ES2232822T3 - Dna que codifica los canales de cloruro de apertura regulada por glutamato. - Google Patents
Dna que codifica los canales de cloruro de apertura regulada por glutamato.Info
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Abstract
SE HAN CLONADO Y CARACTERIZADO DNAS QUE CODIFICAN PARA CANALES DE GLUTAMATO SENSIBLES A AVERMECTINA Y GLUTAMATO. LAS SUBUNIDADES INDIVIDUALES ALFA Y BETA, SON CAPACES DE FORMAR CANALES HOMOMERICOS Y HETEROMERICOS, QUE SE ABREN SELECTIVAMENTE, BIEN CON AVERMECTINA, BIEN CON GLUTAMATO. DICHOS CDNAS HAN SIDO EXPRESADOS EN CELULAS HUESPED RECOMBINANTES, QUE PRODUCEN PROTEINA RECOMBINANTE ACTIVA. LA PROTEINA RECOMBINANTE SE PURIFICA TAMBIEN A PARTIR DE LAS CELULAS HUESPED RECOMBINANTES. ADEMAS, LAS CELULAS HUESPED RECOMBINANTES SE UTILIZAN PARA ESTABLECER UN METODO DE IDENTIFICACION DE MODULADORES DE LA ACTIVIDAD RECEPTORA. LOS MODULADORES DE RECEPTORES SON UTILES COMO INSECTICIDAS Y COMO AGENTES ANTIHELMINTICOS.
Description
DNA que codifica los canales de cloruro de
apertura regulada por glutamato.
Las avermectinas son una familia de lactonas
macrocíclicas originalmente aisladas del actinomiceto
Streptomyces avermitilis. El derivado semisintético de la
avermectina, la ivermectina
(22,23-dihidro-avermectin B_{1a}),
es usado en todo el mundo para tratar pestes de insectos y helmintos
parásitos de hombres y animales. Descubiertas hace unos 15 años, las
avermectinas se mantienen como los endectocidas de amplio espectro
más potentes, mostrando baja toxicidad en el anfitrión. Las
avermectinas exhiben una interacción esencialmente irreversible con
sitios de alta afinidad en membranas de nemátodos [Schaeffer, J.M.
& Haines, H.W. Biochem. Pharm. 38,
2329-2338 (1989); Cully, D.F. & Paress P.S.,
Molecular Pharm. 40:326-332 (1991)] y de
insectos [Rohrer, S.P., Meinke, P.T., Hayes, E.C., Mrozik, H. &
Schaeffer, J.M. Proc. Natl. Acad. Sci, 89,
4168-4172 (1992)], e inducen un incremento de la
permeabilidad del cloruro en membranas de nemátodos [Martin, R.J.
& Pennington, A.J. Br. J. Pharmacol. 98,
747-756 (1989)], de artrópodos [Scott, R.H. &
Duce, I.R. Pestic. Sci. 16, 599-604 (1985)],
[Duce I.R. & Scott, R.H. Brit. J. Pharmacol. 85,
395-401 (1985)] y de crustáceos [Zufall, F., Franke,
C. & Hatt, H. J. Exp. Biol. 142, 191-205
(1989)]. El ligando natural de los canales de cloruro sensitivos a
las avermectinas se mantiene poco claro [Turner M.J. &
Schaeffer, J.M. in Ivermectin and Abamectin (eds. Campbell,
W.C.) 73-88 (Springer-Verlag, New
York, 1989)]. Los canales de apertura por glutamato, o los
receptores-H, han sido identificados en los nervios
y músculos de artrópodos [Linge, C. & Marder, E. Brain Res.
212, 481-488 (1981)], [Horseman, B.G., Seymour,
C., Bermudez, I. & Beadle, D.J. Neurosci. Lett. 85,
65-70 (1988)], [Wafford, K.A. & Sattelle, D.B.
J. Exp. Bio. 144, 499-462 (1989)], [Lea, T.J.
& Usherwood, P.N.R. Comp. Gen. Parmacol. 4,
333-350 (1973)], [Cully-Candy, S.G.
J. Physiol. 255, 449-464 (1976)]. Se ha
propuesto que las avermectinas activan los canales de cloruro
controlados por glutamato, en músculos de langosta [Scott, R.H.
& Duce, I.R. Pestic, Sci. 16, 599-604
(1985)].
El nemátodo del suelo Caenorhabditis
elegans es muy sensible a las avermectinas y es usado en un
modelo in vitro para examinar la eficacia de distintos
compuestos antihelmínticos [Schaeffer J.M. & Haines, H.W.
Biochem. Pharm. 38, 2329-2338 (1989)].
Oocitos de Xenopus laevis inyectados con ARN poli
(A)^{+} de C. elegans, expresan canales de cloruro
sensibles a las avermectinas [Arena, J.P., Liu, K.K., Paress, P.S.
& Cully, D.F. Mol. Pharmacol. 40, 368-374
(1991)]. Se ha establecido que este canal es también sensible al
glutamato [Arena, J.P., Liu, K.K., Paress, P.S., Schaeffer, J.M.
& Cully, D.F. Mol. Brain Res. 15, 339-348
(1992)].
Similares a los receptores-H de
los músculos de la langosta, la corriente sensible al glutamato y a
las avermectinas, es activada por ibotenato, y bloqueada con baja
afinidad por la picrotoxina [Scott, R.H. & Duce, I.R. Pestic.
Sci. 16, 599-604 (1985)], [Lea, T.J. &
Usherwood, P.N.R., Comp. Gen. Pharmacol. 4,
333-350 (1973)], [Cull-Candy, S.G.
J. Physiol. 255, 449-464 (1976)], [Arena,
J.P., Liu, K.K., Paress, P.S., Schaeffer, J.M. & Cully, D.F.
Mol. Brain Res. 15, 339-348 (1992)].
Se ha clonado y caracterizado un objetivo de la
acción de las avermectinas en invertebrados, y esto representa una
novedosa clase de canales de cloruro de apertura controlada por
ligandos. Usando un sistema de expresión recombinante, se han
aislado dos moléculas de ADN funcional que codifican a los canales
de cloruro sensibles al glutamato y a la avermectina, en
invertebrados. Se han revelado las propiedades estructurales y
electrofisiológicas de estas proteínas, así como sus secuencias de
aminoácidos y nucleótidos. Las proteínas recombinantes son muy
útiles para identificar los moduladores del canal. Los moduladores
identificados en este proceso son muy útiles como agentes
terapéuticos, como insecticidas y como antihelmínticos.
Figura 1 - La secuencia de nucleótidos de
GluCl\alpha.
Figura 2 - La secuencia de nucleótidos de
GluCl\beta.
Figura 3 - La secuencia de aminoácidos de
GluCl\alpha.
Figura 4 - La secuencia de aminoácidos de
GluCl\beta.
Figura 5 - Propiedades electrofisiológicas de las
corrientes sensibles al glutamato y al IVMPO_{4}, en oocitos de
Xenopus.
Figura 6 - Permeabilidad y dependencia del
voltaje del GluCl\alpha y el GluCl\beta.
Figura 7 - Modulación de la corriente sensible al
glutamato, por el IVMPO_{4}.
Figura 8 - Un análisis poligenético del
GluCl\alpha y del GluCl\beta.
La presente invención comprende al DNA
codificante de los canales de cloruro sensibles al glutamato y a la
avermectina (GluCl), de invertebrados, los cuales fueron aislados de
células productoras de GluCl. GluCl, según lo explicado aquí, se
refiere a la proteína que puede funcionar específicamente como un
canal anión de apertura controlada por glutamato.
La secuencia de aminoácidos de GluCl de
invertebrados, no era conocida con anterioridad, ni tampoco la
secuencia de nucleótidos que codifican los GluCl. Esta es la primera
clonación reportada, de un canal de cloruro de apertura controlada
por glutamato. Es también el primer informe de la clonación de un
objetivo de la avermectina en invertebrados, y de un canal de
cloruro sensible a la avermectina, en invertebrados. Se predice que
todos los organismos sensibles a la avermectina, contendrán los
canales sensibles a la avermectina y al glutamato ya descritos. Las
células de invertebrados capaces de producir GluCl están incluidas
en, aunque no limitadas a, músculos o células nerviosas aisladas de
estos organismos que muestran sensibilidad a las avermectinas. Los
animales sensibles a la avermectina son variados e incluyen
invertebrados pertenecientes a los filos Artrópodos y Nemátodos.
Otras células y líneas celulares pueden ser
también apropiadas para usarse en el aislamiento de cDNA de los
GluCl. La selección de células adecuadas puede realizarse mediante
la búsqueda de actividad de GluCl en extractos celulares. La
actividad de GluCl puede ser monitorizada realizando un binding
assay (Cully and Paress, supra; Roher et al, supra) o
por medida electrofisiológica directa de un canal de cloruro
sensible a la avermectina y al glutamato [Martin, R.J. &
Pennington, A.J. Br. J. Pharmacol. 98,
747-756 (1989); Scott, R.H. & Duce, I.R.
Pestic. Sci. 16, 599-604 (1985); Duce, I.R.
& Scott, R.H. Brit. J. Pharmacol. 85,
395-401 (1985); Zufall, F., Franke, C. & Hatt,
H. J. Exp. Biol. 142, 191-205 (1989)]. Las
células que muestren actividad GluCl en este análisis, pueden ser
también apropiadas para el aislamiento de DNA o mRNA de los
GluCl.
Toda una variedad de procedimientos conocidos en
esta materia pueden ser usados para clonar molecularmente ADN de los
GluCl. Estos métodos incluyen (aunque no están limitados solo a) la
expresión funcional directa de los genes de los GluCl tras la
construcción de un archivo que contenga cADN de los GluCl, en un
sistema de vectores de expresión apropiados. Otro método es
monitorizar archivos de cADN de GluCl construidos en un plásmido o
bacteriófago que actúe como vector-lanzadera, con
una sonda de oligonucleótidos etiquetados diseñados a partir de la
secuencia de aminoácidos de las subunidades de los GluCl. Un método
adicional consiste en el seguimiento de una archivo de cADN de GluCl
construido en un plásmido o bacteriófago usado como
vector-lanzadera, con un cADN parcial, codificante
de las subunidades de GluCl. Este cADN parcial se obtiene por la
amplificación específica de PCR, de fragmentos de ADN de GluCl, a
través del diseño de cebadores de oligonucleótidos degenerados,
procedentes de la secuencia de aminoácidos de las subunidades
purificadas de GluCl.
Otro método es aislar ARN de células productoras
de GluCl, y traducirlo a proteínas mediante un sistema de
trascripción in vitro, o mediante uno in vivo. La
traducción de ARN a un péptido y una proteína producirá al menos una
porción de la proteína de los GluCl, la cual podrá ser identificada,
por ejemplo, mediante reactividad inmunológica con un anticuerpo
anti-GluCl, o por actividad biológica del la
proteína de GluCl. En este método, reservas de ARN aislado de las
células productoras de GluCl, pueden ser analizados por la presencia
de un ARN que codifique al menos una porción de la proteína de
GluCl. Pueda realizarse un posterior fraccionamiento de la reserva
de ARN, para purificar el ARN de los GluCl, del ARN que no pertenece
a los GluCl. Los péptidos o proteínas generados por este método,
pueden ser analizados para proveer secuencias de aminoácidos, que se
usarán para crear cebadores para la producción de cADN de GluCl; o
el ARN utilizado en la traducción, puede ser analizado para proveer
secuencias de nucleótidos codificantes de GluCl, y generar sondas
para la producción del cADN de los GluCl. Este método es reconocido,
y se lo puede hallar, por ejemplo, en Maniatis, T., Fritsch, E.F.,
Sambrook, J. en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second
Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
NY. 1989.
Es evidente para los expertos en la materia, que
otros tipos de archivos, además de archivos construidos a partir de
otras células, o tipos celulares, pueden ser muy útiles para aislar
el ADN codificante de los GluCl. Otros tipos de archivos incluyen
(aunque no quedan limitados a) archivos de cADN derivado de otras
células, a partir de otros organismos, además de C. elegans;
y archivos de ADN que incluyen CAL (cromosomas artificiales de
levaduras), y archivos de cósmidos.
Es claramente evidente para aquellos cualificados
en la materia, que los archivos de cADN apropiado, pueden ser
preparados a partir de células, o de líneas celulares, con actividad
GluCl. La selección células o líneas celulares para preparar
archivos de cADN para aislar cADN de los GluCl, puede ser realizada
mediante una medición inicial de la actividad de células asociadas a
GluCl, usando sistemas de medición electrofisiológicos, de canales
cloruro sensibles a las avermectinas o al glutamato; o mediante
binding assay de ligandos a las avermectinas y al glutamato.
La preparación de bibliotecas de cADN puede
llevarse a cabo mediante técnicas estándar bien conocidas en esta
disciplina. Se pueden encontrar técnicas de construcción de cADN
reconocidas en, por ejemplo, Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook,
J. en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, (Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
1989).
Es también evidente para los expertos en la
técnica, que el ADN codificante de GluCl puede ser aislado también a
partir de archivos de ADN apropiado genómicamente. La construcción
de bibliotecas de ADN genómico puede ser realizada vía técnicas
estándar bien conocidas. Técnicas reconocidas pueden ser encontradas
en Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J. en Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, NY. 1989).
Para clonar los genes de GluCl mediante los
métodos descritos anteriormente, la secuencia de aminoácidos de los
GluCl puede ser necesaria. Para lograrlo, pueden purificarse
proteínas de GluCl, y determinarse secuencias parciales de
aminoácidos mediante secuenciadores automáticos. No es necesario
determinar la secuencia entera de aminoácidos, pero la secuencia
lineal de dos regiones de 6 a 8 aminoácidos de la proteína, es
determinada por la producción de cebadores para la amplificación
mediante PCR, de un fragmento parcial de ADN de GluCl.
Una vez que las secuencias de aminoácidos
apropiadas han sido identificadas, se sintetizan las secuencias de
ADN capaces de codificarlas. Como el código genético es degenerado,
mas de un codón puede ser usado para codificar un aminoácido
particular, y por lo tanto, la secuencia de aminoácidos puede ser
codificada por cualquiera de los nucleótidos de un set de
oligonucleótidos de ADN similares. Solamente un miembro del set será
idéntico a la secuencia del GluCl, pero será capaz de hibridizar con
el ADN de los GluCl, incluso en presencia de oligonucleótidos de ADN
con incompatibilidades. Los oligonucleótidos de ADN con
incompatibilidades, pueden incluso hibridizar suficientemente con el
ADN de los GluCl, para permitir la identificación y aislamiento del
ADN codificante de los GluCl. El ADN aislado por estos métodos,
puede ser utilizado para monitorizar archivos de ADN procedente de
distintos tipos celulares, tanto de invertebrados como de
vertebrados, y para aislar genes homólogos.
Los GluCl activos, purificados biológicamente,
pueden tener varias formas físicas distintas. Los GluCl pueden
existir como polipéptidos íntegros, recién creados y si procesar; o
como polipéptidos parcialmente procesados; o como combinaciones de
polipéptidos procesados. Los polipéptidos íntegros y recién creados,
pueden ser modificados tras la traducción, por eventos específicos
de escisión, que darán lugar a fragmentos del polipéptido original.
Un fragmento, o asociación física de fragmentos, puede tener la
actividad biológica completa asociada con el GluCl (canal de cloruro
de apertura controlada por la avermectina y el glutamato); sin
embargo, el grado de actividad de los GluCl puede variar entre
fragmentos individuales de GluCl y fragmentos de polipéptidos de
GluCl físicamente asociados.
El ADN de GluCl clonado, obtenido mediante los
métodos descritos aquí, puede ser expresado recombinantemente
mediante clonación molecular en un vector de expresión que contenga
un promotor apropiado, y otros elementos reguladores de la
trascripción adecuados, y que sea transferido a células anfitrionas
procariotas o eucariotas, para producir GluCl recombinante. Las
técnicas para estas manipulaciones son completamente descritas en
Maniatis, T, et al. supra, y son bien conocidas en este
medio. Los vectores de expresión son definidos aquí como secuencias
de ADN que son requeridas para la trascripción de copias clonadas de
genes, y para la traducción de su mARN, en un anfitrión apropiado.
Estos vectores pueden ser usados para expresar genes eucarióticos,
en una variedad de hospedadores tales como bacterias, incluyendo
E. coli, algas verdea-azuladas, células
vegetales, células de insectos, células de hongos (incluyendo
células de levaduras), y células animales.
