JPH1080273A - Ｍｐ５２に対するモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ダイマー型のヒトＭＰ５２に結合し、モノマ
ー型のヒトＭＰ５２に結合しないヒトＭＰ５２に対する
マウスモノクローナル抗体を提供することにある。 【効果】 ＣＨＯ細胞で生産されたヒトＭＰ５２（ＣＨ
Ｏ−ＭＰ５２）と大腸菌で生産されたヒトＭＰ５２（ｒ
ｈＭＰ５２）の両者を感作原としてマウスに用いること
により、ＩｇＧからなる特異性の高い上記マウスモノク
ローナル抗体が得られる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はヒトＭＰ５２に対するマ
ウスモノクローナル抗体、それを産生するハイブリドー
マおよびその利用に関する。

【０００２】

【発明の背景】ヒトＭＰ５２は、ＴＧＦ−βジーンスー
パーファミリーに属する骨形成関連因子として１９９４
年にｃＤＮＡが初めて単離された（Biochem. Biophy. R
es. Comm. Vol.204, No.2, 1994）。ヒトＭＰ５２は、
Ｎ末端にアラニンを有する１２０のアミノ酸残基からな
る蛋白質であると考えられており、そのアミノ酸配列は
WO 93／16099，WO 95／04819に記載されている。ＭＰ５
２が、他の骨形成因子と同様に骨形成に関連しているこ
とは種々の動物実験から明らかである。しかし、骨形成
時に直接的に何によってＭＰ５２が誘導され、どのよう
なメカニズムで骨形成をなし得るかはまだ不明のところ
が多く報告も少ない。また、ＭＰ５２はマウスとヒトで
はＮ末端側のアミノ酸が１ヶ所だけしか異なっておら
ず、種を越えて強く保存されている遺伝子であるため
に、たとえばマウスでヒトのＭＰ５２に対する抗体を得
ることは容易でない。マウスモノクローナル抗体を得た
ことは、既にWO 93／16099に記載されている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、ダイ
マー型のヒトＭＰ５２に結合し、モノマー型のヒトＭＰ
５２に結合しないヒトＭＰ５２に対するマウスモノクロ
ーナル抗体を提供することである。ヒトＭＰ５２を遺伝
子工学的に製造することが試みられている。ヒトＭＰ５
２をコードするｃＤＮＡを組み込んだ宿主細胞を培養し
て産生されたヒトＭＰ５２を精製する場合、ヒトＭＰ５
２と特異的に結合するモノクローナル抗体を用いて精製
することは有効な方法である。すなわち、ヒトＭＰ５２
に特異的なモノクローナル抗体を担体に担持させ、これ
に粗精製のＭＰ５２を接触させることによりヒトＭＰ５
２を結合させて単離し、その後、ヒトＭＰ５２を分離さ
せる。この場合、活性のあるダイマー型のＭＰ５２を単
離するには、ダイマー型のヒトＭＰ５２に特異的に結合
するモノクローナル抗体を用いる事が有利であることは
明らかである。

【０００４】このヒトＭＰ５２に対するモノクローナル
抗体は、ヒトＭＰ５２の定量に用いることが出来る。ヒ
トＭＰ５２を定量することは、ＭＰ５２の誘導因子の解
明、骨形成メカニズム解析に有用である。この場合、ダ
イマー型のＭＰ５２は生体中で分解代謝され活性の無い
モノマーあるいはその断片になる可能性がある。ダイマ
ー型のＭＰ５２に特異的に結合するモノクローナル抗体
を使用することにより、活性のあるダイマー型のみを検
出することが可能となる。

【０００５】さらに本発明は、ヒトＭＰ５２の生物活性
部位に結合する抗体を提供する。すなわち、ヒトＭＰ５
２とそのレセプターとの結合を阻害するヒトＭＰ５２に
対するマウスモノクローナル抗体を提供することであ
る。これは、ＭＰ５２の高次構造を特異的に認識し、ヒ
トＭＰ５２の活性部位に結合し、その活性を阻害するも
のである。ヒトＭＰ５２の活性部位を認識する抗体であ
るので、ダイマー型のＭＰ５２であっても、不活性なも
のが存在した時それを認識しない。このことは、分離、
定量に用いた場合に明らかな利点となる。

【０００６】

【発明の開示】本発明のマウスモノクローナル抗体は、
公知のモノクローナル抗体の製法に準じて次の工程によ
って製造される。 （１）ヒトＭＰ５２を免疫原としてマウスを長期に感作
し、（２）感作マウスの脾細胞とマウスミエローマ細胞
を細胞融合し、（３）得られたハイブリドーマよりヒト
ＭＰ５２に対するモノクローナル抗体を産生しているハ
イブリドーマをスクリーニングし、（４）目的とする抗
体産生ハイブリドーマをクローニングし、（５）クロー
ン化した細胞を大量培養して抗体を生産させるか、クロ
ーン化した細胞をマウスの腹腔中に移植することにより
抗体を生産させ、（６）培養上清の抗体あるいは腹水中
の抗体を分離・精製することにより調製する。

【０００７】上述の工程をさらに詳しく説明する。工程
（１）の免疫感作マウスの作製は、ヒトＭＰ５２を１０
mM塩酸水溶液に溶解したものをフロイントの完全アジュ
バント（ＣＦＡ）と混合、乳化させたものを、４ヶ月の
間に４回の頻度で数回マウスの腹腔内に投与する。ＭＰ
５２の含有量は１０から１００μgとするのが適当であ
る。その後約１ヶ月間隔をあけ、１０から１００μgの
ヒトＭＰ５２を含む溶液をフロイントの不完全アジュバ
ント（ＩＦＡ）で同様に乳化させたものを腹腔内に投与
する。そのようにアジュバントと共にヒトＭＰ５２を感
作し続けたマウスをさらに１から２ヶ月の間隔をあけ、
アジュバントなしで１０から１００μgのヒトＭＰ５２
を皮下投与し、さらに細胞融合の日の数日前に１０から
１００μgのヒトＭＰ５２を尾静脈から投与することが
望ましい。

【０００８】ヒトＭＰ５２は、それをコードするｃＤＮ
Ａを組み込んだ発現ベクターを用いて、ＣＨＯ細胞のよ
うな動物細胞および大腸菌のような細菌を宿主として生
産することが試みられている。本発明者は、ＣＨＯ細胞
で生産されたヒトＭＰ５２（以下ＣＨＯ−ＭＰ５２と略
す）（ヒトＭＰ５２産生動物株ＭＣ−２は工業技術院生
命工学工業技術研究所に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５１
４２として寄託されている）および大腸菌で生産された
ヒトＭＰ５２（以下ｒｈＭＰ５２と略す）（ヒトＭＰ５
２の発現ベクターは工業技術院生命工学工業技術研究所
に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５４９９として寄託されて
いる）のそれぞれを感作原としてモノクローナル抗体を
生産することを試みた。ところが得られた抗体は、全て
ＩｇＭであり、特異性の低いものしか得られなかった。
しかしながら、ＣＨＯ−ＭＰ５２とｒｈＭＰ５２の両者
を感作原として用いることによりＩｇＧからなる特異性
の高いモノクローナル抗体を得ることに成功した。

【０００９】工程（２）の細胞融合は、まず工程（１）
で十分に免疫感作したマウスの脾臓を摘出し、常法に従
って脾細胞の懸濁液を調製する。次に得られた脾細胞と
マウスミエローマ細胞とを混合したものを温ポリエチレ
ングリコールで融合処理する。融合処理後、細胞混合物
をウシ胎児血清（ＦＣＳ）、ＨＡＴ｛ヒポキサンチン
（Ｈ）、アミノプテリン（Ａ）、チミジン（Ｔ）｝を培
地に添加したものを使用して非融合細胞を除去する。低
濃度（１ウェル中に１クローンが増殖できる濃度）で９
６穴プレートに分注し、増殖の確認できたウェルの上清
を１週間後に採取する。

