JPH10512454A - 立体選択的微生物還元プロセス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 式IIの化合物の式Ｉの化合物への立体選択的還元が記載され、これはZygosaccharomyces bailiiのATCC 38924の培養ブロスに式IIの化合物を添加し、得られた混合物をインキュベートして、式Ｉのヒドロキシ化合物を単離することを含む。式IVの化合物の式IIIの化合物への立体選択的還元がまた記載され、これはSchizosaccharomyces octosporusのATCC 2479の培養ブロスに式IVの化合物を添加し、得られた混合物をインキュベートして、式IIIの水酸化化合物を単離することを含む。得られた式ＩおよびIIIの化合物は、血清コレステロール低減薬剤である、1-(4-フルオロフェニル)-3(R)-[3(S)-ヒドロキシ-3-(4-フルオロフェニル)プロピル]-4(S)-(4-ヒドロキシフェニル)-2-アゼチジノンの調製における中間体として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 立体選択的微生物還元プロセス 発明の簡単な要旨 本発明は、American Type Culture Collectionから得られ得る、微生物Zygosa ccharomyces bailiiのAmerican Type Culture Collection（ATCC）38924を、ケ トン化合物である4-(4-フルオロベンゾイル)酪酸（これはまた本明細書中でFBBA という）が添加され得る培地中で培養する工程を包含する、カルボニル基の微生 物学的還元に関し、これにより、所望の立体化学の水酸基を有する化合物が形成 され、蓄積され、そして上記の培地から単離され得る。得られたヒドロキシ化合 物の(S)-5-(4-フルオロフェニル)ヒドロキシ吉草酸（FPHVA）は、血清コレステ ロール低減薬剤である、1-(4-フルオロフェニル)-3(R)-[3(S)-ヒドロキシ-3-(4- フルオロフェニル)プロピル]-4(S)-(4-ヒドロキシフェニル)-2-アゼチジノンの 調製における中間体として有用である。さらに詳細には、ヒドロキシ中間体であ るFPHVAの水酸基および酸基は、Protective Groups in Organic Chemistry、T.W .Greene、John Wiley＆Sons（1981）（本明細書中で参照により援用される）に 述べられるような、保護基化学によって保護され得る。得られる化合物は、1995 年3月30日発行のPCT/US94/10099（本明細書中で参照により援用される）の８頁1 8行目に述べられる式IIIによって包含される。PCT/US94/10099は、上記の血清コ レステロール低減薬剤に変換されるものとしての、FPHVAの保護された形態を示 す。 本発明はまた、Schizosaccharomyces octosporusのATCC #2479を含む、選択さ れた微生物によるFBBA-フェニルオキサゾリジノン結合体におけるカルボニル基 の微生物学的還元に関する。 発明の詳細な説明 上述のように、本発明は、微生物を使用する以下の立体選択的還元を実施する ための方法に関する。 微生物学的還元は、ケトン基質FBBA（上記式IIの化合物）を、微生物を含む培 養ブロスに添加することにより実施される。培地の初期pH値を約4.0〜約8.0の間 の範囲に、好ましくは5.5に調節しつつ、約20℃〜約40℃の範囲（好ましくは30 ℃で行われる）の温度でインキュベートされ得る。 反応物中の化合物IIの初期濃度は、約1.0g/L〜約20.0g/Lの間でさまざまであ り得、そして好ましくは10.0g/Lである。 キラル還元反応の持続時間は、約18から約96時間までさまざまであり、そして 好ましくは約48〜72時間である。 還元反応の終了時、FPHVA（式Ｉのヒドロキシ化合物）は、酢酸エチル、t-ブ チルメチルエーテル（TBME）、塩化メチレンなどのような有機溶媒を使用して抽 出され得る。樹脂への吸着、クロマトグラフィー、および当該分野に公知の他の 物理的方法もまた、化合物Ｉを抽出するために使用され得る。 