JPH10508249A - 分離用材料およびそれらの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒドロキシル基を含有しており、その表面が共有結合したポリマーで被覆されている支持体を基材とする分離用材料およびそれらの製造方法に関する。この分離用材料は、そのポリマーが下記式Ｉで表わされる同一の反復単位からなることを特徴とするものである： 式中、ＸはＣＯ−ＮＨ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＳＯ₃Ｈであり、そしてｎは2〜100である。

Description

【発明の詳細な説明】 分離用材料およびそれらの製造方法 本発明はヒドロキシル基を含有しており、その表面が共有結合したポリマーで 被覆されている支持体を基材とする分離用材料およびそれらの製造方法に関する 。本発明による分離用材料は高分子、特にバイオポリマーの分別に使用すること ができる。生体高分子、例えば核酸、蛋白質、酵素、細胞レベル以下単位、ペプ チド類、モノクローナル抗体または完全細胞の分離および精製は、遺伝子工学お よびバイオテクノロジーに関連して格別の重要性を得てきている。 例えば、生物学的高分子の分別にイオン交換体を使用することは公知である。 慣用の材料はポリマー類、例えばポリメタアクリレート類、ポリスチレン類、ア ガロース、架橋したデキストランまたはシリカゲルからなり、これらは適当な官 能性基を担持している。 EP 337 144には、ヒドロキシル基を含有しており、その表面が共有結合したポ リマーで被覆されている支持体を基材とする分離用材料が記載されており、この ポリマーはセリウム（IV）イオンの存在におけるグラフト重合により支持体に結 合されている同一または相違する反復単位からなる。 全体として、これらの分離用材料は最適とはいえず、特に製造方法およびその グラフト形成率（grafting yield）に関しては、依然としてかなりの欠陥を有し ている。 本発明の目的は、上記欠陥を有さない最適の分離用材料を入手できるようにす ることにある。 本発明はヒドロキシル基を含有しており、その表面が共有結合したポリマーで 被覆されている支持体を基材とする分離用材料に関するものであり、この材料の 特徴はポリマーが下記式Ｉで表わされる同一の反復単位からなることにある： 式中、ＸはＣＯ−ＮＨ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＳＯ₃Ｈであり、そして ｎは2〜100、好ましくは15〜50である。 本発明はさらにまた、これらの分離用材料の製造方法に関し、この方法はグラ フト重合を、ポリアクリル化混合物中でセリウム（IV）イオンおよび無機塩1〜3 .5モル／リットルの存在下に行うことを特徴とする方法である。 この場合に、重合に必要なモノマーを、水性溶液中で安定剤の存在下にアクリ レートとアミノエタンスルホン酸とを反応させることによって製造し、グラフト 重合に直接使用すると特に有利である。 驚くべきことに、本発明による支持材料は高速クロマトグラフイ分離に特に適 することが証明された。本発明による分離用材料は高分子、特にバイオポリマー のイオン交換クロマトグラフイに広く利用できる。 本発明による分離用材料はヒドロキシル基を有し、かつまたその上にモノマー スルホエチルアクリルアミドから出発して、このヒドロキシル基のα−Ｃ原子を 介してポリマー物質がグラフトされている支持粒子からなる。 支持粒子は、その表面上に一級または二級の脂肪族ヒド鎖キシル官能性基を有 する、一般に公知の有孔質および無孔質のクロマトグラフイ用支持体の全部であ ることができる。 この場合の好ましい例としては、アクリレートおよびメタアクリレートを基材 とする親水性ポリマー、ポリビニルアルコールを基材とするポリマー、ジオール 置換シリカゲル、アガロースを基材とする多糖類、セルロース、セルロース誘導 体またはデキストランを基材とするポリマーが挙げられる。しかしなから、ヒド ロキシル化した形態のビニル化合物、アクリルアミド、（メタ）アクリル酸エス テル類または（メタ）アクリロニトリルなどのモノマーを基材とする、その他の ポリマーまたはコポリマーを使用することもできることは勿論のことである。 降下流法と称される高速クロマトグラフイ分離の性能は、近年重要性を増して きている。高速分離の実施において、例えば蛋白質の精製において考慮されるべ き重要な二点がある。すなわち、精製される蛋白質と支持材料との接触が長過ぎ ると、生物学的活性の減少を導くこと、および長い溶離時間の間に細胞破裂分解 をもたらすプロテアーゼが放出されることである。 しかしながら、高速分離を行う場合の基本的予備条件は、蛋白質結合能が線型 流動速度（linear flow rate）とは独立していることにある。連続孔を有する粒 子を構築することによって、1000cm／時間よりも早い線型流動速度を有する非常 に高速のクロマトグラフイ用の材料が開発されている。しかしなから、結合した リガンドの種類がまた、高速クロマトグラフイ用支持材料の適応性に対して影響 を及ぼすことは、現在まで知られていなかったことである。 