【００１０】工程（３）の上清中に産生された抗ヒトＭ
Ｐ５２抗体のアッセイは、免疫原として用いたヒトＭＰ
５２を９６ウェルにコートさせたプレートを用い、通常
のＥＬＩＳＡ法により行うことが出来る。モノマー型ヒ
トＭＰ５２に結合せず、ダイマー型ヒトＭＰ５２に結合
するヒトＭＰ５２を選択するために、１）未処理（非還
元）ダイマー型ヒトＭＰ５２（Ｄ−ｒｈＭＰ５２）と
２）還元化モノマー型ヒトＭＰ５２（Ｍ−ｒｈＭＰ５
２）を用いる二つのＥＬＩＳＡを組み合わせる。この
時、還元状態のモノマー分子は、プレートにコートする
とき容易にダイマーを形成するので、コートに用いるモ
ノマーは、常法によりスルフォン化し、ダイマー分子の
再構成が起こらないように処理したものを使用した。さ
らに、モノマー型ヒトＭＰ５２とダイマー型ヒトＭＰ５
２への反応性はウエスタンブロット法によってその特異
性を確認する。

【００１１】工程（４）のクローニングの操作は、限界
希釈法にて１ウェルに０.５個の細胞が入るように分注
することによって行う。

【００１２】工程（５）は、公知の方法に従って行うこ
とが出来る。クローン化されたハイブリドーマを通常の
培地で培養しその培養上清から抗体を得る場合に比し
て、ハイブリドーマをマウス腹腔内に移植する事によ
り、数百倍から数千倍の濃度で回収することができる。

【００１３】工程（６）は、公知の定法によって行うこ
とが出来る。プロテインＡ或いはプロテインＧを用いた
アフィニティークロマトグラフィーを用いることが出来
る。

【００１４】本発明のモノクローナル抗体の特徴は次の
ように要約できる。 （１）ダイマー型ＭＰ５２に結合する。 （２）モノマー型ＭＰ５２には結合しない。 （３）Ｈ鎖のサブクラスはγである。 （４）ＴＧＦ−βジーンスーパーファミリーに属する他
の骨形成因子、特にアミノ酸組成が類似しているＴＧＦ
−βおよびＢＭＰ−２とは交叉反応しない。

【００１５】本発明のモノクローナル抗体を用いるヒト
ＭＰ５２の精製は、常法によって行うことが出来る。本
発明のモノクローナル抗体を、例えばセファデックス
（ファルマシア製）のような吸着剤に吸着させる。この
吸着剤に粗精製のヒトＭＰ５２溶液を通してヒトＭＰ５
２を吸着させる。ついで、吸着されたヒトＭＰ５２を常
法により適当な溶出液で処理すれば、純度の高いヒトＭ
Ｐ５２が取得できる。本発明のモノクローナル抗体を用
いるヒトＭＰ５２の定量は、公知のＥＬＩＳＡ法等によ
り定量できる。その具体例は本明細書の実施例にも記載
されている。ヒトＭＰ５２を４２.４pg／ml程度の感度
で定量することができる。

【００１６】

【実施例】以下に参考例および実施例をあげて本発明を
説明する。

【００１７】参考例１ ｒｈＭＰ５２の調製 １．ベクターの作製 (１) ｒｈＭＰ５２成熟型部分の単離 ヒトＭＰ５２ｃＤＮＡは、WO 93／16099に記載されたｃ
ＤＮＡを含んだプラスミドベクター（ｐＳＫ５２ｓ）を
鋳型ＤＮＡとして、成熟型部分のみをポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）を用いて増幅した。開始コドンＡＴＧ周
辺のＡＴ含量を上げる事により、目的タンパク質の生産
性を上げる方法｛M. Nobuharaらの報告（Agric. Biol.
Chem., 52(6), 1331〜1338, 1988)｝に従い成熟型のＭ
Ｐ５２遺伝子の一部のＤＮＡを置換した。置換の方法
は、配列番号２の順方向ＰＣＲプライマーを用い、ＰＣ
Ｒ法で行った。ＰＣＲプライマーのＤＮＡ配列は、順方
向プライマーとして配列番号２、及び逆方向プライマー
として配列番号３記載のＤＮＡを用いた。ＰＣＲは、同
じ試験管中で、鋳型ＤＮＡ（１０ナノグラム）、順方向
及び逆方向ＰＣＲプライマー各々５０ピコモル、ｄＮＴ
Ｐ（０.２ミリモル）、及びＭｇＣｌ₂（１.５ミリモ
ル）をＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ）と共に加え
ることにより行った。各サイクルが、変性（９４℃、１
分間）、プライマーアニーリング（５５℃、１分間）、
およびプライマー伸長（７２℃、２分間）からなる３０
サイクルのＰＣＲを行った（以下のＰＣＲはすべてこの
条件で行った）。ＰＣＲ反応からの生成物を１.５％低
融点アガロース（ＦＭＣ社）中で電気泳動により分離
し、配列番号１のアミノ酸配列に相当する約３６０bpか
らなるＤＮＡを切り出した（これをフラグメント１とす
る）。

【００１８】(２) 本タンパク質の大腸菌発現ベクター
の構築 プラスミドの複製数を上げるためには、複製オリジンを
ｐＢＲ系からｐＵＣ系に改変した。市販の大腸菌発現ベ
クターｐＫＫ２２３−３（ファルマシア・バイオテク株
式会社より購入）のｔａｃプロモーター領域を制限酵素
ＳｓｐＩとＥｃｏＲＩで消化後、Mung Bean Nuclease
（宝酒造株式会社，カタログ番号２４２０Ａ）で処理
し、フラグメント１の開始コドン側にＴ４ＤＮＡ Ligas
e（宝酒造株式会社，カタログ番号２０１１Ａ）で結合
させ、ｐＫＫ２２３−３のｒｒｎＢＴ₁Ｔ₂ターミネータ
ー領域を制限酵素ＳａｌＩとＳｓｐＩで消化し、Ｓａｌ
Ｉで消化したフラグメント１の終止コドン側に結合さ
せ、ｐＵＣ１８のＳｍａＩ部位に組み込むことにより、
本タンパク質の生産のための発現ベクター｛ｐＫＯＴ２
４５（受託番号微工研寄第Ｐ−１４８９５号）｝（図
１）を構築した。ｐＫＯＴ２４５のＤＮＡの長さは３.
７kbである。作製した本タンパク質発現ベクターは、Ph
armacia ALF DNA シークエンサーによりその塩基配列の
決定を行った。

【００１９】(３) 形質転換 形質転換は、Kushnerらの塩化ルビジウム法（Genetic E
ngineering, p.17, Elsevier (1978)）に従った。即
ち、ｐＫＯＴ２４５を宿主大腸菌Ｗ３１１０Ｍへ上記の
手法に従い移入し、本タンパク質生産大腸菌とした。

【００２０】２．培養 (１) 培養 本タンパク質発現大腸菌を改変ＳＯＣ培地（Bacto tryp
tone 20ｇ/l, Bacto yeast extract ５ｇ/ｌ, NaCl 0.5
ｇ/ｌ, MgCl₂・6H₂O 2.03ｇ/ｌ, Glucose 3.6ｇ/ｌ）で
前培養し、生産用培地（Bacto tryptone ５ｇ/ｌ, Citr
ic acid 4.3ｇ/ｌ, K₂HPO₄ 4.675ｇ/ｌ, KH₂PO₄ 1.275
ｇ/ｌ, NaCl 0.865ｇ/ｌ, FeSO₄・7H₂O 100mg/ｌ, CuSO₄
・5H₂O １mg/ｌ, MnSO₄・nH₂O 0.5mg/ｌ, CaCl₂・2H₂O ２m
g/ｌ, Na₂B₄O₇・10H₂O 0.225mg/ｌ, (NH₄)6Mo₇O₂₄ 0.1mg
/ｌ, ZnSO₄・7H₂O 2.25mg/ｌ, CoCl₂・6H₂O ６mg/ｌ, MgS
O₄・7H₂O 2.2ｇ/ｌ, Thiamine HCl 5.0mg/ｌ, Glucose
３ｇ/ｌ）５Ｌに対し菌体懸濁液を１００ml添加し、１
０Ｌの培養槽で通気攪拌しながら培養し、対数増殖前期
（OD₅₅₀＝5.0）に達した段階で１mMの濃度でイソプロピ
ル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを添加し、さらに
OD₅₅₀が150に達するまで培養した。培養中、温度は３２
℃、pHはアンモニアを添加することにより7.15に制御
し、溶存酸素濃度の低下を防ぐために攪拌速度をあげる
ことにより空気飽和の５０％に溶存酸素濃度を制御し
た。また、高菌体濃度とするために溶存酸素濃度の急激
な上昇を指標として、５０％グルコース溶液を0.2％濃
度で添加しながら培養した。