多数の微生物が調査されて、それらが化合物IIのケトン基を還元するかどうか が決定された。このような微生物な多くは、所望の特異性または生産性を提供し なかった。この還元について所望の特異性または生産性を提供するものの内で、 Z．bailiiのATCC No.38924が、ケトン（化合物II）の最大開始濃度から、所望の エナンチオマー純度を有する化合物Ｉの最高収率を与えた。化合物IIの最大開始 濃度でこの反応を行うことは、所望のアルコール（化合物Ｉ）を得る最も経済的 手段を与えるので、これは非常に望ましい。 後の実施例において、以下が与えられる： 実施例１．Z．bailiiのATCC No.38924を含む微生物による、化合物IIの立体選 択的還元を同定する方法。 実施例２．Z．bailiiのATCC No.38924を含む培養物による、化合物IIの立体選 択的還元が、もとの同定例よりも高い化合物IIの濃度で行われ得ることを決定す る方法。 実施例３．Z．bailiiのATCC No.38924による、化合物IIの立体選択的還元を、 実施例２で使用されたよりも高い化合物IIの濃度を使用するフラスコ発酵として 行う方法。 実施例４．Z．bailiiのATCC No.38924による、化合物IIの立体選択的還元を、 フラスコ発酵中で行って、グラム量のヒドロキシ化合物Ｉを得る方法。 実施例５．10リットルの発酵槽を用いて、Z.bailiiのATCC 38924による化合物 IIの立体選択的還元を行う方法。 本発明はまた、温度、出発培地の初期pH、式IVの化合物の初期濃度、および反 応の持続時間の適切な条件を使用して、式IIIの化合物を得るための、選択され た微生物（Schizosaccharomyces octosporusのATCC #2479を含む）によるFBBA- フェニルオキサゾリジノン結合体（式IVの化合物）中のカルボニル基の微生物学 的還元に関する。 得られた式IIIの化合物はまた、コレステロール低減薬剤に変換され得る。実施例１． 1-(4-フルオロフェニル)-3(R)-[3(S)-ヒドロキシ-3-(4-フルオロフェニル)プ ロピル]-4(S)-(4-ヒドロキシフェニル)-2-アゼチジノンを生成するための合成前 駆体として使用するための、4-(4-フルオロベンゾイル)酪酸（FBBA、化合物II） の立体選択的微生物還元を同定するための、一般的方法を以下に記載する。 酵母、糸状菌、および細菌の種培養物を、YPD（１% 酵母抽出物、２% ペプト ン、２% デキストロース；pH5.5）、SIM6（3.5% ダイズ粉、５% 白色ジャガイモ デキストロース、0.5% セレロース（cerelose）、２mg/L 塩化コバルト、0.5% 炭酸カルシウム；pH6.0）およびNYC（0.8% 栄養ブロス、２% 酵母抽出物、２% セレロース；pH7.0）の培地を、それぞれ25mL含む125mLのフラスコ中で、30℃で 72時間、撹拌（175〜250rpm）しながら増殖させた。次いで30℃で撹拌（250rpm ）しながらインキュベートしたフラスコ発酵物（25mL YPD/125mL 酵母および糸 状菌のフラスコ、または25mL NYC/125mL 細菌のフラスコ）中に接種（４% v/v） した。すべての発酵物において、接種に先立って、培地pHを調節したが、培養物 増殖およびケトン還元の間は制御しなかった。増殖の24時間後、メタノール（10 0mg/mL）中に溶解した化合物II（１g/L）を培養物に直接添加してケトン還元を 開始した。基質とともに24〜48時間インキュベートした後、TBME（１：２）で抽 出した発酵ブロスのサンプルを、逆相HPLCで分析した。この手順を使用する発酵 を繰り返した後で、基質を著しく分解することなく、調和した還元活性を示す培 養物を、キラルHPLCによりさらに分析して、アルコール生成物の立体配置を決定 した。１g/Lで、高いエナンチオマー過剰率（ee＞95%）で化合物IIを還元して、 化合物ＩのSエナンチオマーを生成し得る培養物を、表１にまとめた。 実施例２． 実施例１に使用されたよりも高い濃度で化合物IIを還元し得る微生物（Z．