JPH10510254A - リポソームインターフェロン組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 コレステロールと、少なくとも２種類のリン脂質との脂質混合物より形成されたリポソームの中に含まれているα−インターフェロンハイブリドを含んで成る薬理組成物であって、ここで少なくとも一種類のリン脂質が帯電しており、そして少なくとも一種類のリン脂質が中性である、組成物。

Description

【発明の詳細な説明】 リポソームインターフェロン組成物 本発明は特にウィルス性肝臓病の処置のためのα−インターフェロン含有リポ ソーム薬理組成物に関する。 インターフェロンについて近年の臨床試験は、それらの様々な病気における有 用性、特に多種多様な癌の処置における抗増殖剤としての、並びに肝炎及びカポ ジ肉腫等の処置における抗ウィルス剤としての有用性を実証してきた。しかしな がら、循環系を介して治療投与した場合、それらは様々な毒性副作用を及ぼしう る。更に、組換インターフェロンはしばしば中和抗体の産生を誘導する。このよ うな欠点をインターフェロンのリポソームの中への封入により解決することが提 唱されている。 組換ヒトα−インターフェロンＢ／Ｄハイブリドは抗腫瘍剤及び抗ウィルス剤 として特に関心がもたれている。EP 0,331,635号において、パルミトイル−（９ −cis−オクタデセノイル）−３−sn−ホスファチジルコリン（POPC）及び１， ２−ジ−（９−cis−オクタデセノイル）−３−sn−ホスファチジル−（Ｓ）− セリン（OOPS）より生成されたリポソームの中に含まれているα−インターフェ ロンBBDD又はBBDBを含んで成る膀胱癌の処置のための薬理組成物が開示されてい る。 安定性の一層高い、即ちタンパク質の漏出しにくい、リポソームα−インター フェロンハイブリド組成物、特に標的細胞集団としての肝細胞に保護形態でα− インターフェロンハイブリドを誘導できる、詳しくはウィルス性肝臓病の処置の ためのリポソーム組成物についてのニーズがある。 特定の脂質の組合せの中に封入されたα−インターフェロンハイブリドを含む リポソームは、良好な安定性を有し、α−インターフェロンハイブリドの抗ウィ ルス活性を保持し、そして肝細胞に結合する高い能力を示すことがこの度見い出 された。 従って、本発明は一の観点において少なくとも二種類のリン脂質と合さったコ レステロールの脂質混合物から成るリポソームの中に含まれたα−インターフェ ロンハイブリドを含んで成る薬理組成物を提供し、ここで少なくとも一種のリン 脂質は帯電しており、そして少なくとも一種のリン脂質は中性となっている。 別の観点において、本発明は、ウィルス性肝臓病の処置のための医薬品の調製 における、コレステロールと上記の少なくとも二種類のリン脂質との脂質混合物 より成るリポソームの中に含まれたα−インターフェロンハイブリドの利用を提 供する。 α−インターフェロンハイブリドは好ましくはα−インターフェロンＢ／Ｄハ イブリドである。かかるハイブリドの調製はUS 4,414,150及びEP 0,205,404に記 載されている。特に好適なハイブリドはα−インターフェロンBDBBであり、その 調製法はEP 0,205,404に記載されている。 リポソームの脂質成分、即ち、上記の脂質混合物は好ましくは20〜30℃の相転 移温度を有する。脂質混合物の主要成分は好ましくは中性リン脂質成分であり、 これは好ましくは脂質混合物の少なくとも50 mol％の量で存在している。この脂 質膜が20〜30℃の好適な範囲の中に相転移温度を有するためには、１又は複数種 のホスファチジルコリンを好適に含む中性リン脂質成分は、好ましくは20〜30℃ の相転移温度を有すべきである。これは中性リン脂質成分として、（ａ）この範 囲内の相転移温度を有する単独のリン脂質、好ましくはホスファチジルコリン、 例えばジミリストイルホスファチジルコ リンもしくは１−ミリストイル−２−パルミトイル−ホスファチジルコリン、（ ｂ）二種類以上のリン脂質、好ましくはホスファチジルコリン、例えば上記のも のの混合物（ここでその少なくとも一種がこの範囲内の相転移温度を有する）又 は（ｃ）30℃より高い相転移温度を有するリン脂質、好ましくはホスファチジル コリンと、20℃未満の相転移温度を有するリン脂質、好ましくはホスファチジル コリンとの混合物、を利用することにより達成できる。 