JPH10508595A

JPH10508595A - アジュバント効果を有したキャリアタンパク質、それを含んだ免疫原複合体、その製造方法、ヌクレオチド配列およびワクチン

Info

Publication number: JPH10508595A
Application number: JP8515107A
Authority: JP
Inventors: バン，ハンス; ボサン，ティエリ; アユー，ジャン−フランソワ; ゴック，ティアンギアン
Original assignee: ピエール、ファーブル、メディカマン
Priority date: 1994-11-07
Filing date: 1995-11-07
Publication date: 1998-08-25
Also published as: AU4119996A; US6197929B1; DE69533961D1; EP0791063A1; EP0791063B1; FR2726472A1; ATE287954T1; ZA959416B; US7408044B2; DK0791063T3; FR2726472B1; ES2236718T3; CA2204510A1; WO1996014415A1; US20060034870A1; PT791063E; US6780420B1; AU714423B2; DE69533961T2; NZ296561A

Abstract

(57)【要約】 Klebsiella pneumoniae タンパク質Ｐ４０の少くとも一部またはそれと少くとも８０％相同性のタンパク質を含むことを特徴とする、宿主へ投与されたとき分子の活性を増加させるためのアジュバント物。このようなペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および薬物としてのその配列の用途も開示されている。このようなＤＮＡ配列は筋肉内または皮内免疫用組成物として特に用いられる。

Description

【発明の詳細な説明】アジュバント効果を有したキャリアタンパク質、それを含んだ免疫原複合体、その製造方法、ヌクレオチド配列およびワクチン本発明は、活性を改善するために、特に免疫応答の強さを増加させるために、分子に結合されるようにしたアジュバントに関する。またそれは、活性分子に結合されたこのようなアジュバントを含む複合体にも関する。活性分子には、特にタンパク質、ペプチド、多糖、オリゴ糖あるいはＤＮＡまたはＲＮＡ核酸がある。完全に明確にされて著しい副作用のないワクチンの開発には、ペプチドまたはオリゴ糖のような低分子量の免疫抗原の使用を必要とする。低分子量のこれら抗原と、細菌壁多糖のようなそれより高い分子量のある抗原は、それら自体では持続性の強力な免疫応答を誘導できない。化学的手段によるかまたは遺伝子操作を用いることにより、これらの抗原をキャリアタンパク質に連結させることが不可欠である。現在用いられているキャリアタンパク質には、以下の２タイプがある： ‐破傷風およびジフテリア毒素：これらキャリアタンパク質の頻繁な使用はハプテンに対する強い応答を損ない、免疫毒性による問題の可能性を生じる ‐Neisseria meningitidis（ＯＭＰＣ）からの膜タンパク質抽出物：脂質およびＬＰＳが混入した膜タンパク質からなるＥＰ‐２６７２０４特許では、免疫原にカップリングさせるための、E.coli またはサルモネラ膜タンパク質からなるサポート分子の使用を提案した。その出願人は、Klebsiella pneumoniae の外膜から抽出されたタンパク質が、抗原またはハプテンに対する免疫応答を、それが後者と同時に宿主に投与されたときに著しく改善することを明らかにした。更に詳しくは、ＯｍｐＡタンパク質、K.pneumoniaeのＰ４０タンパク質は、それが免疫原要素に結合されたときに、免疫原複合体でアジュバントとして用いることができる。ペプチドをＰ４０にカップリングさせて得られる化学複合体は良好な結果をもたらし、その免疫応答の評価ではＫＬＨまたはＴＴ参照キャリアタンパク質が用いられたときに観察される場合よりも大きな抗体応答をこれらのペプチドに対して示す。しかしながら、ペプチド抗原は分子の最も免疫原性な部分である配列のＣ末端部分に優先的に結合される（Puohiniemi,R.et al.,1990,Infect Immu.58,1691-1 696）。これは完全Ｐ４０配列を含んだ融合タンパク質の場合に深刻な問題を生じることがある。したがって、アジュバント活性を支える配列の断片の使用は、キャリアタンパク質の免疫原性とこの免疫原性に伴うリスクを最少に抑える上で大きな影響を有するであろう。この理由から、本発明は、免疫原要素が抗原またはハプテンであり、アジュバントがKlebsiella pneumoniae のＰ４０タンパク質の少くとも一部またはＰ４０タンパク質と少くとも８０％の相同率、好ましくは少くとも９０％の相同率を示すタンパク質を含んでなることを特徴とする、免疫応答の強さを増加させるアジュバントに結合された免疫原要素を含んでなるタイプの免疫原複合体に関する。