ ＣＯＮＣ．：登録商標）である。

【００１８】本発明による洗浄剤組成物は、自体公知の
方法で、粉末形、例えば顆粒、小球又はペレットの形
で、場合により表面被覆を具備して製造することができ
る。その良好な安定性から、前記バチルス−プロテアー
ゼは液体製剤中で使用することができる。

【００１９】営業用繊維洗浄法で常用の条件で、例えば
高アルカリ性ｐＨ値、例えば１１．０以上のｐＨ値並び
に７０℃までの高い洗浄温度で、前記アルカリ性バチル
ス−プロテアーゼは意外にも良好な洗浄特性を有する。
このことは、常用の家事洗濯と比較して、営業用洗濯で
使用される完全連続的操業の逆流洗濯装置によれば多く
の場合に比較的短い洗浄時間しか使用できないことか
ら、なおさら意外である。その際高い温度安定性の他
に、前記アルカリ性バチルス−プロテアーゼは営業用洗
浄剤で常用の内容物質の存在で高い酵素安定性を示す。
例えば病院関係の営業用殺菌洗剤で使用される様な営業
用部門で常用の漂白剤に対しても、特に過硼酸塩又は過
酸化水素系の酸素漂白剤濃縮物に対しても、前記アルカ
リ性バチルス−プロテアーゼは、本発明による使用に際
しては安定である。

【００２０】次に実施例につき本発明を詳説するが、本
発明はこれにのみ限定されるものではない。

【００２１】図面の説明： 図１：バチルス アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ）ＨＡｌ（ＤＳＭ５４６
６）からのアルカリ性プロテアーゼのアミノ酸配列（Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ１）の配列プロトコル 図３：バチルス ｓｐ．ＭＦ１２（ＤＳＭ６８４５）か
らのプロテアーゼの最適温度 図４：バチルス ｓｐ．ＭＦ１２（ＤＳＭ６８４５）か
らのプロテアーゼの温度−安定性 図５：バチルス ｓｐ．ＭＦ１２（ＤＳＭ６８４５）か
らのプロテアーゼの最適ｐＨ 図６：バチルス ｓｐ．ＭＦ１２（ＤＳＭ６８４５）か
らのプロテアーゼのｐＨ−安定性

【００２２】

【実施例】図１に記載のバチルス アルカロフィルスＨ
Ａｌ（ＤＳＭ５４６６）からのアルカリ性プロテアーゼ
のアミノ酸配列の相応するヌクレオチド配列の測定によ
る順序付けは、欧州特許（ＥＰ−Ａ）第２４１５２９６
号明細書の例１〜４に記載されている。

【００２３】ＤＳＭ６８４５の番号で、バチルス ｓ
ｐ．ＭＦ１２−菌株として公知の菌株は、１９９１年１
２月１６日にドイツ微生物寄託局（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｎ
Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉ
ｓｍｅｎ）に寄託された。ＤＳＭ５４６６の番号で、ア
ルカロフィルス ＨＡｌとして公知のバチルスアルカフ
ィルス−菌株は、１９８９年７月２８日にドイツ微生物
寄託局に寄託された。

【００２４】例１： 突然変異によるアミノ酸配列の変えられたアルカリ性プ
ロテアーゼの製造 バチルス アルカロフィルスＨＡｌ（ＤＳＭ５４６６）
の図１に記載のアミノ酸配列とは少なくとも１個のアミ
ノ酸交換Ｑ１２Ｒ、Ｎ４２Ｒ、Ｎ１１４Ｒ、Ｎ１１５
Ｒ、Ｑ１３５Ｒ、Ｍ２１６Ｑ、Ｎ２３７Ｐ、Ｔ２４９Ｒ
により相違している、アルカリ性プロテアーゼの製造
は、自体公知の方法で、相応するプロテアーゼ原のＤＮ
Ａ−部分配列の特定の突然変異生成により実施した。そ
の際、数字を用いて図１に記載のアミノ酸配列の相応す
る位置を表わし、その際、自体公知の文字コードで元の
アミノ酸は位置記載の前に記載し、導入されたアミノ酸
は位置記載の後に記載されている。前記突然変異に関し
ては、特定の突然変異生成の方法が欧州特許（ＥＰ−
Ａ）第４１５２９６号明細書の実施例５〜１８に記載さ
れている。４２、１１４、２１６及び２４９の位置にお
けるアミノ酸交換に関しては、付加的になおドイツ特許
第４３０４１６１号明細書を参照にされたい。