Los vectores diseñados específicamente, permiten
los transportes de ADN entre anfitriones, tales como de bacterias a
células de levadura; o de bacterias a células animales; o de
bacterias a células de hongos; o de bacterias a células de
invertebrados. Un vector de expresión construido adecuadamente,
debería contener: un origen de replicación para replicación autónoma
en células anfitrionas; marcadores seleccionables; un número
limitado de sitios de restricción enzimática; potencial para un
número alto de copias; y promotores activos. Un promotor se define
como una secuencia de ADN que dirige a la
ARN-polimerasa para unirse con el ADN, y así iniciar
la síntesis de ARN. Un promotor fuerte es aquel que implica la
producción de mARN con una alta frecuencia. Los vectores de
expresión pueden incluir (aunque no quedan limitados a) vectores de
clonación; vectores de clonación modificados; plásmidos o virus
específicamente diseñados.
Distintos vectores de expresión de mamíferos
pueden ser utilizados para expresar GluCl recombinantes, en células
de mamíferos. Vectores de expresión de mamíferos, disponibles
comercialmente, y que sean apropiados para la expresión de GluCl
recombinante, incluyen (aunque no quedan limitados a): pMAMneo
(Clontech); pcDAN3 (Invitrogen); pMC1neo (Stratagene); pXT1
(Stratagene); pSG5 (Stratagene);
EBO-pSV2-neo (ATCC
37593); pBPV-1 (8-2) (ATCC 37110);
pdBPV-MMTneo(342-12) (ATCC
37224); pRSVgpt (ATCC 37199); pRSVneo (ATCC 37198);
pSV2-dhfr (ATCC 37146); pUCTag (ATCC 37460); y IZD35
(ATCC
37565).
Distintos vectores de expresión bacterianos
pueden ser usados para expresar GluCl recombinante en células
bacterianas. Vectores de expresión disponibles comercialmente, que
pueden ser apropiados para la expresión de los GluCl recombinantes,
incluyen (aunque no están limitados a): vectores pET (Novagen) y
vectores pQE (Qiagen). Distintos vectores de expresión de células
fúngicas pueden ser usados para la expresión de GluCl recombinante,
en células de hongos, como levaduras. Vectores de expresión en
células fúngicas, disponibles comercialmente, y que son apropiadas
para la expresión de GluCl recombinante, incluyen (aunque no están
limitados a): pYES2 (Invitrogen) y el vector de expresión Pichia
(Invitrogen).
Distintos vectores de expresión de células de
insectos, pueden ser usados para expresar GluCl recombinantes en
células de insectos. Vectores de expresión de células de insectos,
apropiados para la expresión de GluCl recombinante, y disponibles
comercialmente, incluyen (aunque no están limitados a): pBlueBacII
(Invitrogen).
El ADN codificante de los GluCl puede ser también
clonado en un vector de expresión, para la expresión en una célula
hospedadora recombinante. Las células hospedadoras recombinantes
pueden ser procarióticas o eucarióticas, incluyendo (aunque no
quedando limitadas a) bacterias como la E. coli; células
fúngicas como las levaduras; células de mamíferos, incluyendo
(aunque sin quedar limitadas a) líneas celulares de origen humano,
bovino, porcino, de monos y de roedores; y células de insectos,
incluyendo (aunque sin quedar limitados a) líneas celulares
derivadas de la drosophila, o de los gusanos de seda. Las líneas
celulares derivadas de especies de mamíferos, que pueden ser
apropiadas, y comercialmente disponibles, incluyen (aunque no quedan
limitadas a): CV-1 (ATCC CCL 70);
COS-1 (ATCC CRL 1650); COS-7 (ATCC
CRL 1651); CHO-K1 (ATCC CCL 61); 3T3 (ATCC CCL 92);
NIH/3T3 (ATCC CRL 1658); HeLa (ATCC CCL 2); C1271 (ATCC CRL 1616);
BS-C-1 (ATCC CCL 26);
MRC-5 (ATCC CCL 171); células L; y
HEK-293 (ATCC CRL1573).
Los vectores de expresión pueden ser introducidos
en la célula hospedadora mediante cualquiera de las técnicas que
incluyen (aunque no quedan limitadas a): transformación;
transfección; fusión de protoplastos; lipofección; y
electroporación. Las células que contienen vectores de expresión son
propagadas clónicamente, y analizadas individualmente, para
determinar si producen proteínas de GluCl. La identificación de las
células hospedadoras con expresión de GluCl, puede ser realizada por
muchas vías, incluyendo (aunque sin quedar limitadas a): reactividad
inmunológica con anticuerpos anti-GluCl; y la
presencia de actividad GluCl asociada a células hospedadoras.
La expresión de ADN de GluCl puede ser realizada
también usando mRNA sintético producido in vitro. El mRNA
sintético, o el mRNA aislado de células productoras de GluCl, pueden
ser traducidos eficientemente en distintos sistemas libres de
células, incluyendo (aunque sin quedar limitados a) extractos de
germen de trigo, y extractos de reticulocitos; así como pueden ser
traducidos eficazmente en sistemas basados en células, incluyendo
(aunque sin quedar limitados a) la microinyección en oocitos de
rana, siendo esta la preferida.
Para determinar la secuencia (o secuencias) de
ADN de GluCl que dan lugar a niveles óptimos de actividad GluCl y/o
proteínas de los GluCl (incluyendo, aunque no quedando limitado a,
las moléculas de ADN de GluCl), puede construirse lo siguiente: el
marco de lectura, totalmente abierto, del cADN codificante del
GluCl, que codifica las subunidades GluCl\alpha (52.550 kDa) y
GluCl\beta (49.900 kDa), va aproximadamente desde la base 51 hasta
aproximadamente la base 1433, y desde la base 14 hasta
aproximadamente la base 1315, respectivamente (estos números
corresponden al primer nucleótido de la primera metionina, y al
último nucleótido antes del primer codón de detención) y muchas
construcciones conteniendo porciones del cADN codificante de la
proteína del GluCl. Todas las construcciones pueden ser diseñadas
para contener ninguna, todas, o porciones de las regiones sin
traducir 5' o 3', del cADN de GluCl. La actividad de GluCl, y los
niveles de expresión de proteínas, pueden ser determinados siguiendo
la introducción de aquellas construcciones, tanto individualmente
como en combinación, dentro de las células anfitrionas adecuadas.
Siguiendo la determinación de la expresión de cassettes de
producción óptima de ADN de GluCl en análisis pasajeros, estas
construcciones de ADN de GluCl son transferidas a distintos vectores
de expresión, para la expresión en células anfitrionas que incluyen
(aunque no quedan limitadas a): células de mamíferos; células de
insectos infectadas por bacilovirus; E. coli; y la levadura
S. cerevisiae.
Las células hospedadoras transfectantes, y los
oocitos microinyectados, pueden ser analizados para observar tanto
los niveles de actividad de los canales de GluCl, como los niveles
de proteínas de GluCl, siguiendo los siguientes métodos. En el caso
de las células hospedadoras recombinantes, esto implica la
co-transfección de uno, o posiblemente dos o más
plásmidos, conteniendo el ADN de GluCl, una o más subunidades. En el
caso de los oocitos, esto incluye la co-inyección de
sARN sintético para una o más subunidades de GluCl. Dejando pasar un
periodo de tiempo apropiado para permitir la expresión, la proteína
celular es etiquetada metabólicamente con, por ejemplo,
^{35}S-metionina, durante 24 horas, después de las
cuales el lisado celular y el sobrenadante de los cultivos celulares
es recogido y sujeto a inmuno-precipitación con
anticuerpos policlonales, dirigidos contra la proteína de GluCl.
Otros métodos para detectar actividad de GluCl,
incluyen la medida directa de actividad de GluCl en células enteras
transfectadas con cADN de GluCl, o en oocitos inyectados con mARN de
GluCl. La actividad de GluCl se mide mediante ligandos de unión
específica, y por las características electrofisiológicas de las
células hospedadoras que expresan ADN de GluCl. En el caso de las
células hospedadoras recombinantes que expresan GluCl, se pueden
usar técnicas de análisis del potencial de membrana, para medir la
actividad de los canales de cloruro, y cuantificar la proteína de
GluCl. En el caso de los oocitos, se pueden usar tanto técnicas de
potencial de membrana, como de potencial entre dos electrodos, para
medir la actividad de los canales de cloruro y cuantificar la
proteína de GluCl.
Los niveles de proteína de GluCl en células
anfitrionas, son cuantificados mediante técnicas de inmunoafinidad
y/o de afinidad de ligandos. Las células que expresan GluCl, pueden
ser analizadas por el número de moléculas de GluCl expresadas,
midiendo la cantidad de glutamato o ivermectina radioactivos, unidos
a la membrana celular. Cromatografía de afinidad específica para
GluCl o anticuerpos específicos para el GluCl, son usados para
aislar proteína de GluCl etiquetada, por ejemplo, con
^{35}S-metionina; o proteína de GluCl no
etiquetada. La proteína etiquetada es analizada mediante
SDS-Page. La proteína no etiquetada es detectada
mediante Western, ELISA o análisis RIA, empleando anticuerpos
específicos de GluCl.
Puesto que el código genético es degenerado, mas
de un codón puede ser utilizado para codificar un aminoácido en
particular, y por lo tanto, la secuencia de aminoácidos puede ser
codificada por cualquier oligonucleótido de un set de
oligonucleótidos de ADN similares. Solamente un miembro del set será
idéntico a la secuencia de GluCl, pero tendrá la capacidad de
hibridar con el ADN de GluCl, incluso en presencia de
oligonucleótidos de ADN con incompatibilidades, bajo condiciones
adecuadas. Bajo condiciones alternas, los oligonucleótidos de ADN
incompatibles, pueden incluso hibridar con el ADN del GluCl, para
permitir la identificación y aislamiento del ADN codificante del
GluCl.
El ADN codificante del GluCl, de un organismo en
particular, puede ser utilizado para aislar y purificar homólogos de
GluCl de otros organismos. Para conseguir esto, el primer ADN de
GluCl puede ser mezclado con una muestra que contenga ADN
codificador de homólogos de GluCl, bajo condiciones apropiadas de
hibridación. El complejo de hibridación de ADN puede ser aislado, y
el ADN codificante de ADN homólogo, puede entonces ser
purificado.
Se sabe que hay una cantidad sustancial de
redundancia en los distintos codones que codifican para aminoácidos
específicos. Por tanto, esta invención está dirigido también a
aquellas secuencias de ADN que contienen codones alternativos, que
codifican para la traducción eventual de los aminoácidos idénticos.
Para los propósitos de esta especificación, una secuencia que lleva
uno o más codones reemplazados, será definida como una variación
degenerada. También se incluyen en el ámbito de esta invención, las
mutaciones, o en la secuencia de ADN, o las proteínas traducidas que
no alteran sustancialmente las propiedades físicas últimas de las
proteínas expresadas. Por ejemplo, la sustitución de la valina por
leucina, la arginina por lisina, o la asparraguina por glutamina,
pueden no causar un cambio en la funcionalidad de los
polipéptidos.
Se sabe que las secuencias de ADN codificantes
para un péptido, pueden ser alteradas para codificar un péptido con
propiedades distintas de las naturales para ese péptido. Métodos
para alterar las secuencias de ADN incluyen (aunque no están
limitadas a) mutagénesis dirigida a un sitio. Ejemplos de
propiedades alteradas incluyen (aunque no quedan limitadas a)
cambios en la afinidad de una enzima por un substrato, o de un
receptor por un ligando.
Según lo explicado aquí, un "derivado
funcional" del GluCl es un compuesto que posee una actividad
biológica (ya sea funcional o estructural) que es sustancialmente
similar a la actividad biológica del GluCl. En el término
"derivados funcionales" se intenta incluir los
"fragmentos", "variantes", "variantes degeneradas",
"análogos" y "homólogos" o a los "derivados químicos"
del GluCl. El término "fragmento" se refiere a cualquier
subconjunto de polipéptidos de GluCl. El término "variante" se
refiere a una molécula sustancialmente similar en estructura y
función a la molécula entera de GluCl, o a un fragmento de la misma.
Una molécula es "sustancialmente similar" al GluCl si ambas
moléculas tienen estructuras sustancialmente similares, o si ambas
moléculas poseen similar actividad biológica. Por tanto, si las dos
moléculas poseen sustancialmente la actividad similar, se las
considera variantes, incluso si no encontramos la estructura de una
de las moléculas en la otra, o incluso si las dos secuencias de
aminoácidos no son idénticas. El término "análogo" se refiere a
una molécula sustancialmente similar en función, tanto a la molécula
entera de GluCl, como a un fragmento de la misma.
Siguiendo la expresión de GluCl en una célula
hospedadora recombinante, la proteína de la GluCl puede ser
recuperada, para proporcionar GluCl en forma activa. Bastantes
procedimientos de purificación de GluCl están disponibles para el
uso, y son adecuados. Tal como se describió más arriba para la
purificación de GluCl desde fuentes naturales, le GluCl recombinante
puede ser purificado desde lisados y extractos celulares, o desde
medios de cultivo acondicionados, por varias combinaciones de, o
aplicaciones individuales de, fraccionamiento salino,
hidroxilapatita, cromatografía de absorción, y cromatografía de
interacción hidrofóbica.
Además, el GluCl recombinante puede ser separado
de otras proteínas celulares, mediante el uso de columnas de
inmunoafinidad hechas con anticuerpos mono o policlonales,
específicos para GluCl íntegro recién creado, fragmentos de
polipétidos de GluCl, o subunidades de GluCl.
Anticuerpos monoespecíficos del GluCl son
purificados a partir de antisuero de mamíferos, que contiene
anticuerpos reactivos contra el GluCl, o que son preparados como
anticuerpos monoclonales reactivos con el GluCl, usando la técnica
de Kohler y Milstein, Nature 256: 495-497
(1975). Anticuerpo monoespecífico, tal como lo mencionamos aquí, se
definen como una especie de anticuerpos simple, o una especie de
anticuerpos múltiples, con características de unión homogéneas para
el GluCl. Unión homogénea, tal como lo mencionamos aquí, se refiere
a la habilidad de la especie de anticuerpos, para unirse a un
antígeno específico, o epítopo, semejante a aquellos asociados con
el GluCl, tal como se describe anteriormente. Se eleva la cantidad
de anticuerpos específicos al GluCl, inmunizando a animales como
ratones, ratas, cerdos de Guinea, conejos, cabras, caballos, y
similares, siendo los conejos los preferidos, usando una
concentración apropiada de GluCl, tanto con la participación de un
coadyuvante inmune, como sin ella.
El suero preinmune se recoge antes de la primera
inmunización. Cada animal recibe entre unos 0,1 mg y unos 1000 mg de
GluCl asociado con un coadyuvante inmune aceptable. Estos
coadyuvantes aceptables incluyen (aunque no quedan limitados a) el
completo de Freund; el incompleto de Freund; precipitado de alumbre;
agua en emulsión de aceite, conteniendo Corynebacterium
parvum y tRNA. La inmunización inicial consiste en GluCl en,
preferiblemente, adyuvante completo de Freund, en múltiples sitios,
o bien subcutáneamente (SC), o bien intraperitonealmente (IP), o
ambas. Cada animal es sangrado a intervalos regulares,
preferiblemente de manera semanal, para determinar el nivel de
anticuerpos. Los animales pueden recibir, o no, inyecciones para
aumentar la presión, tras la inmunización inicial. A aquellos
animales que si reciben las inyecciones posteriores, se les suele
dar una cantidad igual de antígeno en adyuvante de Freund
incompleto, por la misma ruta. Las inyecciones para aumentar la
presión del tratamiento, se suministran durante intervalos de tres
semanas, hasta que se obtengan los niveles máximos de anticuerpos.
Sobre los 7 días posteriores a cada inyección de inmunización, o
semanalmente tras la inmunización única, los animales son sangrados,
el suero recolectado, y las alícuotas son almacenadas a unos
-20ºC.
Los anticuerpos monoclonales (mAc) reactivos con
el GluCl, se preparan inmunizando con GluCl, fetos de ratones,
preferiblemente Balb/c. Los ratones son inmunizados vía IP o SC, con
entre 0,1 mg y 10 mg (preferiblemente 1 mg) de GluCl en 0,5 ml de
tampón o salino incorporado en un volumen igual de un adyuvante
apropiado, tal como los expuestos anteriormente. El preferido es el
adyuvante completo de Freund. Los ratones reciben una inmunización
inicial el día 0, y se les deja en reposo entre 3 y 30 semanas. Los
ratones inmunizados reciben una o más inmunizaciones adicionales, de
aproximadamente 0,1 a 10 mg de GluCl en solución tampón, tal como
fosfato tamponado salino, por vía intravenosa (IV). Los linfocitos
de ratones con anticuerpos positivos, preferiblemente linfocitos
esplénicos, se obtienen extrayendo los bazos de los ratones
inmunizados, mediante procedimientos estándar conocidos en el medio.