特に、本発明は免疫原性部分を実質的に欠いたＰ４０配列を有するタンパク質またはペプチドからなるアジュバントに関する。本発明によるこれらのＰ４０断片には、特に以下がある： ‐免疫原性細胞周辺Ｃ末端部分を欠いたＰ４０配列 ‐膜内配列に隣接した第三および第四膜外ループを含む配列 ‐１つのインバリアント膜外ループと隣接膜内配列を含む配列それらのＰ４０配列は、異なる腸内細菌種間に保存されているループの配列と相同的であるインバリアント膜外ループとして規定される。進化の過程で保存されなかった膜外ループの配列は、可変ループと称される。膜外ループは、E.coli ＯｍｐＡに関連したVogel and Jahnigモデル（1986,J.Mol.Biol.,190:191-199）に従い位置している。断片、そして更に詳しくは第三配列（アミノ酸１２７‐１７９）の選択は、インバリアント膜外ループ（異なる腸内細菌のＯｍｐＡ間に保存されている）が、免疫適格細胞により認識される配列を含んでおり、これら細胞はこれら配列を認識するレセプターを有することができる、という仮説に基づいている。抗原提示細胞によるこれら配列の特異的認識は、抗原をこれらの細胞に向けさせて、こうしてアジュバント効果を誘導することができる。この理由から、本発明は、また、K.pneumoniaeのＰ４０タンパク質のアミノ酸１‐１７９に包含された配列からなるアジュバント産物、またはK.pneumoniaeのＰ４０タンパク質の配列のアミノ酸１‐１７９に包含された配列と少くとも８０％、好ましくは少くとも９０％の相同率を示す配列にも関する。本発明は更に、K.pneumoniaeのＰ４０タンパク質のアミノ酸１０８‐１７９に包含された配列からなるアジュバント、またはK.pneumoniaeのＰ４０タンパク質のアミノ酸１０８‐１７９に包含された配列と少くとも８０％の相同率、好ましくは少くとも９０％の相同率を示す配列に関する。もう１つの態様によれば、本発明はK.pneumoniaeのＰ４０タンパク質のアミノ酸１２７‐１７９に包含された配列からなるアジュバント、またはK.pneumoniae のＰ４０タンパク質のアミノ酸１２７‐１７９に包含された配列と少くとも８０％、好ましくは少くとも９０％の相同率を示す配列に関する。配列番号２、４、６、および８が本発明によるアジュバントに相当する。このタンパク質とこれらペプチドのアジュバントは、特にKlebsiella pneumoniae 種の細菌の膜から作られる。その方法は下記工程からなる：ａ）界面活性剤と二価カチオンの塩を加えることによりリポ多糖を沈降させて、上澄を回収し、ｂ）上澄からタンパク質を沈降させて、沈降物を再懸濁し、ｃ）陰イオン交換体で懸濁物をクロマトグラフィーに付して、アジュバント産物を含有したフラクションを回収し、ｄ）陽イオン交換体でクロマトグラフィーに付して、アジュバント産物を含有したフラクションを回収し、ｅ）リポ糖を本質的に含まないタンパク質またはペプチドの形でアジュバント産物を回収するために、工程ｄ）から得られたフラクションを濃縮する。透析工程は、有利には、工程ｂ）およびｃ）と、工程ｃ）およびｄ）の間に各々入れることができる。本発明は、また、異なるアジュバントを用いて得られる免疫原複合体にも関する。アジュバントは化学カップリングで免疫原要素に結合させることができる。アジュバントへのペプチドハプテンのこの共有結合カップリングは、当業界に周知の手法で行える。この目的に適した試薬には、特にＮ‐スクシンイミドエステル、カルボジイミド、ＥＥＤＱ（Ｎ‐エトキシカルボニル‐２‐エトキシ‐１，２‐ジヒドロキノリン）などがある。関連Ｐ４０タンパク質の断片と免疫原要素とは、遺伝子操作によって融合させることもできる。Ｐ４０タンパク質の断片と免疫原要素との間で得られる融合タンパク質は、血清タンパク質、特にヒト血清アルブミンに対するレセプターであるタンパク質に遺伝子操作によって融合させることもできる。免疫原要素、抗原、またはハプテンは特にウイルスに由来しており、例えばＲＳＶ（呼吸シンシチアルウイルス）タンパク質またはそれらの断片、例えばＲＳＶのタンパク質ＧまたはＢ型肝炎抗原である。ＲＳＶＧタンパク質の場合には、適宜に点変異または欠失により修飾された全体タンパク質またはその断片が用いられる。本出願人は、本発明によるＰ４０タンパク質の断片にカップリングされたハプテンの投与が、アジュバント自体に対する反応のリスクを限定的なものとしながら、免疫応答の実質的増加を起こすことを証明した。上記抗原またはハプテンがKlebsiella pneumoniae のＰ４０タンパク質の配列の全部または一部を含んだアジュバントが、上記のような複合体の形で結合されてなることを特徴とする、抗原またはハプテンの免疫原性を増加させるための方法も、本発明の一部である。したがって、本発明は、また、天然Ｐ４０タンパク質のＣ末端配列の実質的部分を欠くＰ４０タンパク質の断片に結合された免疫原要素を含有していることを特徴とするワクチンにも関する。本発明は、また、上記のようなアジュバントと免疫原要素との間で形成された複合体と、非経口および／または経口による複合体の投与に適した薬学上許容される賦形剤を含有している医薬組成物にも関する。