【００２５】原則的に、この方法は下記の自体公知の方
法工程を含む：天然分離体バチルス アルカロフィルス
ＨＡ１（ＤＳＭ５４６６）から、サイト（Ｓａｉｔｏ）
その他の方法（１９６３年、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ． Ａｃｔａ７２巻、６１９〜６２９頁）によ
り、染色体ＤＮＡを単離し、制限エンドヌクレアーゼＳ
ａｕ３Ａを用いて部分加水分解した。制限フラグメント
を電気泳動により分離し、３〜８キロ塩基の大きさのフ
ラグメントを単離した。単離し、大きさを選別したバチ
ルス アルカロフィルスＨＡ１からのＤＮＡ−フラグメ
ントを、自体公知のプラスミドｐＵＢ１１０のベクター
ＤＮＡとイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で自体公知
の方法で新たに結合させた。イン・ビトロで新たに結合
された得られたＤＮＡを用いて、バチルス スブチリス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＤ２２４の
菌株のプロトプラスト（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔ
ｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ１Ａ４６）を、Ｓ．チ
ャン（Ｃｈａｎｇ）及びＮ．コーエン（Ｃｏｈｅｎ）
（１９７９年、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６８
巻、１１１〜１１５頁）記載の方法により形質転換し
た。形質転換生成物をプレート上でネオマイシンで淘汰
した。クローンからプラスミドＤＮＡをマニアチス（Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ）その他（マニアチスその他＝Ｔ．Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｓｃｈ、Ｊ．Ｓｏｍｂｒ
ｏｃｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８
２）の教本により単離した。このプラスミド中に含有さ
れるＢ．アルカロフィルス−ＤＮＡからのフラグメント
は、４．１ＫＢの大きさを有し、バチルス アルカロフ
ィルスＨＡ１（ＤＳＭ５４６６）からの高アルカリ性プ
ロテアーゼに関する。完全なＤＮＡ配列を有した（欧州
特許第４１５２９６号明細書の例１及び２参照）。

【００２６】バチルス アルカロフィルスＨＡ１（ＤＳ
Ｍ５４６６）からの高アルカリ性プロテアーゼに関す
る。完全なＤＮＡ配列を有するプラスミドをＡｖａＩで
切断した。突出端部を自体公知の方法（Ｍａｎｉａｔｉ
ｓその他、１１４頁）で充填してＤＮＡ−２本鎖にし
た。引き続くこのＤＮＡのＸｂａＩによる制限の後、Ｎ
−末端１．６１８ＢＰを有するフラグメントを単離し、
自体公知の方法でベクターｐＢＳにクローニングした。
得られたベクターは、図１に記載のアミノ酸配列に関し
てコードするＤＮＡのＮ−末端を有した（欧州特許第４
１５２９６号明細書の例５参照）。

【００２７】同様に、６５８ＢＰを有する相応するプロ
テアーゼ−ＤＮＡのＣ−末端に関してコードするフラグ
メントを有するベクターを製造した。このために、完全
ＤＮＡ−配列を有するプラスミドを、制限エンドヌクレ
アーゼＸｂａＩ及びＡｓｐ７１８で切断し、公知ベクタ
ーｐＢＳの相応する切断部にクローニングした（欧州特
許第４１５２９６号明細書の例７参照）。