Las células hibridomas se producen mezclando los linfocitos
esplénicos con un patrón de fusión adecuado, preferiblemente células
del mieloma, bajo condiciones que permitirán la formación de
hibridomas estables. Los patrones de fusión pueden incluir (aunque
no están limitados a): mielomas de ratón P3/NS1/Ag
4-1; MPC-11; S-194 y
Sp 2/0, siendo el Sp 2/0 el preferido. Las células productoras de
anticuerpos, y las células del mieloma, se unen en glicol de
polietileno, de unos 1000 mol/peso, a concentraciones de entre el
30% y el 50%. Los hibridomas fusionados se seleccionan por
crecimiento en hipoxantina, timidina y aminopterina, suplementados
con el Medio de Eagles Modificado, de Dulbecco (MEMD), mediante
procedimientos conocidos en la materia. Se recolectan los fluidos
sobrenadantes de las fuentes con crecimientos positivos, los días
14, 18 y 21, y se monitorizan para detectar producción de
anticuerpos, usando inmunoensayos tales como inmunoradioensayo de
fase sólida (SPIRA), usando GluCl como antígeno. Los fluidos del
cultivo también son estudiados, usando el análisis de precipitación
Ouchterlony, para determinar los isótopos de los mAc. Las células de
hibridoma procedentes de las fuentes con anticuerpos positivos, son
clonadas mediante técnicas tales como la técnica de agar blando de
MacPherson, Soft Agar Techniques, in Tissue Culture Methods and
Applications, Kruse and Paterson, Eds., Academic Press, 1973.
Los anticuerpos monoclonales son producidos in
vivo mediante inyección en ratones preparados con pristane,
aproximadamente 0,5 ml por ratón, con entre 2 x 10^{6} y 6 x
10^{6} hibridomas, unos 4 días después de la preparación. El
fluido ascite es recogido unos 8-12 días después de
la transferencia celular, y los anticuerpos monoclonales son
purificados mediante técnicas conocidas en la materia.
La producción in vitro de mAc
anti-GluCl se realiza mediante el crecimiento del
hibridoma en MEMD que contenga un 2% de suero fetal de ternero, para
obtener suficientes cantidades del mAc específico. Los mAc son
purificados usando técnicas conocidas en el medio.
Los niveles de anticuerpo de fluidos de cultivos
de ascitas o hibridomas, se determinan mediante distintos ensayos
inmunológicos o serológicos, que incluyen (aunque no quedan
limitados a) precipitación; aglutinación pasiva; técnica de
anticuerpo inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA); y técnicas de
inmunoradioensayo (RIA). Ensayos similares son usados para detectar
la presencia de GluCl en fluidos corporales, o extractos celulares y
tisulares.
Es evidente para aquellos expertos en la materia,
que los métodos para producir anticuerpos monoespecíficos descritos
anteriormente, puede ser usados para producir anticuerpos
específicos para fragmentos de polipéptidos de GluCl, o para
polipéptidos de GluCl enteros recién creados, o para subunidades
individuales de GluCl. Específicamente, es claro para los expertos
en la materia, que los anticuerpos monoespecíficos, pueden ser
generados para ser específicos para solo una subunidad de GluCl, o
para el canal cloruro de apertura controlada por avermectina o
glutamato, totalmente funcional.
Las columnas de afinidad de anticuerpos GluCl, se
realizan añadiendo los anticuerpos a Affigel-10
(Biorda), un soporte de gel que es activado con un éster
N-hidroxisuccinimida, de tal modo que los
anticuerpos forman enlaces covalentes con el soporte de gel de
agarosa. Los anticuerpos se unen entonces al gel, vía enlaces amida,
con el brazo espaciador. Los esteres activados que quedan, se
saturan con etanolamina HCl (pH 8) 1 M. Se lava la columna con agua,
seguida de glicina HCl (pH 2,6) 0,23 M, para remover cualquier
anticuerpo no conjugado, o proteínas extrañas.
Entonces se equilibra la columna con tampón
fosfato salino (pH 7,3), y se hace pasar lentamente a través de la
columna al sobrenadante o a los extractos celulares que contienen
GluCl, o subunidades de GluCl. Finalmente, se lava la columna con
tampón fosfato salino hasta que la densidad óptica (A_{280}) baje
hasta el fondo, y entonces se enjuaga la proteína con glicina HCl
(pH 2,6) 0,23 M. Entonces se dializa la proteína GluCl purificada,
contra tampón fosfato salino.
Dos clones DNA, denominados pGluCl\alpha y
pGlucCl\beta, se han identificado como codificadores de proteínas
que, cuando se expresan en oocitos de Xenopus, forman un
canal cloruro sensible al glutamato y al
4-O-fosfato de ivermectina
(IVMPO_{4}). Cada subunidad es capaz de formar canales cloruro
homoméricos, que muestran distintivamente propiedades
electrofisiológicas y farmacológicas distintas. Cuando las
subunidades GluCl\alpha y_GlucCl\beta son coexpresadas, las
propiedades resultantes indican una interacción de las dos
proteínas, para formar canales cloruro heteroméricos en los oocitos.
La coexpresión de GluCl \alpha y \beta implica la reconstitución
de las propiedades observadas en oocitos inyectados con poli
(A)^{+} ARN codificante de GluCl [Arena, J.P., Liu. K.K.,
Paress, P.S. & Cully, D.F. Mol. Pharmacol. 40.
368-374 (1991)], [Arena, J.P., Liu, K.K., Paress,
P.S., Schaeffer, J.M. & Cully, D.F. Mol. Brain Res. 15,
339-348 (1992)]. Esto incluye: activación directa de
la corriente con IVMPO_{4}, glutamato e ibotenato;
des-sensitización en presencia del glutamato;
potenciación de la corriente sensible al glutamato, mediante
IVMPO_{4}; una relación aparente de rectificación I/V; bloqueo de
baja afinidad por picrotoxina y ácido flufenámico; e insensibilidad
al GABA y la
glicina.
glicina.
Los canales de cloruro controlados por glutamato,
solo han sido reportados en invertebrados, y se encuentran en
músculos de insectos, y en somas neuronales de músculo de
crustáceos, y se expresan en oocitos, desde poli
(A)^{+} RNA, de músculo de insectos [Lingle, C. & Marder, E. Brain Res. 212, 481-488 (1981)], [Horseman, B.G., Seymour, C., Bermudez, I. & Beadle, D.J. Neurosci. Len. 85, 65-70 (1988)], [Wafford, K.A. & Sattelle, D.B. J. Exp. Biol. 144, 449-462 (1989)], [Lea, T.J. & Usherwood, P.N.R. Comp. Gen. Pharmacol. 4, 333-350 (1973)], [Cull-Candy, S.G. J.Physiol. 255, 449-464 (1976)]. [Fraser, S.P., et al., Mol. Brain Res. 8, 331-341 (1990)]. La terminología receptor H (hiperpolarización) se usa para distinguir los canales cloruro controlados por glutamato, de los receptores excitatorios de glutamato D (despolarización), en músculo de langosta [Lea, T.J. & Usherwood, P.N.R. Comp. Gen. Pharmacol. 4, 333-350 (1973)], [Cull-Candy, S.G. J. Physiol. 255, 449-464 (1976)]. Similares a los oocitos inyectados con ARN de GluCl \alpha&\beta, los receptores H de los artrópodos, son activados característicamente con ibotenato, bloqueados con baja afinidad por la picrotoxina, y no se activan con GABA [Lingle, C. & Marder, E. Brain Res. 212, 481-488 (1981)], [Wafford, K.A. & Sattelle, D.B. J. Exp. Biol. 144, 449-462 (1989)], [Cull-Candy, S.G. J. Physiol. 255, 449-464 (1976)], [Lea, T.J. & Usherwood, P.N.R. Comp. Gen. Pharmacol. 4, 351-363 (1973)]. Los receptores H del músculo de langosta son activados directamente con las avermectinas, del mismo modo en que lo son los canales de cloruro controlados por glutamato, expresados a partir de ARN poli (A)^{+} de C.elegans [Scott, R.H. & Duce, I.R. Pestic. Sci. 16, 599-604 (1985)], [Arena, J.P., Liu, K.K., Paress, P.S., Schaeffer, J.M. & Cully, D.F. Mol. Brain Res. 15, 339-348 (1992)]. Además, los canales cloruro controlados por glutamato, de soma neuronal de langosta, son potenciados, y directamente activados, por avermectina [Aydar, E., harding, L., Beadle, D.J. & Bermudez, I. Proceedings of the British Pharmacological Society p24 (1993)]. Por lo tanto, GluCl\alpha y GluCl\beta parecen representar una clase de canales de cloruro de apertura controlada por ligandos, relacionados con los receptores H de los artrópodos. Esta clase de canales, representan el blanco para las avermectinas en C. elegans, y pueden mediar las acciones antihelmínticas e insecticidas de las avermectinas en otros organismos. Los análisis filogenéticos sugieren que GluCl\alpha y GluCl\beta representan una subclase única de canales de cloruro regulados por ligandos, que pueden estar relacionados con la glicina \alpha y \beta, y proteínas Lym z y Dros rdl. Aunque esas proteínas están filogenéticamente relacionadas, responden a distintos ligandos, y son farmacológicamente diferentes [Schmieden, V., Grenningloh, G., Schofield, P.R. & Betz, H. EMBO Journal 8, 695-700 (1989)], [French-Constant, R.H., Rocheleau, T.A., Steichen, J.C. & Chalmers, A.E. Nature 363, 449-451 (1993)], [Grenningloh, G., et al., Neuron 4, 963-970 (1990)], [Hutton, M.L., Harvey, R.J., Earley, F.G.P., Barnard, E.A. & Darlison, M.G. FEBS letters 326, 112-116 (1993)]. La relación de la subunidad GluCl\alpha con la GluCl\beta se refleja también en la evidente conservación de sitios de unión tanto para el glutamato, como para el IVMPO_{4}. Los canales GluCl\beta homoméricos, son directamente activados por con el glutamato, pero también se unen al IVMPO_{4}, puesto que la activación de la corriente por el glutamato, es inhibida por el IVMPO_{4}. En canales GluCl\alpha homoméricos, la corriente activada directamente por el IVMPO_{4}, es aún más activada por el glutamato, demostrando que hay un sitio de unión al glutamato en los GluCl\alpha.
(A)^{+} RNA, de músculo de insectos [Lingle, C. & Marder, E. Brain Res. 212, 481-488 (1981)], [Horseman, B.G., Seymour, C., Bermudez, I. & Beadle, D.J. Neurosci. Len. 85, 65-70 (1988)], [Wafford, K.A. & Sattelle, D.B. J. Exp. Biol. 144, 449-462 (1989)], [Lea, T.J. & Usherwood, P.N.R. Comp. Gen. Pharmacol. 4, 333-350 (1973)], [Cull-Candy, S.G. J.Physiol. 255, 449-464 (1976)]. [Fraser, S.P., et al., Mol. Brain Res. 8, 331-341 (1990)]. La terminología receptor H (hiperpolarización) se usa para distinguir los canales cloruro controlados por glutamato, de los receptores excitatorios de glutamato D (despolarización), en músculo de langosta [Lea, T.J. & Usherwood, P.N.R. Comp. Gen. Pharmacol. 4, 333-350 (1973)], [Cull-Candy, S.G. J. Physiol. 255, 449-464 (1976)]. Similares a los oocitos inyectados con ARN de GluCl \alpha&\beta, los receptores H de los artrópodos, son activados característicamente con ibotenato, bloqueados con baja afinidad por la picrotoxina, y no se activan con GABA [Lingle, C. & Marder, E. Brain Res. 212, 481-488 (1981)], [Wafford, K.A. & Sattelle, D.B. J. Exp. Biol. 144, 449-462 (1989)], [Cull-Candy, S.G. J. Physiol. 255, 449-464 (1976)], [Lea, T.J. & Usherwood, P.N.R. Comp. Gen. Pharmacol. 4, 351-363 (1973)]. Los receptores H del músculo de langosta son activados directamente con las avermectinas, del mismo modo en que lo son los canales de cloruro controlados por glutamato, expresados a partir de ARN poli (A)^{+} de C.elegans [Scott, R.H. & Duce, I.R. Pestic. Sci. 16, 599-604 (1985)], [Arena, J.P., Liu, K.K., Paress, P.S., Schaeffer, J.M. & Cully, D.F. Mol. Brain Res. 15, 339-348 (1992)]. Además, los canales cloruro controlados por glutamato, de soma neuronal de langosta, son potenciados, y directamente activados, por avermectina [Aydar, E., harding, L., Beadle, D.J. & Bermudez, I. Proceedings of the British Pharmacological Society p24 (1993)]. Por lo tanto, GluCl\alpha y GluCl\beta parecen representar una clase de canales de cloruro de apertura controlada por ligandos, relacionados con los receptores H de los artrópodos. Esta clase de canales, representan el blanco para las avermectinas en C. elegans, y pueden mediar las acciones antihelmínticas e insecticidas de las avermectinas en otros organismos. Los análisis filogenéticos sugieren que GluCl\alpha y GluCl\beta representan una subclase única de canales de cloruro regulados por ligandos, que pueden estar relacionados con la glicina \alpha y \beta, y proteínas Lym z y Dros rdl. Aunque esas proteínas están filogenéticamente relacionadas, responden a distintos ligandos, y son farmacológicamente diferentes [Schmieden, V., Grenningloh, G., Schofield, P.R. & Betz, H. EMBO Journal 8, 695-700 (1989)], [French-Constant, R.H., Rocheleau, T.A., Steichen, J.C. & Chalmers, A.E. Nature 363, 449-451 (1993)], [Grenningloh, G., et al., Neuron 4, 963-970 (1990)], [Hutton, M.L., Harvey, R.J., Earley, F.G.P., Barnard, E.A. & Darlison, M.G. FEBS letters 326, 112-116 (1993)]. La relación de la subunidad GluCl\alpha con la GluCl\beta se refleja también en la evidente conservación de sitios de unión tanto para el glutamato, como para el IVMPO_{4}. Los canales GluCl\beta homoméricos, son directamente activados por con el glutamato, pero también se unen al IVMPO_{4}, puesto que la activación de la corriente por el glutamato, es inhibida por el IVMPO_{4}. En canales GluCl\alpha homoméricos, la corriente activada directamente por el IVMPO_{4}, es aún más activada por el glutamato, demostrando que hay un sitio de unión al glutamato en los GluCl\alpha.
Se ha informado que las avermectinas interactúan
con otros miembros de la familia de los canales de cloruro regulados
por ligandos. En nemátodos e insectos, las avermectinas bloquean la
corriente sensible al GABA, mientras que en cangrejos, las
avermectinas activan directamente un canal de cloruro regulado por
multitransmisores (glutamato, acetilcolina, GABA) [Martin, R.J.
& Pennington, A.J. Br. J. Pharmacol. 98,
747-756 (1989)], [Zufall, F., Franke, C. & Hatt,
H. J. Exp. Biol. 142, 191-205 (1989)],
[Holden-Dye, L. & Walker, R.J. Parasitology
101, 265-271 (1990)], [Bermudez, I., Hawkins,
C.A., Taylor, A.M. & Beadle, D.J. Journal of Receptor
Research 11, 221-232 (1991)]. En oocitos que
expresan receptores GABA_{a}, de cerebro de pollito, las
avermectinas potencian la respuesta GABA [Sigel, E. & Baur, R.
Mol. Pharmacol. 32, 749-752 (1987)]. Además,
las avermectinas inhiben la unión de la estricnina a los receptores
de glicina, en mamíferos [Graham, D., Pfeiffer, F. & Betz, H.
Neurosci. Letters 29, 173-176 (1982)]. Sin
embargo, las proteínas GluCl\alpha y GluCl\beta son los únicos
miembros de la familia de canales cloruro regulados por ligandos,
que muestran características farmacológicas únicas con respecto al
glutamato y el ibotenato, y por tanto representan una nueva subclase
de la familia de los canales iónicos regulados por ligandos.