bai lii ATCC 38924を含む）を同定するための一般的方法を以下に記載する。 酵母の種培養物を、25mLのYPD培地（１% 酵母抽出物、２% ペプトン、２% デ キストロース；pH5.5）を含む125mLのフラスコ中で、30℃で72時間、撹拌（250r pm）しながら増殖させた。次いで30℃で撹拌（250rpm）しながらインキュベート したフラスコ発酵物（25mL YPD/125mL フラスコ）中に接種（４% v/v）した。す べての発酵物において、接種に先立って、培地pHを調節したが、培養物増殖およ びケトン還元の間は制御しなかった。表２に示すように接種時、増殖の24時間後 、または両方で、メタノール（100mg/mL）に溶解した化合物II（１〜４g/L）を 培養物に直接添加することによりケトン還元を開始した。化合物IIとともに24〜 48時間インキュベートした後、TBME（１：２）で抽出した発酵ブロスのサンプル を、HPLCにより分析して、表２にまとめたような化合物Ｉの収率を評価した。 実施例３． フラスコ発酵における、Z．bailiiのATCC 38924による化合物IIの還元に対す る発酵パラメータを調べるための一般的方法を以下に記載する。Z．bailiiのATC C 38924の種培養物を、YPD（１% 酵母抽出物、２% ペプトン、２% デキストロー ス；pH5.5）またはTNC（１% Tastone 154、２% NZアミン、３% セレロース；pH5 .5）の25mLまたは100mLを含む125mLまたは300mLのフラスコ中で、30℃で24〜72 時間、撹拌（250rpm）しながら増殖させた。次いで30℃で撹拌（250rpm）しなが らインキュベートした、表３に示すフラスコ発酵物（25mL〜100mL YPDまたはTNC /125mL〜300mL フラスコ）中に接種（２〜８% v/v）した。すべての条件で、接 種に先立って、培地pHを調節したが、培養物増殖およびケトン還元の間は制御し なかった。24時間増殖させた後、メタノール（MeOH；100mg/mL）またはジメチル スルホキシド（DMSO；500mg/mL、わずかに加熱する）に溶解した化合物II（４〜 10g/L）を培養物に直接添加してケトン還元を開始した。次いで化合物IIととも に24〜72時間インキュベートし、そしてTBME（１：４）で抽出した後、発酵ブロ スのサンプルを採取した。抽出物をエタノール（１：１）で希釈し、その後逆相 HPLCにより分析して、表３にまとめたような化合物Ｉの収率を決定した。実施例４． 化合物IIの立体選択的還元に由来するグラム量の化合物Ｉを、フラスコ発酵に おいて、表３まとめたパラメータセット27のような、高い収率および選択性を与 える条件を適用して、Z．bailiiのATCC 38924を使用して調製した。特に、Z．ba iliiのATCC 38924の種培養物を、TNC培地（１% Tastone 154、２% NZアミン、３ % セレロース；pH5.5）100mLを含む300mLのフラスコ中で、30℃で72時間、撹拌 （250rpm）しながら増殖させた。接種に先立って、培地のpHを調節したが、培養 物増殖または、それに続くケトン還元の間は制御しなかった。接種材料（seed i noculum）（４% v/v）を100mLのTNC培地を含む発酵フラスコ（300mL）中に移し 、30℃で24時間、撹拌（250rpm）しながら増殖させ、次いでジメチルスルホキシ ド（DMSO；500mg/mL、わずかに加熱する）中に溶解した10g/Lの化合物IIを添加 した。化合物IIとともに24時間インキュベートした後、さらにセレロース （３% w/v）を発酵物に添加した。化合物IIとともにインキュベートする間に採 取された発酵ブロスのサンプルを、TBME（１：４）で抽出して、エタノール（１ ：１）で希釈し、そして逆相HPLCにより分析した。72時間のインキュベート後に 、化合物IIの化合物Ｉへの還元が終結したことを示した。 遠心分離し、そして上清をTBME（２×250mL）および酢酸エチル（１×200mL） で抽出して細胞を除去することにより、発酵ブロス（５×100mL）から化合物Ｉ を回収した。