【００２８】所望の突然変異は、Ｃ−末端又はＮ−末端
を有するＤＮＡ−部分配列で、クンケル（Ｋｕｎｋｅ
ｌ）、Ｔ．Ａ．（１９８５年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ第８２巻、４８８〜４９２頁）
に記載の“一次拡大（ｐｒｉｍｅｒ ｅｘｔｅｎｔｉｏ
ｎ）”法を用いて実施した。このために、相応するベク
ターを、先ず自体公知の方法で、付加的にヘルパーファ
ージＭ１３Ｋ０７（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ、カリフォルニア州リッチモンドによる）で接
種された、二つのベクターの一つで形質転換されたＥ．
コリ（ｃｏｌｉ）ＣＪ２３６−細菌と一緒に培養するこ
とによって、ウラシル化１本鎖類似体に変えた。この細
菌Ｅ．コリＣＪ２３６は、自体公知のウラシル−Ｎ−グ
リコシラーゼ−マンゲル突然変異体であり、これはベク
ターの複製でチミジンの代わりにヌクレオチドウラシル
をベクターのＤＮＡ−配列に組み込む。ウラシル化され
たベクターは、自体公知の方法で、有利に突然変異生成
のイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）−反応に使用する
ことができる。それというのも、この反応の後に、突然
変異されたＤＮＡ−鎖を生成するマトリックスとして働
くウラシル含有ＤＮＡ−１本鎖は、ウラシル−Ｎ−グリ
コシラーゼで処理することによって除去することができ
るからである。前記ヘルパーファージの使用は、形成さ
れ、ウラシル化された１本鎖ベクターＤＮＡ用の被覆蛋
白質（Ｈｕｅｌｌｐｒｏｔｅｉｎ）を合成するために必
要であった。被覆されたウラシル化された１本鎖−ベク
ターＤＮＡは、形質転換された宿主微生物Ｅ．コリＣＪ
２３６から排除され、引き続き培地から単離された。

【００２９】Ｃ−末端又はＮ−末端の単離された、ウラ
シル化されたＤＮＡ−単一鎖ベクターを、突然変異部を
含有し、同時に次に突然変異で補充して完全なＤＮＡ−
２本鎖にするためのプライマーとして働く合成オリゴヌ
クレオチドと交雑させた。その際使用される合成オリゴ
ヌクレオチドは、自体公知の方法で、ビューケイジ（Ｂ
ｅａｕｃａｇｅ）、Ｓ．Ｌ．及びカルサーズ（Ｃａｒｕ
ｔｈｅｒｓ）Ｍ．Ｈ．の方法（１９８１年、Ｔｅｔｒａ
ｈｅｄｒｏｎ ｌｅｔｔｅｒｓ第２２巻、１８５９〜１
８６２頁）により製造した。第二のＤＮＡ鎖の合成は、
自体公知の方法でＴ４−ＤＮＡ−ポリメラーゼを用い
て、次いでＴ４−ＤＮＡ−リガーゼを用いるリゲーショ
ン（Ｌｉｇａｔｉｏｎ）により実施した（Ｋｕｎｋｅｌ
その他、１９８７年、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙ
ｍｏｌ．第１５４巻、３６７〜３８２頁）。生成された
２本鎖−ベクター−ＤＮＡをＥ．コリＭＣ１０６１に形
質転換させ、この突然変異されたベクターを、合成オリ
ゴヌクレオチドを用いて導入されたか又は除去された相
応する統一（ｕｎｉｔａｅｒｅｎ）制限エンドヌクレア
ーゼ−認識位置の検査により同定した。

【００３０】例えばプロテアーゼ−ＤＮＡのＮ−末端部
又はＣ−末端部のいずれかに二つの突然変異を得するた
めに、最初の突然変異導入後に同様にして第二の突然変
異を導入するための更なる合成オリゴヌクレオチドの使
用下にこの方法を繰り返した。