本発明は、上記のペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列、更に薬剤としてのこれら配列の使用にも関する。更に詳しくは、このようなＤＮＡ配列は筋肉内または皮内経路による免疫向けである組成物に用いられる。下記例は本発明を説明するためのものであり、その範囲を何らかに制限するわけではない。これらの例において、下記図面が参照される：図１：遺伝子増幅によりＰ４０をクローニングするための方法図２：Ｐ４０をｐＶＡＢＢＧ２△Ｃ中へのクローニング図３：異なるＰ４０断片の選択図４：△Ｐ４０Ｇ２△ＣをｐＶＡＢＢ中へのクローニング図５：異なる濃度のＰ４０ｅｘｔ‐Ｇ１△Ｃで免疫後における抗Ｇ１△Ｃペプチド抗体応答図６：異なる免疫プロトコールを用いて得られる抗Ｇ１△Ｃペプチド抗体応答例１：Ｐ４０タンパク質の単離および精製物質および方法 Klebsiella pneumoniae（株Ｉ‐１４５、乾燥細胞４０ｇ）バイオマスを純粋酢酸でｐＨ２．５に調整する。ｐＨが酢酸で２．５に調整された６％セトリミド、６０％エタノールおよび１．５ＭＣａＣｌ₂を含有する溶液１／２容量を加えた後、混合液を室温で１６時間撹拌させる。混合液を１５，０００ｇで２０分間４℃で遠心した後、上澄中のタンパク質をエタノールで沈降させる。２０〜５０％、その後５０〜８０％での２回の連続沈降を中間遠心（１０分間、１０，０００ｇ、４℃）で行う。２回目の沈降後に得られたペレットをzwittergent ３‐１４の１％溶液に再懸濁する。混合液を室温で４時間撹拌した後、そのｐＨは１ＮＮａＯＨを用いて６．５に調整する。１０，０００gで２０分間４℃での混合液の遠心から、膜タンパク質に富むフラクション（ＭＰフラクション）を得る。ＭＰフラクションのタンパク質をｐＨ８．０の２０ｍＭ Tris／ＨＣｌ、０．１％zwittergent ３‐１４緩衝液に対して透析する。透析物は上記緩衝液で平衡化された強陰イオン交換体タイプの支持体を含有したカラム（φ＝５０ｍｍ×Ｈ＝２５０ｍｍのカラム、Biorad Macroprep High Ｑゲル）にのせる。Ｐ４０タンパク質を平衡緩衝液中５０ｍＭのＮａＣｌ濃度で溶出させる。Ｐ４０を含有したフラクションをプールし、ｐＨ３．０の２０ｍＭシトレート、０．１％zwittergent ３‐１４緩衝液に対して透析する。透析物はｐＨ３．０の２０ｍＭシトレート、０．１％zwittergent ３‐１４緩衝液で平衡化された強陽イオン交換体タイプの支持体を含有したカラム（カラムの寸法：φ＝２５ｍｍ ×Ｈ＝１６０ｍｍ、Biorad Macroprep High Ｓゲル）にのせる。Ｐ４０タンパク質を０．７ＭのＮａＣｌ濃度で溶出させる。Ｐ４０を含有したフラクションをプールし、１０ｋＤａのカットオフ閾値を有する膜ディスクを用いてMinitan Mill ipore 接線流動ロ過システムを用いた限外ロ過により濃縮させる。結果各クロマトグラフィー工程後に得られたフラクションは、Ｐ４０タンパク質を含有したものをプールするために、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥにより分析する。タンパク質の量は Lowry法で測定する（表１）。Ｐ４０タンパク質の純度および等質性はＳＤＳ‐ＰＡＧＥにより評価する。陽イオン交換クロマトグラフィー工程後に、Ｐ４０タンパク質はＭＰフラクション中に存在した主要混入物を含まず（そのタンパク質は１８ｋＤａの見掛け分子量を有している）、純度９５％以上である。更にこの精製工程ではリポ多糖を除去する。この精製工程は、既に提示された精製プロセスに存在していなかった。Ｐ４０の電気泳動プロフィールではいくつかのバンドを与える。これらのバンドはマウス抗Ｐ４０モノクローナル抗体との免疫ブロット後に出現する。上の主要バンドは（ＳＤＳの存在下１００℃で１５分間の処理による）変性タンパク質に相当し、それより下の小さなバンドはその天然形のタンパク質に相当する。したがって、Ｐ４０はいわゆる熱改質しうるタンパク質であり、この性質はＳＤＳの存在下１００℃で加熱動態を行うことによりチェックした。加熱がないと、その天然形のタンパク質は、より多くのＳＤＳを固定させ、したがって変性形（１００℃で５分間後に完全変性）の場合よりも更に陽極の方に移動して、α‐ ヘリックス構造を示す、β‐シート構造を有している（Keller,K.B.1978 J.Bact eriol.,134,1181-1183）。リポ多糖（ＬＰＳ）の混入は、Klebsiella pneumoniae ＬＰＳに関するマーカー脂肪酸であるβ‐ヒドロキシミリスチン酸の気相クロマトグラフィー測定により評価される（表１）。この方法は、異なる精製工程から得られたサンプル中におけるＬＰＳの含量を大体で知るためだけに用いられる。陽イオン交換クロマトグラフィー後にＰ４０フラクション中に存在するβ‐ヒドロキシミリスチン酸の量は測定閾値より少なかったため、残留ＬＰＳの量は１％未満と評価される。