本発明によりここに、リガンド（カチオン交換体中の）の化学構造といわゆる 動的蛋白質結合能（dynamic protein binding capacity）（線型流に依存する漏 出能）の大きさとの間には依存性が存在することが見出された。 動的蛋白質結合能を測定するために、モノマー スルホエチルアクリルアミド をセリウム（IV）イオンの存在下にフラクトゲル（Fractogel）（登録商標名） 上にグラフトさせ、カラム［スーパーフォーマンス（Superformance）（登録商 標名）、50〜10mm］に充填した。試料としては、リン酸塩緩衝液中のリゾチーム 10mg／mlの溶液を使用した。この場合に、720cm／時間の線型流動速度において 、動的蛋白質結合能は25.6％のみ減少されることが見出された。同一実験方法に よるが、グラフトされるモノマーとしてスルホイソブチルアクリルアミドを使用 した場合には、この動的蛋白質結合能は65.5％減少された。これは、驚くべきこ とに、結合したリガンドの性質が高速クロマトグラフイ用支持材料の適合性に対 して多大の影響力を有することを示している。 さらにまた、グラフト重合用の混合物中の無機塩の濃度が高いほど、グラフト 形成率の格別の増大が得られることが、驚くべきことに見出された。これは中で も、置換ポリアクリルアミド型のグラフトしたイオン交換体の場合に、蛋白質に 対する動的結合能の格別の増大によって証明される。この従来未知の驚くべき効 果の結果として、基材上にグラフト重合させることによって製造されるクロマト グラフイ支持体および使用されるその他の粒子または膜状材料の内面に達成する ことができるリガンド濃度の制御可能性が得られる。この効果は、強力に酸性の 基を含有する親水性モノマーを使用した場合、例えば本発明に従い使用されるス ルホエチルアクリルアミドの場合に、特に得られる。 グラフト重合用のポリアクリル化混合物中の無機塩の濃度は、1〜3.5モル／リ ットル、好ましくは2〜3モル／リットルの範囲にあるべきである。この重合にお いては、重合の開始に使用される開始剤、例えばセリウム（IV）イオンとの相互 反応を受けないか、僅かにのみ相互反応を受ける塩の全部を使用することができ る。本発明による方法に適する無機塩には、例えば塩化ナトリウム、過塩素酸ナ トリウム、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム等、およびまたこれらの塩の混合 物がある。 ポリアクリル化混合物中により高濃度の無機塩（例えば、３モル／リットルの 塩化ナトリウムまたは１モル／リットルの塩化ナトリウムおよび１モル／リット ルの過塩素酸ナトリウム）を添加することによって、例えばフラクトゲル（登録 商標名）HW65（Ｓ）またはフラクトゲル（登録商標名）ＨＷ65（Ｍ）に対するス ルホエチルアクリルアミドのグラフト形成率は、より少ない塩濃度（１モル／リ ットルの塩化ナトリウム）を有する相当する混合物に比較して、3倍まで増加さ れる。図１は、３モル／リットルの塩化ナトリウムが存在するか(曲線a)、また は１モル／リットルの塩化ナトリウムが存在するかあるいは塩が添加されていな い場合（曲線b）における、リゾチームに対するフラクトゲル（登録商標名）EMD SE−650(Ｓ)の動的結合能のポリアクリル化時間に対する依存性を示している。 この混合物の濃度はそれぞれの場合に、ゲル2.5リットル／総容積12.5リットル であった。塩が添加されていない混合物に比較して、蛋白質に対して達成するこ とができる結合能にかかわる結果に際立った改良が見られる。さらにまた、この 種の「グラフト動態」（grafting kinetics）の組込みにより決定される反応条 件は、バッチ中の重要成分を変更した場合でも、生成物の蛋白質結合能の再現性 を有する制御を可能にすることは明白である。 種々の無機塩がこれらによって重合混合物中に導入されるイオンの種類に応じ てグラフト形成率に対して相違する効果を有する。リゾチームに対するグラフト 生成物の最高結合能は、ゲル200mg／mlを使用して、１モル／リットルの過塩素 酸ナトリウムを存在させてポリアクリル化させることによって得られた。これに 関連して、使用されたモノマー溶液中で事前に行われた中和反応の結果として、 反応混合物中に１モル／リットル濃度の塩化ナトリウムをさらに存在させた。し かしながら、過塩素酸ナトリウムを省略した混合物では、反応時間を12時間まで 延長させた場合でも、ゲル65mg／mlの最高結合能が達成された。過塩素酸ナトリ ウムの代わりに塩化ナトリウム、硫酸アンモニウムおよび硫酸ナトリウムを1〜3 .5 モル／リットルの濃度で添加することによって、100〜180mg／mlの数値まで増大 した結合能が得られた。 本発明による分離用材料の製造は、スルホエチルアクリルアミドを用いるグラ フト重合によって行う。この場合に、スルホエチルアクリルアミドは、その一部 をアクリル酸誘導体とアミノエタンスルホン酸との反応によって製造する。