【００２１】(２) 大腸菌インクルージョンボディの調
製 上記方法により得られた培養液を遠心して菌体を回収
し、１０mMエチレンヂアミン四酢酸を含む２５mM Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を（pH7.3）に懸濁し菌体破砕装置
（ゴーリン社製）を用いて細菌を破砕し、再度遠心して
インクルージョンボディを含む沈殿を回収した。

【００２２】３．精製 (１) 大腸菌インクルージョンボディの可溶化 大腸菌インクルージョンボディを１％ Triton X−100で
３回洗浄後、３０００×ｇで３０分間、４℃で遠心し、
得られた沈殿を２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、pH８.
３、８Ｍ尿素、１０mM ＤＴＴ、１mM ＥＤＴＡで超音波
をかけながら可溶化した。

【００２３】(２) 単量体精製 その可溶化液を２００００×ｇで３０分間、４℃で遠心
し、その上清を回収した。得られた上清を２０mM Ｔｒ
ｉｓ・ＨＣｌ緩衝液pH８.３、６Ｍ尿素、１mM ＥＤＴＡ
で平衡化したSP−Sepharose FF（ファルマシア社）に通
し、同溶液で洗浄後、０.５Ｍ食塩を含む同溶液で溶出
させた。溶出液にＮａ₂ＳＯ₃とＮａ₂Ｓ₄Ｏ₆をそれぞれ
最終濃度が１１１mM、１３mMになるように加え４℃、１
５時間スルホン化を行った。スルホン化溶液を２０mM
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、pH８.３、６Ｍ尿素、０.２Ｍ
食塩、１mM ＥＤＴＡで平衡化したSephacryl S−200
（ファルマシア社）でゲル濾過を行い、単一なスルホン
化された本タンパク質単量体を得た。

【００２４】(３) リフォールディング スルホン化された本タンパク質単量体の溶液に９倍量の
５０mM Ｎａ−Ｇｌｙｃｉｎｅ緩衝液pH９.８、１Ｍ塩化
ナトリウム、３０mM ＣＨＡＰＳ、５mM ＥＤＴＡ、２mM
ＧＳＨ（還元型グルタチオン）、１mM ＧＳＳＧ（酸化
型グルタチオン）を加えた後、３日間、４℃で撹拌しリ
フォールディングを行った。

【００２５】(４) 二量体精製 リフォールディングされた試料を０.０５％ＴＦＡ、２
５％アセトニトリルで平衡化しておいた逆相ＨＰＬＣの
RESOURCE RPCカラム（ファルマシア社）に通し、０.０
５％ＴＦＡ、２５〜４５％アセトニトリルグラジェント
により溶出した。溶出液は吸光度光度計を用い２８０nm
の吸光度によりモニターした。ＭＰ５２二量体画分を回
収し、凍結乾燥した。これを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−リン
酸緩衝液、pH８.０、８Ｍ尿素、１Ｍ食塩で平衡化して
おいたSephacryl S−200でゲル濾過を行った後、本タン
パク質二量体画分を上述と同様の条件で逆相ＨＰＬＣの
RESOURCE RPCカラムに通し精製された本タンパク質二量
体画分を得た。

【００２６】(５) 精製された本タンパク質の物理化学
的性質の測定 （ア）Ｎ末端アミノ酸配列分析 上記で得られた精製された本タンパク質につき、Ｎ末端
アミノ酸配列をアミノ酸シークエンサー、モデル４７６
Ａ（アプライドバイオシステムズ社）により分析したと
ころ、配列表配列番号１で示すＮ末端から３０番目まで
のアミノ酸配列が確認された。 （イ）アミノ酸組成分析 上記で得られた精製された本タンパク質のアミノ酸組成
をアミノ酸分析機｛PICO TAGシステム(ウォーターズ
社)｝により調べた。その結果を表１に示す。表に示さ
れた数は１モノマー当りのアミノ酸残基数を示す。

【表１】 （ウ）電気泳動による分析 上記で得られた精製された本タンパク質の分子量を非還
元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認したところ、約
２８KDaの分子量を示した。上記(ア)、(イ)および(ウ)
に示された結果より、本タンパク質はＮ末端が単一にＰ
ｒｏから始まる１１９残基からなるタンパク質であるこ
とが解った。

【００２７】参考例２ ＣＨＯ−ＭＰ５２の製造 （１） ＣＨＯ−ＭＰ５２の発現ベクターの構築 Biopharm GmbHのDr. Hoettenから提供されたヒトＭＰ５
２遺伝子を含むｐＳＫ５２ｓベクターをHind IIIで消化
後、ヒトＭＰ５２遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを
０.８％低融点アガロースゲルからの抽出により単離
し、Behringwerke AGのDr. Gerd Zettlmeisslから提供
されたｐＡＢｓｔｏｐベクターのHind III部位に結合さ
せた。図２に示すＣＨＯ−ＭＰ５２発現ベクターのｐＭ
ＳＳ９９（５.０kb）の構造をＤＮＡ塩基配列決定およ
び制限酵素消化により確認した。ｐＭＳＳ９９のＣＨＯ
−ＭＰ５２ ＤＮＡ塩基配列は、配列表の配列番号４に
示した５７６番目から２２７９番目までのヌクレオチド
であった。

【００２８】（２） ＣＨＯ−ＭＰ５２を生産するＣＨ
Ｏクローンの確立 Behringwerke AGのDr. Zettlmeisslから提供されたＣＨ
Ｏ−ＤＵＫＸ−Ｂ１１細胞、すなわちＣＨＯ細胞の突然
変異株に、ｐＭＳＳ９９およびDr. Zettlmeisslから提
供されたｐＳＶＯＡｄｈｆｒをりん酸カルシウムＤＮＡ
共沈法によって導入した。次に、ＣＨＯ−ＭＰ５２の高
産生細胞株をメトトレキセート（ＭＴＸ）を用いる遺伝
子増幅法により確立した。

【００２９】ｐＭＳＳ９９の１０μｇおよびｐＳＶＯＡ
ｄｈｆｒの２μｇを２５mM ＨＥＰＥＳ−１４０mM Ｎａ
Ｃｌ−０.７５mM Ｎａ₂ＨＰＯ₄（pH７.０５）１mlに溶
解し、次に２.５Ｍ ＣａＣｌ₂５０μｌと混合した。得
られた沈殿を１０cmディシュ中のＣＨＯ−ＤＵＫＸ−Ｂ
１１細胞に重層し、室温で３０分間放置した。次に、１
０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むリボ−およびデオキ
シリボ−ヌクレオチド含有ＭＥＭ ＡＬＰＨＡ培地（Ｍ
ＥＭα⁺）８mlを細胞層に加え、ＣＯ₂インキュベーター
中４〜６時間培養した。細胞を１０％グリセロールで室
温３分間処理した後、１０％ＦＢＳを含むＭＥＭα⁺培
地で２日間培養した。次に１０％透析ＦＢＳを含むリボ
−およびデオキシリボ−ヌクレオチド不含ＭＥＭ ＡＬ
ＰＨＡ培地（ＭＥＭα^-）中に細胞を撒き直して形質転
換株を選択した。形質転換クローンを単離し、次で記述
するウェスターンブロッティング分析によりＣＨＯ−Ｍ
Ｐ５２の発現を検定した。ＣＨＯ−ＭＰ５２産生クロー
ンを更にメトトレキセート（ＭＴＸ）の濃度を上げるこ
とにより段階的に選択して、ｐＳＶＯＡｄｈｆｒ遺伝子
に従ってＭＰ５２遺伝子を増幅させた。４００nM ＭＴ
Ｘで１〜３μｇのＣＨＯ−ＭＰ５２／１０⁶細胞／２４
時間産生する数個のクローンが得られた。

【００３０】（３） 培養上清液中のＣＨＯ−ＭＰ５２
の検出 次のとおりのウェスターンブロッティング分析により、
ＣＨＯ−ＭＰ５２の発現についてクローンを検定した：
培養上清液（１〜１５μｌ）を還元条件下にＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ（１５〜２５％ポリアクリルアミド勾配ゲル、第
一化学）により分離し、次にタンパク質をＰＶＤＦ膜
（Clear Blot Membrane-P, ATTO）に転写した。膜をBlo
ck Ace（大日本製薬）で１時間ブロックし、Tris緩衝食
塩水（ＴＢＳ）ですすぎ、次に１０倍希釈されたBlock
Ace中のＣＨＯ−ＭＰ５２に対するニワトリ抗体１０μ
ｇ／mlで一晩処理した。膜を０.１％Tween２０を含むＴ
ＢＳ（ＴＴＢＳ）で洗った後、膜を１０倍希釈Block Ac
e中のウサギ抗ニワトリＩｇＧ−ＡＬＰ複合体(Sigma A9
171)で処理した。膜をＴＴＢＳで洗い、アルカリ性ホス
ファターゼ複合体基質キット（ＢＩＯ−ＲＡＤ）と反応
させてＭＰ５２に相当するバンドを可視化した。