例２：Ｐ４０タンパク質のクローニングおよび発現 Klebsiella pneumoniae のＯｍｐＡ遺伝子の配列の７２％は、LAWRENCE et al .,1991,J.Gen.Microbiol.,137:1911-1921に公表されている。我々の研究のオリジナリティーは、その配列の全部、即ち（全体で３３５アミノ酸のうち）８３Ｎ‐末端アミノ酸と１１Ｃ‐末端アミノ酸に相当する配列を決定したことにある。物質および方法細菌株・E.coli：ＲＶ３０８：ＡＴＣＣ３１６０８株（Maurer,R.et al.,1980,J.Mol.Biol.,139,147-161）・K.pneumoniae：ＩＰ１４５：C.I.B.P.F.‐株１９８１年１月１９日付で出願された特許ベクター・ｐＲＩＴ２８（Hultman T.et al.,1988,Nucleosides Nucleotides,7: 629-6 38）：アンピシリン耐性遺伝子、E.coliおよびファージＦ１の複製起点と、E.co li（β‐ガラクトシダーゼ）ｌａｃＺ遺伝子の部分を有したクローニングおよび配列決定ベクター・ｐＶＡＢＢ：遺伝子融合発現ベクター溶液・遺伝子増幅溶解緩衝液：２５ｍＭＴａｐｓ、ｐＨ９．３２ｍＭＭｇＣｌ₂ 増幅緩衝液：２５ｍＭＴａｐｓ、ｐＨ９．３２ｍＭＭｇＣｌ₂ ０．１％ Tween２０２００ｍＭｄＮＴＰ・タンパク質の精製ＴＳＴ（２０ｘ）：Trisベース０．５ＭＨＣｌ０．３ＭＮａＣｌ４Ｍ Tween ２０１％ＥＤＴＡ２０ｍＭ洗浄緩衝液： TrisＨＣｌ５０ｍＭｐＨ８．５ＭｇＣｌ₂ ５ｍＭ変性溶液： Gua-ＨＣｌ７．８Ｍ Tris‐ＨＣｌ２８ｍＭｐＨ８．５復元溶液： Gua-ＨＣｌ０．５Ｍ Tris‐ＨＣｌ２５ｍＭｐＨ８．５ＮａＣｌ１５０ｍＭ Tween ２００．０５％オリゴヌクレオチドの合成ヌクレオチドプライマーの選択は、Klebsiella pneumoniae ＯＭＰＡ配列の公表部分（Lawrence,J.G.et al.,1991,J.Gen.Microbiol.,137: 1911-1921）、５腸内細菌（E.coli、S.typhimurium、S.marcescens、S.dysenteriae およびE.aerog inosae）ＯＭＰＡの配列を並べて得られたコンセンサス配列と、マニュアルで配列決定して得られたペプチド配列とをベースにして決定した。オリゴヌクレオチドはPharmacia の"Gene Assembler Plus" 装置でホスホルアミダイト化学法により合成した。Ｐ４０遺伝子のＰＣＲ遺伝子増幅 Klebsiella pneumoniae ＯＭＰＡのＤＮＡは下記のように増幅させた。 Klebsiella pneumoniae コロニーを、９５℃で５分間加熱することにより、溶解緩衝液１０μｌ中で溶解させる。この溶液１μｌは増幅反応用のＤＮＡ源として役立つ。これらの反応は各プライマー５pmolとＴａｑポリメラーゼ酵素（Perkin Elmer Cetus）１単位を用いて増幅緩衝液１００μｌ中で行う。各サイクルは９５℃で３０秒間の１回の変性工程、その後７２℃で１分間のＤＮＡへのプライマーのハイブリッド形成と伸長からなる。３０サイクルをPerkin Elmer Cetus "Gen AmpP CR"９０００サーモサイクラーを用いてこうして行う。その後のＰＣＲは既に増幅されたＤＮＡ断片を用いて行う。次いで増幅されたＤＮＡ断片を切断して、ｐＲＩＴ２８ベクターに連結させる。配列決定こうしてクローニングされた断片はApplied Biosystems３７３自動ＤＮＡ Seq uencer で配列決定する。配列決定反応は、遺伝子増幅後に得られたかまたはmax iprepから得られた二本鎖ＤＮＡ、あるいは変性ＰＣＲ断片から得られた一本鎖ＤＮＡで、供給業者（Applied Biosystems）の勧めに従い"Dye Terminator"キットを用いて行う（Hultman,T.et al.,1989,Nucleid Acids Rev.17:4937-4946）。タンパク質の発現全体Ｐ４０遺伝子を発現ベクターｐＶＡＢＢ中にクローニングする。このベクターによれば“ＢＢ”親和性テイル部をＰ４０に付着させることができるが、Ｂは血清アルブミンを結合させる連鎖球菌Ｇタンパク質の部分である（Nygren,P.A .et al.,1988,J.Mol.Recognit.1,69-74）。ｐＶＡＢＢＰ４０ベクターで形質転換された E.coli ＲＶ３０８株を、酵母抽出物、アンピシリン（２００μg/ml）、テトラサイクリン（８μg/ml）およびトリプトファン（１００μg/ml）で補充されたＴＳＢ１００ｍｌ中３７℃で一夜撹拌しながら培養する。翌日、５８０ｎｍ波長でＯＤ＝１の培養物をＴＳＢ＋酵母抽出物＋ａｍｐ＋ｔｅｔ中で作る。１０分間培養後、タンパク質の発現はＩＡＡ（２５μg/ml）を培地に加えることにより誘導させる。培養物を２４６０ｇで１０分間４℃で遠心する。ペレットをｐＨ７．４の１×ＴＳＴ２０ｍｌに溶解させ、その後溶液を２３，０００ｇで３０分間４℃で遠心する。上澄はいわゆる可溶性タンパク質を単離させることができるＨＳＡ Sepharose に通す。ペレットを洗浄緩衝液で洗浄し、その後２３，０００ｇで３０分間４℃ で遠心する。