【００３１】突然変異生成により得られたＤＮＡ−配列
を制限エンドヌクレアーゼで切断し、ＤＮＡ−配列の相
応するその他の端部並びに表現に必要な全エレメントを
有するベクター−ＤＮＡと結合させることによって、プ
ロテアーゼ−ＤＮＡ−配列のＣ−末端部又はＮ−末端部
に突然変異を有する表現ベクターを製造した。得られた
ベクターは、相応する突然変異されたムテアーゼの表現
用の好適なレーザラスター（Ｌｅｓｅｒａｓｔｅｒ）を
有する完全な表現ベクターであった。この表現ベクター
の製造は、欧州特許第４１５２９６号明細書の実施例１
６に詳説されている。次の突然変異のために表現ベクタ
ーを製造した： ＤＳＭ ５４６６ Ｍｕｔ． Ｎ１１４Ｒ／Ｍ２１６Ｑ ＤＳＭ ５４６６ Ｍｕｔ． Ｎ１１５Ｒ／Ｑ１３５Ｒ ＤＳＭ ５４６６ Ｍｕｔ． Ｎ４２Ｒ／Ｎ１１４Ｒ／
Ｍ２１６Ｑ ＤＳＭ ５４６６ Ｍｕｔ． Ｎ４２Ｒ／Ｎ１１４Ｑ／
Ｎ１１５Ｑ ＤＳＭ ５４６６ Ｍｕｔ． Ｎ１１４Ｒ／Ｎ２３７Ｐ ＤＳＭ ５４６６ Ｍｕｔ． Ｎ４２Ｒ／Ｎ１１４Ｒ ＤＳＭ ５４６６ Ｍｕｔ． Ｑ１２Ｒ／Ｎ４２Ｒ．Ｎ
１１４Ｒ ＤＳＭ ５４６６ Ｍｕｔ． Ｎ１１４Ｒ／Ｎ２３７Ｐ
／Ｔ２４９Ｒ ＤＳＭ ５４６６ Ｍｕｔ． Ｑ１２Ｒ／Ｎ４２Ｒ／Ｎ
１１４Ｒ 突然変異された高アルカリ性プロテアーゼは、Ｂ．スブ
チリスＢＤ２２４を、各々前記の表現ベクターの一つを
用いて自体公知の方法で形質転換することによって製造
した。この形質転換された菌株の培養上澄み液から、突
然変異されたプロテアーゼを自体公知の方法により単離
した。突然変異されたプロテアーゼを単離するための詳
細な説明は、欧州特許第４１５２９６号明細書の実施例
１６及び１８に記載されている。

【００３２】突然変異によりアミノ配列で変えられた、
バチルス アルカロフィルスＨＡ１（ＤＳＭ５４６６）
を基礎とするアルカリ性プロテアーゼを、実施例３に記
載の洗浄試験で使用した。

【００３３】例２： バチルスｓｐ．ＭＦ１２ ＤＳＭ６８４５からのアルカ
リ性プロテアーゼの単離 ３個の栓（Ｓｃｌｃｉｋａｎｅｎ）を有する内容５００
ｍｌのエルレンマイヤ−フラスコ中のｐＨ９．５のルリ
ア−ブイヨン（Ｌｕｒｉａ−Ｂｒｏｔｈ）（酵母抽出物
１０ｇ、トリプトン５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ及び炭酸塩緩衝
剤５０ｍｌに蒸留水で全量１０００ｍｌ）５０ｍｌに、
バチルス ｓｐ．ＭＦ１２ＤＳＭ６８４５の菌株の単一
コロニー（Ｐ８Ａ−寒天プレート上で培養）を接種し、
３７℃及び２４０Ｕｐｍで１６時間培養した。この培養
物２．５ｍｌで、３個の栓を有する内容５００ｍｌのエ
ルレンマイヤ−フラスコ中の主培地［大豆２％、澱粉５
％、トウモロコシ膨化水（Ｍａｉｓｑｕｅｌｌｗａｓｓ
ｅｒ）１％、炭酸塩緩衝剤５０ｍｌ（Ｎａ₂ＣＯ₃４．２
％）］５０ｍｌに接種し、３７℃及び２４０Ｕｐｍで４
８時間培養した。

【００３４】プロテアーゼの活性をデルフト単位（Ｄ
Ｕ）で測定した。１０００ＤＵは、２％（ｗ／ｗ）の酵
素溶液１ｍｌの容量でカゼインの分解により０．４００
０の吸光差（光路１ｃｍ；２７５ｎｍ；盲検試料試験に
対して測定）を生じる蛋白質分解活性である。