【００３１】（４） ＣＨＯ−ＭＰ５２生産ＣＨＯセル
・ラインの細胞培養 ＣＨＯ−ＭＰ５２の最高生産性を有するＣＨＯセル・ラ
インのＭＣ−２（寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５１４２）
を１０％ＦＢＳ、４００nM ＭＴＸ、１００Ｕ／mlペニ
シリン、１００μｇ／mlストレプトマイシンを加えたＭ
ＥＭα^-を入れたローラーボトルで増殖させた。ＭＣ−
２細胞がコンフルエンシーに達した後、細胞を血清を含
まないＭＥＭα^-で洗い、次に１０mM ＨＥＰＥＳ（pH
７.３)、１０KIU Aprotinin、１mM酪酸ナトリウム、６
μｇ／mlセレン酸ナトリウム、５μｇ／mlトランスフェ
リン、１８μｇ／mlエタノールアミン、９μｇ／mlイン
シュリン、１００Ｕ／mlペニシリン、１００μｇ／mlス
トレプトマイシンを添加した血清を含まないＤＭＥ／Ｆ
１２中で培養した。馴化培地を１週間毎日採集した。

【００３２】（５） ＣＨＯ−ＭＰ５２の精製 ＣＨＯ培養上澄液および０.１容量０.２Ｍりん酸ナトリ
ウム緩衝剤、pH６.０を混合し、５０mM ＮａＣｌ、２０
mMりん酸ナトリウム緩衝剤、pH６.０で予め平衡化して
おいたＰＯＲＯＳ ＨＳカラム（１０ml、PerSeptive Bi
osystems）にかけた。タンパク質を０.０５〜２Ｍ直線
勾配ＮａＣｌで溶出し、１０mlフラクション２０本に採
集した。溶離されたＭＰ５２は３つのタイプの単量体と
して認められ、それらの見掛け分子量を還元条件下でＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥ分析により約５２、４０および１４kDで
あると測定された。これらの単量体は、３つのタイプの
ホモ二量体（１０４kD、８０kDおよび２８kD）および３
つのタイプのヘテロ二量体（９２kD：４０kD〜５２kD、
６６kD：１４kD〜５２kD、および５４kD：１４kD〜４０
kD）を形成し、これらの二量体すべてをＣＨＯ−ＭＰ５
２と命名した。但し、２８kDホモ二量体はヒトＭＰ５２
の成熟ホモ二量体として知られている（ＷＯ９５／０４
８１９）と思われるので除外する。従って、１０４kDホ
モ二量体および８０kDホモ二量体を上記のフラクション
から単離してＮ末端アミノ酸配列および生物活性を検定
した。

【００３３】５番目から９番目までのフラクションをプ
ールし、約１０倍に濃縮した。濃縮物を、１Ｍ ＮａＣ
ｌを含む２０mMりん酸ナトリウム緩衝剤、pH７.１で予
め平衡化したSuperdex 200pg（１.６ I.D.×６００cm、
Pharmacia)に充填した。流速０.５ml／分で溶離を行っ
た。１０４kDホモ二量体を含むフラクションと８０kDホ
モ二量体を含むフラクションとを別個にプールした。各
フラクションを逆相ＨＰＬＣカラム（RESOURCE RPC、３
ml、Pharmacia）にかけ、これらのタンパク質を３５〜
４０％アセトニトリルで溶出した。単離したＣＨＯ−Ｍ
Ｐ５２の濃度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでのタンパク質
のバンドのデンシトメトリーにより測定した。Ｎ末端ア
ミノ酸配列分析は、パルス液ガス相シークエンサー（Ap
plied Biosystemsモデル４７６）を用いて、８０kDホモ
二量体および１０４kDホモ二量体について、それぞれ行
った。結果を表２に示す。

【００３４】

【表２】 アミノ酸配列８０kDは配列表配列番号４のＬｙｓ １２
１またはＡｌａ １２２からＡｒｇ ４７４に由来し、ま
たアミノ酸配列１０４kDはＡｌａ １からＡｒｇ４７４
に由来した。ＣＨＯ細胞は３つのタイプのホモ二量体、
１０４kD、８０kDおよび２８kD、および３つのタイプの
ヘテロ二量体、すなわち９２kD、６６kDおよび５４kDの
二量体を生産することが新たにわかった。

【００３５】実施例１ 抗原の調製及び感作法 ヒトＭＰ５２のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを含
んだプラスミド（ｐＫＯＴ２４５）を用いて大腸菌（寄
託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５４９９号）で発現させ、その
インクルージョンボデイー（Inclusion body）を常法に
より可溶化したモノマー型ｒｈＭＰ５２を酸化させるこ
とにより、ダイマー型（以下Ｄ−ｒｈＭＰ５２と略す。
参考例１参照）を構成させ、等電点沈殿法、ゲルろ過等
の精製過程を経て、最終的に約０.５mg／mlの濃度のｒ
ｈＭＰ５２を抗原として用いた。あるいはＣＨＯ細胞
（寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５１４２号）で発現させ
（以下ＣＨＯ−ＭＰ５２と略する。参考例２参照）、抗
原として上述の濃度を用いた。免疫感作マウスの作製
は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにＣＨＯ−ＭＰ５２（プロセッ
シングが不完全な前駆体を８割以上含む）を１０mM塩酸
水溶液に溶解したものをフロイントの完全アジュバント
（ＣＦＡ）と１：１割合で混合、乳化したものを０、
７、１６および１１２日目にそれぞれ７０、２０、１０
および５２μgを、またその間２９日目にはＥ．Ｃｏｌ
ｉ由来のＭＰ５２（モノマーを若干含む）１８μgを同
様に調製したものを腹腔内に注射した後、約１カ月間隔
をあけて、５０μgのＤ−ｒｈＭＰ５２を含む溶液をフ
ロイントの不完全アジュバント（ＩＦＡ）と１：１で混
合、乳化したものを腹腔内に注射することにより行っ
た。このように６回感作し続けたマウスに対し、最終投
与後４２日目に、６０μgのＤ−ｒｈＭＰ５２をアジュ
バントなしで皮下投与し、さらに４２日の間隔をあけて
（細胞融合の３日前にあたる)、５０μgのＤ−ｒｈＭＰ
５２を尾静脈から投与した。

【００３６】実施例２ 細胞融合 最終免疫から３日後に、感作マウスから脾臓を取り出
し、脾細胞を調製した。得られた脾細胞をマウス骨髄腫
細胞株（ＳＰ２／０）を１０：１の比率で混合し、１５
００rpmで遠心し、その細胞のペレットを４０％ポリエ
チレングリコール（ＰＥＧ１５００）を３７℃で保温し
ながらゆっくりほぐす。そこに、ＦＣＳを除いた１mlの
ＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬製）をゆっくり注ぎな
がらピペットの先で軽く撹拌し、その後、約６分間かけ
て２５０rpmから１０００rpmまで徐々に遠心の回転数を
上げていき、その後得られたペレットをＦＣＳ無しの培
地にて１回洗浄した後、最終的には２０％のＦＣＳ入り
のＲＰＭＩ１６４０培地にＨＡＴ｛ヒポキサンチン
（Ｈ）、アミノプテリン（Ａ）、チミジン（Ｔ）｝を添
加した液にて９６ウェルプレートに１ウェルあたり脾細
胞数が１０,０００個となるように分注した。