本発明の好適な態様において、この中性リン脂質はジミリストイルホスファチ ジルコリン、又はそれとその他の中性ホスファチジルコリンとの混合物であり、 ここでこの混合物は20〜30℃の相転移温度を有する。特に好適な態様においては 、ジミリストイルホスファチジルコリンを中性リン脂質成分として使用する。 帯電したリン脂質は好ましくは負に帯電している。適当な負に帯電しているリ ン脂質には、ホスファチジルセリン、例えばジミリストイルホスファチジルセリ ン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、又はジオレオイルホスファチジルセ リン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸及びホスファチジルエタ ノールアミンが含まれる。ホスファチジルセリン、特にジオレオイルホスファチ ジルセリンが好ましい。 上記の脂質混合物は好ましくは50〜75 mol％の中性リン脂質、20〜40 mol％の コレステロール及び５〜10 mol％の帯電したリン脂質、より好ましくは55〜70 m ol％の中性リン脂質、25〜35 mol％のコレステロール及び５〜10 mol％の帯電し たリン脂質を含んで成る。特に好適な脂質混合物において、中性リン脂質：コレ ステロール：帯電したリン脂質のモル比は９：５：１とする。 リポソームは好ましくは200ナノメーター以下、特に80〜180 ナノメーターの 平均粒子サイズを有する。 一般に、リポソームの安定性との関係で、α−インターフェロンハイブリド、 対、脂質の重量比は可能な限り高いことが所望される。この重量比についての最 大値は脂質成分の種類及び組成に依存して変えてよいが、一般には約１：200に するのがよい。しかしながら、この比が１：400〜１：300であるリポソームによ り良好な結果が得られうることが見い出された。 本発明のα−インターフェロンハイブリド含有リポソームは薬剤含有リポソー ムの調製のための公知の方法を利用して調製できる。本発明に従うと、上記の本 発明の組成物を調製する好適な方法は、好ましくは凍結乾燥により、有機溶媒中 の上記の脂質混合物溶液から溶媒を除去して脂質残渣を得ること、この脂質残渣 をα−インターフェロンハイブリドを含む水性媒体と混合すること、得られる混 合物を撹拌して封入されたα−インターフェロンハイブリドを含むリポソームの 水性懸濁物を得ること、及び得られるこの懸濁物を、任意的に水性媒体で希釈し た後に、１又は数枚の膜フィルターを通じて押出すこと、を含んで成る。 上記の方法において使用するのに適当な有機溶媒にはアルコール、エーテル、 炭化水素、ハロ炭化水素及びその混合物を含む。アルコール、特にtert−ブタノ ールにより良好な結果が得られている。 α−インターフェロンハイブリド含有水性媒体は通常pHを 7.0〜8.0、好まし くは7.5〜7.7に維持する緩衝剤を含む。この媒体と脂質残渣との混合物の撹拌は 慣用の手段、例えばボルテックスミキサーの使用又は高速撹拌により行われうる 。所望の粒子サイズを得るための水性リポソーム懸濁物の押出に適する膜フィル ターには規定の孔サイズを有する慣用のポリカーボネートフィルターが含まれる 。 押出を経て得られる水性リポソーム懸濁物は、クロマトグラフィ ー、それに続くインターフェロン非含有水性相に対する透析の如き慣用の手段に より、未封入α−インターフェロンハイブリドからリポソームを分離するように 更に処理にかけられうる。 貯蔵目的のため、リポソームはその調製後に粉末となるまで脱水にかけてよい 。脱水は好ましくはリポソームの水性懸濁物の凍結乾燥による慣用の手段で行わ れる。凍結乾燥は一般に低温保護剤、好ましくは糖、例えばスクロース、マルト ース、トレハロース、又は特にラクトースの存在下で行って、低温保護剤と混合 した脱水リポソームを含んで成る粉末を得る。