次いで封入体を含有したペレットを変性溶液９００μｌ＋１０ｍＭジチオスレイトール１００μｌに溶解させ、この溶液を３７℃で２時間インキュベートする。次いで溶液を復元緩衝液１００ｍｌ中室温で一夜撹拌しながらインキュベートし、その後２３，０００ｇで３０分間４℃で遠心する。上澄をＨＳＡ Sepharoseに通す。２つの場合において、結合タンパク質はｐＨ２．８の０．５Ｍ酢酸で溶出させ、１ｍｌフラクションで集める。次いで集められたフラクションはＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲル電気泳動および免疫ブロットにより分析する。結果遺伝子は図１で示された方法に従い３つの段階でクローニングした。第一段階において、我々は配列の公表部分を確認したが、但し１０３位はＡの代わりにＴであった。次いで我々は遺伝子の３′配列、その後で５′配列を決定した。全体の遺伝子は２つの部分８／４および３／１４を融合させることにより得て、その後ｐＲＩＴ２８ベクター中にクローニングさせた。配列は配列番号１である。タンパク質はＢＢＰ４０形で発現される。それは主に封入体から得られる。タンパク質の一部５０ｍｇを培養物２００ｍｌから精製する。電気泳動プロフィールでは、変性後に得られるＢＢＰ４０が高純度であることを証明している。見掛け分子量は、６３ｋＤａである計算理論重量に相当する。免疫ブロット特徴では、精製タンパク質がウサギ抗Ｐ４０血清で十分認識されることを証明している。例３：ＢＢＰ４０Ｇ２△Ｃ融合タンパク質、サブグループａ停止コドンが欠失された遺伝子のＮ末端部分に相当するオリゴヌクレオチドを合成した。５′部分をＰＣＲにより増幅させ、精製し、ｐＲＩＴ２８ベクター中にクローニングして、例２に記載された方法により配列決定した。第二段階では、遺伝子の２つの部分を融合させ、ベクターｐＶＡＢＢＧ２△Ｃ中にクローニングした（図２）。Ｇ２△Ｃは呼吸シンシチアルウイルスＧのＧタンパク質の１０１アミノ酸断片（１３０‐２３０）の配列を表す。次いでＲＶ３０８株のE.coli細菌をｐＶＡＢＢＧ２△Ｃベクターで形質転換させる。産生されたタンパク質はＢＢＰ４０について既に記載されたように精製する。結果ＢＢＰ４０Ｇ２△Ｃタンパク質は封入体から主に得られる。タンパク質の一部１２ｍｇを培地２００ｍｌから精製する。タンパク質は電気泳動によるとかなり純粋である。見掛け分子量は、７５ｋＤａである計算理論重量に相当する。例４：３つのＰ４０断片のクローニングおよび発現物質および方法オリゴヌクレオチドＰ４０配列に相補的な３つのオリゴヌクレオチドを合成した：１６‐１７‐１８（ｃｆ．図３）。次いで遺伝子の所定部分はｐＲＩＴ２８Ｐ４０のminiprep（Applied プロトコール）からのＤＮＡを用いてＰＣＲにより増幅させた。こうして、すべての貫膜部分（８／１７、断片Ｎｏ．８と表示）、２つの外部ループおよび２つの貫膜部分（１６／１７、断片Ｎｏ．１６と表示）と、１つの外部ループおよび２つの貫膜部分（１８／１７、断片Ｎｏ．１８と表示）に相当する遺伝子の部分をクローニングすることができた。こうして増幅されたＤＮＡ断片を切断し、その後単離し、ｐＲＩＴ２８ベクター中に連結させて、配列決定する（ｃｆ．Ｐ４０のＢＢＰ４０クローニング）。ＢＢ△Ｐ４０Ｇ２△Ｃ融合タンパク質Ｇ２△Ｃ遺伝子は、ベクターｐＲＩＴ２８Ｇ２△Ｃを切断し、その後切断されたベクターｐＲＩＴ２８ △Ｐ４０中に連結させることにより単離する（△Ｐ４０はＰ４０断片の１つを表す）。その後、全体△Ｐ４０Ｇ２△Ｃを切断により単離し、ｐＶＡＢＢ中にクローニングする（ｃｆ．図４）。３つのハイブリッドタンパク質をＢＢＰ４０に関して記載されたプロトコールに従い発現させる。結果ＢＢＰ４０およびＢＢＰ４０Ｇ２△Ｃのように、ＢＢ８Ｇ２△Ｃは主に封入体から得られる。培養液４００ｍｌは約１０ｍｇのタンパク質を産生する。対照的に、タンパク質ＢＢ１８Ｇ２△ＣおよびＢＢ１６Ｇ２△Ｃのほとんどは超音波工程で可溶形で存在している。各場合において、約１０ｍｇを培養物４００ｍｌ当たりで得る。これらのタンパク質はＳＤＳ‐ＰＡＧＥ電気泳動により特徴付けした。それらの分子量は計算理論重量に相当する：ＢＢ８Ｇ２△Ｃ５８．０３ｋＤａＢＢ１６Ｇ２△Ｃ４６．５ｋＤａＢＢ１８Ｇ２△Ｃ４５．５ｋＤａウエスタンブロットでは、３つのハイブリッドが抗Ｐ４０抗体と同様に抗Ｇ２ポリクローナル抗体により認識される。例５１．免疫系の細胞におけるＰ４０タンパク質の効果１．ａ．Ｂリンパ球膜の抽出（Ｐ４０ｅｘｔ）によるかまたは遺伝子組換え（ｒｅｃＰ４０、即ちＢＢＰ４０）により得られたＰ４０３０μｇを０および２１日目にＢＡＬＢ／ｃマウス（５匹／群）に皮下注射した。免疫処置はどんなアジュバントも用いずに行った。最後の免疫処置から１０日後に、抗Ｐ４０ｅｘｔ抗体応答をＥＬＩＳＡ法により個々の血清で評価した。表２は５サンプルで得られた力価の平均を示している。陰性コントロールはいかなる抗Ｐ４０ｅｘｔ抗体も含有していなかった。これらの実験条件下で、Ｐ４０ｒｅｃはＰ４０ｅｘｔと同様に免疫原性である。