【００３７】実施例３ ＥＬＩＳＡ法による第１次スク
リーニング 約６,０００の融合細胞の生産物について、ヒトＭＰ５
２に対するモノクローナル抗体の産生の有無を以下の手
順で調べた。 １）免疫に使用したＤ−ｒｈＭＰ５２とそれを還元し、
ｓｓ結合を阻害するためにＳＨ基をスルホン化したモノ
マー型ｒｈＭＰ５２（以下Ｍ−ｒｈＭＰ５２と略する）
をそれぞれ１μg／mlの濃度で１ウェルあたり５０μlず
つプレート（ＮＵＮＣ，ＭＡＸＩＳＯＲＰ）に１時間室
温でインキュベートすることによりコートした。 ２）Ｔｗｅｅｎ２０入りの０.０１Ｍりん酸ナトリウム
緩衝剤（ＰＢＳ）(ｐＨ７.２）で洗浄後、培養上清を原
液で５０μlずつ添加し、室温で１時間インキュベート
した。 ３）洗浄液で３回洗浄した後、約１μg／mlの濃度で各
ウェルに４５μlのＨＲＰＯ標識ウサギ抗マウス免疫グ
ロブリン抗体（ＤＡＫＯ，Ｆ２０６）を添加した。この
時に使用した希釈液は、２mg／mlのカゼイン（関東化
学）を０.１Ｍトリスヒドロキシアミノメタン緩衝液
（ＴＢＳ，ｐＨ７.４）を溶解したものを用いた。 ４）室温で１時間インキュベートし、３回洗浄液で洗浄
した後、発色液（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ−ＴＭＢ，Behrin
gwerke）を５０μlずつ加えた。 ５）約５分間室温で発色反応を起こさせた後、５０μl
の０.５Ｎ硫酸を加えることにより発色反応を停止させ
た。 ６）反応停止後、３０分以内に吸光度ＯＤ₄₅₀nmにて発
色の程度を測定した。ａＭＰ−１からａＭＰ−２３と命
名した２３個のモノクローナル抗体のうち、以後のクロ
ーニング過程で維持できなかったａＭＰ−１７、ａＭＰ
−１９およびａＭＰ−２３を除く２０のモノクローナル
抗体についての結果を、表３に示した。陽性陰性の判定
は、陰性コントロールの平均±１０ＳＤ（ＯＤ₄₅₀nm＝
０.０５）をカットオフ値とした。ａＭＰ−１，２，
３，４，５，６，７，９，１２，１４，１５，１８とａ
ＭＰ−２２はＤ−ｒｈＭＰ５２だけに反応し、ａＭＰ−
８，１０，１１，１３，１６，２０とａＭＰ−２１はＤ
−ｒｈＭＰ５２とＭ−ｒｈＭＰ５２の両方に反応した。
ここで、特異性の観点から少なくとも２種類の抗体に分
類された。

【００３８】実施例４ ウェスタンブロット法による特
異性の確認 １）ｒｈＭＰ５２（１μg／lane／０.５mm）を非還元条
件（Ｄ−ｒｈＭＰ５２として泳動される）と還元条件
（Ｍ−ｒｈＭＰ５２として泳動される）で、１５〜２５
％のグラジエントゲル（第一化学社製）を用いてＳＤＳ
−ＰＡＧＥを行った後、定法によりニトロセルロース膜
に転写（３０Ｖ，２ｈ）した。 ２）転写したニトロセルロース膜を約３mg／mlのカゼイ
ンを含んだＴＢＳ溶液に２０分以上つけておくことによ
って非特異反応をブロックした。 ３）モノクローナル抗体を含む培養上清（４μg／ml〜4
0μg／mlの範囲）原液の中でｒｈＭＰ５２を転写してあ
るニトロセルロース膜を１時間、室温で振とうしながら
インキュベートした。 ４）大量のＰＢＳ洗浄液（ｐＨ７.２）で洗浄（５分間
ずつ浸透しながら、液替えを３回）した。 ５）２次抗体として1μg／mlのＨＲＰＯ標識ウサギ抗マ
ウス免疫グロブリン抗体をカゼイン／ＴＢＳの希釈液中
で１時間、室温でインキュベートした。 ６）４）と同様に良く洗浄した。 ７）発色剤（TrueBlue／Peroxidase substrate，Kirkeg
aard Perry Laboratories社製）に１０分浸すことによ
り、呈色反応をひきおこさせた。その後、流水にて十分
に洗浄した。結果は、ＥＬＩＳＡによる第１次スクリー
ニングの結果と一致した。結果は図３に記載した。

【００３９】実施例５ モノクローナル抗体のサブクラ
スの決定 クローンが産生するモノクローナル抗体のサブクラス
は、マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット
（Mouse monoclonal antibody isotyping kit，Amersha
m社製, RPN29）を用いてその取扱説明書に従って決定し
た。モノクローナル抗体のサブクラスは表４に示してあ
る。全てのモノクローナル抗体のＬ鎖のサブクラスはκ
であり、Ｈ鎖のサブクラスは、γ1もしくはγ2aであっ
た。

【００４０】実施例６ 特異性の確認 ヒトＭＰ５２は、ＴＧＦ−βジーンスーパーファミリー
に属する分子であり、構造やアミノ酸配列の点で他のＴ
ＧＦ−βジーンスーパーファミリー、特にＴＧＦ−β２
とＢＭＰ−２に類似していることがわかっている。本発
明のモノクローナル抗体が、ヒトＭＰ５２特異的である
かを調べるために、ヒトリコンビナントＴＧＦ−β２
（ｒｈＴＧＦβ２）とヒトリコンビナントＢＭＰ−２
（ｒｈＢＭＰ−２）を入手し、前述した実施例３と同様
な方法でＥＬＩＳＡを行い、その特異性を調べた。結果
は、表５に示した。これらの全てのモノクローナル抗体
は、ＴＧＦ−β２およびＢＭＰ−２とは反応せずＭＰ５
２特異的な抗体であることが確認された。

【００４１】実施例７ 抗体の精製 培養上清及びマウス腹水からのモノクローナル抗体の精
製は、プロテインＡあるいはプロテインＧのカラム（Ph
armacia社製）を用いて、取扱説明書に従って精製し
た。培養上清からの精製には、プロテインＡのカラムを
用い、腹水からの精製にはプロテインＧカラムを用い
た。

【００４２】実施例８ サンドイッチＥＬＩＳＡ法によ
る第２次スクリーニング（タイピング） １）精製されたモノクローナル抗体（ａＭＰ−１，２，
３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１
３，１４，１５，１６，１８，２０，２１，２２の２０
種類）をそれぞれ９６ウェルプレートに１μg／mlの濃
度で各ウェルに５０μlずつコート（１時間、室温）す
る。 ２）洗浄液にて洗浄（ＢＥＰ−II，ベーリングヴェルケ
社製で３回）した後、１定量のＤ−ｒｈＭＰ５２（３０
ng／ml）をカゼイン／ＴＢＳ中に希釈した溶液を５０μ
lずつ分注し、１時間、室温でインキュベートする。 ３）洗浄後、ビオチン化キット（Antibody Labelling s
ystems; Biotinylation Kit, American Qualex社製）を
用いてビオチン化した１）に示したモノクローナル抗体
をそれぞれ１μg／mlとなるようにカゼイン／ＴＢＳに
希釈したものを１）でコートした全てのモノクローナル
抗体に対し、反応させた。例えば、ａＭＰ−１をコート
したプレートにビオチン化したすべてのａＭＰ−１，
２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，
１３，１４，１５，１６，１８，２０，２１とａＭＰ−
２２をそれぞれ反応させ、ａＭＰ−２〜２２をコートし
たプレートにも同様に全てのビオチン化モノクローナル
抗体を反応させた（１時間、室温）。 ４）洗浄後、カゼイン／ＴＢＳにＨＲＰＯ標識したアビ
ジン(AVIDIN-PEROXIDASE，SIGMA社製）を１μg／mlの濃
度で加え、１時間、室温でインキュベートし、 ５）洗浄後、３、４）と同様に発色反応を起こさせ、 ６）１５分後に、３、５）６）と同様に反応停止及び測
定した。この結果の一部を図４に示した。同じモノクロ
ーナル抗体であれば全ての組み合わせで同等の結果が得
られるはずである。しかしながら、例として図４に示し
たａＭＰ−１とａＭＰ−４は全く異なる抗体であること
がわかった。これらの結果から、全てのモノクローナル
抗体の異同性が判明し、結果として１０種類のエピトー
プに対する特異性の異なったモノクローナル抗体が同定
された。これらを表６に記載の如くＴｙｐｅＡ，Ｂ，
Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，ＩおよびＪと分類した。