La presente invención está también dirigido a
métodos para monitorizar compuestos que modulen la expresión del ADN
o el ARN codificantes del GluCl, además de la función de la proteína
GluCl in vivo. Los compuestos que modulan esas actividades
pueden ser ADN, ARN, péptidos, proteínas, o moléculas orgánicas
no-proteináceas. Los compuestos que modulan la
expresión del ADN o el ARN codificantes del GluCl, o la función de
la proteína GluCl, pueden ser detectados por una variedad de
ensayos. El ensayo puede ser un simple ensayo "si/no" para
determinar si hay un cambio en la expresión o en la función. El
ensayo puede ser hecho cuantitativo, comparando la expresión o la
función de una muestra de prueba, con los niveles de expresión o de
función en una muestra estándar. Los moduladores identificados en
este proceso, son muy útiles como agentes terapéuticos, insecticidas
y antihelmínticos.
Los kits que contienen ADN de GluCl, anticuerpos
de GluCl, o proteínas de GluCl, pueden ser preparados. Estos kits
son usados para detectar ADN que hibridiza con el ADN del GluCl, o
para detectar la presencia de proteína de GluCl, o de fragmentos de
péptido, en una muestra. Esta caracterización es muy útil para una
variedad de propósitos, que incluyen (aunque no quedan limitados a)
análisis forenses y estudios epidemiológicos.
Las moléculas de ADN, las de ARN, las proteínas
recombinantes, y los anticuerpos de la presente invención, pueden
ser usados para monitorizar y medir los niveles de ADN de GluCl, de
ARN de GluCl, o proteína GluCl. Las proteínas recombinantes, las
moléculas de ADN, las moléculas de ARN y los anticuerpos, se prestan
para la formulación de kits apropiados para la detección y tipeo del
GluCl. Un kit como estos, comprendería un transportador
compartimentalizado apropiado para contener en estricto
confinamiento al menos un envase. El transportador abarcaría incluso
re-agentes como proteína GluCl recombinante, o
anticuerpos anti-GluCl, apropiados para detectar
GluCl. El transportador también contendría un medio para la
detección, tal como antígenos marcados, o substratos enzimáticos, o
similares.
Las secuencias de nucleótidos que son
complementarias a la secuencia de ADN codificante del GluCl, pueden
ser sintetizadas por terapia "de sentido contrario". Esas
moléculas de "sentido contrario" pueden ser ADN; derivados
estables de ADN tales como fósforotioatos o metilfosfonatos; ARN;
derivados estables del ARN tales como
2'-O-alkilARN; u otros
oligonucleótidos de GluCl de "sentido contrario", miméticos.
Las moléculas de GluCl de "sentido contrario" pueden ser
introducidas en células, vía microinyección; encapsulación en
liposomas; o por expresión a partir de vectores que albergan la
secuencia de "sentido contrario". La "terapia de sentido
contrario" del GluCl, puede ser particularmente útil para el
tratamiento de enfermedades donde es beneficioso reducir la
actividad GluCl.
La terapia con genes de GluCl puede ser utilizada
para introducir GluCl en las células de los organismos que son
nuestro objetivo. Los genes de GluCl pueden ligarse a vectores
virales, los cuales median en la transferencia del AND de GluCl,
infectando las receptoras células hospedadoras. Los vectores virales
apropiados incluyen retorvirus, adenovirus, virus
adeno-asociados, herpes virus, virus de la vacuna,
polio virus, y similares. Alternativamente, el ADN de GluCl puede
ser transferido a las células, mediante terapia génica con técnicas
no-virales, que incluyen transferencia de
ADN-blanco mediante receptor, usando conjugados de
ligandos de ADN, o conjugados de ligandos de ADN a adenovirus, o
fusión de membrana de lipofección, o microinyección directa. Estos
porcedimientos, y sus variaciones, son apropiadas tanto para terapia
génica de GluCl ex vivo como in vivo. La terapia con
genes de GluCl puede ser particularmente útil para el tratamiento de
enfermedades donde es beneficioso elevar la actividad del GluCl.
Composiciones farmacéuticamente útiles que
comprendan ADN de GluCl, ARN de GluCl, o proteína GluCl, o
moduladores de la actividad del receptor de GluCl, pueden ser
formuladas de acuerdo a métodos conocidos, tales como la adición de
un transportador farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de estos
transportadores y de estos métodos de formulación, pueden ser
hallados en Remington's Pharmaceutical Sciencies. Para crear una
composición farmacéuticamente aceptable, apropiada para una
administración eficaz, estas composiciones contendrán una cantidad
efectiva de la proteína, ADN, ARN, o modulador.
Composiciones terapéuticas o diagnósticas de la
invención, son administradas a un individuo, en cantidades
suficientes para tratar o diagnosticar trastornos en los cuales se
ha indicado la modulación de la actividad relacionada con el GluCl.
La cantidad eficaz puede variar de acuerdo a la variedad de
factores, tales como la condición del individuo, el peso, el sexo y
la edad. Otros factores incluyen el modo de administración. Las
composiciones farmacéuticas pueden ser dadas al individuo por varias
vías, como la subcutánea, la tópica, la oral, o la
intramuscular.
El término "derivado químico" describe una
molécula que contiene fragmentos químicos adicionales, que
normalmente no son parte de la molécula base. Estos fragmentos
pueden mejorar la solubilidad, la vida media, la absorción, etc. de
la molécula base. Alternativamente, estos fragmentos pueden atenuar
indeseables efectos secundarios de la molécula base, o disminuir la
toxicidad de la misma. Se describen ejemplos de estos fragmentos en
distintos textos, como el Remington's Pharmaceutical Sciences.
Los compuestos identificados de acuerdo a los
métodos aquí divulgados, pueden ser usados solos, en dosis
apropiadas definidas por pruebas de rutina, con el fin de obtener
una inhibición óptima del receptor GluCl o de su actividad, mientras
se minimiza cualquier toxicidad potencial. Además, puede ser
deseable la co-administración, o la administración
secuencial de otros agentes.
La presente invención también tiene el objetivo
de proveer formulaciones farmacéuticas apropiadas, de tipo tópico,
oral, sistémico o parenteral, para su uso en los nuevos métodos de
tratamiento de la presente invención. Las composiciones que
contienen compuestos identificados de acuerdo a esta invención como
el ingrediente activo para su uso en la modulación de los receptores
de GluCl, pueden ser administradas en una amplia variedad de formas
de dosis terapéuticas, en vehículos convencionales para su
administración. Por ejemplo, los compuestos pueden ser administrados
en forma de dosis orales, vía comprimidos, cápsulas (cada una
incluyendo formulaciones de liberación por tiempo, o liberación
sostenida), píldoras, polvos, gránulos, elixires, tinturas,
soluciones, suspensiones, siropes y emulsiones, o por inyección. Así
mismo, también pueden ser suministradas vía intravenosa (tanto en
forma de bolo, como de infusión), intraperitoneal, subcutánea,
tópica con o sin oclusión, o por vía intramuscular, siendo todas
estas, formas bien conocidas para los expertos en temas
farmacéuticos. Una cantidad efectiva, pero no tóxica, del compuesto
deseado, puede ser empleado como un agente modulador del GluCl.
La dosis diaria de los productos, puede variar
sobre un amplio rango, desde los 0,01 a los 1000 mg por paciente,
por día. Para la administración oral, las composiciones se dan
preferiblemente en forma de comprimidos marcados, conteniendo 0,01,
0,05, 0,1, 0,5, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0 y 50,0 miligramos del
ingrediente activo, para el ajuste sintomático de la dosis para el
paciente en tratamiento. Una cantidad efectiva de la droga es
suministrada ordinariamente a un nivel de dosis de entre 0,0001
mg/kg y 100 mg/kg de peso corporal, por día. El rango está más
particularmente entre los 0,001 mg/kg y los 10 mg/kg de peso
corporal, por día. Las dosis de los moduladores de los receptores
GluCl, son ajustadas cuando se combinan para alcanzar los efectos
deseados. Por otro lado, las dosis de esos distintos agentes, pueden
ser optimizadas independientemente, y combinadas para alcanzar un
resultado sinérgico allí donde la patología se reduce más de lo que
sucedería si cada agente se usara por separado.
Ventajosamente, los compuestos de la presente
invención pueden ser administrados en una única dosis diaria, o la
dosis total diaria puede ser administrada en dosis divididas en dos,
tres o cuatro tomas diarias. Además, los compuestos para la presente
invención, pueden ser administrados de forma intranasal, por vía de
vehículos intranasales apropiados, por vía tópica; o bien por rutas
transdermales, usando aquellas formas de parches cutáneos
transdermales, bien conocidos por los expertos en la materia. Para
ser administrados de forma transdermal, la dosis de administración
será, por supuesto, más bien continua que intermitente, a lo largo
del régimen de dosificación.
Para tratamiento de combinación, con más de un
agente activo, donde los agentes activos se encuentran en dosis de
formulaciones separadas, los agentes activos pueden ser
administrados concurrentemente, o bien cada uno de ellos puede ser
administrado por separado, en tiempos escalonados.
El régimen de dosificación al usar los compuestos
de la presente invención, se selecciona de acuerdo con distintos
factores, incluyendo tipo, especie, edad, peso, sexo, y condición
médica del paciente; la severidad de la enfermedad a ser tratada; la
ruta de administración; las funciones renal y hepática del paciente;
y el compuesto empleado en particular. Un médico o veterinario
corrientes pueden fácilmente determinar y prescribir las cantidades
efectivas de la droga, requeridas para prevenir, contrarrestar o
detener el avance de la enfermedad. La precisión óptima al conseguir
concentraciones de la droga que estén en el rango que proporciona
eficacia sin toxicidad, requiere un régimen basado en las cinéticas
de la disponibilidad de la droga sobre los objetivos. Esto incluye
una consideración de la distribución, el equilibrio, y la
eliminación de la droga.
En los métodos de la presente invención, los
compuestos descritos aquí en detalle, pueden formar el ingrediente
activo, y son administrados típicamente mezclados con diluyentes
farmacéuticos apropiados, excipientes o transportadores
(colectivamente referidos aquí como materiales
"transportadores") adecuadamente seleccionados con respecto a
las forma intencionada de administración, que es pastillas orales,
cápsulas, elixires, siropes y similares, y consistentes con las
prácticas farmacéuticas convencionales.
Por ejemplo, para la administración oral en forma
de pastilla oral o cápsula, el componente activo de la droga puede
ser combinado con un transportador oral inerte aceptable,
farmacéuticamente no tóxico, tal como el etanol, glicerol, agua y
similares. Es más, cuando se desee, o sea necesario, se pueden
incorporar a la mezcla, agentes colorantes, desintegrantes,
lubricantes y cobertores, apropiados. Los agentes cobertores
apropiados incluyen, sin limitación, almidón, gelatina, azúcares
naturales como glucosa o beta-lactosa, dulcificantes
de maíz, gomas naturales y sintéticas como la acacia, tragacanto o
alginato sódico, carboximetilcelulosa, glicol polietileno, ceras, y
similares. Los lubricantes usados en estas formas de dosificación
incluyen, sin limitación, oleato sódico, esterato sódico, esterato
de magnesio, benzoato sódico, acetato sódico, cloruro sódico, y
similares. Los desintegradores incluyen, sin limitación, almidón,
metil celulosa, agar, bentonita, goma de xantano, y similares.
Para las formas líquidas, los componentes activos
de la droga pueden combinarse con agentes suspensores o dispersores,
adecuadamente sazonados, tales como las gomas sintéticas y
naturales, por ejemplo el tragacanto, la acacia, la
metil-celulosa, y similares. Otros agentes
dispersantes que pueden ser empleados incluyen la glicerina, y
similares. Para administración parenteral, se prefieren soluciones y
suspensiones estériles. Las preparaciones isotónicas que contienen
preservativos adecuados, se emplean cuando se prefiere la
administración intravenosa.
Las preparaciones tópicas que contienen el
componente activo de la droga, pueden ser mezcladas con distintos
materiales transportadores bien conocidos en la materia, tales como,
por ejemplo, alcoholes, gel de aloe vera, allantoína, glicerina,
aceites de vitaminas A y E, aceite mineral, PPG2 miristil
propionato, y similares; para formar, por ejemplo, soluciones
alcohólicas, limpiadores tópicos, cremas limpiadoras, geles
cutáneos, lociones cutáneas, y champúes en crema o gel.
Los compuestos de la presente invención pueden
ser también administrados en forma de liposomas, tales como pequeñas
vesículas unilamelares, vesículas unilamelares grandes, y vesículas
multilamelares. Los liposomas pueden estar formados por distintos
fosolípidos, tales como el colesterol, estearilamina, o
fosfatidilcolinas.
Los compuestos de la presente invención pueden
ser también liberados mediante el uso de anticuerpos monoclonales
que actúan como transportadores individuales a los que se unen las
moléculas del compuesto. Los compuestos de la presente invención
pueden unirse también con polímeros solubles, que funcionarán como
transportadores de la droga. Estos polímeros pueden incluir
polivinilo-pirrolidona,
piran-copolímero,
polihidroxipropilmetacril-amidefenol,
polihidroxietilaspartamidefenol, o
polietil-eneoxidepolilisina sustituida con residuos
de palmitol. Es más, los compuestos de la presente invención pueden
unirse a una clase de polímeros biodegradables muy útiles en la
liberación controlada de una droga, como por ejemplo, ácido
poliláctico, poliépsilon caprolactona, ácido polihidroxi butírico,
poliortoésteres, poliacetales, polidihidro-piranos,
policianoacrilatos, o copolímeros de hidrogeles, de bloque
anfipático, o enlazados en cruz.
Los compuestos son agentes antiparasitarios
contra endo y ectoparásitos, particularmente helmintos y artrópodos,
que causan numerosas enfermedades parasitarias en humanos, animales
y plantas.
Las enfermedades parasitarias pueden ser causadas
tanto por endoparásitos, como por ectoparásitos. Los endoparásitos
son aquellos parásitos que viven dentro del cuerpo del hospedador,
ya sea dentro de un órgano (como el estómago, los pulmones, el
corazón, los intestinos, etc...), o simplemente bajo la piel. Los
exoparásitos son aquellos parásitos que viven sobre la superficie
externa del hospedador, pero aún cogen nutrientes del mismo.
Las enfermedades endoparasitarias generalmente
referidas como helmintiasis, se deben a la infección del hospedador
por gusanos parasitarios conocidos como helmintos. La helmintiasis
es un problema económico serio y extendido a nivel mundial, debido a
la infección de animales domésticos tales como cerdos, ovejas,
caballos, ganado vacuno, cabras, perros, gatos, y aves de corral.
Muchas de esas infecciones son causadas por el grupo de gusanos
descrito como nemátodos, los cuales causan enfermedades en distintas
especies de animales, a lo largo de todo el mundo. Esas enfermedades
son frecuentemente serias, y pueden acabar en la muerte del animal
infectado. Los géneros más comunes de nematodos que afectan a los
animales mencionados antes, son Haemonchus, Trichostrongylus,
Ostertagia, Nematodirus, Cooperia, Ascaris, Bunostomum,
Oesophagostomum, Chabertia, Trichuris, Strongylus, Trichonema,
Dictyocaulus, Capillaria, Heterakis, Toxocara, Ascaridia, Oxyuris,
Ancylostoma, Uncinaria, Toxascaris, y Parascaris. Muchos
parásitos son especies específicas (infectan solo a un hospedador),
y la mayoría tienen también un sitio preferido de infección dentro
del animal. Así, Haemonchus y Ostertagia infectan
sobre todo el estómago, mientras que Nematodirus y
Cooperia atacan sobre todo los intestinos. Otros parásitos
prefieren residir en el corazón, ojos, pulmones, vasos sanguíneos, y
similares, mientras que otros son parásitos subcutáneos. Las
helmintiasis pueden llevar a debilidad, pérdida de peso, anemia,
daños intestinales, malnutrición, y daños en otros órganos. Si se
dejan sin tratar, estas enfermedades pueden acabar en la muerte del
animal.
Las infecciones por artrópodos ectoparásitos como
garrapatas, ácaros, piojos, moscas de los establos, tábanos,
moscardas, pulgas y similares, son un serio problema también. La
infección por estos parásitos, implica pérdida de sangre, lesiones
cutáneas, y puede interferir con los hábitos normales de
alimentación, lo que provoca pérdida de peso. Estas infecciones
pueden también acabar en transmisión de enfermedades importantes que
pueden ser fatales, como encefalitis, anaplasmosis, viruela porcina,
y similares.