【００３５】４８時間後に、２７０００×ｇで１５分間
遠心分離により得られた培養上澄み中の蛋白質分解活性
は５０００ＤＵ／ｍｌであった。

【００３６】培養上澄み中に含有されるプロテアーゼの
最適温度を４０〜７２℃の範囲で測定した。結果を第１
表及び図３に記載する。

【００３７】バチルス ｓｐ．ＭＦ１２ ＤＳＭ６８４
５からのプロテアーゼの最適温度は６４℃である。

【００３８】

【表１】

【００３９】温度安定性を測定するために、プロテアー
ゼ含有上澄みを１５分間異なる温度で培養し、引き続き
反応性を測定した。結果を第２表及び図４に記載する。

【００４０】バチルス ｓｐ．ＭＦ１２ ＤＳＭ６８４
５からのプロテアーゼは３１℃までで安定（残活性＞９
０％）であり、５０℃で１５分間培養した後になお残活
性５８％を示す。

【００４１】

【表２】

【００４２】バチルス ｓｐ．ＭＦ１２ ＤＳＭ６８４
５からのプロテアーゼの最適ｐＨを測定するために、活
性を異なるｐＨ値で測定した。ｐＨ値を調整するため
に、ｐＨ範囲５．０〜７．０では燐酸塩緩衝剤（０．１
Ｍ）、ｐＨ範囲７．０〜９．０ではトリス−ＨＣｌ緩衝
剤（０．１Ｍ）及びｐＨ範囲９．０〜１３．０ではグリ
シン−ＮａＯＨ−緩衝剤（０．１Ｍ）を使用した。活性
測定の値を図５に記載する。

【００４３】バチルス ｓｐ．ＭＦ１２ ＤＳＭ６８４
５からのアルカリ性プロテアーゼの最適ｐＨは、約ｐＨ
１２である。ｐＨ１３で活性はなお＞９０％である。

【００４４】ｐＨ−安定性を測定するために、バチルス
ｓｐ．ＭＦ１２ ＤＳＭ６８４５からのプロテアーゼ
を種々異なるｐＨ値の緩衝剤中で４℃で２４時間培養し
た。引き続きプロテアーゼの残活性を測定した。ｐＨ範
囲５〜７．１では燐酸塩緩衝剤（０．１Ｍ）を、ｐＨ範
囲７．５〜９ではトリス−ＨＣｌ緩衝剤［トリス（ヒド
ロキシメチル）アミノメタン−緩衝剤］（０．１Ｍ）
を、かつｐＨ範囲９〜１２．１ではグリシン／水酸化ナ
トリウム−緩衝剤（０．１Ｍ）を使用した。結果を図６
に記載する。

【００４５】バチルス ｓｐ．ＭＦ１２ ＤＳＭ６８４
５からのアルカリ性プロテアーゼは、全てのｐＨ範囲で
２４時間培養後少なくとも７０％の残活性をなお有し、
約ｐＨ１１で完全に安定である。

【００４６】例３： 営業用繊維洗浄法で常用の条件下における洗浄試験 洗浄試験を汚染試験織布を用いて営業用方法で常用の条
件下で実施した。試験織布としては、血液、牛乳及び墨
で汚染したポリエステル−木綿−混合繊維（ＥＭＰＡ１
１７、スイス、セイントガレン在のスイス連邦材料試験
研究所から取り寄せた）、卵黄及び墨で汚染したポリエ
ステル−木綿−混合繊維（ＥＹ−ＰＣ、独自に製造）並
びに牛乳及び墨で汚染したポリエステル−木綿−混合繊
維（Ｍ−ＰＣ、独自に製造）を使用した。ゼルテックス
ポリカラー（ＺｅｌｌｔｅｘＰｏｌｙｃｏｌｏｒ）型
の実験用洗濯機で洗浄したが、その際、洗剤基礎調製物
として営業用分野で常用の市販名テン カラー及びテナ
ックス コンク（製造会社：Ｆｉｒｍａ Ｊ．Ｐ．Ｈａ
ａｓ／Ｓｔｅｉｎａｕ）なる名称で入手可能な予備洗い
洗浄剤を使用した。洗浄は温度範囲１５〜６０℃で４５
分間（２℃／分；半分の時間である２２．５分間６０℃
で）又は温度範囲１５〜６５℃で２５分間（５℃／分；
半分の時間である１５分間６５℃で）実施した。水硬度
は１５゜ｄＨであり；酵素濃度は洗浄液１ｌ当り純粋な
プロテアーゼ０．７１ｍｇであった。酵素含有洗剤溶液
は、水浴に適切な温度プログラムに関して制御された回
転試験容器室中で試験織布に作用した。この洗浄工程後
に、試験織布を脱塩水で２回すすぎ、引き続きアイロン
をかけた。