このリポソームは水による慣用の 手段での脱水粉末の処理により、必要なときにもどすことができうる。 本発明の薬理組成物は非経口的に、例えば筋肉内的に、皮内的に、又は好まし くは静脈内的に投与してよい。この組成物は滅菌されることができ、そして慣用 の賦形剤、例えば保存剤、安定剤、乳化剤、可溶化剤又は緩衝剤を含みうる。日 常の用量は処置する患者の年齢及び体重、並びに考慮される病気の状態に従って 変わりうる。 本発明の薬理組成物によるラットのin vivo実験は、静脈内投与後の肝細胞に よるα−インターフェロンハイブリドの高度な取込みを示し、Ｂ型及びＣ型肝炎 の如きウィルス性肝臓病の処置のための本組成物の適切さを示唆する。 本発明を以下の実施例により説明する。実施例１ tert−ブタノール（10ml）中の９：５：１（１ｇ）のモル比のジミリストイル ホスファチジルコリン、コレステロール及びジオレオイルホスファチジルセリン の混合物の溶液を定常撹拌しながら50℃に加熱する。アリコート（１ml）を７ml のガラスバイアルに入れ、それを液体窒素の中にその内容物が凍結するまで維持 し、次いで冷 却された溶媒トラップを介して真空ポンプに接続された予備冷却金属デシケータ ーの中に入れる。バイアルの内容物を低温室の中で24時間凍結乾燥し、そして得 られる脂質ケーキを−20℃で保存する。 リン酸緩衝化された（pH7.6）水性の200mMのマンニトール（５ml）中のα−イ ンターフェロンハイブリドrIFN−αBDBB（0.64mg， 160×10⁶ IU）をこの脂質ケ ーキに30℃にて加え、そしてその混合物をボルテックスミキサーで３〜10秒間撹 拌する。得られるリポソーム懸濁物を50mlの更なるリン酸緩衝化されたマンニト ールで希釈し、そして窒素圧力下で0.2μｍの孔サイズを有するポリカーボネー トフィルターに30℃で10回押出する。180nmの平均サイズを有するリポソームを 含む得られる懸濁物をSepharose CL−6Bカラムでクロマトグラフィーにかける。 リポソーム含有画分を回収し、プールし、そして限外濾過を利用して50mg／mlの 脂質へと濃縮する。得られる懸濁物を水性リン酸緩衝化された0.26Ｍのラクトー ス溶液に対して一夜かけて透析し、次いで濾過し、無菌バイアルに分注し、そし て Lyovac GT−４凍結乾燥器の中で24時間プログラムを利用して凍結乾燥する。 リポソームはバイアルの内容物を滅菌バイロジェン・フリー水で処理すること によりもどし、そしてSepharose CL−6Bカラムでのクロマトグラフィーにかける 。リポソームからのα−インターフェロンハイブリドの漏出の徴候はなかった。 セムリキ森林熱ウィルスを利用するin vitro実験−感染WISH細胞は、封入され たα−インターフェロンハイブリドがもどしたリポソームの中でその抗ウィルス 活性を保持していることを示した。実施例２ 実施例１を¹²⁵Ｉ−ラベル化rIFNα−BDBBを用いて繰り返す。得られるリポソ ームをin vivo薬理動力学試験にかけ、それではこれ らをラクトモデルで遊離のα−インターフェロンハイブリドと比較する。雄のWi starラットに本リポソーム及び遊離のα−インターフェロンハイブリドをそれぞ れ尾静脈に静脈注射する。α−IFNハイブリドの用量はそれぞれ同一とする。一 部の動物を注射の15分後に犠牲にし、そして残りは注射の２時間後に犠牲にする 。犠牲にした動物の肝臓中の放射能をガンマ−計測により決定し、そして、肝臓 中のもとのα−IFNハイブリドの用量に対するパーセンテージを計算する。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９６年１１月１５日 【補正内容】 請求の範囲 １．50〜75 mol％の中性リン脂質、20〜40 mol％のコレステロール及び５〜10 mol％の帯電したリン脂質を含んで成る脂質混合物より成るリポソームの中に含 まれたα−インターフェロンＢ／Ｄハイブリドを含んで成る薬理組成物。 ２．前記α−インターフェロンハイブリドがα−インターフェロンBDBBハイブ リドである、請求項１記載の組成物。 ３．前記脂質混合物が20〜30℃の相転移温度を有する、請求項１又は２記載の 組成物。 ４．前記脂質混合物の主要成分が20〜30℃の相転移温度を有する中性リン脂質 成分である、先の請求項のいづれか１項記載の組成物。 ５．前記中性リン脂質成分が１又は複数種のホスファチジルコリンを含んで成 る、請求項４記載の組成物。 ６．前記中性リン脂質成分が、ジミリストイルホスファチジルコリン又はそれ とその他の中性ホスファチジルコリンとの混合物であり、ここで前記混合物が20 〜30℃の相転移温度を有する請求項４記載の組成物。 ７．前記中性リン脂質成分がジミリストイルホスファチジルコリンである、請 求項４記載の組成物。 ８．前記帯電したリン脂質成分が１又は複数種の負に帯電したリン脂質を含ん で成る、先の請求項のいづれか１項記載の組成物。 ９．前記帯電したリン脂質成分が１又は複数種のホスファチジルセリンを含ん で成る、請求項８記載の組成物。 10．前記帯電したリン脂質成分がジオレオイルホスファチジルセリンである、 請求項９記載の組成物。 11．前記脂質混合物が50〜70 mol％の中性リン脂質、25〜35 mol％のコレステ ロール及び５〜10 mol％の帯電したリン脂質を含んで成る、先の請求項のいづれ か１項記載の組成物。 12．中性リン脂質：コレステロール：帯電したリン脂質のモル比が９：５：１ である、請求項11記載の組成物。 13．前記リポソームが200ナノメーター以下の平均粒子サイズを有する、先の 請求項のいづれか１項記載の組成物。 14．前記リポソームが80〜180nm の平均粒子サイズを有する、請求項13記載の 組成物。 15．前記α−インターフェロンハイブリド、対、脂質混合物の重量比が１：40 0〜１：300である、先の請求項のいづれか１項記載の組成物。 16．前記リポソームが脱水状態となっている、先の請求項のいづれか１項記載 の組成物。 17．請求項１記載の組成物を調製する方法であって、有機溶媒中の請求項１に 規定する脂質混合物の溶液から溶媒を除去して脂質残渣を得る、この脂質残渣を α−インターフェロンハイブリドを含む水性媒体と混合する、得られる混合物を 撹拌して封入されたα−インターフェロンハイブリドを含むリポソームの水性懸 濁物を得る、そして得られる懸濁物を、任意的に水性媒体による希釈の後、１又 は数枚の膜フィルターに押出する、ことを含んで成る方法。 18．押出したリポソームの水性懸濁物を脱水にかけ、必要なときに水による処 理によってもどすことのできるリポソームを供する粉末を得る、請求項17記載の 方法。 19．前記α−インターフェロンハイブリドが請求項２に特定されたものであり 、前記脂質混合物が請求項３〜12のいづれか１項に特定されたものであり、そし て前記リポソームが請求項13〜15のいづ れか１項に特定されたものである、請求項17又は18記載の方法。 20．ウィルス性肝臓病の処置のための医薬品の調製における、請求項１〜18の いづれか１項に特定されているリポソームの中に含まれたα−インターフェロン ハイブリドの利用であって、ここで前記リポソームがコレステロールと、少なく とも２種類のリン脂質との脂質混合物より形成されたものであり、ここで少なく とも一種のリン脂質は帯電しており、そして少なくとも一種のリン脂質は中性で ある、方法。 21．ウィルス性肝臓病の処置を必要とする温血動物に対して請求項１〜18のい づれか１項記載の組成物を投与することを含んで成る、前記処置の方法であって 、ここで前記リポソームがコレステロールと、少なくとも２種類のリン脂質との 脂質混合物より形成されたものであり、ここで少なくとも一種のリン脂質は帯電 しており、そして少なくとも一種のリン脂質は中性である、方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｃ Ａ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 アコーラク，モハメット イギリス国，ウエスト サセックス アー ルエイチ11 ８エルワイ，クローリー，グ ラスホップス グリーン，コルネ ウォー ク ６