Los animales pueden ser infectados por muchas
especies de parásitos al mismo tiempo, puesto que la infección
provocada por uno de los parásitos, puede debilitar al animal, y
hacerle más susceptible a la infección por una segunda especie de
parásito. Por lo tanto, un compuesto con un amplio espectro de
actividad es particularmente ventajoso en el tratamiento de esas
enfermedades. Los compuestos de esta invención tienen actividad
contra esos parásitos, y además son activos contra
Dirofilaria en perros, Nematospiroides y
Syphacia en roedores, insectos picadores, y larvas díperas
migrantes, como Hypoderma sp. en ganado vacuno, y
Gastrophilus en caballos. Los compuestos son también muy
útiles contra endo y ectoparásitos que causan enfermedades
parasitarias en humanos. Ejemplos de estos endoparásitos que pueden
infectar al hombre, incluyen parásitos
gastro-intestinales de los géneros Ancylostoma,
Necator, Ascaris, Strongyloides, Trichinella, Capillaria, Trichuris,
Enterobius, y similares. Otros endoparásitos que infectan al
hombre se ubican en la sangre o en otros órganos. Ejemplos de esos
parásitos son los gusanos filarias Wucheria, Brugia,
Onchocerca, y similares, además de estados
extra-intestinales de los gusanos intestinales
Strongyloides y Trichinella. Los ectoparásitos que parasitan
al hombre, incluyen artrópodos tales como garrapatas, pulgas,
ácaros, piojos y similares, y al igual que con los animales
domésticos, las infecciones por esos parásitos pueden acabar en la
transmisión de serias, e incluso fatales, enfermedades. Los
compuestos son activos contra estos endo y ectoparásitos, y además
son también activos contra insectos picadores y otras pestes de
dípteros que molestan al hombre.
Los compuestos son también muy útiles contra las
pestes corrientes de las casas, tales como Blastella sp.
(cucaracha), Tineola sp. (polilla de la ropa), Attagenus
sp. (escarabajo de las alfombras), Musca domestica (mosca
común), y contra Solenopsis invicta (hormiga roja
importada).
Los compuestos son incluso útiles contra pestes
agrícolas, tales como áfidos (Acyrthiosiphon sp.), langostas,
gorgojos, además de contra pestes de insectos que atacan el grano
almacenado, tales como Tribolium sp., y contra estados
inmaduros de insectos, que viven en los tejidos vegetales. Los
compuestos también son muy útiles como nematodicidas para el control
de los nemátodos del suelo, lo que puede ser importante
agrícolamente.
Para ser usados como agente antiparasitario, los
compuestos pueden administrarse internamente, bien oralmente, bien
por inyección, o tópicamente, como friegas, o como champú.
Para la administración oral, los compuestos
pueden administrarse en cápsulas, pastillas, o bolos, o pueden
mezclarse alternativamente en la comida de los animales. Las
cápsulas, pastillas y bolos, son comprimidos del ingrediente activo
en combinación con un vehículo transportador apropiado, tal como
almidón, talco, estereato magnésico, o fosfato
di-cálcico. Estas formas de unidad dosificadora se
preparan mezclando íntimamente el ingrediente activo con
ingredientes inertes apropiados, finamente pulverizados, incluyendo
agentes diluyentes, rellenantes, y desintegrantes, y/o cobertores,
de tal modo que se obtiene una mezcla uniforme. Un ingrediente
inerte es aquel que no reaccionará con los compuestos, y que es
no-tóxico para el animal bajo tratamiento. Los
ingredientes inertes indicados, incluyen al almidón, lactosa, talco,
estereato magnésico, gomas vegetales, y aceites, y similares. Esas
formulaciones pueden contener una cantidad ampliamente variable de
los ingredientes activos e inactivos, dependiendo de numerosos
factores tales como el tamaño y tipo de la especie animal a ser
tratada, y del tipo y severidad de la infección. El ingrediente
activo puede ser administrado también como un aditivo en la comida,
simplemente mezclando el compuesto con la materia alimentaria, o
aplicando el compuesto en la superficie del alimento.
Alternativamente, los ingredientes activos pueden ser mezclados con
un transportador inerte, y la composición resultante puede ser
entonces mezclada con la comida, o bien ser suministrada
directamente al animal. Los transportadores inertes aceptables
incluyen harina de maíz, pulpa de cítricos, residuos de
fermentaciones, harina de soja, granos desecados, y similares. Los
ingredientes activos esta íntimamente mezclados con esos
transportadores inertes, mediante molienda y agitado, de tal manera
que la composición final contiene entre el 0,001 y el 5% del peso de
ingrediente activo.
Los compuestos pueden ser alternativamente
administrados, parenteralmente, vía inyección de una formulación
consistente en el ingrediente activo disuelto en un transportador
líquido inerte. La inyección puede ser o bien intramuscular, o
intraruminal, o intratraqueal, o bien subcutánea. La formulación
inyectable consta del ingrediente activo mezclado con un
transportador líquido inerte adecuado. Los transportadores líquidos
aceptables incluyen a los aceites vegetales, como el aceite de
cacahuete, el aceite de semilla de algodón, el aceite de sésamo, y
similares; además de solventes orgánicos tales como solketal,
glicerol formal, y similares. Como una alternativa, pueden usarse
también formulaciones acuosas parenterales. Los transportadores
líquidos preferidos son los aceites vegetales. La formulación se
prepara disolviendo o suspendiendo el ingrediente activo en el
transportador líquido, de tal modo que la formulación final contenga
entre 0,005 y el 10% del peso de ingrediente activo.
La aplicación tópica de los compuestos es posible
mediante el uso de friegas o champúes que contengan los compuestos
instantáneos en forma de solución acuosa o suspensión. Esas
formulaciones contienen generalmente un agente suspensor, como la
bentonita, y normalmente también contendrá un agente antiespumoso.
Son aceptables las formulaciones que contengan entre el 0,005 y el
10% del peso de ingrediente activo. Las formulaciones preferidas son
aquellas que contienen entre el 0,01 y el 5% del peso de los
compuestos instantáneos.
Los compuestos son principalmente útiles como
agentes antiparasitarios para el tratamiento y/o prevención de
helmintiasis en animales domésticos como el ganado vacuno, ovejas,
caballos, perros, gatos, cabras, cerdos, y aves de corral. También
son muy útiles en el tratamiento y prevención de infecciones
parasitarias de esos animales, por ectoparásitos como garrapatas,
ácaros, piojos, pulgas y similares. Son efectivos también en el
tratamiento de infecciones parasitarias en humanos. En el
tratamiento de dichas infecciones, los compuestos pueden usarse
individualmente, o en combinación de uno con el otro, o con otros
agentes antiparasitarios sin relación. La dosis de los compuestos,
requerida para los mejores resultados, depende de muchos factores,
tales como la especie y tamaño del animal, el tipo y severidad de la
infección, el método de administración, y el compuesto usado. La
administración oral de los compuestos, a niveles de dosis entre los
0,0005 y los 10 mg por Kg de peso corporal del animal, ya sea en una
dosis única, o bien en varias dosis espaciadas unos pocos días,
generalmente da buenos resultados. Una única dosis de uno de los
compuestos, normalmente da un control excelente, sin embargo se
pueden dar dosis repetidas para combatir
re-infecciones, o para tratar especies de parásitos
que son inusualmente persistentes. Las técnicas de administración de
esos compuestos a los animales, son conocidas por los expertos en el
campo de la veterinaria.
Los compuestos pueden usarse también para
combatir pestes agrícolas que atacan a las cosechas, ya sea en el
campo, o en los almacenes. Los compuestos son aplicados para esos
usos en forma de sprays, polvos, emulsiones, y similares, bien sobre
las plantas en crecimiento, bien sobre lo cosechado. Las técnicas de
aplicación de esos compuestos, de esta manera, son conocidas por los
expertos en temas agrícolas.
Los siguientes ejemplos ilustran la presente
invención, aunque sin limitarla a ellos.
Se mantuvieron cultivos de C. elegans en
placas petri con agar sembrado con E. coli, y se aislaron por
flotación de sacarosa 60%, tal como lo describen Sulston and Hodgkin
[In: The Nematode Caenorhabditis elegans
p602-603 (1988) W.B. Wood editor, Cold Spring
Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York Publisher]. Las
preparaciones de C. elegans se congelaron rápidamente en
N_{2} líquido, y se sedimentaron con un mortero, mientras estaban
sumergidas en el N_{2} líquido. Una solución que contenía
tiocianato de guanidinio 4 M, citrato sódico pH 7.0 5 mM, y
\beta-mercaptoetanol 0,1 M, se mezcló en un
homogeinizador politron, mientras los gusanos pulverizados
congelados fueron añadidos, a 10 ml/g de gusanos. Tras 5 minutos de
homgeinización, se añadió sarcosil sódico 0,5%, mezclándose bien, y
la solución fue centrifugada a 10.000 rpm, durante 10 minutos. El
sobrenadante se diferenció por capas sobre un cojín de CsCl 5,7 M, y
se centrifugó durante 16 horas a 33.000 rpm. El pellet de ARN se
lavó con etanol 70%, se resuspendió en H_{2}O, y se extrajo con
cloroformo:isobutanol, 4:1 , y se precipitó con etanol. El ARN poli
A(+) fue aislado tras dos rondas de purificación en columnas de
oligo (dT)-celulosa.
Se usó agarosa de temperatura ultra baja de
gelificación (SeaPrep, FMC) para fraccionar el ARN poli A(+) por
tamaño. La agarosa (2%) se hirvió en NaPO_{4} 15 mM, EDTA 1 mM, pH
6.5, y una vez que estuvo totalmente disuelta, se le añadió ácido
iodoacético (AIA) 15 mM, y la agarosa se hirivió 2 minutos
adicionales para desactivar cualquier ARN-asa
presente. Todas las soluciones se trataron con dietilpirocarbonato
0,1% durante 12 horas, y pasadas por el autoclave durante 15
minutos. El gel, y el peine preparativo, se empaparon en AIA 15 mM
durante 12 horas, y fueron aclarados con H_{2}O tratada con DEP.
El gel se moldeó y se realizó la electroforesis a 4ºC en NaPO_{4}
15 mM, EDTA pH 6.5 1 mM y 6,5 V/cm, con circulación tampón. Se le
realizó la electroforesis al ARN durante aproximadamente 20 horas, o
hasta que el cilanol de xileno hubiera penetrado 7 cm en el gel. Se
tomaron lonchas de gel de aproximadamente 1-2 mm,
desde los 7,5 cm dentro del gel, hasta el origen del mismo, y se
numeraron 1-47 (de abajo a arriba).
Se precipitó con etanol aproximadamente 150
\mug de ARN poli A(+) de C. elegans, y el pellet desecado
se resuspendió en 400 \mul de formamida, y se desnaturalizó a 65ºC
durante 3 minutos; se le añadió 50 \mul de SDS 1%, EDTA 10 mM, se
mezcló, y la muestra se calentó a 65ºC durante 3 minutos. Se le
añadió 50 \mul de tampón de carga de ARN (glicerol 50% EDTA 1mM
BPB 0,4%, XC 0,4%), y la muestra fue inmediatamente cargada.
Las lonchas de gel se añadieron a tubos de 15 ml,
y se bañaron a 65ºC hasta que se fundieron. Se añadió 10 ml de 1x
oligo dT tampón de unión (BB) precalentado (KCl 0,5 M, HEPES pH 7.5
10 mM, EDTA 1 mM), y la muestra se mezcló, y se llevó a temperatura
ambiente (unos 23ºC). Se hidrató en 1x BB, 1 g de celulosa oligo dT
(Tipo 7, Farmacia), y se resuspendió en 15 ml de 1x BB con 1 ug/ml
de tARN, y 25 u/ml de RNasin (Promega). Se proporcionaron 200 \mul
de la suspensión en celulosa oligo dT, en las muestras de agarosa
fundida, y se mezcló durante 1 hora. La muestra fue centrifugada,
lavada una vez con 1x BB, y dos veces con tampón de lavado (KCl 0,1
M, HEPES pH 7.5 10 mM, y EDTA 1 mM). Se transfirió la muestra a
tubos, y se centrifugó a 10.000 x g, 1 minuto, y el pellet fue
resuspendido en 200 \mul de tampón de elución (HEPES pH 7.5 10 mM,
EDTA 1 mM). El ARN fue extraído con fenol tamponado a 65ºC, y
CHCl_{3} a 22ºC, y se añadió acetato sódico hasta los 0,3 M con 1
\mug de tARN transportador, y el ARN se precipitó con 2 volúmenes
de etanol. Se repitió la precipitación de etanol, y el ARN se
almacenó a -20ºC, hasta su uso, como un precipitado de etanol.
El plásmido vector pBluescript SKII(+) se obtuvo
del Stratagene. El plásmido (4 \mug) se digirió con 20 unidades de
Not I, y 24 unidades de EcoRV, en NaCl 150 mM,
Tris-HCl pH 7.9 6 mM, MgCl_{2} 6 mM, DTT 1 mM, en
un volumen de 46 \mul, durante 2 horas a 37ºC. Las enzimas fueron
desactivas por calor a 65ºC, durante 10 minutos, y extraídas 2 veces
con fenol tamponado, 2 veces con CHCl_{3}, y precipitado con
Acetato sódico 0,3 M, y con 2 volúmenes de etanol 100%. El pellet
fue resuspendido en 20,5 \mul de agua. y se añadió 2,5 \mul de
tampón 10x AP (Tris-HCl pH 9.0 0,5 M, MgCl_{2} 10
mM, ZnCl_{2} 1 mM, espermidina 10 mM), con 1 \mul (1 unidad) de
fosfatasa alcalina (Promega), y se les hizo reaccionar durante 30
minutos a 42ºC con una alícuota adicional de 1 unidad de AP añadida,
y reaccionaron durante otros 30 minutos a 37ºC. La muestra fue
sometida a electroforesis a través de gel de agarosa SeaKem LE 0,8%,
en tampón TAE (Tris-Acetato 40 mM, EDTA pH 8.3 1
mM), y se purificaron los vectores lineales de ADN a partir del gel,
usando el Clean Gene (Bio101).
Aproximadamente 75 ng de ADN lineal pBluescript
SK II(+) EcoRV-Not I digerido, se mezcló con
aproximadamente 6 ng de cADN, de aproximadamente 3,1 ml del comienzo
de la columna CL6B, en 15 \mul, y se trató con 0,5 unidades de ADN
T4 ligasa (Boehringer Mannheim) durante 16 horas a 16ºC. Las
muestras se precipitaron con la adición de 7,5 \mul de acetato
amónico 8 M, y de 2 volúmenes de etanol 100%. El pellet fue lavado
en etanol 70%, secado y resuspendido en 2 \mul de agua.
Síntesis del primer filamento:
Aproximadamente la mitad del ARN procedente de las fracciones 21 y
22 fue usado para sintetizar cADN. El precipitado de ARN fue
centrifugado, y se lavó el pellet con etanol 70%, y se secó en el
vacío. El pellet de ARN fue resuspendido en 25 \mul de H_{2}O
tratada con DEP, calentado a 65ºC durante 10 minutos, y colocado en
hielo. Los siguientes reagentes se añadieron una vez colocado en el
hielo: 2 \mul de RNasin (40 u/\mul), 1 \mul de Actinomicina D
(800 \mug/\mul refrescados en etanol 100%), 10 \mul de tampón
5x RT (Tris-HCl pH 8.3 250 mM, KCl 375 mM,
MgCl_{2} 15 mM, BRL), 5 \mul de DTT 0,1 M, 5 \mul de dNTPs 5
mM, 2,8 \mul de 1 lng/\mul oligonucleótido
primer
primer
5'GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGCGGCCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTT3'
(SEQ. ID. NO.: 5), y 0,5 \mul de
200 u/\mul de transcriptasa inversa de virus Moloney Murine
Leukemia. La reacción se incubó durante 60 minutos a 37ºC, se
extrajo con fenol:CHCl_{3} (1:1, v:v, con fenol tamponado con
Tris-HCl pH 7.4, BRL), y se purificó con una columna
de sepharosa G-50, de acuerdo a las especificaciones
de los fabricantes (Boehringer
Mannheim).
Síntesis del segundo filamento: La
producción del primer filamento a partir de la columna
G-50 (Boehringer Mannheim) se ajustó a 55 \mul, y
se añadieron los siguientes reagentes, a 4ºC: 10 \mul de tampón
10x del segundo filamento (Tris pH 7.4 200 mM, MgCl_{2} 70 mM, KCl
1 M), 5 \mul de BSA (1 mg/ml), 3 \mul de dNTPs (nucleótido
tri-fosfatos) 5 mM, 10 \mul de NAD (pH 7.2, 1,4
mM, hecho con métodos de ARNasa libre, y almacenado a -20ºC), 5
\mul de aP^{32}dCTP (3.000 Ci/mmol, 10,0 mCi/ml), 2,5 \mul de
E. coli ligasa (NEBL 6 u/\mul), 1,1 \mul de ARNasa H (1,1
u/\mul Pharmacia), 7 \mul de ADN pol I (4 u/\mul Pharmacia).