したがって、これら２つのタンパク質はＢリンパ球と相互作用するＢエピトープを含んでいる。１．ｂ．Ｔリンパ球Ｐ４０ｅｘｔに対する遅延過敏症反応（ＨＳＲ）は繰延べ足蹠膨脹試験により測定した。ＢＡＬＢ／ｃマウス（５匹／群）をどんなアジュバントもなしにＰ４０ｅｘｔ１００μｇで皮下感作した。６〜１０日後に、マウスを右後足蹠でＰ４０ｅｘｔ１００μｇ／２０μｌにより皮下刺激し、左後足蹠にはＰＢＳを与えた。足蹠の膨脹は２４時間後に測定した。遅延過敏症は陰性コントロールで観察されない（非感作マウス５匹）。表３で示された結果は、Ｐ４０ｅｘｔで免疫されたマウスが足蹠で量的に高い遅延過敏症反応を生じることを示している。ＨＳＲ反応はＴｈ１細胞を要する細胞性免疫応答を表している。これから、Ｐ４０ｅｘｔはＭＨＣ制限なしにＴｈ１応答を促進することができる少くとも１つのＴエピトープを含んでいると結論付られる。１．３．マクロファージマクロファージに対するＰ４０ｅｘｔの効果は亜硝酸の産生により決定した。マウス単球マクロファージであるＲＡＷ２６４．７細胞を異なる濃度のＰ４０ｅｘｔの存在下３７℃で７２時間インキュベートした。細胞培養物の上澄中における亜硝酸の量は、Griess-Ilosvay試薬を用いて比色分析により測定した。亜硝酸の産生はマクロファージの活性化を反映し、これら細胞の抗微生物および抗腫瘍活性で重要な役割を果たす。得られたデータは、Ｐ４０ｅｘｔがＲＡＷ２６４．７細胞からの亜硝酸の産生を刺激することを示しており、Ｐ４０ｅｘｔがマクロファージを活性化することを証明している。２．Ｐ４０は、ペプチド（Ｇ１△Ｃ）用に、アジュバント効果を有したキャリアである２．１．Ｐ４０ｅｘｔと他のサポートとの比較用いられるペプチドはＧ１△Ｃであって、これはＲＳＶのタンパク質Ｇから得られるペプチドである：（Ｇ１７４‐１８７△Ｃ）Trudel et al.,1991,J.Virol . 185:749-757 Ｇ１△Ｃに対する免疫応答の動態Ｃ５７Ｂ１／６マウス（５匹／群）を同一の免疫プロトコールに従い異なる形のＧ１△Ｃで免疫処置した。異なる形のＧ１△Ｃにより誘導される抗体応答は、実験の開示後に７、１７、２８、３５および４２日目に比較する。抗Ｇ１△Ｃ応答は、マウスがより常法的にＴＴ／Ｇ１△ＣまたはＫＬＨ／Ｇ１ △Ｃ＋ＦＡで免疫処置されたときよりも、それらがＰ４０／Ｇ１△Ｃで免疫処置されたときの方が著しく大きくて速い。Ｐ４０／Ｇ１△Ｃの単回注射は、７日間で１０００の抗Ｇ１△Ｃ抗体力価になる。ＴＴ／Ｇ１△Ｃ＋ＦＡの場合、この力価は２８日間で得られる。２８日間で３回の注射後に得られた最大応答（力価＝１／３８００００）は、ＫＬＨ／Ｇ１△Ｃ＋ＦＡで得られる場合よりも約３０倍大きく、ＴＴ／Ｇ１△Ｃで得られる場合よりも７０倍大きい。抗Ｇ１抗体力価は４２日目まで消失することなく持続する。結論Ｇ１△ＣペプチドをＰ４０タンパク質に化学的にカップリングさせると、ＫＬＨ／Ｇ１△Ｃ＋ＦＡまたはＴＴ／Ｇ１△Ｃ参照モデルで得られる場合と同様に大きな抗Ｇ１△Ｃ応答を誘導することができた。得られた結果は、Ｐ４０ｅｘｔがアジュバント効果を有したＧ１△Ｃ用のキャリア分子であり、Ｐ４０ｅｘｔが破傷風毒素よりも優れていて、組合せＫＬＨ＋ Freund'sアジュバントと同じに良いことを証明している。２．１．抗Ｇ１△Ｃペプチド抗体のイソタイプ分布上記実験中に得られた血清のイソタイプはＥＬＩＳＡにより決定した。表４は１／２５０希釈で試験された５つの個別血清のＡ４５０値の平均を示している。抗体イソタイプの分泌は、２つのサブセットＴｈ１およびＴｈ２に分けられる、抗原特異的Ｔｈ細胞のサブセットにより調節されることが示されている。Ｔｈ１クローンはＩＬ‐２、ＩＦＮγおよびリンホトキシンを産生し、Ｔｈ２クローンはＩＬ‐４およびＩＬ‐５を産生する。Ｔｈ１およびＴｈ２クローンは、抗原特異的Ｂ細胞により各々ＩｇＧ２ａ＋ＩｇＧ３およびＩｇＧ１＋ＩｇＧ２ｂ＋ＩｇＥの分泌を特異的に誘導する。表４に示されたデータは、ＩｇＧ１＋ＩｇＧ２ｂが抗Ｇ１△Ｃ抗体の２つの主要イソタイプであることを示していて、ＩｇＧ２ａも表される。Ｃ５７Ｂ１／６マウスにおいて、Ｐ４０‐Ｇ１△ＣがＴｈ１応答よりも大きなＴｈ２応答を生じると結論付けられる。２．２．用量‐効果の検討異なる濃度のＰ４０ｅｘｔ‐Ｇ１△Ｃを０、１０および２１日目にＢＡＬＢ／ｃマウス（５匹／群）に皮下注射した。最後の免疫処置から１週間後に、血液サンプルを採取し、抗Ｇ１△Ｃペプチド抗体応答を個々の血清でＥＬＩＳＡにより測定する。５サンプルの力価の平均を計算する。図５はＰ４０ｅｘｔ‐Ｇ１△Ｃに関する用量‐効果関係を示している。抗Ｇ１ △Ｃペプチド抗体応答を１μｇのＰ４０ｅｘｔ‐Ｇ１△Ｃで得る。最大抗体力価は１０〜５０μｇのＰ４０ｅｘｔ‐Ｇ１△Ｃで観察される。２．４．最良免疫プロトコールの決定Ｐ４０ｅｘｔ‐Ｇ１△Ｃ（Ｇ１△Ｃ１０μｇに相当）を図６で示された日にＢＡＬＢ／ｃマウス（５匹／群）に皮下注射した。抗Ｇ１△Ｃペプチド抗体応答は個々の血清でＥＬＩＳＡにより測定する。４つの免疫プロトコールを試験した：１回の注射、０および１４日目または０および２１日目に２回の注射、０、２１および４０日目に３回の注射。