【００４３】実施例９ Ｄ−ｒｈＭＰ５２の生物活性の
モノクローナル抗体による阻害 ラット骨芽細胞株ＲＯＢ／Ｃ２６は、ヒトＭＰ５２のレ
セプターを有していることが知られており、培養液中に
ヒトＭＰ５２を添加すると、アルカリフォスファターゼ
（ＡＬＰ）の活性が上昇する事が知られている。ｒｈＭ
Ｐ５２を一定量加える時に、精製した全てのモノクロー
ナル抗体を最終的に２０μg／mlとなるように添加した
ときのＡＬＰ活性上昇の阻害が見られるかどうかを検討
した。１０ng／mlの濃度でｒｈＭＰ５２をＲＯＢ／Ｃ２
６に添加し、数日間培養したときに、細胞表面上のＭＰ
５２レセプターを介し刺激が伝導され、結果としてＡＬ
Ｐの活性が上昇する。上昇したＡＬＰ活性はＡＬＰ特異
的な基質を反応させることによりＥＬＩＳＡと同様に発
色反応で定量化できる（ただし、測定波長はＯＤ４０５
nm）。結果は、表７に示してあるが、抗体無しでｒｈＭ
Ｐ５２単独で０.１５８を示し、そこにモノクローナル
抗体を共存させた時に得られるＡＬＰ活性が低ければ低
いほど阻害活性が強いと判断する。結果として、ａＭＰ
−４，５，８，１１，２０とａＭＰ−２１による強い阻
害活性が認められた。このうちａＭＰ−４およびａＭＰ
−５は、Ｄ−ｒｈＭＰ５２に特異的に反応する抗体であ
り（表１）、Ｍ−ｒｈＭＰ５２にも反応するａＭＰ−
８，１１，２０および２１とは異なり、実質的にＭＰ５
２がＭＰ５２レセプターへ結合するのを生理的条件下で
阻害するモノクローナル抗体であると考えられる。モノ
クローナル抗体ａＭＰ−４およびａＭＰ−５を産生する
ハイブリドーマは工業技術院、生命工学工業技術研究所
にそれぞれ寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５５５５およびＦ
ＥＲＭ Ｐ−１５５５６として寄託されている。

【００４４】実施例１０ サンドイッチＥＬＩＳＡによ
るＭＰ５２の定量 実施例８よりモノクローナル抗体が１０種類に分類され
た。その内、ＴｙｐｅＣのａＭＰ−４とＴｙｐｅ Ｄの
ＭＰ−５によるサンドイッチＥＬＩＳＡを構築した。す
なわち、 １）精製されたａＭＰ−５を９６ウェルプレートに５μ
g／mlの濃度で各ウェルに５０μlずつコート（１時間、
室温）する。 ２）洗浄液にて洗浄した後、精製されたＭＰ５２を１ng
／mlを最高濃度として、順にカゼイン／トリス緩衝液に
希釈したものを各ウェルに５０μlずつ添加し、１時
間、室温でインキュベートする。 ３）洗浄液にて洗浄した後、ビオチン化したａＭＰ−４
精製抗体を１μg／mlの濃度で各ウェルに５０μlずつ添
加し、１時間、室温で反応させる。 ４）洗浄液にて洗浄した後、アビジン化ペルオキシダー
ゼ（SIGMA A−3151）を１μg／mlの濃度で添加し、１時
間、室温で反応させる。 ５）洗浄液にて洗浄した後、３、４）と同様に発色反応
を起こさせ、 ６）３０分後、５０μlの０.５Ｎ硫酸を加えることによ
り、発色反応を停止させた。 ７) 反応停止後、吸光度ＯＤ₄₅₀nmにて発色の程度を測
定した。これらの結果は、図５に示してあり、検出限界
は２３.９pg／ml、定量限界は４２.４pg／mlであった。
ここで、検出限界とは、ＭＰ５２を含まない緩衝液のバ
ックグラウンド値よりは有意に高いＭＰ５２の濃度を、
また、定量限界とは、定量するに信頼のおけるＭＰ５２
の最低濃度をいう。

【００４５】

【表３】 ＥＬＩＳＡによる抗ＭＰ５２抗体価測定結果 使 用 し た 抗 原 モノクローナル抗体 モノマー型rhMP52 ダイマー型rhMP52 ａＭＰ−１ ０.０３ １.３５ ａＭＰ−２ ０.０１ １.０３ ａＭＰ−３ ０.０１ ０.９２ ａＭＰ−４ ０.０１ １.５８ ａＭＰ−５ ０.０１ １.０３ ａＭＰ−６ ０.０１ ０.９６ ａＭＰ−７ ０.０１ １.５３ ａＭＰ−８ １.８９ １.９８ ａＭＰ−９ ０.０４ １.１５ ａＭＰ−１０ １.０８ １.７８ ａＭＰ−１１ １.８１ １.９５ ａＭＰ−１２ ０.０２ ０.３３ ａＭＰ−１３ ０.２６ １.４８ ａＭＰ−１４ ０.０３ １.２６ ａＭＰ−１５ ０.０１ １.３５ ａＭＰ−１６ ０.０６ １.５８ ａＭＰ−１８ ０.０１ １.１９ ａＭＰ−２０ １.８５ ２.０１ ａＭＰ−２１ １.４１ １.８６ ａＭＰ−２２ ０.０１ ０.８８ 抗ＭＰ５２抗血清 １.８３ ２.２３ 陰性コントロール ０.０１ ０.０１ 単位；ＯＤ₄₅₀nm カットオフ値；０.０５

【００４６】

【表４】 モノクローナル抗体のサブクラス サ ブ ク ラ ス モノクローナル抗体 Ｈ鎖 Ｌ鎖 ａＭＰ−１ γ１ κ ａＭＰ−２ γ１ κ ａＭＰ−３ γ１ κ ａＭＰ−４ γ２ａ κ ａＭＰ−５ γ１ κ ａＭＰ−６ γ１ κ ａＭＰ−７ γ２ａ κ ａＭＰ−８ γ１ κ ａＭＰ−９ γ１ κ ａＭＰ−１０ γ１ κ ａＭＰ−１１ γ１ κ ａＭＰ−１２ γ１ κ ａＭＰ−１３ γ１ κ ａＭＰ−１４ γ２ａ κ ａＭＰ−１５ γ１ κ ａＭＰ−１６ γ１ κ ａＭＰ−１８ γ１ κ ａＭＰ−２０ γ１ κ ａＭＰ−２１ γ１ κ ａＭＰ−２２ γ２ａ κ

【００４７】

【表５】 モノクローナル抗体の特異性 使 用 し た 抗 原 モノクローナル抗体 ｒｈＴＧＦβ２ ｒｈＢＭＰ−２ ａＭＰ−１ ０.０１６ ０.０６ ａＭＰ−２ ０.０１４ ０.０４３ ａＭＰ−３ ０.０４７ ０.０５５ ａＭＰ−４ ０.０４６ ０.０４８ ａＭＰ−５ ０.０１８ ０.０２４ ａＭＰ−６ ０.０２９ ０.０１８ ａＭＰ−７ ０.０２６ ０.０３ ａＭＰ−８ ０.０３４ ０.０３２ ａＭＰ−９ ０.０１１ ０.０３２ ａＭＰ−１０ ０.０１９ ０.０２８ ａＭＰ−１１ ０.０１９ ０.０２７ ａＭＰ−１２ ０.０１２ ０.０１８ ａＭＰ−１３ ０.０３５ ０.０３５ ａＭＰ−１４ ０.０２２ ０.０２４ ａＭＰ−１５ ０.０１５ ０.０２３ ａＭＰ−１６ ０.０２３ ０.０２８ ａＭＰ−１８ ０.０３５ ０.０２５ ａＭＰ−２０ ０.０２５ ０.０１８ ａＭＰ−２１ ０.０２９ ０.０１９ ａＭＰ−２２ ０.０２５ ０.０２ 抗ＴＧＦβ抗体 ２.２ ０.０２５ 抗BMP−2抗体含有抗血清 １.５ １.３５１ 陰性コントロール ０.０７６ ０.０６５ 単位；ＯＤ₄₅₀nm カットオフ値；陰性コントロール値

【００４８】

【表６】 モノクローナル抗体の分類 Ｔｙｐｅ 同一エピトープに反応するモノクローナル抗体 Ａ ａＭＰ−１，ａＭＰ−１５ Ｂ ａＭＰ−２，ａＭＰ−３，ａＭＰ−６，ａＭＰ−７， ａＭＰ−１８ Ｃ ａＭＰ−４ Ｄ ａＭＰ−５ Ｅ ａＭＰ−８，ａＭＰ−１１，ａＭＰ−２０ Ｆ ａＭＰ−９，ａＭＰ−１４ Ｇ ａＭＰ−１０，ａＭＰ−２１ Ｈ ａＭＰ−１２ Ｉ ａＭＰ−１３，ａＭＰ−１６ Ｊ ａＭＰ−２２