La reacción tuvo lugar a 16ºC durante 60 minutos, 22ºC durante 120
minutos, 65ºC durante 10 minutos, y luego se colocó en hielo. La
reacción se extrajo 2 veces con fenol tamponado, y 2 veces con
CHCl_{3}:alcohol isoamilo (24:1, v:v). Se quitó una muestra de 1
\mul para la cuantificación de la síntesis del cADN, y se añadió
Acetato sódico hasta los 0,3 M, con 20 \mug de glicógeno
(Boehringher Mannheim), y 2 volúmenes de etanol 100%, y el ADN
precipitado a -20ºC. La síntesis de cADN se cuantificó mediante
precipitación TCA. Se hizo una dilución 1:10 tras la síntesis del
segundo filamento, y se añadió 1 \mul a 10 ml de Aquasol, para
estimar el material radioactivo total que se había añadido. Se
mezcló una alícuota de 1 \mul, con 50 \mug de ADN transportador
en 100 \mul y 100 \mul de TCA 25%, y se añadió pirofosfato
sódico 0,1%, en hielo, durante 15 minutos. El precipitado se
recolectó por filtración de vacío en un filtro de cristal
GF-B que había sido previamente empapado en TCA 10%
y pirofosfato sódico 0,1%, a 4ºC, y se lavaron los filtros con TCA
10% congelado. Los filtros se añadieron a los frascos que contenían
10 ml de Aquasol, y se cuantificó la radioactividad. La producción
estimada de cADN, de aproximadamente una mitad del ARN, de las
fracciones 21 y 22, fue de 282 ng.
El ADN procedente de la síntesis del segundo
filamento, fue tratado con ADN T4 polimerasa, para desafilar los
extremos del ADN. El pellet de ADN fue resuspendido en 25 \mul de
agua, y se añadió 3 \mul de tampón 10x ADN T4 polimerasa, con 1,5
\mul de dNTPs 5 mM, y 0,5 \mul de ADN T4 polimerasa. La reacción
tuvo lugar a 37ºC durante 30 minutos, y se detuvo mediante la
adición de 0,5 \mul de EDTA 500 mM, se extrajo 2 veces con tampón
fenol:CHCl_{3} (1:1), 2 veces con CHCl_{3}, y se precipitó con
acetato sódico 0,3 M, y con 2 volúmenes de etanol 100%. El pellet de
ADN se resuspendió en 17 \mul de agua y 0,2 \mul de BSA 1 mg/ml
y 2 \mul de tampón 10x Not I (NEBL) y 0,4 \mul (4 u) de Not I, y
fue incubado a 37ºC durante 3 horas. La muestra se extrajo 2 veces
con tampón fenol:CHCl_{3} (1:1), 2 veces con CHCl_{3}, y se
precipitó con acetato sódico 0,3 M, y con 2 volúmenes de etanol
100%. El precipitado de ADN se resuspendió en 25 \mul de agua, y
se calentó a 65ºC durante 5 minutos, y se enfrió en hielo, y se
añadieron 2,5 \mul de NaCl 5 M, y se aplicó la muestra sobre una
columna de Sepharosa CL6B (0,7 x 22 cm), la cual estaba
pre-equilibrada, y corría en NaCl 0,5 M,
Tris-HCl pH 7.4 10 mM, y EDTA 1 mM. Se recolectaron
100 \mul de muestras, y se monitorizaron por el conteo de
Cherenkoff para las fracciones que contuvieran cADN, las cuales
estaban excluidas de la columna, y se enjuagaron del volumen de la
columna vacía, aproximadamente 3,1 ml. El cADN se cuantificó
basándose en las actividades específicas obtenidas a partir de la
precipitación TCA, y estimándose una eficiencia en la medida del
conteo de Cherenkoff, del 21%. Se estimó que la producción de cADN
en el pico 8 de las fracciones, fue de unos 268 ng. Cada una de las
fracciones de 100 \mul fue precipitada con etanol con 10 \mug de
glicógeno, y dos volúmenes de etanol 100%. Los pellets se
resuspendieron en 10 \mul de agua, y se extrajeron con tampón
fenol:CHCl_{3} (1:1), siendo extraído el fenol cloroformo con 5
\mul de agua, y extraído dos veces con CHCl_{3}, añadido 1,5
\mul de acetato sódico 3 M y siendo añadido 16,5 \mul de
isopropanol a 22ºC. Se recogió el pellet por centrigugación, se lavó
y secó y resuspendió en 5 \mul de agua. Se le realizó la
electroforesis al ADN, dentro de células TOP10 de E. coli
(Invitrogen), y se seleccionaron los clones por crecimiento en medio
líquido con ampicilina. El ADN extraído de archivos amplificados,
representando 2 x 10^{5} recombinantes, fue Not I digerido, y
separado por tamaño mediante electroforesis en gel. El ADN lineal de
4,0 a 4,7 Kb, fue recubierto (con Celan Gene, Bio101) y reclonado en
reservas de 5000 recombinantes. Las 5000 colonias fueron sembradas
en placas de agar LB-Amp individuales, crecieron por
la madrugada, se recogieron por raspado en medio LB, y 1/3 fue
congelado a -70ºC como reserva de bacterias, y el resto se usó para
preparar ADN con el sistema Promega Wizard Miniprep. El ADN se
linearizó con Not I, y se usó para sintetizar ARN in
vitro.
Los oocitos de Xenopus laevis fueron
preparados e inyectados usando métodos estándar previamente
descritos y conocidos en el medio [Arena, J.P., Liu, K.K., Paress,
P.S. & Cully, D.F. Mol. Pharmacol. 40,
368-374 (1991); Arena J.P., Liu K.K., Paress, P.S.,
Shaeffer, J.M. & Cully, D.F. Mol. Brain Res. 15,
339-348 (1992)]. Las hembras adultas de Xenopus
laevis fueron anestesiadas con metanosulfonato de tricaína
0,17%, y los ovarios fueron extraídos quirúrgicamente, y colocados
en un plato que contenía (mM): NaCl 82,5, KCl 2, MgCl_{2} 1,
CaCl_{2} 1,8, HEPES 5 ajustado a pH 7.5 con NaOH
(OR-2). Los lóbulos ováricos fueron abiertos,
enjuagados varias veces, y suavemente sacudidos en
OR-2 conteniendo colagenasa (Sigma, Tipo 1A) 0,2%
durante 2-5 horas. Cuando se hubieron quitado
aproximadamente el 50% de las capas foliculares, fueron
seleccionados los oocitos de las etapas V y VI, y se los colocó en
un medio que contenía (mM): NaCl 86, KCl 2, MgCl_{2} 1, CaCl_{2}
1,8, HEPES 5, piruvato sódico 2,5, teofilina 0,5, gentamicina 0,1
ajustada a pH 7.5 con NaOH (ND-96) durante
24-48 horas antes de la inyección. Los oocitos se
inyectaron con 50-70 nl de ARN poly A(+) (1 mg/ml) o
50 nl de GluCl\alpha (0,1-100 ng) y/o GluCl\beta
(0,1-100 ng). Los oocitos control se inyectaron con
50 nl de agua. Se incubaron los oocitos durante 2-10
días en ND-96 antes de las grabaciones. Las
incubaciones y la digestión de la colagenasa se llevaron a cabo a
18ºC.
Las grabaciones se realizaron a temperatura
ambiente, 2-10 días después de la inyección. A menos
que se indique de otro modo, las grabaciones se realizaron en suero
salino estándar de rana, que contiene (mM): NaCl 115, KCl 2,
MgCl_{2} 1, CaCl_{2} 1,8, HEPES 10 ajustado a pH 7.5 con NaOH.
Los oocitos fueron sometidos a gradiente de voltaje, usando un
amplificador estándar de dos microelectrodos (Dagan 8500 o
TEV-200, Minneapolis, MN). Se llenaron las pipetas
con KCl 3 M, y se pusieron las resistencias entre
0,5-3,0 M\Omega. Un tanque de grabación, de
plexiglás (volumen de 200 \mul) era constantemente rellenada, a un
ritmo de 10 ml/min. El tanque de grabación estaba conectado a tierra
directamente con el electrodo Ag/AgCl, o a través de un puente de
agar KCl 3 M, si el cloruro extracelular hubiera variado. Para bajas
soluciones de cloruro, el NaCl fue reemplazado con concentraciones
equimolares de ácido isetiónico sódico. Para bajas soluciones de
sodio, el NaCl fue reemplazado con KCl o Cl colina, equimolares. Se
consiguieron los datos, y se analizaron, usando PCLAMP con una
interfaz TL-1 (Axon Instruments, Foster City, CA).
Se grabó una corriente de membrana con un potencial sostenido de -80
mV. La amplitud de la corriente sensible a la droga, fue determinada
substrayendo la corriente sostenida a -80 mV, del pico de corriente
obtenido en presencia de la droga. Se filtraron los datos a 30 Hz, y
se muestrearon a 16,6 Hz. La relación corriente/voltaje (I/V), y los
potenciales inversos (E_{rev}), se determinaron usando gradiente
de voltaje de 1-3 s. sobre el rango de voltaje de
-110 a +80 mV. Para los gradientes, los datos se filtraron a
0,3-3 kHz y se muestrearon a 160 Hz. La corriente en
solución libre de droga, se substrajo de la corriente en presencia
de droga, para obtener las relaciones de corriente/voltaje sensibles
a la
droga.
droga.
Los oocitos de Xenopus inyectados con ARN
Poli (A)+ de C. elegans, exhibieron una corriente sensible
rápidamente activable, reversible con el glutamato, e irreversible
con la ivermectina 4-O-fosfato
(IVMPO_{4}) (Fig.5 [Arena, J.P., Liu, K.K., Paress, P.S.,
Schaeffer, J.M., & Cully, D.F. Mol. Brain Res. 15,
339-348 (1992); Arena et al., 1991
supra]. Para aislar un clon de cADN funcional para el canal
sensible a glutamato y IVMPO_{4}, se construyó un archivo de cADN
direccional, a partir de las fracciones 1,7-1,9 Kb,
del ARN poli (A)^{+} de C. elegans, fraccionado por
tamaño. Se observaron las corrientes sensibles al glutamato y al
IVMPO_{4}, tras la inyección de ARN sintetizado in vitro a
partir de la reserva de 5.000 cADNs. El subfraccionamiento de esta
población de cADNs en reservas menores, indicaron que eran
necesarias dos subunidades para recuperar las respuestas del
glutamato y el IVMPO_{4}. Se identificó que, dos reservas de 500
cADNs, al ser añadidas juntas, recuperaban ambas respuestas. El clon
cADN del pGluCl\alpha, fue aislado por
co-inyección de ARN procedente de una reserva
subfraccionada con ARN de una segunda reserva de 500 cADNs. El clon
cADN del pGluCl\beta, se aisló por subfraccionamiento de la
segunda reserva de 500 clones, y por co-inyección
con ARN in vitro de pGluCl\alpha. Cuando se redujo la
complejidad de las reservas subfraccionadas, a 25 cADNs, fue posible
identificar respuestas en oocitos inyectados con una única
reserva.
Se examinaron las propiedades electrofisiológicas
en oocitos inyectados con ARN in vitro de pGluCl\alpha y
pGluCl\beta (Fig. 5). Los oocitos con expresión simultánea de las
proteínas pGluCl\alpha&\beta, exhibieron la corriente
rápidamente activable sensible a glutamato de manera reversible, y
al IVMPO_{4}de manera irreversible, también encontrada en oocitos
inyectados con ARN Poli (A)^{+} (Fig. 5). El tiempo para la
máxima activación de la corriente sensible al IVMPO_{4}fue de
42\pm2 segundos para lo GluCl \alpha&\beta, y de 36\pm3
segundos para los ARN Poli (A)^{+}. La desensibilización de
la corriente sensible a glutamato, vista en oocitos inyectados con
ARN Poli (A)^{+}, también se observó en oocitos inyectados
con GluCl \alpha&\beta, a concentraciones de glutamato
mayores de 1 mM. Las subunidades individuales, GluCl\alpha o
GluCl\beta, expresaron canales funcionales homoméricos, que
respondieron selectivamente al IVMPO_{4}o al glutamato,
respectivamente (Fig. 5). El tiempo transcurrido para la activación
de los canales homoméricos GluCl\alpha por el IVMPO_{4}, fue de
18 \pm 1 segundos, más rápido que el observado para GluCl
\alpha&\beta o para ARN Poli (A)^{+} (p<0,001).
Los canales GluCl\alpha fueron insensibles al glutamato a
concentraciones tan altas como 10 mM, mientras que el umbral de
activación por el glutamato, de los canales GluCl\beta
homoméricos, fue de 50 \muM. Fue necesario inyectar 10 veces más
ARN a las subunidades individuales para conseguir corrientes con
amplitudes comparables a las de los oocitos
co-inyectados, sugiriendo que la formación funcional
de canales homoméricos, es menos eficaz.
El análisis de las curvas de las respuestas a las
dosis de glutamato e IVMPO_{4}, indicaron que la coexpresión de
GluCl \alpha&\beta dieron como resultado cambios en la
afinidad a los ligandos, y en el coeficiente de Hill (Fig. 5). La
co-inyección de GluCl\alpha con GluCl\beta, dio
lugar a un cambio en el EC_{50} para el glutamato, de 380 a 1360
\muM. (Fig. 1b). Los coeficientes de Hill, de 1,9 para el
GluCl\beta, y de 1,7 para el GluCl \alpha&\beta, sugieren
que se necesita más de una molécula de glutamato para regular los
canales. La EC_{50} para la activación de corriente por el
IVMPO_{4}, fue similar en oocitos inyectados con GluCl\alpha y
GluCl \alpha&\beta, con valores de 140 y 190 nM,
respectivamente (Fig. 5). Sin embargo, el coeficiente de Hill varió
del 1,5 para el GluCl\alpha, al 2,5 para el GluCl
\alpha&\beta, sugiriendo un incremento en el número de
moléculas de IVMPO_{4} necesarias para abrir el canal. Los cambios
observados en el EC_{50} y en el coeficiente de Hill, no pueden
deberse a la activación de los canales GluCl\alpha por el
glutamato, o a la activación de los canales GluCl\beta por el
IVMPO_{4}, puesto que esos canales homoméricos no responden a esos
ligandos (Fig. 5).
Las propiedades de permeabilidad, y las
relaciones de voltajes de corriente en oocitos que expresan canales
GluCl \alpha&\beta, fueron similares a los observados en
oocitos con ARN poly (A)^{+} inyectado (Fig. 6) [Arena,
J.P., Liu, K.K., Paress, P.S. & Cully, D.F. Mol. Pharmacol.
40, 368-374 (1991); Arena, J.P., Liu, K.K.,
Paress, P.S., Schaeffer, J.M. & Cully, D.F. Mol. Brain.
Res.15, 339-348 (1992)]. Los canales GluCl
\alpha&\beta fueron selectivos para el cloruro, como se
demostró con el cambio del potencial inverso (E_{rev}) para la
corriente sensible al glutamato o al IVMPO_{4}, tras la
sustitución del NaCl externo, con isotionato sódico (Fig. 6). Los
canales GluCl \alpha&\beta fueron impermeables a los
cationes monovalentes, puesto que al reemplazar el NaCl externo con
KCl o colina-Cl, no hubo cambio en el E_{rev}
(Fig. 6). Los estudios de la permeabilidad para los canales
homoméricos GluCl\alpha y GluCl\beta, también revelaron
selectividad para los aniones, antes que para los cationes (Fig. 6).
Tanto en los canales GluCl\alpha como en los GluCl\beta, la
sustitución de NaCl con isotionato sódico, generaron cambio del
E_{rev} a voltajes positivos, mientras que la sustitución con KCl
o con colina-Cl, no tuvo efecto en el E_{rev}
(Fig. 6). El E_{rev} de los canales GluCl\alpha en el isotionato
sódico, indicó que había permeabilidad al anión isotionato, mas
grande, con un radio respecto al cloruro de 0,2 [Goldman, D.E. J.
Gen. Physiol. 27, 37-60 (1943); Hodgkin, A.L.
& Katz B. J. Physiol. (Lond.) 108, 37-77
(1949)].
La relación de tensión corriente (I/V) en oocitos
inyectados con GluCl \alpha&\beta, mostró una dependencia
externamente rectificante del voltaje (Fig. 6). La I/V para las
corrientes sensibles al glutamato o al IVMPO_{4}, mostraron una
dependencia similar del voltaje, tal como confirmaron los ajustes de
los datos a la ecuación de campo constante (Fig. 6) [Goldman, D.E.