【００４７】プロテアーゼの洗浄効率は、洗濯済み試験
織布の反射率をレミッションスホトメーターを用いてで
測定した。同様に、洗剤基礎調物のみで洗濯した試験織
布の反射率を測定した。これら二つの反射率の差が、い
わゆるデルタＲ値（Ｄｅｌｔａ Ｒ−Ｗｅｒｔ）として
各プロテアーゼの洗浄効率の尺度である。公知技術のプ
ロテアーゼと比較して、全ての洗浄試験を同様に同一条
件下で市販名オプチクリーン（Ｏｐｔｉｃｌｅａｎ）な
る名称で入手されるプロテアーゼに関して実施した。

【００４８】第３表は、市販名テナックス コンクとし
て市販されているような、営業用繊維洗浄試験用の漂白
剤不含の洗剤調製物を有する本発明により使用したプロ
テアーゼの洗浄効率を表わす。

【００４９】

【表３】

【００５０】第４表は、市販名テン−カラーとして市販
されているような、営業用繊維洗浄試験用の、酸素系
（過酸化物）漂白剤を含有する、洗剤調製物を有する本
発明により使用したプロテアーゼの洗浄効率を表わす。

【００５１】

【表４】

【００５２】本発明により使用されるプロテアーゼの高
い反射値は、営業用繊維洗浄法で常用の条件（高アルカ
リ性ｐＨ値、高イオン温度における長い保持時間）下
で、蛋白質汚染織布に対する高い洗浄効率を裏付ける。

【００５３】試験織布ＥＭ−ＰＡ１１７に対する洗浄作
用の他に付加的に、卵黄−墨で汚染した試験織布ＥＹ−
ＰＣ及び牛乳−墨で汚染したＭ−ＰＣを用いる洗浄試験
も実施した。更に洗浄条件を加熱速度５℃／分及び６５
℃で１５分間の保持時間にして厳しくした。これらの洗
浄試験でも営業用繊維洗浄試験用の漂白剤含有洗浄剤調
製物テン−カラーを使用した。

【００５４】

【表５】

【００５５】第３表〜第５表から、本発明により使用さ
れるプロテアーゼが、種々の蛋白質汚染物質で汚染され
た種々の織布に対して、非常に高い洗浄効率を有するこ
とが明かである。その際、洗浄液の高アルカリ性環境、
高い洗浄温度並びに漂白剤によって酵素活性が損なわれ
ることは事実上確認されなかった。その際２５分間のみ
の短い洗浄時間では、極めて良好な洗浄効率が確認され
る。従ってこれらの結果は、前記プロテアーゼが営業用
繊維洗浄法に非常に適することを示している。

【図面の簡単な説明】

【図１】バチルス アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ）ＨＡｌ（ＤＳＭ５４６
６）からのアルカリ性プロテアーゼのアミノ酸配列（Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ１）のプロトコル。

【図２】図１の続き。

【図３】バチルス ｓｐ．ＭＦ１２（ＤＳＭ６８４５）
からのプロテアーゼの最適温度を表わす図。

【図４】バチルス ｓｐ．ＭＦ１２（ＤＳＭ６８４５）
からのプロテアーゼの温度−安定性を表わす図。

【図５】バチルス ｓｐ．ＭＦ１２（ＤＳＭ６８４５）
からのプロテアーゼの最適ｐＨを表わす図。

【図６】バチルス ｓｐ．ＭＦ１２（ＤＳＭ６８４５）
からのプロテアーゼのｐＨ−安定性を表わす図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アンドレ クリッペ ベルギー国 ブリュッセル リュ ジェネ ラル ビアビュイク 24 アペペ デ２ (72)発明者 ゲルハルト コニーツィナー−ヤンダ ドイツ連邦共和国 パテンゼン シェーネ ベルガー シュトラーセ 23