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．コレステロールと、少なくとも２種類のリン脂質との脂質混合物より形成 されたリポソームの中に含まれているα−インターフェロンハイブリドを含んで 成る薬理組成物であって、ここで少なくとも一種類のリン脂質が帯電しており、 そして少なくとも一種類のリン脂質が中性である、組成物。 ２．前記α−インターフェロンハイブリドがα−インターフェロンＢ／Ｄハイ ブリドである、請求項１記載の組成物。 ３．前記α−インターフェロンハイブリドがα−インターフェロンBDBBハイブ リドである、請求項２記載の組成物。 ４．前記脂質混合物が20〜30℃の相転移温度を有する、先の請求項のいづれか １項記載の組成物。 ５．前記脂質混合物の主要成分が20〜30℃の相転移温度を有する中性リン脂質 成分である、先の請求項のいづれか１項記載の組成物。 ６．前記中性リン脂質成分が１又は複数種のホスファチジルコリンを含んで成 る、請求項５記載の組成物。 ７．前記中性リン脂質成分が、ジミリストイルホスファチジルコリン又はそれ とその他の中性ホスファチジルコリンとの混合物であり、ここで前記混合物が20 〜30℃の相転移温度を有する請求項５記載の組成物。 ８．前記中性リン脂質成分がジミリストイルホスファチジルコリンである、請 求項５記載の組成物。 ９．前記帯電したリン脂質成分が１又は複数種の負に帯電したリン脂質を含ん で成る、先の請求項のいづれか１項記載の組成物。 10．前記帯電したリン脂質成分が１又は複数種のホスファチジル セリンを含んで成る、請求項９記載の組成物。 11．前記帯電したリン脂質成分がジオレオイルホスファチジルセリンである、 請求項10記載の組成物。 12．前記脂質混合物が50〜75 mol％の中性リン脂質、20〜40 mol％のコレステ ロール及び５〜10 mol％の帯電したリン脂質を含んで成る、先の請求項のいづれ か１項記載の組成物。 13．前記脂質混合物が55〜70 mol％の中性リン脂質、25〜35 mol％のコレステ ロール及び５〜10 mol％の帯電したリン脂質を含んで成る、請求項に記載の組成 物。 14．中性リン脂質：コレステロール：帯電したリン脂質のモル比が９：５：１ である、請求項13記載の組成物。 15．前記リポソームが200ナノメーター以下の平均粒子サイズを有する、先の 請求項のいづれか１項記載の組成物。 16．前記リポソームが80〜180nm の平均粒子サイズを有する、請求項15記載の 組成物。 17．前記α−インターフェロンハイブリド、対、脂質混合物の重量比が１：40 0〜１：300である、先の請求項のいづれか１項記載の組成物。 18．前記リポソームが脱水状態となっている、先の請求項のいづれか１項記載 の組成物。 19．請求項１記載の組成物を調製する方法であって、有機溶媒中の請求項１に 規定する脂質混合物の溶液から溶媒を除去して脂質残渣を得る、この脂質残渣を α−インターフェロンハイブリドを含む水性媒体と混合する、得られる混合物を 撹拌して封入されたα−インターフェロンハイブリドを含むリポソームの水性懸 濁物を得る、そして得られる懸濁物を、任意的に水性媒体による希釈の後、１又 は数枚の膜フィルターに押出する、ことを含んで成る方法。 20．押出したリポソームの水性懸濁物を脱水にかけ、必要なときに水による処 理によってもどすことのできるリポソームを供する粉末を得る、請求項19記載の 方法。 21．前記α−インターフェロンハイブリドが請求項２又は３に特定されたもの であり、前記脂質混合物が請求項４〜14のいづれか１項に特定されたものであり 、そして前記リポソームが請求項15〜17のいづれか１項に特定されたものである 、請求項19又は20記載の方法。 22．ウィルス性肝臓病の処置のための医薬品の調製における、請求項１〜18の いづれか１項に特定されているリポソームの中に含まれたα−インターフェロン ハイブリドの利用。 23．ウィルス性肝臓病の処置を必要とする温血動物に対して請求項１〜18のい づれか１項記載の組成物を投与することを含んで成る、前記処置の方法。