J. Gen. Physiol. 27, 37-60 (1943)], [Hodgkinm
A.L. & Katz B. J. Physiol. (Lond.) 108,
37-77 (1949)]. Las curvas I/V para los canales
GluCl\alpha o GluCl\beta homoméricos, se desviaron mucho de las
curvas I/V para GluCl \alpha&\beta, y no se ajustaron bien a
los supuestos del campo constante (Fig. 6). La corriente sensible al
glutamato de los canales GluCl\beta, exhibió una pronunciada
dependencia del voltaje externamente rectificante con pequeñas
corrientes en voltajes negativos (Fig. 6). La corriente sensible al
IVMPO_{4}de los canales GluCl\alpha, mostró esencialmente una
dependencia lineal del voltaje (Fig. 6).
El IVMPO_{4} tuvo un efecto dual en los oocitos
inyectados con ARN Poli (A)^{+} de C. elegans
[Arena, J.P., Lui, K.K., Paress, P.S. & Cully, D.F. Mol.
Pharmacol. 40, 368-374 (1991)], [Arena, J.P.,
Liu, K.K., Paress, P.S., Schaeffer, J.M. & Cully, D.F. Mol.
Brain. Res.15, 339-348 (1992)]. Además de la
activación directa de la corriente (Fig. 5), la corriente sensible
al glutamato es potenciada por bajas concentraciones de IVMPO_{4}
(Fig. 7) [Arena, J.P., Liu, K.K., Paress, P.S., Schaeffer, J.M.
& Cully, D.F. Mol. Brain. Res. 15,
339-348 (1992)]. Así mismo, el IVMPO_{4} (5 nM)
potenció 490\pm45% a la corriente sensible al glutamato, en
oocitos inyectados con GluCl \alpha&\beta (Fig. 7). La
co-aplicación del IVMPO_{4} y el glutamato, movió
el EC_{50}para el glutamato, de 1360 a 360 \muM, y redujo el
coeficiente de Hill, de 1,7 a 1,3. Las respuesta de la canales
GluCl\beta homoméricos al glutamato, no fueron potenciados por el
IVMPO_{4} (Fig. 7). En contraste, siguiendo a altas
concentraciones de IVMPO_{4} (1 \muM), la corriente sensible al
glutamato se redujo 88\pm4% en oocitos inyectados con GluCl\beta
(Fig. 7). En oocitos que expresaban canales GluCl\alpha, los
cuales no respondían al glutamato (Fig. 5), la activación primaria
de la corriente por el IVMPO_{4}, dio lugar a un incremento de la
corriente con glutamato, de 20\pm4% (Fig. 7). La corriente
sensible al glutamato en oocitos inyectados con canales
GluCl\alpha, fue observada solamente siguiendo a la activación de
corriente con el IVMPO_{4}, y pudo ser observada con
concentraciones de glutamato tan bajas como 10 \muM.
El perfil farmacológico de los oocitos inyectados
con GluCl \alpha&\beta, fue distinto de todos los otros
canales cloruro regulados por ligando clonados, y de los canales
catión regulados por glutamato (Tabla 1). Se probaron muchos canales
ion regulados por ligando, tanto agonistas como antagonistas, en
oocitos inyectados con GluCl \alpha&\beta (Tabla 1). Todos
los compuestos estaban inactivos, excepto por el ibotenato, un
análogo estructural del glutamato, del cual se sabe que activa a los
canales cloruro sensibles al glutamato [Cull-Candy,
S.G. J. Physiol. 255, 449-464 (1976); Arena,
J.P., Liu, K.K., Paress, P.S., Schaeffer, J.M. & Cully, D.F.
Mol. Brain. Res. 15, 339-348 (1992); Lea,
T.J. & Usherwood, P.N.R. Comp. Gen. Pharmacol. 4,
351-363 (1973)]. Las corrientes sensibles al
glutamato y al IVMPO_{4}, fueron bloqueadas con picrotoxina y
ácido flufenámico, con una dependencia de la concentración similar a
la reportada para el ARN Poli (A)^{+} de C. elegans
[Arena, J.P., Liu, K.K., Paress, P.S. & Cully, D.F. Mol.
Pharmacol. 40, 368-374 (1991); Arena, J.P., Liu,
K.K., Paress, P.S., Schaeffer, J.M. & Cully, D.F. Mol. Brain.
Res.15, 339-348 (1992)].
Muchas líneas de evidencia indicaron que la
co-expresión de GluCl \alpha&\beta, lleva a
la formación de canales heteróméricos. La primera indicación de
asociación de subunidades, fue durante el procedimiento de
clonación, donde se requirieron dos reservas de cADNs para obtener
respuestas. En segundo lugar, es necesario inyectar 10 veces más ARN
de las subunidades individuales, para alcanzar el nivel de expresión
obtenido con los oocitos co-inyectados. Además, se
observaron los siguientes cambios en las respuestas específicas para
ligandos, en los oocitos que coexpresaron GluCl
\alpha&\beta: el curso del tiempo de la activación de
corriente por el IVMPO_{4}; la afinidad por el glutamato y el
coeficiente de Hill de la activación de corriente por el
IVMPO_{4}; diferencias en la rectificación de la relación I/V; la
permeabilidad al isetionato; y la potenciación por el IVMPO_{4},de
la respuesta al glutamato. La indéntica dependencia del voltaje en
las curvas I/V sensibles al glutamato y al IVMPO_{4}, en oocitos
co-inyectados, sugiere fuertemente que la mayoría de
los canales formados son heteroméricos. Si un número significativo
de canales homoméricos GluCl\alpha y GluCl\beta estuviesen
presentes en los oocitos co-inyectados, entonces la
curva I/V sensible al glutamato sería más externamente rectificante
que la I/V para la corriente sensible al IVMPO_{4}. Estos
resultados sugieren que las propiedades observadas en oocitos
co-inyectados, representan las propiedades de los
canales heteroméricos.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Los oocitos fueron inyectados simultáneamente con
RNA de GluCl\alpha y de GluCl\beta (25 pg cada uno). n = al
menos cuatro para cada grupo.
a- Los datos son expresados como % de la
respuesta obtenida con glutamato 10 mM. b- NR = no respuesta. c-
N-metil-D-aspartato.
d- ácido
a-amino-3-hidroxil-5-metil-4-isoxazol
propiónico. e- El bloqueo se consideró 0 si la respuesta en
presencia del bloqueador era \pm 3% del control. f-
(-)-Bicuculina metocloruro. g-
-6-ciano-7-nitroquino-xalino-2,3-diona.
Los oocitos inyectados con ARN in vitro de
GluCl\alpha y GluCl\beta, fueron usados en binding assays para
la ivermectina-^{3}H y el
glutamato-^{3}H. Se inyectó ARN de GluCl\alpha
(1 ng) y de GluCl\beta (1 ng) en oocitos individualmente, o se
co-inyectó (0,5 ng de cada uno), y 2 días después,
se rompieron los oocitos con un homogeinizador dounce, y las
proteínas de la yema del huevo fueron extraídas usando métodos
estándar conocidos en la materia. Se realizaron binding assays de
equilibrio de lingandos, usando procedimientos convencionales. Los
oocitos que expresaban tanto GluCl \alpha&\beta como
GluCl\alpha, se unieron a la ivermectina-^{3}H
con una alta afinidad, aproximadamente 0,2 nM. Se observaron uniones
específicas con el glutamato-^{3}H en
preparaciones de membrana, a partir de oocitos inyectados con
GluCl\alpha. Los oocitos que expresan GluCl \alpha&\beta,
son usados para medir la afinidad de la unión de otros compuestos, y
su capacidad para desplazar la unión a la
ivermectina-^{3}H y al
glutamato-^{3}H.
Las secuencias de nucelótidos de pGluCl\alpha y
de pGluCl\beta, revelaron grandes y únicos marcos abiertos de
lectura, de entre 1383 y 1302 pares de bases. Los cDNAs tienen
extensiones 5' y 3' sin traducir, de entre 50 y 90 nucleótidos para
el pGluCl\alpha, y de entre 13 y 144 nucleótidos para el
pGluCl\beta, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos de las
pGluCl\alpha y pGluCl\beta, en las regiones de los marcos
abiertos de lectura, compartieron aproximadamente el 50% de la
identidad. Las primeras metioninas dentro del marco, fueron
designadas como los codones de iniciación para los marcos abiertos
de lectura, que predecían una proteína GluCl\alpha con una masa
molecular (M_{r}) estimada de aproximadamente 52.550, y una
proteína de GluCl\beta con una M_{r} de aproximadamente 49.900.
Ambas proteínas contenían residuos amino terminales, hidrofóbicos,
con secuencias altamente predictivas de los sitios con señales de
escisión que darían lugar a proteínas maduras, iniciando en el
aminoácido 21 en GluCl\alpha, y en el 23 en GluCl\beta. La
comparación de las proteínas GluCl\alpha y GluCl\beta,
mostraron un 45% de identidad de aminoácidos, y un 63% de
similaridad.
Las proteínas GluCl\alpha y GluCl\beta
predichas, fueron alineadas con nucleótidos y bases de datos de
proteínas, y se encontró que estaban relacionadas con los receptores
de glicina y de GABA_{a}. Aproximadamente el 21% de los
aminoácidos en GluCl\alpha y GluCl\beta, estaban altamente
conservados, mostrando al menos un 75% de identidad de aminoácidos,
con la familia de los canales de cloruro regulados por ligandos. Los
motivos conservados encontrados en esta familia de canales, tales
como un gran dominio extracelular NH_{2}-terminal,
y los cuatro dominios hidrofóbicos transmembrana, del M1 al M4,
también fueron encontrados en las secuencias de GluCl\alpha y de
GluCl\beta. Las proteínas GluCl\alpha y GluCl\beta contenían
los residuos de cisteína conservados, encontrados en el dominio
extracelular de todos los canales de cloruro regulados por ligandos
(aminoácidos 191 y 205 en GluCl\alpha, y 161 y 175 en
GluCl\beta). Había también dos residuos adicionales de cisteína,
que también se encuentran en canales cloruro regulados por glicina
(aminoácidos 252 y 263 en GluCl\alpha, y aminoácidos 223 y 234 en
GluCl\beta). La proteína GluCl\alpha contenía una fuerte
secuencia de consenso para el sitio de fosforilación por la
proteín-kinasa C, localizado entre los dominios
putativos atravesantes de la membrana, M3 y M4. En subunidades del
receptor de GABA_{a}, se localizan similares sitios de
fosforilación, en el dominio intracelular entre M3 y M4, y se cree
que juegan un rol importante en la regulación de los canales
[Leidenheimer, N.J., McQuilkin, S.J., Hahner, L.D., Whiting, P.
& Harris, R.A. Mol. Pharm. 41, 1116-1123
(1992)], [Kellenberger, S., Malherbe, P. & Sigel, E. J. Biol.
Chem. 267, 24660-25663 (1992)]. Al igual que lo
encontrado en las secuencias de los receptores de glicina y
GABA_{a}, las proteínas GluCl\alpha y GluCl\beta contenían en
los dominios extracelulares propuestos, sitios putativos de
glicosilación unida a N. Los análisis de alineación con la
acetilcolina y las subunidades del canal catión glutamato, mostraron
que GluCl\alpha y GluCl\beta compartían aproximadamente 10% y
<5% de similaridad, respectivamente.
Se realizó un análisis filogenético con las
secuencias enteras de las proteínas GluCl\alpha y GluCl\beta,
las subunidades de los receptores de glicina y GABA_{a}, y
secuencias de proteínas de invertebrados relacionadas. Se mostró una
discreta división evolutiva en esta familia de proteínas, debido a
una divergencia en dos ramas mayores, que acabaría en la división de
las subunidades \alpha y \gamma del GABA_{a}, respecto a las
restantes proteínas. Dentro de esas grandes ramas, hay
sub-ramas que agrupan a las proteínas en las
respectivas subclases, tales como GABA_{a} \alpha, \beta,
\gamma, delta (d), rho ®, y glicina \alpha y \beta. Las
secuencias de Drosophila melanogaster (Dros) y de Lymnae
stagnalis (Lym), representan las secuencias de proteínas de
invertebrados disponibles que son similares a los canales anión de
apertura regulada por ligandos. Las secuencias de las proteínas
GluCl\alpha y GluCl\beta de C. elegans están libremente
agrupadas en la misma rama que la glicina \alpha y \beta, y que
las proteínas Lym zeta (\zeta) y Dros rdl, sugiriendo que
esas proteínas fueron originadas por un ancestro común. Las
proteínas GluCl\alpha y GluCl\beta están más relacionadas con
las glicinas que con las proteínas, tal como indica la menor
longitud de sus miembros de unión. Este análisis sugiere que las
proteínas GluCl\alpha y GluCl\beta forman una
sub-rama independiente, separada de las otras
proteínas. Se obtuvieron similares árboles filogenéticos, usando un
programa de parsimonia máxima, o cuando se analizaron por separado
los dominios extracelulares (y los que atraviesan la membrana) de
GluCl\alpha y GluCl\beta.
Aunque las proteínas GluCl\alpha y GluCl\beta
están filogenéticamente relacionadas con la glicina \alpha y
\beta, y con las proteínas Lym zeta (\zeta) y Dros rdl,
son farmacológicamente distintas. Los estudios de expresión en
oocitos de Xenopus muestran que los canales de cloruro
homoméricos funcionales están formados por las proteínas glicina
\alpha, que son sensibles a la glicina [Schmieden, V.,
Grenningloh, G., Schofield, P.R. & Betz, H. EMBO Journal
8, 695-700 (1989)], y por las proteínas Dros
rdl que son sensibles al GABA
[Ffrench-Constant, R.H., Rocheleau, T.A., Steichen,
J.C. & Chalmers, A.E. Nature 363, 449-451
(1993)]. Los canales de glicina b homomérica se forman con poca
eficiencia [Grenningloh, G., et al., Neuron 4,
963-970 (1990)], y las proteínas Lym \zeta no
forman canales homoméricos funcionales [Hutton, M.L., Harvey, R.J.,
Earley, F.G.P., Barnard, E.A. & Darlinson, M.G. FEBS letters
326, 112-116 (1993)]. Puesto que los canales
homoméricos GluCl\alpha y GluCl\beta son insensibles al GABA,
glicina y canales agonistas y antagonistas relacionados (ver Tabla
1), esos canales parecen haber desarrollado ligandos distintos de
manera selectiva, separados de sus canales relacionados
filogenéticamente.
El análisis de hibridación fue realizado con ARN
poli (A)+ y ADN genómico de C. elengans, usando los cADNs de
GluCl\alpha y GluCl\beta como sondas. La hibridación de elevado
rigor de las sondas de cADN con ADN genómico digerido con
restricción, mostró que los cADNs de GluCl solo hibridan a un único
fragmento de la copia del ADN. La hibridación de elevado rigor del
ARN de C. elegans, mostró que el GluCl\alpha hibridizó a
ARN de 2,4 y 1,7 Kb, y el GluCl\beta hibridizó a ARN de 1,7 Kb.
Las sondas usadas para este estudio representan solo las regiones de
los cADNs de GluCl\alpha y GluCl\beta que codifican los grandes
marcos únicos de lectura abierta. Las sondas GluCl\alpha y
GluCl\beta fueron hibridadas con YAC de C. elegans y con
archivos de cósmidos. Esta hibridación mostró que el gen de
GluCl\alpha está localizado en el cromosoma V, en el YAC # Y42B4 y
en el cósmido # C25D4. El gen de GluCl\beta está localizado en el
cormosoma I, YAC # Y24C9 y cósmido # C04E4. La clasificación de los
YAC y cósmido, está sacada de John Sulston, MRC labs, Cambridge,
England.
El GluCl recombinante es producido en E.
coli, tras la transferencia del cassette de expresión del GluCl
dentro de los vectores de expresión E. coli, incluyendo
(aunque no quedando limitado a) la series pET (Novagen). Los
vectores pET ponen la expresión de GluCl bajo el control del
estrechamente regulado promotor bacteriófago T7. A continuación de
la transferencia de esta construcción dentro del hospedador E.
coli, el cual contiene una copia cromosomial del gen de la
polimerasa ARN T7 conducido por el promotor inducible lac, la
expresión de GluCl es inducida cuando un substrato lac adecuado
(IPTG) es añadido al cultivo. Los niveles de GluCl expresados son
determinados mediante los análisis indicados anteriormente.