最大の抗Ｇ１△Ｃペプチド抗体応答は３回の注射で得られる。３．Ｐ４０ｅｘｔはタンパク質抗原（ＢＢＧ２△Ｃ）向けに有効なアジュバントであるＰ４０ｅｘｔと化学的に複合化されたＢＢＧ２△Ｃ（Ｇ２△Ｃ１０μｇに相当）を０および２１日目にＢＡＬＢ／ｃマウス（５匹／群）に皮下注射した。１０日後に、抗Ｇ２△Ｃ抗体応答を個々の血清でＥＬＩＳＡにより測定する。５サンプルの力価の平均は表５に示されている。陰性コントロールは抗Ｇ２△Ｃ抗体を含んでいなかった。ＢＢＧ２△Ｃは弱い免疫原性である。Freund'sアジュバントを用いると、抗Ｇ２△Ｃ抗体の力価を増加させる。ＢＢＧ２△ＣがＰ４０ｅｘｔと化学的に複合化されているとき、抗Ｇ２△Ｃ抗体応答は約２００倍増加する。したがって、Ｐ４０ｅｘｔはタンパク質抗原向けに良いアジュバントである。４．Ｐ４０断片のアジュバント活性ＢＡＬＢ／ｃマウス（５匹／群）を、下記の組換えタンパク質で、０日目に皮下注射し、２１日目に刺激した：融合タンパク質ＢＢＰ４０Ｇ２△Ｃ、Ｐ４０断片Ｎｏ．８を含む融合タンパク質（ＢＢ８Ｇ２△Ｃ）、Ｐ４０断片Ｎｏ．１６を含む融合タンパク質（ＢＢ１６Ｇ２△Ｃ）およびＰ４０断片Ｎｏ．１８を含む融合タンパク質（ＢＢ１８Ｇ２△Ｃ）（Ｇ２△Ｃ１０μｇに相当）３１日目に、抗Ｇ２△Ｃ、抗Ｐ４０および抗ＢＢ抗体応答を個々の血清でＥＬＩＳＡにより測定する。５つの個別血清の力価の平均を計算する。陰性コントロールは抗Ｇ２△Ｃ抗体を含んでいなかった。この実験は、Ｐ４０断片が完全タンパク質の性質を留めていることを示している。これは、抗ＢＢ抗体応答において特に著しい。抗Ｐ４０抗体応答は、Ｐ４０の断片が用いられたときに著しく減少する。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９６年１１月４日【補正内容】請求の範囲１． Klebsiella pneumoniae のＰ４０タンパク質の少くとも一部またはKleb siella pneumoniae のＰ４０タンパク質と少くとも９０％の相同率を有するタンパク質を含んでなることを特徴とする、宿主に投与されたときに分子の活性を改善する、アジュバント物。２．配列番号２の配列を有するかまたはこの配列と少くとも９０％の相同率を有するタンパク質を含んでなる、請求項１に記載のアジュバント物。３． K.pneumoniaeのＰ４０タンパク質のアミノ酸１‐１７９に包含された配列、またはK.pneumoniaeのＰ４０タンパク質の配列のアミノ酸１‐１７９に包含された配列と少くとも９０％の相同率を有する配列からなる、請求項１または２に記載のアジュバント物。４． K.pneumoniaeのＰ４０タンパク質のアミノ酸１０８‐１７９に包含された配列、またはK.pneumoniaeのＰ４０タンパク質のアミノ酸１０８‐１７９に包含された配列と少くとも８０％の相同率を有する配列からなる、請求項１または２に記載のアジュバント物。５． K.pneumoniaeのＰ４０タンパク質のアミノ酸１２７‐１７９に包含された配列、またはK.pneumoniaeのＰ４０タンパク質の配列のアミノ酸１２７‐１７９に包含された配列と少くとも８０％の相同率を有する配列からなる、請求項１または２に記載のアジュバント物。６．配列番号２、４、６、または８のいずれか１つの配列を有する、タンパク質またはペプチド。７．分子の免疫原性を改善するためのアジュバントを製造するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載のアジュバンド物をコードするＤＮＡ配列の使用。８．免疫原要素が抗原またはハプテンであり、アジュバントが請求項１〜６のいずれか一項に記載のアジュバンド物を含んでなることを特徴とする、免疫応答を増強させるアジュバントに結合された免疫原要素を含んでなるタイプの免疫原複合体。９．免疫原要素が共有結合によりアジュバントに結合されてなる、請求項８に記載の免疫原複合体。１０．免疫原要素がＲＳＶのＧタンパク質の断片からなる、請求項８または９に記載の免疫原複合体。１１．アジュバントに結合された免疫原要素が、血清タンパク質、特にヒト血清アルブミンに対するレセプターであるタンパク質に融合されてなる、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の免疫原複合体。１２．抗原またはハプテンが請求項８〜１１のいずれか一項に記載の複合体の形で請求項１〜６のいずれか一項に記載のアジュバントに結合されてなることを特徴とする、抗原またはハプテンの免疫原性を増加させる方法。１３．抗原またはハプテンが化学カップリングでアジュバントに結合されてなる、請求項１２に記載の方法。１４．抗原またはハプテンが遺伝子操作でアジュバントに融合されてなる、請求項１２または１３に記載の方法。１５．請求項８〜１１のいずれか一項に記載の複合体を含有してなり、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法により製造されることを特徴とする、ワクチン。１６．医薬としての、請求項７に記載のＤＮＡ配列。１７．