プールした抽出物を、蒸留水および飽和塩化ナトリウム溶液（２× 250mL）で洗浄した。無水硫酸マグネシウムを、洗浄された溶媒抽出物に添加し て、残留水を吸着させ、そして濾過により除去した。濾液をエバポレートして濃 縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（２×５〜10インチ カラムベッド）で精 製した。塩化メチレン：酢酸エチル（60:40）溶液で、物質をカラムから溶出さ せた。化合物Ｉだけを含むピークの画分を薄層クロマトグラフィーで同定し、プ ールして、そしてエバポレートにより濃縮した。化合物Ｉの総重量3.43gを生物 変換物５gから単離した。この物質のサンプルが所望の生成化合物Ｉであること を、逆相HPLC、キラルHPLC、NMR、質量スペクトルおよび元素分析で確認した。実施例５． 10Lの発酵槽における、Z．bailiiのATCC 38924を使用する、化合物Ｉへの化合 物IIの生物変換のための一般的方法を以下に記載する。 第１段階種培養物を、TNC培地（１% Tastone 154、２% NZアミン、３% セレロ ース；pH5.5）中で100mL/300mLのフラスコを使用して、30℃で24時間、撹拌（25 0rpm）しながら増殖させた。その後、30℃で撹拌（250rpm）しながらインキュベ ートしたTNC培地（500mL/2L フラスコ）を使用した、第２段階の種発酵物に逐次 移した（５%）。72時間増殖させた後、第２段階種培養物を使用して、５〜10Lの BTX-1-XO2培地（１% Tastone 154、２% NZアミン、12% セレロース、0.5mL SAG- 471 消泡剤/L 培地；pH5.5）を含む発酵槽に接種した（５% v/v）。培養物を、 発酵槽中にて30℃で撹拌しながら（インペラ速度；600〜1000rpm）増殖させ、圧 力（５psi）下で通気（エアフロー；３〜10L/分）した。溶解した酸素を、撹拌 速度および通気率を調節して、30%以上に維持した。培養物の増殖を、オフガス （off gas）を二酸化炭素に対して分析することによりモニターし、そして培地 のpHを、接種に先立って調節したが、培養物増殖およびケトン還元の間は制御し なかった。オフガスが初期濃度3.9%に達した時に、ジメチルスルホキシド（DMSO ；400mg/mL）に溶解した化合物II（10g/L）を培養物に直接添加してケトン還元 を開始した。オフガスが、初期濃度が2.5%でかつ二酸化炭素発生が最大に達した 時に、セレロース（３% w/v）を発酵中の発酵物に添加した。二酸化炭素発生が 最大（オフガスが２%の二酸化炭素を含む時）になったら、さらに６%のセレロー スを添加した。発酵ブロスのサンプルを、化合物IIとともに24〜72時間インキュ ベートし、そしてTBME（１：４）で抽出した後、採取した。抽出物をエタノール （１：１）で希釈し、その後逆相HPLCにより分析した。48〜72時間インキュベー トした後に、化合物IIの約80〜90%が化合物Ｉに還元された。 実施例６． 選択された微生物（Schizosaccharomyces octosporus ATCC #2479を含む）によ るFBBA-フェニルオキサゾリジノン結合体の還元 1-(4-フルオロフェニル)-3(R)-[3(S)-ヒドロキシ-3-(4-フルオロフェニル)プ ロピル]-4(S)-(4-ヒドロキシフェニル)-2-アゼチジノンを生成するための合成前 駆体として使用するための、4-(4-フルオロベンゾイル)酪酸（FBBA）およびフェ ニルオキサゾリジノンから形成される縮合生成化合物IVの化合物IIIへの立体選 択的微生物還元を同定するための、一般的方法を以下に記載する。 酵母、糸状菌、および細菌の種培養物を、YPD（１% 酵母抽出物、２% ペプトン 、２% デキストロース；pH5.5）、SIM6（3.5% ダイズ粉、５% 白色ジャガイモデ キストロース、0.5% セレロース、２mg/L 塩化コバルト、0.5% 炭酸カルシウム ；pH6.0）およびNYC（0.8% 栄養ブロス、２% 酵母抽出物、２% セレロース；pH7 .0）培地をそれぞれ25mL含む125mLのフラスコ中で、30℃で72時間、撹拌（175〜 250rpm）しながら増殖させ、次いでフラスコ発酵物に接種（４% v/v）した。