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 営業用繊維洗浄法において、 ａ）バチルス−菌株ＤＳＭ６８４５及び／又は ｂ）図１に記載のアミノ酸配列とは少なくとも１個のア
   ミノ酸交換Ｑ１２Ｒ、Ｎ４２Ｒ、Ｎ７４Ｒ、Ｎ１１４
   Ｒ、Ｎ１１５Ｒ、Ｑ１３５Ｒ、Ｍ２１６Ｑ、Ｎ２３７
   Ｐ、Ｔ２４９Ｒにより相違しているアミノ酸配列を有す
   るバチルス−菌株ＤＳＭ５４６６からのアルカリ性バチ
   ルス−プロテアーゼの群から選択したアルカリ性プロテ
   アーゼ少なくとも１種類を使用することを特徴とする、
   営業用繊維洗浄法。
2. 【請求項２】 下記特性： （１）作用：蛋白質及びペプチドの分解； （２）最適ｐＨ：約ｐＨ値８．５〜１３．０、 （３）ｐＨ−安定性：ｐＨ値９．５〜１１．０でプロテ
   アーゼはほぼ完全に安定である； （４）最適温度：約６４℃； （５）温度−安定性：プロテアーゼを温度３０℃で１５
   分間恒温維持することによって、プロテアーゼの活性は
   実質的に損なわれない；４０℃で１５分間後にプロテア
   ーゼの反応性は少なくとも７５％であるを有する菌株Ｄ
   ＳＭ６８４５からのアルカリ性バチルス−プロテアーゼ
   を使用することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 図１に記載のアミノ酸配列とは少なくと
   も１個のアミノ酸交換Ｑ１２Ｒ、Ｎ４２Ｒ、Ｎ１１４
   Ｒ、Ｎ１１５Ｒ、Ｑ１３５Ｒ、Ｍ２１６Ｑ、Ｎ２３７
   Ｐ、Ｔ２４９Ｒにより相違しているアミノ酸配列を有す
   る菌株ＤＳＭ５４６６からのアルカリ性バチルス−プロ
   テアーゼを使用することを特徴とする、請求項１に記載
   の方法。
4. 【請求項４】 図１に記載のアミノ酸配列とは少なくと
   も１個のアミノ酸交換Ｎ４２Ｒ／Ｎ１１４Ｒ／Ｎ１１５
   Ｒ又はＮ４２Ｒ／Ｎ１１４／Ｍ２１６Ｑ、により相違し
   ているアミノ酸配列を有する菌株ＤＳＭ５４６６から成
   るアルカリ性バチルス−プロテアーゼを使用することを
   特徴とする、請求項３に記載の方法。
5. 【請求項５】ａ）バチルス−菌株ＤＳＭ６８４５及び／
   又は ｂ）図１に記載のアミノ酸配列とは少なくとも１個のア
   ミノ酸交換Ｑ１２Ｒ、Ｎ４２Ｒ、Ｎ７４Ｒ、Ｎ１１４
   Ｒ、Ｎ１１５Ｒ、Ｑ１３５Ｒ、Ｍ２１６Ｑ、Ｎ２３７
   Ｐ、Ｔ２４９Ｒにより相違しているアミノ酸配列を有す
   るバチルス−菌株ＤＳＭ５４６６からのアルカリ性バチ
   ルス−プロテアーゼの群から選択したアルカリ性プロテ
   アーゼ少なくとも１種類を含有することを特徴とする、
   営業用繊維洗浄法用の組成物。
6. 【請求項６】 多アルカリ溶液法、特に２槽浴法に好適
   な予備洗い洗浄剤であることを特徴とする、請求項５に
   記載の組成物。
7. 【請求項７】 酵素製剤１ｇ当り５００００〜１０００
   ０００ＤＵの活性を有するアルカリ性バチルス−プロテ
   アーゼを含有することを特徴とする、請求項５又は６の
   いずれか１項に記載の組成物。
8. 【請求項８】 ０．１〜５．０重量％の量のアルカリ性
   バチルス−プロテアーゼを含有することを特徴とする、
   請求項７に記載の組成物。
9. 【請求項９】 酸素漂白剤を含有することを特徴とす
   る、請求項５から８までのいずれか１項に記載の組成
   物。