筋肉内または皮内経路により用いられるワクチンを製造するための、請求項７に記載のＤＮＡ配列の使用。１８．ａ）界面活性剤と二価カチオンの塩を加えることによりリポ多糖を沈降させて、上澄を回収し、ｂ）上澄からタンパク質を沈降させて、沈降物を再懸濁し、ｃ）陰イオン交換体で懸濁物をクロマトグラフィーに付して、アジュバント産物を含有したフラクションを回収し、ｄ）陽イオン交換体でクロマトグラフィーに付して、アジュバント産物を含有したフラクションを回収し、ｅ）リポ糖を本質的に含まないタンパク質の形でアジュバント産物を回収するために、工程ｄ）から得られたフラクションを濃縮する、工程からなることを特徴とする、Klebsiella pneumoniae 属の細菌の膜から請求項１〜６のいずれか一項に記載のアジュバント物を製造するための方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:22） (72)発明者ギアンゴック，ティアンフランス国サン−ジュリアン−アン−ジュヌボワ、レ、プティ−ジュタン−ラトワ、７

Claims

【特許請求の範囲】１． Klebsiella pneumoniae のＰ４０タンパク質の少くとも一部またはKleb siella pneumoniae のＰ４０タンパク質と少くとも８０％の相同率を有するタンパク質を含んでなることを特徴とする、宿主に投与されたときに分子の活性を改善する、アジュバント物。２．配列番号２を有するかまたはこの配列と少くとも８０％の相同率を有するタンパク質を含んでなる、請求項１に記載のアジュバント物。３． K.pneumoniaeのＰ４０タンパク質のアミノ酸１‐１７９に包含された配列、またはK.pneumoniaeのＰ４０タンパク質の配列のアミノ酸１‐１７９に包含された配列と少くとも８０％の相同率を有する配列からなる、請求項１または２に記載のアジュバント物。４． K.pneumoniaeのＰ４０タンパク質のアミノ酸１０８‐１７９に包含された配列、またはK.pneumoniaeのＰ４０タンパク質の配列のアミノ酸１０８‐１７９に包含された配列と少くとも８０％の相同率を有する配列からなる、請求項１または２に記載のアジュバント物。５． K.pneumoniaeのＰ４０タンパク質のアミノ酸１２７‐１７９に包含された配列、またはK.pneumoniaeのＰ４０タンパク質の配列のアミノ酸１２７‐１７９に包含された配列と少くとも８０％の相同率を有する配列からなる、請求項１または２に記載のアジュバント物。６．配列配列２、４、６、または８のいずれか１つを有する、タンパク質またはペプチド。７．請求項１〜６のいずれか一項に記載のアジュバンド物をコードする、ＤＮＡ配列。８．免疫原要素が抗原またはハプテンであり、アジュバントが請求項１〜６のいずれか一項に記載のアジュバンド物を含んでなることを特徴とする、免疫応答を増強させるアジュバントに結合された免疫原要素を含んでなるタイプの免疫原複合体。９．免疫原要素が共有結合によりアジュバントに結合されてなる、請求項７に記載の免疫原複合体。１０．免疫原要素がＲＳＶのＧタンパク質の断片からなる、請求項８または９に記載の免疫原複合体。１１．アジュバントに結合された免疫原要素が、血清タンパク質、特にヒト血清アルブミン、に対するレセプターであるタンパク質に融合されてなる、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の免疫原複合体。１２．抗原またはハプテンが、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の複合体の形で請求項１〜６のいずれか一項に記載のアジュバントに結合されてなることを特徴とする、抗原またはハプテンの免疫原性を増加させる方法。１３．抗原またはハプテンが化学カップリングでアジュバントに結合されてなる、請求項１２に記載の方法。１４．抗原またはハプテンが遺伝子操作でアジュバントに融合されてなる、請求項１２または１３に記載の方法。１５．請求項８〜１１のいずれか一項に記載の複合体を含有してなり、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法により製造されることを特徴とする、ワクチン。１６．医薬としての、請求項７に記載のＤＮＡ配列。１７．筋肉内または皮内経路により用いられるワクチンを製造するための、請求項７に記載のＤＮＡ配列の使用。１８．ａ）界面活性剤と二価カチオンの塩を加えることによりリポ多糖を沈降させて、上澄を回収し、ｂ）上澄からタンパク質を沈降させて、沈降物を再懸濁し、ｃ）陰イオン交換体で懸濁物をクロマトグラフィーに付して、アジュバント産物を含有したフラクションを回収し、ｄ）陽イオン交換体でクロマトグラフィーに付して、アジュバント産物を含有したフラクションを回収し、ｅ）リポ糖を本質的に含まないタンパク質の形でアジュバント産物を回収するために、工程ｄ）から得られたフラクションを濃縮する、工程を含んでなることで特徴とする、Klebsiella pneumoniae 種の細菌の膜から請求項１〜６のいずれか一項に記載のアジュバント物を製造するための方法。