【００４９】

【表７】 単位；ＯＤ₄₀₅nm 測定値；ＭＰ５２なしの時のコントロール値を引いた値

【００５０】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１１９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 起源： 生物名：ヒト（homo sapiens） 組織の種類：ヒト胎児 配列の特徴： 存在位置： 他の情報：ＭＰ５２アミノ酸配列の３８３番目から５０
１番目のアミノ酸配列。 配列： CCA CTG GCC ACT CGC CAG GGC AAG CGA CCC AGC AAG AAC CTT AAG GCT 48 Pro Leu Ala Thr Arg Gln Gly Lys Arg Pro Ser Lys Asn Leu Lys Ala 5 10 15 CGC TGC AGT CGG AAG GCA CTG CAT GTC AAC TTC AAG GAC ATG GGC TGG 96 Arg Cys Ser Arg Lys Ala Leu His Val Asn Phe Lys Asp Met Gly Trp 20 25 30 GAC GAC TGG ATC ATC GCA CCC CTT GAG TAC GAG GCT TTC CAC TGC GAG 144 Asp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Leu Glu Tyr Glu Ala Phe His Cys Glu 35 40 45 GGG CTG TGC GAG TTC CCA TTG CGC TCC CAC CTG GAG CCC ACG AAT CAT 192 Gly Leu Cys Glu Phe Pro Leu Arg Ser His Leu Glu Pro Thr Asn His 50 55 60 GCA GTC ATC CAG ACC CTG ATG AAC TCC ATG GAC CCC GAG TCC ACA CCA 240 Ala Val Ile Gln Thr Leu Met Asn Ser Met Asp Pro Glu Ser Thr Pro 65 70 75 80 CCC ACC TGC TGT GTG CCC ACG CGA CTG AGT CCC ATC AGC ATC CTC TTC 288 Pro Thr Cys Cys Val Pro Thr Arg Leu Ser Pro Ile Ser Ile Leu Phe 85 90 95 ATT GAC TCT GCC AAC AAC GTG GTG TAT AAG CAG TAT GAG GAC ATG GTC 336 Ile Asp Ser Ala Asn Asn Val Val Tyr Lys Gln Tyr Glu Asp Met Val 100 105 110 GTG GAG TCG TGT GGC TGC AGG 357 Val Glu Ser Cys Gly Cys Arg 115

【００５１】配列番号：２ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 起源：なし 生物名：なし 株名：なし 配列の特徴：ＭＰ５２成熟型単離用順方向ＰＣＲプライ
マー。 配列： ＡＴＡＡＴＧＣＣＡＣ ＴＡＧＣＡＡＣＴＣＧ ＴＣＡＧＧＧＣ ２７

【００５２】配列番号：３ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 起源：なし 生物名：なし 株名：なし 配列の特徴：ＭＰ５２成熟型単離用逆方向ＰＣＲプライ
マー。 配列： ＣＧＴＣＧＡＣＴＡＣ ＣＴＧＣＡＧＣＣＡＣ ＡＣＧＡＣＴ ２６