す べての発酵物において、接種に先立って、培地のpHを調節したが、培養物増殖お よびケトン還元の間は制御しなかった。増殖の24時間後、30℃で撹拌（250rpm） しながらインキュベートした、25mL YPD/125mL 酵母および糸状菌のフラスコ、 または25mL NYC/125mL 細菌のフラスコ中にメタノール（100mg/mL）に溶解した 化合物IV（１g/L）を培養物に直接添加してケトン還元を開始した。化合物IIIの 合成およびエナンチオマー過剰率を、化合物IVとともに24〜48時間インキュベー トした後、TBME（１：２）で抽出した発酵ブロスのサンプルを使用して、キラル HPLCにより決定した。化合物IVの還元をして、化合物IIIを生じ得る培養物を、 表 ４にまとめた。 Schizosaccharomyces octosporus ATCC 2479は、化合物IV１g/Lから、所望の エナンチオマー純度で、化合物IIIの最高収率を与えた。 複数のフラスコ生物変換を、S．octosporus ATCC 2479を用いて行い、化学的 キャラクタリゼーションのための物質を生じさせた。種培養物をYPD培地（25mL/ 125mL フラスコ）中で、30℃で72時間、撹拌しながら増殖させ、次いでフラスコ 発酵物（20×100mL/300mL）中に接種した（４% v/v）。接種に先立って、培地の pHを調節したが、培養増殖およびケトン還元の間は制御しなかった。増殖の24時 間後、化合物IV（１g/Lをメタノール100mg/mL中に溶解）を、30℃で24時間、撹 拌（250rpm）しながらフラスコ発酵物に添加した。化合物IVは収率20〜40％で化 合物IIIに還元された。化合物IVの加水分解（degrative hydrolysis）もまた観 測された。発酵ブロスをプールし、遠心分離して、細胞を除去し、そして上清を 酢酸エチル（１：0.5）で抽出した。抽出物を等量の塩の溶液（6M 塩化ナトリウ ム）で２回洗浄し、その後脱イオン蒸留水で洗浄した。無水硫酸マグネシウムを エチル酢酸抽出物に添加して、残留水を除去し、この抽出物を濾過し、そして濾 液をエバポレートして濃縮した。抽出物の濃縮物をシリカゲルクロマトグラフィ ー（１×12インチ カラムベッド）により精製した。塩化メチレン：酢酸エチル ：酢酸（90:10:0.5）の溶液で、物質をカラムから溶出させた。生成物を含むピ ークの画分をプールして、エバポレートにより濃縮し、次いで分離用の薄層クロ マトグラフィープレートで、酢酸エチル：ヘキサン：酢酸（60:40:0.5）の溶液 を使用して分離した。この手順を使用して発酵ブロスから２種の生成物を単離し 、そして、HPLCおよびNMR分析により決定されて、所望の還元されたアルコール 結合化合物IIIおよび化合物IVの合成に使用されるフェニルオキサゾリジノン試 薬であることを示した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:645） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ， ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，Ｌ Ｃ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．式IIの化合物の、式Ｉの化合物への立体選択的還元であって、 Zygosaccharomyces bailiiのATCC 38924の培養ブロスに式IIの化合物を添加する 工程、得られた混合物をインキュベートする工程、および式Ｉのヒドロキシ化合 物を単離する工程を含む、立体選択的還元。 ２．式IVの化合物の、式IIIの化合物への立体選択的還元であって、 Schizosaccharomyces octosporusのATCC 2479の培養ブロスに式IVの化合物を添 加する工程、得られた混合物をインキュベートする工程、および式IIIのヒドロ キシ化合物を単離する工程を含む、立体選択的還元。