使用 される好適アクリル酸誘導体はアクリロイルクロライドであり、この化合物は新 たに蒸留し、暗所で−20℃において保存すると、約２年間にわたり本発明による 使用に対する適性を保有する。アクリロイルクロライドとアミノエタンスルホン 酸とを反応させる場合に、安定剤を添加する必要がある。この安定剤は、使用直 前のアクリロイルクロライドに添加し、次いで数時間以内に、かつまた10℃より 温くならないうちに、アクリル化反応に使用することができる。この方法で安定 化されたスルホエチルアクリルアミドは、検知できる有害な変化を受けることな く、数か月にわたり暗所で10℃以下の温度において水溶液として安定である。 本発明に従う有効な安定剤は、特に４−メトキシフェノールであることが証明 された。この安定剤は、約0.01〜2ｍＭの濃度でグラフト混合物中に使用すべき である。 この方法により製造されたスルホエチルアクリルアミドの水溶液は、ＨＰＬＣ を用いる分析において副生成物の存在の兆しを示さない。従って、４−メトキシ フェノールによるアクリロイルクロライドの前述の簡単な安定化はオリゴマー形 成の回避に適するものと見做されるべきことがまた証明される。驚くべきことに 、引続くグラフト重合中における前記の特異な安定剤の存在は重合の結果に対し て妨害作用を有していない。例１ アミノエタンスルホン酸のアクリル化 蒸留水400ml中のアミノエタンスルホン酸50gおよび水酸化ナトリウムペレット 32gの溶液を、氷浴中で５℃に冷却させる。短時間前に４−メトキシフェノール3 .85mgが添加されているアクリロイルクロライド32mlを、温度が８℃を越えない ように１時間かけて、この溶液に滴下して添加する。次いで氷浴を取り除き、こ の混合物のｐＨを25％塩酸によりｐＨ４に調整し、次いでさらに１時間撹拌する 。例２ フラクトゲル（登録商標名）に対する重合 例１による溶液810mlおよび0.5Ｍ硝酸50ml中に溶解した硝酸セリウム（IV）ア ンモニウム14.5gからの開始剤溶液を、塩化ナトリウム292.2gを含有する蒸留水1 200mlおよびフラクトゲル（登録商標名）ＨＷ 65 Ｓ 400mlからなる懸濁液に添 加し、この混合物を室温で５時間撹拌する。この反応混合物をＰ２ガラスフリッ トを用いて吸引濾過し、次いで下記の洗浄溶液により洗浄する： 各500mlの、 0.2Ｍ硫酸／0.2Ｍ亜硫酸ナトリウム、 蒸留水、２回、 0.2Ｍ硫酸、 蒸留水、２回、 1Ｍ水酸化ナトリウム溶液、 蒸留水、 リン酸塩緩衝液、0.2Ｍ、ｐＨ７。 得られたゲルは、0.02Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７）中の0.2％ナトリウムアジ ドに添加するか、あるいは別法として、20％エタノール／150ｍＭ塩化ナトリウ ム中で保存する。 塩化ナトリウム292.2gの代わりに、例えば硫酸アンモニウム330.35gまたは過 塩素酸ナトリウム351.15gを使用することもできる。例３ 動的蛋白質結合能の測定 a）スーパーホーマンス（Superformance）（登録商標名）50−10mmカラムに、 例２からの分離用材料を充填し、次いで20ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７）中のリ ゾチーム10mg／mlの試料50mlを適用する。この溶出液を280nmで測定し、下記の 結果を得た： この表は、例２による分離用材料を使用した場合の720cm／時間の線型流動速 度における動的蛋白質結合能は25.6％減少したのみであることを示している。 b）スルホエチルアクリルアミド基の代わりに、スルホイソブチルアクリルア ミド基を付加した分離用材料を用いて、測定を行う。例3a）と同様の方法を行い 、下記の結果を得た： この結果は、720cm／時間の線型流動速度において、動的蛋白質結合能は出発 時結合能の35％の数値を有するのみであることを示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ブリッシュ，ロタール ドイツ連邦共和国 デー−79276 ロイテ、 メースレシュトラーセ 20

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ヒドロキシル基を含有しており、その表面が共有結合したポリマーで被覆さ れている支持体を基材とする分離用材料であって、このポリマーが式Ｉ 式中、ＸはＣＯ−ＮＨ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＳＯ₃Ｈであり、そして ｎは2〜100である、 で表わされる同一の反復単位からなることを特徴する、前記分離用材料。 ２．グラフト重合をポリアクリル化混合物中でセリウム（IV）イオンおよび無機 塩1〜3.5モル／リットルの存在下に行うことを特徴とする、請求項１に記載の分 離用材料の製造方法。 ３．モノマーを、水性溶液中で安定剤の存在下にアクリレートとアミノエタンス ルホン酸とを反応させることによって製造し、グラフト重合に直接使用すること を特徴とする、請求項２に記載の分離用材料の製造方法。 ４．使用する安定剤が４−メトキシフェノールであることを特徴とする、請求項 ３に記載の方法。