【００５３】配列番号：４ 配列の型：対応するタンパク質のヌクレオチド 配列の長さ：２７０３ 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直線状 分子の型：cDNA − mRNA 起源 生物名：ヒト（homo sapiens） 640〜720 bp シグナルペプチド 1783〜2142 bp 成熟ペプチド 組織の種類：ヒト胎児 配列記載：配列番号１： CCATGGCCTC GAAAGGGCAG CGGTGATTTT TTTCACATAA ATATATCGCA CTTAAATGAG 60 TTTAGACAGC ATGACATCAG AGAGTAATTA AATTGGTTTG GGTTGGAATT CCGTTTCCAA 120 TTCCTGAGTT CAGGTTTGTA AAAGATTTTT CTGAGCACCT GCAGGCCTGT GAGTGTGTGT 180 GTGTGTGTGT GTGTGTGTGT GTGTGTGTGA AGTATTTTCA CTGGAAAGGA TTCAAAACTA 240 GGGGGAAAAA AAAACTGGAG CACACAGGCA GCATTACGCC ATTCTTCCTT CTTGGAAAAA 300 TCCCTCAGCC TTATACAAGC CTCCTTCAAG CCCTCAGTCA GTTGTGCAGG AGAAAGGGGG 360 CGGTTGGCTT TCTCCTTTCA AGAACGAGTT ATTTTCAGCT GCTGACTGGA GACGGTGCAC 420 GTCTGGATAC GAGAGCATTT CCACTATGGG ACTGGATACA AACACACACC CGGCAGACTT 480 CAAGAGTCTC AGACTGAGGA GAAAGCCTTT CCTTCTGCTG CTACTGCTGC TGCCGCTGCT 540 TTTGAAAGTC CACTCCTTTC ATGGTTTTTC CTGCCAAACC AGAGGCACCT TTGCTGCTGC 600 CGCTGTTCTC TTTGGTGTCA TTCAGCGGCT GGCCAGAGG ATG AGA CTC CCC AAA 654 Met Arg Leu Pro Lys -25 CTC CTC ACT TTC TTG CTT TGG TAC CTG GCT TGG CTG GAC CTG GAA TTC 702 Leu Leu Thr Phe Leu Leu Trp Tyr Leu Ala Trp Leu Asp Leu Glu Phe -20 -15 -10 ATC TGC ACT GTG TTG GGT GCC CCT GAC TTG GGC CAG AGA CCC CAG GGG 750 Ile Cys Thr Val Leu Gly Ala Pro Asp Leu Gly Gln Arg Pro Gln Gly -5 1 5 10 ACC AGG CCA GGA TTG GCC AAA GCA GAG GCC AAG GAG AGG CCC CCC CTG 798 Thr Arg Pro Gly Leu Ala Lys Ala Glu Ala Lys Glu Arg Pro Pro Leu 15 20 25 GCC CGG AAC GTC TTC AGG CCA GGG GGT CAC AGC TAT GGT GGG GGG GCC 846 Ala Arg Asn Val Phe Arg Pro Gly Gly His Ser Tyr Gly Gly Gly Ala 30 35 40 ACC AAT GCC AAT GCC AGG GCA AAG GGA GGC ACC GGG CAG ACA GGA GGC 894 Thr Asn Ala Asn Ala Arg Ala Lys Gly Gly Thr Gly Gln Thr Gly Gly 45 50 55 CTG ACA CAG CCC AAG AAG GAT GAA CCC AAA AAG CTG CCC CCC AGA CCG 942 Leu Thr Gln Pro Lys Lys Asp Glu Pro Lys Lys Leu Pro Pro Arg Pro 60 65 70 GGC GGC CCT GAA CCC AAG CCA GGA CAC CCT CCC CAA ACA AGG CAG GCT 990 Gly Gly Pro Glu Pro Lys Pro Gly His Pro Pro Gln Thr Arg Gln Ala 75 80 85 90 ACA GCC CGG ACT GTG ACC CCA AAA GGA CAG CTT CCC GGA GGC AAG GCA 1038 Thr Ala Arg Thr Val Thr Pro Lys Gly Gln Leu Pro Gly Gly Lys Ala 95 100 105 CCC CCA AAA GCA GGA TCT GTC CCC AGC TCC TTC CTG CTG AAG AAG GCC 1086 Pro Pro Lys Ala Gly Ser Val Pro Ser Ser Phe Leu Leu Lys Lys Ala 110 115 120 AGG GAG CCC GGG CCC CCA CGA GAG CCC AAG GAG CCG TTT CGC CCA CCC 1134 Arg Glu Pro Gly Pro Pro Arg Glu Pro Lys Glu Pro Phe Arg Pro Pro 125 130 135 CCC ATC ACA CCC CAC GAG TAC ATG CTC TCG CTG TAC AGG ACG CTG TCC 1182 Pro Ile Thr Pro His Glu Tyr Met Leu Ser Leu Tyr Arg Thr Leu Ser 140 145 150 GAT GCT GAC AGA AAG GGA GGC AAC AGC AGC GTG AAG TTG GAG GCT GGC 1230 Asp Ala Asp Arg Lys Gly Gly Asn Ser Ser Val Lys Leu Glu Ala Gly 155 160 165 170 CTG GCC AAC ACC ATC ACC AGC TTT ATT GAC AAA GGG CAA GAT GAC CGA 1278 Leu Ala Asn Thr Ile Thr Ser Phe Ile Asp Lys Gly Gln Asp Asp Arg 175 180 185 GGT CCC GTG GTC AGG AAG CAG AGG TAC GTG TTT GAC ATT AGT GCC CTG 1326 Gly Pro Val Val Arg Lys Gln Arg Tyr Val Phe Asp Ile Ser Ala Leu 190 195 200 GAG AAG GAT GGG CTG CTG GGG GCC GAG CTG CGG ATC TTG CGG AAG AAG 1374 Glu Lys Asp Gly Leu Leu Gly Ala Glu Leu Arg Ile Leu Arg Lys Lys 205 210 215 CCC TCG GAC ACG GCC AAG CCA GCG GCC CCC GGA GGC GGG CGG GCT GCC 1422 Pro Ser Asp Thr Ala Lys Pro Ala Ala Pro Gly Gly Gly Arg Ala Ala 220 225 230 CAG CTG AAG CTG TCC AGC TGC CCC AGC GGC CGG CAG CCG GCC TCC TTG 1470 Gln Leu Lys Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gly Arg Gln Pro Ala Ser Leu 235 240 245 250 CTG GAT GTG CGC TCC GTG CCA GGC CTG GAC GGA TCT GGC TGG GAG GTG 1518 Leu Asp Val Arg Ser Val Pro Gly Leu Asp Gly Ser Gly Trp Glu Val 255 260 265 TTC GAC ATC TGG AAG CTC TTC CGA AAC TTT AAG AAC TCG GCC CAG CTG 1566 Phe Asp Ile Trp Lys Leu Phe Arg Asn Phe Lys Asn Ser Ala Gln Leu 270 275 280 TGC CTG GAG CTG GAG GCC TGG GAA CGG GGC AGG GCC GTG GAC CTC CGT 1614 Cys Leu Glu Leu Glu Ala Trp Glu Arg Gly Arg Ala Val Asp Leu Arg 285 290 295 GGC CTG GGC TTC GAC CGC GCC GCC CGG CAG GTC CAC GAG AAG GCC CTG 1662 Gly Leu Gly Phe Asp Arg Ala Ala Arg Gln Val His Glu Lys Ala Leu 300 305 310 TTC CTG GTG TTT GGC CGC ACC AAG AAA CGG GAC CTG TTC TTT AAT GAG 1710 Phe Leu Val Phe Gly Arg Thr Lys Lys Arg Asp Leu Phe Phe Asn Glu 315 320 325 330 ATT AAG GCC CGC TCT GGC CAG GAC GAT AAG ACC GTG TAT GAG TAC CTG 1758 Ile Lys Ala Arg Ser Gly Gln Asp Asp Lys Thr Val Tyr Glu Tyr Leu 335 340 345 TTC AGC CAG CGG CGA AAA CGG CGG GCC CCA CTG GCC ACT CGC CAG GGC 1806 Phe Ser Gln Arg Arg Lys Arg Arg Ala Pro Leu Ala Thr Arg Gln Gly 350 355 360 AAG CGA CCC AGC AAG AAC CTT AAG GCT CGC TGC AGT CGG AAG GCA CTG 1854 Lys Arg Pro Ser Lys Asn Leu Lys Ala Arg Cys Ser Arg Lys Ala Leu 365 370 375 CAT GTC AAC TTC AAG GAC ATG GGC TGG GAC GAC TGG ATC ATC GCA CCC 1902 His Val Asn Phe Lys Asp Met Gly Trp Asp Asp Trp Ile Ile Ala Pro 380 385 390 CTT GAG TAC GAG GCT TTC CAC TGC GAG GGG CTG TGC GAG TTC CCA TTG 1950 Leu Glu Tyr Glu Ala Phe His Cys Glu Gly Leu Cys Glu Phe Pro Leu 395 400 405 410 Arg Ser His Leu Glu Pro Thr Asn His Ala Val Ile Gln Thr Leu Met 415 420 425 AAC TCC ATG GAC CCC GAG TCC ACA CCA CCC ACC TGC TGT GTG CCC ACG 2046 Asn Ser Met Asp Pro Glu Ser Thr Pro Pro Thr Cys Cys Val Pro Thr 430 435 440 CGG CTG AGT CCC ATC AGC ATC CTC TTC ATT GAC TCT GCC AAC AAC GTG 2094 Arg Leu Ser Pro Ile Ser Ile Leu Phe Ile Asp Ser Ala Asn Asn Val 445 450 455 GTG TAT AAG CAG TAT GAG GAC ATG GTC GTG GAG TCG TGT GGC TGC AGG 2142 Val Tyr Lys Gln Tyr Glu Asp Met Val Val Glu Ser Cys Gly Cys Arg 460 465 470 TAG CAGCACTGGC CCTCTGTCTT CCTGGGTGGC ACATCCCAAG AGCCCCTTCC 2195 *** 475 TGCACTCCTG GAATCACAGA GGGGTCAGGA AGCTGTGGCA GGAGCATCTA CACAGCTTGG 2255 GTGAAAGGGG ATTCCAATAA GCTTGCTCGC TCTCTGAGTG TGACTTGGGC TAAAGGCCCC 2315 CTTTTATCCA CAAGTTCCCC TGGCTGAGGA TTGCTGCCCG TCTGCTGATG TGACCAGTGG 2375 CAGGCACAGG TCCAGGGAGA CAGACTCTGA ATGGGACTGA GTCCCAGGAA ACAGTGCTTT 2435 CCGATGAGAC TCAGCCCACC ATTTCTCCTC ACCTGGGCCT TCTCAGCCTC TGGACTCTCC 2495 TAAGCACCTC TCAGGAGAGC CACAGGTGCC ACTGCCTCCT CAAATCACAT TTGTGCCTGG 2555 TGACTTCCTG TCCCTGGGAC AGTTGAGAAG CTGACTGGGC AAGAGTGGGA GAGAAGAGGA 2615 GAGGGCTTGG ATAGAGTTGA GGAGTGTGAG GCTGTTAGAC TGTTAGATTT AAATGTATAT 2675 TGATGAGATA AAAAGCAAAA CTGTGCCT 2703

【図面の簡単な説明】

【図１】参考例１（２）で得られたｒｈＭＰ５２の発現
ベクター（ｐＫＯＴ２４５）のプラスミドマップであ
る。

【図２】ＣＨＯ−ＭＰ５２発現ベクターｐＭＳＳ９９
（５.０kb）のプラスミドマップである。ｐＭＳＳ９９
でのＣＨＯ−ＭＰ５２ ＤＮＡ塩基配列は、配列表の配
列番号４に示す５７６番目から２２７９番目のヌクレオ
チドである。

【図３】モノマー型（Ａ）とダイマー型（Ｂ）とｒｈＭ
Ｐ５２に対するモノクローナル抗体の反応性のウェスタ
ンブロット解析図の写真である。

【図４】モノクローナル抗体の異同性（タイピング）を
調べたときの図である。例として、ａＭＰ−１およびａ
ＭＰ−４をコートしたものを示す。

【図５】モノクローナル抗体を用いてＭＰ５２の定量曲
線を示した図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/577 Ｂ 33/577 Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＥＤＮ // Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＥＤ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 中川 啓 静岡県浜松市葵町289−38 (72)発明者 柳澤 幸子 埼玉県川越市南台１丁目３番地２ 日本ヘ キスト・マリオン・ルセル株式会社創薬研 究所内

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ダイマー型のヒトＭＰ５２に結合し、モ
   ノマー型のヒトＭＰ５２に結合しない、ヒトＭＰ５２に
   対するマウスモノクローナル抗体。
2. 【請求項２】 ヒトＭＰ５２の活性部位に結合する請求
   項１のマウスモノクローナル抗体。
3. 【請求項３】 請求項１のヒトＭＰ５２に対するマウス
   モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
4. 【請求項４】 請求項１のヒトＭＰ５２に対するマウス
   モノクローナル抗体を用いるダイマー型ヒトＭＰ５２の
   精製方法。
5. 【請求項５】 請求項１のヒトＭＰ５２に対するマウス
   モノクローナル抗体を用いるダイマー型ヒトＭＰ５２の
   検出方法。