El cADN que codifica todo el marco de lectura
abierta para el GluCl\alpha y \beta, se inserta dentro del sitio
NdeI del pET [16]11a. Las construcciones en la orientación
positiva, son identificadas por análisis de secuencia, y se usan
para transformar la cepa hospedadora de expresión BL21. Los
transformantes son entonces usados para inocular cultivos para la
producción de proteína GluCl. Los cultivos pueden realizarse en
medios M9 o ZB, cuya formulación es conocida para los entendidos de
la materia. Tras el crecimiento a OD_{600}=1,5, se induce la
expresión de GluCl con IPTG 1 mM durante 3 horas, a 37ºC.
Los cADNs de GluCl fueron clonados en vectores de
expresión de mamíferos, pMAMneo y pcDNA3. Los plásmidos Bluescript
de GluCl\alpha y GluCl\beta fueron digeridos con Not I, y
tratados con enzima Klenow, para crear un final romo de clonación.
Los insertos fueron extraídos con digestión Sal I, y purificados
mediante electroforesis en gel de agarosa. El vector pMAMneo fue
tratado con XhoI, enzima Klenow, y entonces Sal I, y con fosfatasa
intestinal de ternera (PIT). El vector lineal fue purificado en gel
de agarosa, y usado para ligarse a los insertos de cADN de GluCl. Se
aislaron los recombinantes, designados
GluCl\alpha-pMAMneo y
GluCl\beta-pMAMneo, y se usaron para transfectar
células de mamífero (células L) mediante precipitación
CaPO_{4}-ADN. Las células fueron transfectadas con
GluCl\alpha-pMAMneo,
GluCl\beta-pMAMneo, o tanto
GluCl\alpha-pMAMneo como
GluCl\beta-pMAMneo. Se seleccionaron clones
celulares estables mediante crecimiento en presencia de G418. Los
únicos clones resistentes a G418 fueron aislados, y resultaron
contener el gen GluCl\alpha o el gen GluCl\beta intactos, o
incluso los dos genes, GluCl\alpha y GluCl\beta, intactos. Los
clones que contenían los cADNs de GluCl son analizados para la
expresión, usando técnicas inmunológicas, tales como
inmunoprecipitación, un "Western", e inmunofluorescencia,
usando anticuerpos específicos para las proteínas GluCl. El
anticuerpo se obtiene de conejos inoculados con péptidos que son
sintetizados a partir de la secuencia de aminoácidos predicha por
las secuencias de GluCl. La expresión se analiza también mediante
técnicas de potencial-parcheado electro fisiológico,
y por binding assay con ivermectina-^{3}H y
glutamato-^{3}H.
Los genes GluCl\alpha o GluCl\beta fueron
insertados en pdDNA3. Los GluCl\alpha -Bluescript SKII+ y
GluCl\beta - Bluescript SKII+ fueron digeridos con XhoI y NotI, y
los insertos de cADN se aislaron mediante electroforesis en gel de
agarosa. El vector, pcDNA3, se digirió con XhoI y NotI, se trató con
PIT, y los vectores lineales se aislaron mediante electroforesis en
gel, y se ligaron con los insertos de cADN. Los plásmidos
recombinantes GluCl\alpha-pcDNA3 y
GluCl\beta-pcDNA3 son usados para transformas las
células de mamífero COS o CHO.
Las células que expresan GluCl\alpha o
GluCl\beta, y GluCl\alpha & \beta, estable o
transitoriamente, serán usadas para hacer pruebas para la expresión
de canales cloruro sensibles al glutamato y a la avermectina, y para
la actividad de unión de ligandos. Esas células se usan para
identificar y examinar otros compuestos por su capacidad para
modular, inhibir o activar a los canales de cloruro sensibles al
glutamato y la avermectina, y para competir por con la unión de
glutamato e ivermectina radioactivos.
Los cassettes que contienen el cADN de GluCl con
orientación positiva con respecto al promotor, están ligados en los
sitios apropiados de restricción 3' del promotor, y son
identificados por mapeo y/o secuenciado del sitio de restricción.
Esos vectores de expresión de cADN, son introducidos en células
hospedadoras fiboblásticas, como por ejemplo COS-7
(ATCC# CRL1651), y CV-1 tat [Sackevitz et al.,
Science 238: 1575 (1987)], 293, L (ATCC# CRL6362)], mediante
métodos estandar que incluyen (aunque no están limitados a) la
electroporación, o procedimientos químicos (liposomas catiónicos,
DEAE dextrano, fosfato cálcico). Las células transfectadas y los
sobrenadantes del cultivo celular, pueden ser cosechados y
analizados para ver la expresión de GluCl, tal como se ha descrito
aquí.
Todos los vectores usados para la expresión
temporal en mamíferos, pueden ser usados para establecer líneas
celulares expresantes de GluCl, de manera estable. Se espera que las
construcciones de cADN de GluCl, inalteradas, y clonadas en vectores
de expresión, programen a las células hospedadoras para producir
proteína GluCl. Además, la GluCl es expresada extracelularmente como
una proteína secretada al ligar construcciones de cADN de GluCl, al
ADN codificante de la secuencia señal de la proteína secretada. Las
células hospedadoras de transfección incluyen (aunque no están
limitadas a) CV-1-P [Sackevitz et
al., Science 238: 1575 (1987)], tk-L
[Wigler, et al., Cell 11: 223 (1977)], NS/0, y
dHFr-CHO [Kaufman and Sharp, J. Mol. Bil.
159: 601, (1982)].
La co-transfección de cualquier
vector que contenga cADN de GluCl, con un plásmido de selección de
droga, incluyendo (aunque no quedando limitados a) G418,
fosfotransferasa aminoglicósido; higromicina,
higromicin-B fosfotransferasa; APRT,
xantina-guanina
fosforibosil-transferasa; permitirá la selección de
clones transfectados establemente. Los niveles de GluCl son
cuantificados mediante los análisis descritos aquí mismo.
Las construcciones de cADN de GluCl también son
ligadas a vectores que contienen marcadores amplificables de
resistencia a drogas, para la producción de clones celulares de
mamíferos que sinteticen los niveles más altos posibles de GluCl. A
partir de la introducción de esas construcciones dentro de las
células, se seleccionan los clones que contengan el plásmido,
mediante el agente apropiado, y se realiza el aislamiento de un clon
sobre-expresante con un elevado número de copias de
plásmidos, mediante selección en crecientes dosis del agente.
La expresión de GluCl recombinante se alcanza
mediante transfección de cADN de GluCl en toda su longitud, dentro
de una célula de mamífero hospedadora.
Los vectores bacilovirus, los cuales están
derivados del genoma del virus AcNPV, son diseñados para para
proporcionar un alto nivel de expresión de cADN en la línea Sf9 de
células de insectos (ATCC CRL# 1711). El cADN expresante de GluCl,
de bacilovirus recombinantes, es producido por los siguientes
métodos estandar (en el Manual de Vitrogeno Maxbac): las
construcciones están ligadas al gen polihedrin en distintos
bacilovirus vectores de transferencia, incluyendo el pAC360 y el
vector BlueBac (en Vitrogeno). Los bacilovirus recombinantes son
generados por recombinación homóloga, siguiendo a la
co-transfección del bacilovirus vector de
transferencia, con el ADN genómico linearizado AcNPV [Kitts, P.A.,
Nuc, Acid. Res. 18: 5667 (1990)], dentro de células Sf9. Los
virus recombinantes pAC360 son identificados por la ausencia de
cuerpos de inclusión en células infectadas, y los virus
recombinantes pBlueBac son identificados en la base de la expresión
de \beta-galactosidasa (Summers, M.D. and Smith,
G.E., Texas Agriculture Exp. Station Bulletin No. 1555). Siguiendo a
la purificación de placa, la expresión del GluCl es medida mediante
los análisis descritos aquí.
El cADN codificante del marco entero de lectura
abierta para las subunidades de GluCl, es insertado en el sitio
BamHI del BlueBacII. Las construcciones con orientación positiva,
son identificadas mediante análisis de secuencia, y se usan para
transfectar células Sf9 en presencia del ADN AcNPV de tipo
suave.
El auténtico GluCl activo se encuentra en el
citoplasma de las células infectadas. El GluCl se extrae de las
células infectadas mediante lisis hipotónica, o lisis con
detergente.
El GluCl recombinante es producido en la levadura
S. cerevisiae tras la inserción del cistrón cADN de GluCl
óptimo, dentro de vectores de expresión diseñados para dirigir la
expresión intra o extracelular de proteínas heterólogas. En el caso
de la expresión intracelular, los vectores como el EmBLyex4, o
similares, son ligados al cistrón GluCl [Rinas, U. et al.,
Biotechnology 8: 543-545 (1990); Horowitz, B.
et al., J. Biol. Chem. 265: 4189-4192
(1989)]. Para la expresión extracelular, el cistrón GluCl se liga
dentro de vectores de expresión de levadura, los cuales fusionan una
señal de secreción (un péptido de mamífero o de levadura) al término
NH_{2} de la proteína de GluCl [Jacobson, M.A., Gene 85:
511-516 (1989); Riett, L. and Bellon, N. Biochem.
28: 2941-2949 (1989)].
Esos vectores incluyen (aunque no quedan
limitados a) el pAVE1>6, el cual fusiona la señal del suero
humano de albúmina, al cADN expresado [Steep, O. Biotechnology 8:
42-46 (1990)]; y el vector pL8PL, el cual fusiona la
señal de lisozima humana, al cADN expresado [Yamamoto, Y.,
Biochem. 28: 2728-2732)]. Además, el GluCl es
expresado en la levadura como una proteína de fusión, conjugada a la
ubiquitina, usando el vector pVEP [Ecker, D. J., J. Biol. Chem.
264: 7715-7719 (1989), Sabin, E. A.,
Biotechnology 7: 705-709 (1989), McDonell D.
P., Mol. Cell Biol. 9: 5517-5523 (1989)]. Los
niveles de GluCl expresado, son determinados mediante los análisis
descritos aquí.
El GluCl producido mediante recombinación, puede
ser purificado por cromatografía de afinidad por anticuerpos.
Las columnas de afinidad a anticuerpos de GluCl
son hechas añadiendo los anticuerpos anti-GluCl al
Affigel-10 (Biorad), un soporte de gel que es
preactivado con ésteres N-hidroxisuccinimida, de tal
modo que los anticuerpos forman enlaces covalentes con el soporte de
gel de agarosa. Los anticuerpos se unen entonces al gel a través de
la unión de la amida con el brazo espaciador. Los ésteres activados
que quedan, son completados entonces con
HCl-etanolamina (pH 8) 1 M. Se lava la columna con
agua, seguida de HCl-glicina (pH 2,6) 0,23 M, para
remover cualquier anticuerpo no-conjugado, o
proteína extraña. A continuación se equilibra la columna con tampón
fosfato salino (pH 7,3), junto con agentes solubilizantes de
membrana apropiados, tales como detergentes, y entonces se pasan a
través de la columna los sobrenadantes del cultivo celular, o los
extractos celulares que contengan subunidades de GluCl, o GluCl
solubilizada. La columna es lavada entonces con tampón fosfato
salino, junto con detergentes, hasta que la densidad óptica (A280)
caiga al nivel del trasfondo, y entonces la proteína es enjuagada
con HCl-glicina (pH 2,6) 0,23 M, junto con
detergentes. La proteína GluCl purificada se dializa entonces contra
tampón fosfato salino.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- ASPIRANTES: Cully, Doris F.
\hskip3.7cmArena, Joseph P.
\hskip3.7cmLiu, Ken K.
\hskip3.7cmVassilatis, Demetrios
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: ADN CODIFICANTE DE LOS CANALES CLORURO DE APERTURA REGULADA POR GLUTAMATO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 5
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIONES DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Wallen, John W.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 126 E. Lincoln Ave., P.O. Box 2000
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Rahway
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: New Jersey
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAIS: E.E.U.U.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- ZIP: 07065
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMAS DE LECTURA POR EL ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- MEDIO TIPO: disquette
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.25
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/249.112
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE LA CUMPLIMENTACIÓN: 25 de mayo de 1994
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Wallen, John W.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 35.403
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/CEDULA: 19194
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (908) 594-3905
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (908) 594-4720
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1542 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FILAMENTACIÓN: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1479 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FILAMENTACIÓN: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 510 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FILAMENTACIÓN: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 487 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FILAMENTACIÓN: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 46 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FILAMENTACIÓN: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAGAGAGAGA GAGAGAGAGA GCGCGCCGCTT TTTTTTTTTT TTTTTT
\hfill46
Claims (16)
1. Una proteína de canal cloruro regulado por
glutamato (GluCl) de C. elegans, substancialmente libre de
otras proteínas, que comprende ambas secuencias de aminoácidos
dispuestas en SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4.
2. Un vector de expresión para expresar proteína
del canal GluCl de C. elegans, en una célula hospedadora
recombinante, en la cual el vector de expresión mencionado comprende
el ADN codificante de la secuencia de aminoácidos dispuesta en SEQ
ID NO: 3.
3. Un vector de expresión para expresar proteína
del canal GluCl de C. elegans, en una célula hospedadora
recombinante, en la cual el vector de expresión mencionado comprende
el ADN codificante de la secuencia de aminoácidos dispuesta en SEQ
ID NO: 4.
4. El vector de expresión de la reivindicación 2,
que comprende la secuencia de nucleótidos dispuesta en SEQ ID NO:
1.
5. El vector de expresión de la reivindicación 3,
que comprende la secuencia de nucleótidos dispuesta en SEQ ID NO:
2.
6. Una molécula de ADN purificada que codifica un
proteína que comprende una secuencia de aminoácidos como la
dispuesta en SEQ ID NO: 3.
7. Una molécula de ADN purificada que codifica un
proteína que comprende una secuencia de aminoácidos como la
dispuesta en SEQ ID NO: 4.
8. La molécula de ADN purificada de la
reivindicación 6 la cual está constituida por la secuencia de
nucleótidos como la dispuesta en SEQ ID NO: 1.
9. La molécula de ADN purificada de la
reivindicación 7 la cual está constituida por la secuencia de
nucleótidos como la dispuesta en SEQ ID NO: 2.
10. Una célula hospedadora que expresa una
proteína del canal GluCl recombinante de C. elegans, donde
dicha célula contiene un vector de expresión de acuerdo con la
reivindicación 2 o con la 4, y un vector de expresión de acuerdo con
la reivindicación 3 o con la 5.
11. Un proceso para expresar proteína del canal
GluCl de C. elegans en una célula recombinante hospedadora,
que comprende:
(a) la transfección, en una célula hospedadora
apropiada, de un vector de expresión de acuerdo con la
reivindicación 2 o con la 4, y un vector de expresión de acuerdo con
la reivindicación 3 o con la 5; y
(b) el cultivo de la célula hospedadora del paso
(a) bajo condiciones que permitan la expresión de la proteína del
canal GluCl de C. elegans mencionada, a partir del mencionado
vector de expresión.
12. Un método de identificación de compuestos que
modulan la actividad de la proteína de unión al glutamato y/o la
avermectina, que comprende:
(a) proveer, por medio de vectores de expresión
recombinantes, de una proteína GluCl de C. elegans, donde
dicha proteína comprende ambas secuencias de aminoácidos dispuestas
en SEQ ID NO: 3 y en SEQ ID NO: 4; y
(b) combinar un modulador putativo de dicha
actividad, con dicha proteína, y medir el efecto del modulador
putativo sobre dicha proteína.
13. Un método de identificación de compuestos que
modulan la actividad del canal anión de apertura regulada por el
glutamato, que comprende:
(a) proveer una célula expresante de proteína
GluCl de C. elegans, por medio de vectores de expresión
recombinantes, o por medio de ARN sintético, donde la mencionada
proteína comprende ambas secuencias de aminoácidos dispuestas en SEQ
ID NO: 3 y en SEQ ID NO: 4; y
(b) combinar un modulador putativo de la
actividad de dicho canal, con la mencionada célula, y medir el
efecto del modulador putativo sobre el canal.
14. El método de la reivindicación 12, o de la
13, en el que el efecto medido es de inhibición o aumento de la
unión de los ligandos a canales anión de apertura regulada por
glutamato.
\newpage
15. El método de la reivindicación 12, o de la
13, en el que el efecto medido es de estimulación o inhibición del
flujo de aniones mediada por los canales anión de apertura regulada
por glutamato.
16. El método de la reivindicación 15 en el que
el flujo de aniones es un flujo de cloruro en membrana.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US249112 | 1994-05-25 | ||
| US08/249,112 US5527703A (en) | 1994-05-25 | 1994-05-25 | DNA encoding glutamate gated chloride channels |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2232822T3 true ES2232822T3 (es) | 2005-06-01 |
Family
ID=22942110
Family Applications (1)
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